Summary
Aquí detallamos las técnicas experimentales usadas para evaluar las fuerzas de la saliente que podosomes aplicar sobre una película compatible con, desde la preparación de la película para el análisis automatizado de imágenes topográficas.
Abstract
En numerosos contextos biológicos, las células animales necesitan interactuar físicamente con su entorno mediante el desarrollo de las fuerzas mecánicas. Entre ellas, las fuerzas de tracción han sido bien caracterizadas, pero hay una falta de técnicas que permite la medición de las fuerzas de protrusión ejercida por células ortogonalmente a su substrato. Se diseñó un montaje experimental para medir las fuerzas de protrusión ejercidas por las células adherentes a su substrato. Células sobre una hoja de Formvar compatible con este sustrato deforman y la topografía resultante se asigna por microscopía de fuerza atómica (AFM) en la escala de nanómetros. Valores de fuerza se extraen luego de un análisis del perfil de deformación basado en la geometría de las estructuras celulares protrusivo. Por lo tanto, las fuerzas ejercidas por las unidades individuales que sobresale de una célula viva pueden medirse con el tiempo. Esta técnica permite el estudio de generación de fuerzas y su regulación en los procesos celulares que implican protrusión. Aquí, Describimos su aplicación para medir las fuerzas protrusivo generadas por podosomes formado por macrófagos humanos.
Introduction
Las células animales interactúan físicamente con la matriz y las otras células que constituyen su medio ambiente1. Esto es necesario para que puedan migrar, internalizar cuerpos, adquirir información externa o distinguir. En tales procesos, la célula debe generar fuerzas mecánicas y, como han demostrado numerosos estudios en los últimos años, la capacidad de una célula para generar fuerzas y probe su entorno influye en su comportamiento biológico, dirigir por ejemplo proliferación o diferenciación de2,3. A su vez, la medición de fuerzas celulares es una ayuda importante para estudiar la regulación de la generación de fuerzas y comprender su implicación en la célula comportamiento y tejido destino4,5.
Años recientes han presenciado el desarrollo de numerosas técnicas para medir las fuerzas que una célula puede ejercer sobre su medio ambiente6. La mayoría de ellos ha sido instrumental en revelar que la tracción las fuerzas que las células ejercen como tiran en sondas móviles o un substrato deformable. Sin embargo, las fuerzas mecánicas involucradas en protrusión en el ambiente extracelular sufren de una falta de técnicas de medición y hasta la fecha no bien caracterizado.
Para superar esta limitación, se presenta un método para medir las fuerzas ejercidas ortogonalmente al sustrato. Consiste en las células vivas en una fina lámina elástica que pueden deformarse en la dirección ortogonal, lo que es posible medir la deformación del sustrato por las células y deducir las fuerzas implicadas de la galjanoplastia. Topografía del sustrato se mide con una resolución de nanoescala utilizando microscopía de fuerza atómica y la evaluación de las fuerzas de deformación se basa en el conocimiento de la geometría de las estructuras celulares protrusivo7,8, 9.
Aquí, describimos la configuración y su aplicación para medir las fuerzas generadas por podosomes, estructuras de protrusión de la adherencia, formadas por los macrófagos para su migración mesenquimal en entornos tridimensionales10,11, 12,13,14,15,16,17. Creemos que esta técnica será avanzar en el entendimiento de la generación de fuerzas y su regulación en los procesos celulares que implican protrusión.
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Protocol
1. elaboración de rejillas de Formvar recubierto
- Limpiar rejillas de microscopia electrónica con acetona pura y seca sobre papel filtro. Luego limpiar el portaobjetos de un microscopio con etanol puro, limpie con un papel de lente y quite el polvo con un soplador.
- Colocar un portaobjetos de vidrio limpieza de etanol verticalmente en el embudo de un dispositivo de colada de película que contiene una solución de Formvar en la parte inferior. Cubrir la parte superior del embudo.
- Bomba de 100 mL de solución de Formvar (0.5% en dicloruro de etileno) con el bulbo atomizador hasta que alcanza las dos terceras partes de la diapositiva.
- Mantener la corredera en la solución durante 1 minuto.
- Abra la válvula del dispositivo para drenar la solución de Formvar en un flujo constante. Un caudal de 10 a 15 mL/s producirá una película de Formvar de 30-80 nm. El espesor de la película se determina por la concentración de la solución de Formvar y por la tasa de drenaje.
Nota: La tasa de drenaje puede controlarse por la presión a través de la válvula de salida de aire de ventilación abriendo lentamente la válvula. Más rápido el drenaje, cuanto más gruesa la película. En la práctica, porque es difícil predecir el espesor de la película de la tasa de flujo de Formvar, preparamos varios lotes de películas de Formvar y controlar su espesor por AFM (véase paso 2). - Retire el portaobjetos de la cámara y secar delicadamente en papel de filtro para eliminar cualquier líquido Formvar.
