Summary
Här, detalj vi de experimentella tekniker som används för att utvärdera de utstick krafter som podosomes tillämpas på en kompatibel film, från beredning av filmen till automatiserad analys av topografiska bilder.
Abstract
I många biologiska sammanhang behöver djurs celler fysiskt interagerar med sin omgivning genom att utveckla mekaniska krafter. Bland dessa dragkraft krafter har varit välkarakteriserad, men det finns en brist på tekniker som möjliggör mätning av de utskjutande delen krafter som utövas av celler ortogonalt till deras substrat. Vi utformade ett experiment att mäta de utstick krafter som utövas av vidhäftande celler på deras substrat. Celler pläterade på en kompatibel Formvar ark deformeras detta substrat och resulterande topografin är mappad av atomic force microscopy (AFM) i nanometer skala. Kraft värden extraheras sedan från en analys av deformation profilen baserat på geometri av de protrusive cellulära strukturerna. Därför kan de krafter som utövas av enskilda utskjutande enheter av en levande cell mätas över tiden. Denna teknik kommer att möjliggöra studiet av styrkebidrag och dess reglering i många cellulära processer som involverar utstick. Här, beskriver vi sin ansökan att mäta de protrusive styrkorna som genereras av podosomes bildas av mänskliga makrofager.
Introduction
Djurceller interagera fysiskt med matrisen och de andra cellerna som utgör deras miljö1. Detta krävs att migrera, internalisera organ, förvärva extern information eller skilja. I sådana processer, cellen måste generera mekaniska krafter och, som ett flertal studier har visat de senaste åren, förmågan hos en cell att generera styrkor och sond dess miljö påverkar dess biologiska beteende, till exempel styra spridning eller differentiering2,3. Mätningen av cellulära krafter är i sin tur ett större stöd för att studera regleringen av styrkebidrag och förstå dess implikation i cell beteende och vävnad öde4,5.
Senaste åren har bevittnat utvecklingen av många tekniker för att mäta de krafter som en cell kan utöva på dess miljö6. Majoriteten av dessa har varit avgörande i avslöjar dragkraften tvingar att celler utöva eftersom de dra på mobila sonder eller en deformerbar substrat. Men de mekaniska krafterna som är inblandade i utstick i extracellulära miljön lider brist på mätteknik och är hittills inte väl karakteriserade.
För att övervinna denna begränsning, presenterar vi en metod att mäta krafter som utövas ortogonalt till substratet. Den består i plätering levande celler på en tunn elastisk blad som kan deformera i ortogonal riktning, vilket gör det möjligt att mäta substrat deformation av celler och härleda krafterna som är inblandade. Substratet topografi mäts med nanoskala upplösning med atomic force microscopy och utvärderingen av styrkor från deformation bygger på kunskap om geometri av den protrusive cellulära strukturer7,8, 9.
Här, beskriver vi installationen och dess tillämpning på mäta de krafter som genereras av podosomes, protrusive vidhäftning strukturer bildas av makrofager för deras mesenkymala migrering i tredimensionella miljöer10,11, 12,13,14,15,16,17. Vi tror att denna teknik kommer förväg förståelsen av styrkebidrag och dess reglering i många cellulära processer som involverar utstick.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av Formvar-belagd nät
- Rengör elektronmikroskopi nät med ren aceton och torka dem på filterpapper. Rengör sedan ett objektglas med ren etanol, torka med en lins papper och ta bort damm med en fläkt.
- Placera en etanol-rengöras glasskiva vertikalt i tratten av en film gjutning anordning som innehåller en lösning av Formvar i den nedre delen. Täck toppen av tratten.
- Pumpa 100 mL Formvar lösning (0,5% i etylendiklorid) med glödlampa atomizer tills nivån når två tredjedelar av bilden.
- Hålla bilden i lösningen för 1 min.
- Öppna ventilen för att dränera Formvar lösningen i en jämn ström. En flödeshastighet av 10 till 15 mL/s kommer att ge en Formvar film på 30-80 nm. Tjockleken på filmen bestäms av koncentrationen av Formvar lösningen och andelen dränering.
Obs: Andelen dränering kan styras av avluftning den tryck via luften ut ventilen genom att sakta öppna ventilen. Desto snabbare dränering, desto tjockare filmen. I praktiken, eftersom det är svårt att förutsäga filmtjockleken från Formvar flödet klassar, vi förbereder flera partier av Formvar filmer och styra deras tjocklek av AFM (se steg 2). - Ta bort bilden från kammaren och torka den försiktigt på filterpapper att ta bort någon flytande Formvar.
