Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

التنمية وتوصيف وظيفي للخلايا الجذعية مورين توليروجينيك

Published: May 18, 2018 doi: 10.3791/57637
Automatic Translation
1, 2,3, 2,3
1Department of Biochemistry, School of Medicine, Case Western Reserve University, 2Department of Pediatrics, Division of Pediatric Hematology/Oncology, Case Western Reserve University, 3Angie Fowler Cancer Institute, Rainbow Babies & Children's Hospital, University Hospitals, Cleveland

Summary

نقدم هنا، وضع بروتوكول لتطوير وتميز الخلايا الجذعية توليروجينيك (تولدكس) وتقييم فائدتها إيمونوثيرابيوتيك.

Abstract

يعمل الجهاز المناعي بالحفاظ على توازن محكم بين تنسيق الاستجابات ضد المستضدات الأجنبية والحفاظ على دولة لا تستجيب ضد المستضدات الذاتية فضلا عن المستضدات المستمدة من الكائنات الحية commensal. يمكن أن يؤدي الإخلال بهذا التوازن المناعي لالتهاب مزمن وتنمية المناعة الذاتية. الخلايا الجذعية (DCs) هي خلايا نظام المناعة الفطرية المشتركة في تنشيط الخلايا السذاجة T الشروع في الاستجابات المناعية ضد المستضدات الأجنبية عرض مستضد المهنية. ومع ذلك، وحدات تحكم المجال Dc يمكن أن تكون متباينة أيضا في تولدكس التي تعمل على الحفاظ على وتعزيز التسامح خلية تي وأن قمع خلايا المستجيب المساهمة في تطوير الأوضاع الذاتية أو المزمن التهاب أما. النهوض الأخيرة في فهمنا تولدكس يوحي بأنه يمكن تحقيق التسامح DC بتحوير ظروف التمايز. أدت هذه الظاهرة إلى النمو الهائل في تطوير علاجات تولدك للاضطرابات المناعية عديدة تسبب الواجبة لكسر في منأى عن التسامح. كذلك أقرت الدراسات الناجحة في نماذج مورين المناعة الذاتية الإكلينيكية الأداة إيمونوثيرابيوتيك من تولدكس في علاج اضطرابات المناعة الذاتية. اليوم، أصبحت تولدكس أداة إيمونوثيرابيوتيك واعدة في العيادة لإعادة المفصولين التسامح المناعي في الاضطرابات المناعية المختلفة باستهداف الاستجابات الذاتية المسببة للمرض بينما ترك حصانة وقائية سليمة. على الرغم من أن مجموعة من الاستراتيجيات اقترحه مختبرات متعددة للحث على تولدكس، لا يوجد اتساق في وصف النمط الظاهري الخلوية والوظيفية لهذه الخلايا. هذا البروتوكول يوفر دليل خطوة بخطوة لتطوير وحدات تحكم المجال Dc المشتقة من نخاع العظام بإعداد كبيرة، أسلوب فريد يستخدم للتفريق بينهم في تولدكس مع triterpenoid اصطناعية 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic حمض-ديفلورو-بروبيل-أميد (كدو-مديرة)، والتقنيات المستخدمة لتأكيد على النمط الظاهري، بما في ذلك تحليلات للتوقيعات الجزيئية الأساسية من تولدكس. وأخيراً، نحن إظهار أسلوب تقييم الدالة تولدك باختبار تلك الاستجابة المثبطة للمناعة في المختبر و في فيفو في نموذج السريرية للتصلب المتعدد.

Introduction

الخلايا الجذعية (DCs) هي جزء لا يتجزأ من نظام المناعة الفطرية وأول مرة اكتشفت وتميزت رالف ستينمان وزانفيل كوهن في عام 1973 كما عرض مستضد المهنية الأولية الخلايا1. وحدات تحكم المجال Dc قد ثبت أن تلعب دوراً مهما في تنشيط محصنة بتقديم المستضدات المجهزة للخلايا T والخلايا ب عن طريق المجمعات الكبرى histocompatibility (MHC) في الأجهزة اللمفاوية الثانوية لربط نظم المناعة الفطرية وتكيفية2. في الثدييات المناعي، هناك فئتين على الأقل من وحدات تحكم المجال Dc التي وصفت بأنها النقوي وحدات تحكم المجال Dc وبلاسماسيتويد DCs (pDCs)3. وحدات تحكم المجال Dc النقوي، أيضا يعرف باسم Dc التقليدية (المؤلفان)، تتميز بالتعبير عن CD11c ويمكن أن تكون متباينة DCs (البلدان الجزرية النامية) غير ناضجة في المختبر من خلايا السلف نخاع العظام أو الدم المحيطي وحيدات باستخدام عامل المحببات-بلعم-مستعمرة-حفز (GM-CSF)، وايل-4 في الأنواع موريني أو البشرية، على التوالي4.