- Cortar un rectángulo de 20 x 50 mm de la película de Formvar con una cuchilla de afeitar.
- Llene un vaso de precipitados con agua destilada y sumergirse lentamente el portaobjetos verticalmente en el agua para flotar fuera de la película: la película debe flotar sobre la superficie del agua.
- Lugar seco acetona limpia las rejillas en la película, brillante hacia arriba.
- Coloque un cubreobjetos de vidrio redonda (Ø 12 mm) en algunas de las rejillas. Este cubreobjetos servirá para medir el espesor de la película (véase paso 2).
- Cubrir el portaobjetos de un microscopio con una pegatina blanca cambia el tamaño para colocarlo. Sumerja la diapositiva verticalmente en la frontera de la película de Formvar flotante hasta que toda la película se adhiera al portaobjetos. Quitar exceso de agua de lo portaobjetos con papel de filtro y dejar secar a temperatura ambiente durante la noche.
2. medición del espesor de la película
- Corte el Formvar alrededor el cubreobjetos con las pinzas para separar de la diapositiva.
- Marque la ubicación de la rejilla bajo el cubreobjetos con un lápiz.
- Corte el Formvar alrededor de la rejilla marcada para desprenderse del cubreobjetos. Por lo tanto habrá un agujero en la hoja restante de Formvar, que permitirá medir el espesor de la película. Cubrir el cubreobjetos con PBS y se coloca sobre un portaobjeto en el microscopio.
- Montar un voladizo de nitruro de silicio en el bloque de cristal AFM, asegurándose de que la raya de oro no está cubierta por la punta del muelle.
Nota: La sensibilidad y la constante elástica del voladizo deben haberse previamente calibrados en PBS. - Monte el bloque de vidrio en el módulo AFM y luego colocar el módulo en el microscopio.
- Colocar el cubreobjetos de Formvar recubierto en la cámara de observación y cubrirla con 500 μl de PBS.
- Explorar la frontera del agujero en la hoja de Formvar utilizando AFM en modo de contacto y un punto de ajuste de fuerza de 0.5 nN.
- Utilizar la superficie del cubreobjetos de vidrio como la referencia para la medición de la altura y evaluar el grosor de Formvar que la altura de la sección transversal (realizar al menos 10 mediciones por Formvar lote).
3. siembra de células en redes
- Bajo una campana de estéril, coloque una tira (12 mm x 3 mm) de cinta adhesiva de doble cara en un cubreobjetos.
- Corte una cuadrícula Formvar recubierto con pinzas y ponerlo boca abajo sobre la cinta adhesiva (sólo el borde de la red necesita ser atado a la cinta). La película de Formvar debe enfrentar el cubreobjetos.
- Poner este dispositivo en una cultura así.
- Coloque una gota de 10 μl de RPMI sin FCS que contiene 10 macrófagos4 distinguidos de monocitos humanos16.
Nota: Asegúrese de no tocar la red con la punta de la pipeta para evitar dañar el revestimiento de Formvar. - Incubar durante 30 min (37 ° C, 5% CO2) para dejar que las células se adhieren.
- Llenar el pozo con 2 mL de RPMI con 10% FCS.
- Incubar el dispositivo por 2 h a 37 ° C y 5% CO2 para dejar que las células se adhieren antes de observación AFM.
4. topografía mediciones de deformaciones inducidas por Podosome
- Pegar dos tiras de cinta adhesiva de doble cara en un fondo de cristal plato de Petri.
Nota: La distancia entre las dos tiras debe ser más pequeña que el diámetro de la rejilla. - Cuidadosamente separe la rejilla plateada con los macrófagos de la cinta adhesiva.
- Invierta la red para tener las células hacia el vidrio y la red entre las dos tiras de adhesivo se pega.
- Fijar la rejilla con dos nuevas tiras de adhesivo doble cara: la red así se se intercala entre dos tiras de adhesivo, dejando la zona central de la red de acceso a la punta AFM.
Nota: Asegúrese de que la red es bien fija y no doblada; de lo contrario el voladizo AFM no podrían acercarse a la superficie de Formvar. - Llene la caja Petri con 2 mL de medio de cultivo previamente calentadas 37 ° C (RPMI con 10% FCS) suplementado con 10 mM HEPES (pH 7.4).
- Coloque la placa de cultivo en un calentador de plato de 37 ° C.
- Instale el calentador de plato en el escenario de la AFM.
- Deje que el sistema se estabilice a 37 ° C.