- Klipp ut en 20 x 50 mm rektangel från Formvar filmen med ett rakblad.
- Fyll en bägare med rent destillerat vatten och sakta störta bilden vertikalt i vattnet att flyta bort filmen: filmen ska flyta på vattenytan.
- Plats torr aceton-rengöras knappsatser på filmen, glänsande uppåt.
- Placera en runda täckglas (Ø 12 mm) på några av rutnäten. Detta täckglas kommer att kunna mäta filmtjockleken (se steg 2).
- Täcka ett objektglas med en vit etikett storlek anpassas det. Doppa i bilden vertikalt på gränsa av flytande Formvar filmen tills hela filmen följer bilden. Avlägsna överskottsvatten från bilden med filterpapper och låt det torka i rumstemperatur över natten.
2. mätning av filmtjocklek
- Skär Formvar runt täckglaset med pincett för att lossa det från bilden.
- Markera platsen för rutnätet under täckglaset med en penna.
- Skär Formvar runt det markerade rutnätet för att lossa det från täckglaset. Det blir därför ett hål i återstående Formvar bladet, som gör det möjligt för att mäta filmtjockleken. Täcka täckglaset med PBS och placera den på en glasskiva på mikroskopet.
- Montera en silicon nitriden fribärande AFM glas block, att se gyllene strecket inte är täckt av spetsen på våren.
Anmärkning: Känsligheten och våren konstant av uthänget bör har tidigare kalibrerats i PBS. - Montera glas blocket på AFM modulen och placera sedan modulen på mikroskopet.
- Placera det Formvar-belagd täckglaset på observation kammaren och täck den med 500 µL av PBS.
- Skanna gränsa av hålet i bladet Formvar använder AFM i kontakt läge och en 0.5 nN kraft börvärdet.
- Använda täckglas glasytan som referens för höjdmätningar och utvärdera Formvar tjockleken som höjden av tvärsnitt (utföra minst 10 mätningar per Formvar batch).
3. sådd celler på rutnät
- Under sterila huva, sätta en remsa (12 x 3 mm) av dubbelsidig tejp på ett täckglas.
- Klipp ut ett Formvar-belagd rutnät med pincett och lägga den upp och ner på självhäftande remsa (endast kanten av rutnätet måste anslutas på band). Formvar filmen måste möta täckglaset.
- Sätta enheten i en kultur väl.
- Placera en 10 µL droplet av RPMI utan FCS som innehåller 104 makrofager åtskilt från humana monocyter16.
Obs: Kontrollera att rutnätet med pipettspetsen att förhindra skadliga Formvar beläggning. - Inkubera i 30 min (37 ° C, 5% CO2) för att låta celler följer.
- Fyll upp brunnen med 2 mL RPMI innehållande 10% FCS.
- Inkubera enheten för 2 h vid 37 ° C och 5% CO2 att låta celler följer innan AFM observation.
4. topografi mätningar av Podosome-inducerad deformationer
- Sticka två remsor av fördubblats dubbelsidig tejp på ett glas botten petriskål.
Obs: Avståndet mellan de två remsorna bör vara mindre än rutnät diameter. - Försiktigt loss rutnätet pläterad med makrofager från tejpen.
- Vrida rutnätet uppochned för att ha cellerna mot glaset och sticka rutnätet mellan de två självhäftande remsorna.
- Fix rutnätet med två nya remsor av fördubblats dubbelsidig självhäftande: rutnätet kommer således vara inklämt mellan två självhäftande remsor, lämnar den centrala delen av rutnätet tillgänglig för AFM spetsen.
Obs: Kontrollera att rutnätet är väl fast och inte vridna; AFM uthänget kan annars inte kunna närma Formvar ytan. - Fyll petriskål med 2 mL odlingsmedium för förvärmda 37 ° C (RPMI med 10% FCS) kompletteras med 10 mM HEPES (pH 7,4).
- Placera skålen kultur på en 37 ° C maträtt värmare.
- Installera maträtt värmaren på AFM scenen.
- Låt systemet stabiliseras vid 37 ° C.
- I kontakt läge med en 0,5 nN kraft, göra en första global bild att hitta podosomes och skanna sedan Formvar topografin vid 3 Hz med en ca 20 nm-stora pixel.