تفعيل 'خطر' إشارات، مثل أنماط الجزيئية المرتبطة بالعوامل الممرضة (بمب) أو أنماط الجزيئية المرتبطة بالضرر (الرطوبة)، سوف تدفع البلدان الجزرية النامية النضج تجاه DCs مكسبه ناضجة DCs (مدكس) عبر ملزم مستقبلات الاعتراف بنمط مختلف سطح DC5. DCs مكسبه كذلك رئيس الوزراء تكاثر الخلايا T ساذجة والتمايز من خلال أوبريجوليشن مهسيي2، يغاندس كوستيمولاتوري (CD80 و CD86 و CD40)6، السيتوكينات، وسائر الوسطاء للذوبان7. سلسلة من الوسطاء المحترفين التهابات الإنتاج من "وحدات تحكم المجال Dc مكسبه" ضروري للتمايز سيتوكين بوساطة الخلايا T. على سبيل المثال، IFN-γ وايل-12 ضرورية ل التمايز Th18 و IL-1، إيل-6، وايل-23 حاسمة بالنسبة للسذاجة خلية T الاستقطاب نحو خلايا Th179. رغم DCs ناضجة الرد على المستضدات الأجنبية، غير المنضبط DC التنشيط بواسطة المستضدات الذاتية قد تسبب التذرية التسامح وتعزيز التنمية لأمراض المناعة الذاتية عن طريق توليد خلايا أوتوريكتيفي تي التنشيط الذي يؤدي إلى تدمير الأنسجة10 .

وقدمت التقارير الأخيرة دليل واضح على اللدونة DC، يتجلى في قدرتها على التفاعل مع إشارات مختلفة داخل بهم المكروية الأنسجة والتفريق إلى مجموعات فرعية متميزة المستجيب/القامع DC. الوسطاء للالتهابات، مثل TGF-β12، إيل-1011و 1 هو13 تبين أن تلعب دوراً مهما في قمع المناعة بحمل توليروجينيك DCs (تولدكس). هذه تولدكس الحصول على المهام التنظيمية وقمع انتشار الخلايا T14. وعلاوة على ذلك، انعدام التحفيز المشارك بوحدات تحكم المجال Dc وإنتاج الوسطاء للالتهابات من تولدكس سواء المساهمة في تنظيم دورات تعريفية للخلايا التائية التنظيمية (تريجس) وأيضا فعالة تحول دون Th1 و Th17 التمايز وتوسيع15. في الماضي عقدين، إمكانات علاجية تولدكس أبلغت العديد من المحققين. في هذه الدراسات، ولدت تولدكس ليس فقط تحسن الأعراض المرضية في مختلف النماذج السريرية لأمراض المناعة الذاتية16 إدارة السابقين فيفو ، لكنه أدى أيضا إلى تنمية التسامح المناعي في المرضى الذين17 ،18. من المثير للاهتمام، اليوم، العلاج تولدكس نظرت كنهج بديل أو مرافقة لأمراض المناعة الذاتية في العديد من التجارب السريرية، بما في ذلك نوع 1 مرض البول السكري19،20التهاب المفاصل، 21، التصلب المتعدد (MS)22،،من2324، و مرض كرون25.

وهناك مجموعة متنوعة من البروتوكولات التي استخدمت لوضع تولدكس وأفادت مختبرات عدة أساليب لتوليد وتوصيف المظهرية من تولدكس. يمكن استخدام هذه الأساليب لتكاثر توليد تولدكس في المختبر من فروعه المكونة للدم والحفاظ على ستابلي لهم في توليروجينيك دولة في فيفو26،،من2728،29. البلدان الجزرية النامية يمكن تحويلها إلى تولدكس بالتعرض لمختلف العوامل الدوائية immunomodulatory أو السيتوكينات المضادة للالتهابات. على سبيل المثال، فيتامين D3 عامل دوائية معروفة المعروفة لزيادة إنتاج إيل-10 وقمع إفراز إيل-12 من وحدات تحكم المجال Dc ومما يعزز هذه الدالة كآبته30. وعلاوة على ذلك، عندما يتعرض DCs للمنبهات تحريضية قوية، مثل ليبوبوليساكتشاريديس (LPS)، عدة وكلاء الدوائية مثل الديكساميتازون31و32من ربمسن القشرية33 قد ثبت للحث النمط الظاهري تولدك بتخفيض DC التعبير السطحي CD40، CD80، CD86، ومهسيي34. إيل-10 و TGF-β، أظهرت السيتوكينات المضادة للالتهابات التي درست معظم للحث على التسامح العاصمة35 والتعرض ملازم لكل من هذه السيتوكينات للحث النمط الظاهري توليروجينيك في وحدات تحكم المجال Dc36.