- En modo de contacto con una fuerza de 0,5 nN, hacer una primera imagen global para localizar podosomes y después explorar la topografía de Formvar a 3 Hz con un pixel aproximadamente 20 nm-grande.
Nota: Evitar analizar cerca de los bordes de la rejilla.
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Representative Results
El protocolo de arriba describe cómo preparar la configuración experimental para cuantificar la fuerza saliente por macrófagos podosomes en un substrato de Formvar. Esto se consigue utilizando AFM y se ilustra en la figura 1.
Al analizar una imagen topográfica de protuberancias debajo de podosomes usando el software de procesamiento de datos JPK, un polinomio de tercer grado ajuste debe restarse de cada línea de exploración independiente. La altura máxima de golpes podosome-inducida puede ser evaluada mediante la adición de una escala de color de z en el lado de la imagen. Después de ser exportados en formato TIFF, la imagen topográfica más es analizada mediante un dedicado casero ImageJ macro disponible en línea8. Esta macro de bombeos se localiza en la imagen de la altura corregida y produce un mapa de la fuerza (figura 2) según dado parámetros: Formvar película grueso y podosome anillo radio. Además, la macro también produce un archivo de texto con las coordenadas, altura y valor de la fuerza computada para cada bulto detectado en la superficie de Formvar.
Este proceso también se aplica en el caso de adquisiciones de Time-lapse. La macro entonces las pistas cada bombeo desde el punto de tiempo medio hacia adelante y hacia atrás, solicitando la validación del usuario si se presenta alguna duda.
Figura 1 : Montaje experimental
Ilustración esquemática de la disposición experimental. Se siembran las células en una rejilla de microscopia electrónica revestida con una película de Formvar delgada y obediente y se coloca la rejilla, celdas hacia abajo, dentro de una caja de Petri. Al adherirse a un sustrato, macrófagos forman estructuras de adherencia muy dinámica de submicron llamadas podosomes. La topografía de la película de Formvar debajo de las células es entonces reflejada mediante AFM. Podosome aplicar fuerzas ortogonales al sustrato, que resultan en protuberancias en su superficie.
Figura 2 : Deformación del sustrato y las fuerzas ejercidas por podosomes
Topografía de la película de Formvar en el reverso de las células que muestran desviación (panel izquierdo) y altura (el panel central, los códigos de color para la altura). Los bombeos en la película corresponden a la deformación por podosomes individuales. La fuerza aplicada por cada podosome es evaluada por el modelo (panel de la derecha, cada punto corresponde a una podosome y valores de fuerza están codificados por colores). Barra de escala: 5 μm.
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Discussion
Propiedades de los materiales
La elección del material de la membrana deformable, en nuestro caso Formvar, debe cumplir con unos requisitos. El material debe ser transparente a la luz visible y exhiben fluorescencia auto limitada para permitir observaciones en campo brillante y microscopía de fluorescencia. La rugosidad de la capa fina debe estar muy por debajo de 10 nm para evitar efectos topográficos sobre la adhesión celular y para permitir la observación clara de las protuberancias celular inducida por proyección de imagen de AFM. Por último, la rigidez de la membrana, que depende de los jóvenes módulo y espesor del material, debe ser lo suficientemente alta para inducir la formación de podosomes manteniendo cierta deformabilidad observable para las típicas tensiones generadas en sitios de podosome que están alrededor de 10-100 kPa. Material de Formvar, preparado en películas delgadas de 30-80 nm es un buen compromiso entre todos estas limitaciones. Vale la pena notar que al adaptar el grosor de la membrana de Formvar, su rigidez puede ajustarse para estudiar las propiedades de mechanosensing de podosomes7.
Calidad de la preparación de Formvar y reproducibilidad
Algunos lotes de Formvar presentan pliegues en la red y por lo tanto son inutilizables: esto se puede ver previamente en imágenes de campo claro. En nuestra experiencia, tenemos varias rejillas para una condición porque a veces no es perfecto el montaje de la rejilla y la rejilla se mueve o se torció. El espesor de la película de Formvar debe adaptarse a la fuerza esperada. Cuanto más gruesa la película, la más rígida es, pero menos las deformaciones serán, dificultando la observación. Por el contrario, el deluente la película, el más frágil es y más difíciles de manipular no se despegan de lo.
Influencia de la fuerza aplicada por el voladizo sobre las mediciones de la topografía
Para obtener una medida de la deformación de la película sin afectar la actividad nanomecánicos de la podosome o deformación de la película con la sonda AFM, es crucial para las fuerzas de control aplicadas durante la proyección de imagen de AFM. De hecho, aplicar una fuerza excesiva durante la proyección de imagen puede llevar a una sobreestimación de la altura de la protuberancia y de la fuerza de protrusión. En otras palabras, hay que limitar esta fuerza muy por debajo de la fuerza de parada del sitio que sobresale. Se recomienda limitar las fuerzas aplicadas durante la proyección de imagen alrededor de a unos pocos cientos de pico newtons.