Obs: Undvik skanning nära kanterna på rutnätet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollet ovan beskriver hur du förbereder den experimentella setup att kvantifiera utstick krafter som tillämpas av makrofag podosomes på ett Formvar substrat. Detta uppnås med hjälp av AFM och illustreras i figur 1.
När man analyserar en topografisk bild av utbuktningar under podosomes med hjälp av JPK databehandling programvara, bör en tredje gradens polynom passa dras från varje scan självständigt. Den maximala höjden på podosome-inducerad gupp kan bedömas genom att lägga till en z färgskala på sidan av bilden. Efter att ha förts i TIFF-format, analyseras topografiska bilden ytterligare med en dedikerad hemgjorda ImageJ makro tillgängligt online8. Detta makro lokaliserar utbuktningar på korrigerade höjd bilden och ger en kraft karta (figur 2) enlighet med parametrar: Formvar film tjocklek och podosome ring radie. Dessutom ger makrot också en textfil med koordinater, höjd och beräknade kraft värde för varje upptäckta utbuktning på Formvar ytan.
Denna process gäller också time-lapse förvärv. Makrot spår sedan varje utbuktning från den mellersta tidpunkten och framåt och bakåt, begär användaren validering om tvivel uppstår.
Figur 1 : Experimentell setup
Schematisk illustration av den experimentella setup. Celler är seedade på en elektronmikroskopi rutnät belagda med en tunn, kompatibla Formvar film och rutnätet är placerad, celler nedåt, inuti en petriskål. När ansluter sig till ett substrat, bildar makrofager submicron högdynamiska vidhäftning strukturer som kallas podosomes. Topografin av Formvar filmen under cellerna är sedan avbildas med hjälp av AFM. Podosome gäller styrkor ortogonala substratet, vilket resultera i utbuktningar på dess yta.
Figur 2 : Substrat deformation och krafter som utövas av podosomes
Topografi av Formvar filmen på baksidan av cellerna visar nedböjning (till vänster) och höjd (mellersta panelen, färgkoder för höjd). De utbuktningar som observerats på filmen motsvarar deformation av enskilda podosomes. Den kraft som varje podosome utvärderas av modellen (rätt panel, varje plats motsvarar till en podosome och kraft värden är färgkodade). Skalstapeln: 5 µm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Materialets egenskaper
Valet av material för det deformerbara membranet, i vårt fall Formvar, behöver uppfylla några krav. Materialet måste vara transparent för synligt ljus och uppvisar begränsad auto fluorescens för att tillåta observationer i ljusa fält och fluorescensmikroskopi. Ojämnheter på tunna filmen måste vara väl under 10 nm att undvika topografiska effekter på celladhesion och tillåta tydlig observation av utskjutande delar cell-inducerad av AFM imaging. Slutligen, styvheten i membranet, vilket beror på Youngs modulus och tjockleken på materialet, måste vara tillräckligt hög för att inducera bildandet av podosomes samtidigt hålla några observerbara deformability för de typiska påfrestningar som genereras på podosome platser som är runt 10-100 kPa. Formvar material, som beretts i tunna filmer på 30-80 nm är en bra kompromiss mellan alla dessa begränsningar. Det är värt att notera att genom att trimma tjockleken på Formvar membranet, dess styvhet kan justeras för att studera mechanosensing egenskaperna för podosomes7.
Reproducerbarhet och kvaliteten på Formvar förberedelser
Vissa partier av Formvar presentera veck på nätet och är därför oanvändbara: Detta kan ses i förväg på ljusa fält bilder. Vår erfarenhet, vi behöver flera rutnät för ett villkor eftersom ibland montering av rutnätet är inte perfekt och rutnätet flyttar eller blir vridna. Tjockleken på Formvar filmen behöver anpassas till den beräknade styrkan. Ju tjockare filmen, den styvare är det, men ju lägre deformationer kommer vara, försvårar observation. Omvänt, ju tunnare filmen, den mer ömtålig det är och svårare att manipulera utan att riva den.
Påverkan av den kraft som av uthänget på topografi mätningar
För att få en mätning av filmen deformation utan att antingen påverka aktiviteten nanomechanical av podosome eller deformeras filmen med AFM sond, är det viktigt att kontroll styrkor tillämpas under AFM imaging. Faktiskt kan tillämpa överdriven kraft under imaging leda till en överskattning av utstick höjd och därmed av utstick kraft. Med andra ord, finns det ett behov av att begränsa denna kraft långt under stall kraft utskjutande platsen. Vi rekommenderar att begränsa de tillämpa styrkorna under imaging runt till några hundratals pico-Newton.