منذ توليروجينيك DC تتحدد بالخصائص الوظيفية بدلاً من قبل علامات المظهرية، هناك كبيرة تحتاج إلى تطوير طريقة متسقة لتوصيف تولدكس الخلوية والوظيفية. وعلاوة على ذلك، يجب إنشاء بروتوكول دقيق ومتسق للتقييم متسقة ووصف النمط الظاهري توليروجينيك العاصمة إذا ما أردنا مقارنة فعالية وتكاثر عوامل جديدة قادرة على حمل النمط الظاهري تولدك في مختبر. هنا نقدم بروتوكول مفصلة خطوة بخطوة طرق لعزل البلدان الجزرية النامية من فروعه المكونة للدم في الفئران وبعد ذلك تحليل فعالية عوامل جديدة قيد التقييم لقدرتها على تحويل البلدان الجزرية النامية في تولدكس، توفير قوي توصيف وظيفي والمظهرية تولدكس في المختبر و في فيفوعلى حد سواء. ويشمل هذا الوصف أسلوب وضع وصف تولدكس يغاندس السطحية وسيتوكين الشخصية، ووظائف كآبته في المختبر. كما نقدم مثالاً على طريقة لاستكشاف إمكانية تطبيق العلاج من هذه تولدكس في نموذج ما قبل سريرية لمرض التصلب العصبي المتعدد، النخاع الذاتية التجريبية (ع). هذا البروتوكول المتبعة سوف يساعد المحققين لتقييم قدرة عوامل جديدة النهوض بتحريض تولدكس وسيتم تيسير الجهود الرامية إلى توسيع نطاق التنمية العلاجية تولدك.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وأجريت جميع الدراسات وفقا للإجراءات التي أقرتها القضية Western Reserve كلية الطب بجامعة لرعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة.

1. إعداد الخلايا الجذعية المشتقة من نخاع العظم (بمدكس)

  1. تعقيم كل الأدوات الجراحية عن طريق التعقيم وإجراء التجربة في فئة السلامة البيولوجية الثاني مجلس الوزراء مع إجراءات السلامة المعتمدة.
  2. Euthanize الفئران C57BL/6 8-10 أسابيع عمر باستخدام الدائرة2 CO. ضع الماوس على متنها تشريح وشطف مع الإيثانول 70%. المكوس عظام الشظية الساق والفخذ باستخدام مقص جراحي ووضعها مع الإيثانول 70% في صحن ثقافة 10 سم.
  3. استخدام شفرات الجراحية وملقط تشريح الأنسجة بعيداً قدر الإمكان على غطاء 10 سم الثقافة الطبق وعزل تيبياس وقصبة وضعها مع الإيثانول 70% في صحن ثقافة 6 سم.
  4. استخدام شفرات الجراحية لتقليم كلا طرفي تيبياس وقصبة. استخدام 3 مل برنامج تلفزيوني في محقن 3 مللي بإبرة ز 23 لمسح محتويات نخاع من واحدة من نهاية العظام إلى أنبوب مخروطي الشكل يحتوي على 12 مل برنامج تلفزيوني. كرر هذه الخطوة 3 x لكل طرف من أطراف العظام.
  5. الطرد المركزي بتعليق خلية في 300 غرام x لمدة 5 دقائق.
  6. إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه الخلية مع ACK 1 مل ليسينج المخزن المؤقت لمدة 5 دقائق لإزالة خلايا الدم الحمراء.
  7. إضافة 9 مل برنامج تلفزيوني تمييع ACK ليسينج المخزن المؤقت والطرد المركزي في 300 x ز لمدة 5 دقائق.
  8. إزالة المادة طافية وريسوسبيند مع 10 مل الثقافة المتوسطة (RPMI 1640 بالإضافة إلى الجلوتامين ل 10% FBS، 1% من الأحماض الأمينية غير الأساسية (100 x)، 10 ملم حبيس، 50 نانومتر β-ميركابتوثانول والبنسلين/ستربتوميسين 5%).
    ملاحظة: مستوى الذيفان يجب أن تكون أقل من 0.1 مليلتر الاتحاد الأوروبي في FBS.
  9. يمر بتعليق خلية مصفاة خلية 40 ميكرومتر واتخاذ 20 ميليلتر من تعليق خلية وتخلط مع 80 ميليلتر من تريبان الأزرق لعد عدد الخلايا الحية باستخدام سيتوميتير.
  10. ضبط عدد الخلايا إلى 1 × 106 خلايا/مل مع 15 نانوغرام/مليلتر GM-CSF و 10 نانوغرام/مل إيل-4.
  11. لوحة 3 مل من 1 × 106 خلايا/مل في كل من لوحة 6-جيدا جيدا واحتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 5% CO2و 95% نسبة الرطوبة في الحاضنة2 CO.
    ملاحظة: خلايا النخاع العظمى من الماوس واحد حوالي 3-5 × 107 الخلايا، مما يشير إلى أنها يمكن أن توضع من 2 إلى 3 6-جيدا لوحات.
  12. في يوم 3، إزالة جميع المتوسطة الثقافة 3 مل من كل بئر، إضافة 2 مل برنامج تلفزيوني جديد في كل بئر، ومن ثم بلطف دوامة لوحة لضمان إزالة كافة الخلايا غير ملتصقة.
  13. استبدال 3 مل الطازجة الثقافة المتوسطة مع 15 نانوغرام/مليلتر GM-CSF و 10 نانوغرام/مل إيل-4 في كل بئر. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 5% CO2و 95% نسبة الرطوبة في الحاضنة2 CO.
  14. في يوم 5، مباشرة إضافة آخر 3 مل الطازجة المتوسطة الثقافة مع 15 نانوغرام/مليلتر GM-CSF و 10 نانوغرام/مل إيل-4 في كل بئر. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 5% CO2، 95% نسبة الرطوبة في الحاضنة2 CO.
    ملاحظة: الحجم الإجمالي في كل بئر الآن 6 مل.
  15. في يوم 7، وضعت لوحة كاملة على الجليد لمدة 10 دقائق. بلطف "الماصة؛" المتوسطة الثقافة في كل بئر لإزاحة شكل فضفاض-تمسكا بمدكس كالبلدان الجزرية النامية في التعليق.
    ملاحظة: لا يزال يتم إرفاق الضامة ملتصقة باللوحة. درجة الحرارة منخفضة والإجراءات بلطف هي المفتاح لتجنب التنشيط DC للتأثير على مزيد من التجارب.
  16. الطرد المركزي من تعليق خلية في 300 غرام x لمدة 5 دقائق وريسوسبيند مع المتوسطة ثقافة جديدة لإجراء مزيد من التجارب.
    ملاحظة: يمكن تحديد بمدكس بجسم CD11c fluorescence المسمى بالتدفق الخلوي واظهرنا استراتيجيتنا النابضة من بمدكس لتجارب أخرى في الشكل 1.