Modelo para la evaluación de la fuerza de protrusión
Para convertir las mediciones topográficas de AFM en valores de fuerza, es necesario definir las condiciones de límite y conocer la configuración espacial del uso de la fuerza. En el caso de podosomes, nos propone un modelo basado en el conocimiento actual de su organización molecular y verificado que este modelo proporciona perfiles de deformación constantes con observaciones topográficas8. Más precisamente, modelamos el denso núcleo de polimerizar en filamentos de actina vertical rodeados por un anillo de proteínas de adhesión como un módulo central empujando el sustrato y un módulo periférico tirando de él. Deformación del substrato de estos dos módulos actuando se determinó utilizando simulaciones de elementos finitos, conduce a una relación de fuerza de deformación. Gracias a este enfoque numérico, nos caracteriza la influencia de cada parámetro geométrico en la relación fuerza-deformación, mostrando ese anillo diámetro y sustrato grueso debían medirse precisamente. La relación entre la altura h de un abultamiento en el sustrato y la fuerza F aplicada por un podosome puede ser expresado como F = C0 E / (1-υ2) e3/r2 h, donde E = 2.1 GPa es módulo de Young de Formvar y υ = 0,3, su coeficiente de Poisson7, C0 es una constante igual a 2.7 y e y r denotan respectivamente la película grueso y podosome radio8. Para cada condición, se obtuvo el valor promedio de r de imágenes de fluorescencia de podosomes.
Aplicaciones de la microscopia de la fuerza de protrusión
Microscopia de la fuerza de protrusión fue utilizada provechosamente en macrófagos para probar la importancia de las proteínas específicas en la generación de fuerza podosome, demostrar el papel mecánico de podosome anillo18 y revelar correlaciones espacio-temporales de la fuerza generación entre vecinos cercanos dentro de la red de podosomes8.
Las células se han encontrado para sobresalir en su medio ambiente en varios procesos biológicos. Las células del tumor invasivo utilizan protrusivo estructuras llamadas invadopodios, que son esenciales para la degradación de matriz extracelular19. Los linfocitos han demostrado sobresalir en las células endoteliales durante su diapedesis transcelular a través del endotelio20. Algunos casos de interacción célula-célula también confían en que resaltan las estructuras celulares: este es el caso de reconocimiento del antígeno de células T en las células endoteliales21y para la iniciación de la fusión de la célula que conduce a osteoclastos multinucleados o a miotubos 22 , 23 , 24. por último, procesos de internalización como celulares de uso fagocitosis actinia-basado estructuras ese proyecto alrededor del blanco cuerpo de25. Estudiar las fuerzas generadas por que sobresalen estructuras sin duda ayudará a arrojar luz sobre los mecanismos en juego en estos procesos.
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Disclosures
No hay conflicto de interés declarado.
Acknowledgments
Los autores agradecemos a Anna Labernadie, Guillaume Charrière y Patrick Delobelle por su contribución inicial a esta obra y a Matthieu Sanchez y Françoise Viala por su ayuda con video filmación y edición. Este trabajo ha sido apoyado por la Agence Nationale de la Recherche (ANR14-CE11-0020-02), la Fondation pour la Recherche Médicale (FRM DEQ2016 0334894), INSERM Plan cáncer, Fundación Toulouse cáncer humano programa de ciencia de frontera (RGP0035/2016).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200 mesh nickel grids | Electron Microscopy Sciences | G200-Ni | |
| Filter paper | Sigma-Aldrich | 1001-055 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 10235612 | |
| White stickers 26 x 70 mm | Avery | DP033-100 | |
| Film casting device with valve in its outlet | Electron Microscopy Sciences | 71305-01 | |
| Razorblades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Ethanol | VWR | 1.08543.0250 | |
| Acetone | VWR | 20066.321 | |
| Formvar 0.5% solution in ethylene dichloride | Electron Microscopy Sciences | 15820 | |
| 12 mm coverslips | VWR | 631-0666 | |
| Inverted microscope | Carl Zeiss | Axiovert 200 | |
| Atomic Force Microscope | JPK Instruments | NanoWizard III | |
| Temperature-controlled sample holder | JPK Instruments | BioCell | |
| Silicon nitride cantilever with a nominal spring constant of 0.01 N/m | Veeco Instruments | MLCT-AUHW | |
| PBS | Gibco | 14190-094 | |
| Double-sided adhesive tape | APLI AGIPA | 118100 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 31870-025 | |
| FCS | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| 35 mm glass-bottom Petri dishes | WPI | FD35-100 |
References
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