Modell för utstick kraft utvärdering
För att konvertera AFM topografiska mätningar i kraft värden, är det nödvändigt att fastställa den gräns villkoren och känna den rumsliga konfigurationen av kraft program. När det gäller podosomes föreslog vi en modell baserat på nuvarande kunskap om dess molekylära organisation och verifierade att denna modell som deformation profiler konsekvent med topografiska observationer8. Mer exakt, modellerad vi tät kärna polymeriserande vertikala aktin filament omgiven av en ring av vidhäftning proteiner som en central modul Driver substratet och en perifer modul att dra på den. Substratet deformation av dessa två moduler agerar bestämdes med hjälp av finita element simulering, leder till en kraft-deformation relation. Tack vare detta numeriska tillvägagångssätt kännetecknas vi av varje geometriska parameter påverkar kraft-deformation förhållandet, visar att ring diameter och substrat tjocklek som krävs för att mätas exakt. Sambandet mellan höjden h i en utbuktning i substratet och kraft F tillämpas av en podosome kan uttryckas som F = C0 E / (1-υ2) e3/r2 h, där E = 2.1 GPa är de Youngs modulus av Formvar och υ = 0,3 dess Poisson baserat på7, C0 är en konstant motsvarar 2,7 och e och r respektive beteckna film tjocklek och podosome radie8. För varje villkor erhölls det genomsnittliga värdet på r från fluorescens bilder av podosomes.
Tillämpningar av utstick Force Microscopy
Utstick force microscopy användes lönsamt i makrofager att testa vikten av specifika proteiner på podosome styrkebidrag, demonstrera mekaniska rollen av podosome ring18 och avslöja plats och tid korrelationer av kraft generation mellan nära grannar inom nätverket för podosomes8.
Celler har befunnits sticker ut i deras miljö i flera biologiska processer. Invasiv tumörceller använder protrusive strukturer som kallas invadopodia, som är väsentliga för extracellulärmatrix nedbrytning19. Lymfocyter har visat sig sticker ut i endotelceller under deras transcellular diapedesis genom endotelet20. Vissa fall cell-cell interaktioner även åberopa cellular utskjutande strukturer: Detta är fallet för antigen erkännande av T-celler på endotelceller21och för inledandet av Cellfusion som leder till Multinucleära osteoklaster eller myotubes 22 , 23 , 24. Slutligen internalisering processer såsom fagocytos användning cellular aktin-baserade strukturer projektet runt målet kropp25. Studera de krafter som alstras utskjutande strukturer kommer säkerligen att hjälpa till att belysa mekanismerna spelar i dessa processer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter förklarade.
Acknowledgments
Författarna är tacksamma till Anna Labernadie, Guillaume Charrière och Patrick Delobelle för deras första bidrag till detta arbete och Matthieu Sanchez och Françoise Viala för hjälp med video filmning och redigering. Detta arbete har stötts av l'Agence Nationale de la Recherche (ANR14-CE11-0020-02), la Fondation pour la Recherche Médicale (FRM DEQ2016 0334894), INSERM planera Cancer, Fondation Toulouse Cancer och Human Frontier Science Program (RGP0035/2016).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 200 mesh nickel grids | Electron Microscopy Sciences | G200-Ni | |
| Filter paper | Sigma-Aldrich | 1001-055 | |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 10235612 | |
| White stickers 26 x 70 mm | Avery | DP033-100 | |
| Film casting device with valve in its outlet | Electron Microscopy Sciences | 71305-01 | |
| Razorblades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Ethanol | VWR | 1.08543.0250 | |
| Acetone | VWR | 20066.321 | |
| Formvar 0.5% solution in ethylene dichloride | Electron Microscopy Sciences | 15820 | |
| 12 mm coverslips | VWR | 631-0666 | |
| Inverted microscope | Carl Zeiss | Axiovert 200 | |
| Atomic Force Microscope | JPK Instruments | NanoWizard III | |
| Temperature-controlled sample holder | JPK Instruments | BioCell | |
| Silicon nitride cantilever with a nominal spring constant of 0.01 N/m | Veeco Instruments | MLCT-AUHW | |
| PBS | Gibco | 14190-094 | |
| Double-sided adhesive tape | APLI AGIPA | 118100 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 31870-025 | |
| FCS | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| 35 mm glass-bottom Petri dishes | WPI | FD35-100 |
References
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
- Paszek, M. J., et al. Tensional Homeostasis and the Malignant Phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Gilbert, P. M., Weaver, V. M. Cellular Adaptation to Biomechanical Stress across Length Scales in Tissue Homeostasis and Disease. Seminars in Cell & Developmental Biology. 67, 141-152 (2017).
- Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical Forces Direct Stem Cell Behaviour in Development and Regeneration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2017).
- Roca-Cusachs, P., Conte, V., Trepat, X. Quantifying Forces in Cell Biology. Nature Cell Biology. 19, 742-751 (2017).
- Labernadie, A., et al. Protrusion Force Microscopy Reveals Oscillatory Force Generation and Mechanosensing Activity of Human Macrophage Podosomes. Nature Communications. 5, 5343 (2014).
- Proag, A., et al. Working Together: Spatial Synchrony in the Force and Actin Dynamics of Podosome First Neighbors. ACS Nano. 9, 3800-3813 (2015).
- Proag, A., Bouissou, A., Vieu, C., Maridonneau-Parini, I., Poincloux, R. Evaluation of the Force and Spatial Dynamics of Macrophage Podosomes by Multi-Particle Tracking. Methods. 94, 75-84 (2016).
- Cougoule, C., et al. Three-Dimensional Migration of Macrophages Requires Hck for Podosome Organization and Extracellular Matrix Proteolysis. Blood. 115, 1444-1452 (2010).
- Cougoule, C., et al. Blood Leukocytes and Macrophages of Various Phenotypes Have Distinct Abilities to Form Podosomes and to Migrate in 3d Environments. European Journal of Cell Biology. 91, 938-949 (2012).
- Guiet, R., et al. Macrophage Mesenchymal Migration Requires Podosome Stabilization by Filamin A. Journal of Biological Chemistry. 287, 13051-13062 (2012).
- Maridonneau-Parini, I. Control of Macrophage 3d Migration: A Therapeutic Challenge to Limit Tissue Infiltration. Immunology Review. 262, 216-231 (2014).
- Park, H., et al. Tyrosine Phosphorylation of Wiskott-Aldrich Syndrome Protein (Wasp) by Hck Regulates Macrophage Function. Journal of Biological Chemistry. 289, 7897-7906 (2014).
- Van Goethem, E., et al. Macrophage Podosomes Go 3d. European Journal of Cell Biology. 90, 224-236 (2011).
- Van Goethem, E., Poincloux, R., Gauffre, F., Maridonneau-Parini, I., Le Cabec, V. Matrix Architecture Dictates Three-Dimensional Migration Modes of Human Macrophages: Differential Involvement of Proteases and Podosome-Like Structures. Journal of Immunology. 184, 1049-1061 (2010).
- Verollet, C., et al. Hiv-1 Reprograms the Migration of Macrophages. Blood. 125, 1611-1622 (2015).
- Bouissou, A., et al. Podosome Force Generation Machinery: A Local Balance between Protrusion at the Core and Traction at the Ring. ACS Nano. 11, 4028-4040 (2017).
- Lizarraga, F., et al. Diaphanous-Related Formins Are Required for Invadopodia Formation and Invasion of Breast Tumor Cells. Cancer Research. 69, 2792-2800 (2009).
- Carman, C. V., et al. Transcellular Diapedesis Is Initiated by Invasive Podosomes. Immunity. 26, 784-797 (2007).
- Sage, P. T., et al. Antigen Recognition Is Facilitated by Invadosome-Like Protrusions Formed by Memory/Effector T Cells. Journal of Immunology. 188, 3686-3699 (2012).
- Sens, K. L., et al. An Invasive Podosome-Like Structure Promotes Fusion Pore Formation During Myoblast Fusion. Journal of Cell Biology. 191, 1013-1027 (2010).
- Takito, J., et al. The Transient Appearance of Zipper-Like Actin Superstructures During the Fusion of Osteoclasts. Journal of Cell Science. 125, 662-672 (2012).
- Shilagardi, K., et al. Actin-Propelled Invasive Membrane Protrusions Promote Fusogenic Protein Engagement During Cell-Cell Fusion. Science. 340, 359-363 (2013).
- Freeman, S. A., et al. Integrins Form an Expanding Diffusional Barrier That Coordinates Phagocytosis. Cell. 164, 128-140 (2016).