2-تميز تولدك الجينات والبروتين الشخصية

  1. لوحة 2 مل من 1 × 106 بمدكس/مل كل بئر في البئر 6-لوحة مع الثقافة المتوسطة في وجود أو عدم وجود 100-400 نانومتر كدو-مديرة لحضانة ح 1 في 37 درجة مئوية و 5% CO2 و 95% نسبة الرطوبة في الحاضنة2 CO.
    ملاحظة: كدو-مديرة، تريتيربينويد اصطناعية، عامل نووية (المستمدة من محمر 2)-مثل-2 (Nrf2) عامل محفز ومثبط النووية عامل-κB (NF-κB). تطبيق العوامل الأخرى لتحريض تولدكس من البلدان الجزرية النامية، مثل إيل-10، وفيتامين D3، الديكساميتازون أو خليج 11-7085، وتعديل هذه الخطوة بشرط أمثل لكل عامل.
  2. إضافة 10 أو 100 نانوغرام/مليلتر من لبس تفرخ 4-24 ساعة للحث على مدكس (وقت الحضانة مختلفة بسبب القياس مرناً أو البروتين).
  3. بلطف "الماصة؛" المتوسطة الثقافة في كل بئر والحصاد تعليق خلية باستخدام ماصة 1 مل. الطرد المركزي في 300 غرام x لمدة 5 دقائق لجمع الخلايا والمادة طافية، على التوالي.
  4. تحليل يغاندس السطحية من الكريات الخلية بالتدفق الخلوي، مثل يغاندس تنشيطية: CD40، CD80، CD86، MHC-ثانيا، OX40L، إيكوسل، أو يغاندس المثبطة: PD-L1، PD L2، ILT3، ILT4.
  5. عزل الحمض النووي الريبي من الكريات الخلية وتحليل الحمض النووي الريبي وعينات طافية على المستويات الشخصية والجينات والبروتين سيتوكين الكمي PCR الوقت الحقيقي (قرة-PCR) وإليزا، على التوالي.
    ملاحظة: على سبيل المثال، السيتوكينات الالتهابية: السيتوكينات تنف-α، IFNγ، EDN-1، وايل-6، وايل-12، وايل-23، أو المضادة للالتهابات: إيل-4، وايل-10، إيل-15، TGF-β1، وهو 1.

3-تقييم وظيفة تولدكس في المختبر و في فيفو

  1. تي خلية انتشار سينجينيك الإنزيم
    1. تعقيم كل الأدوات الجراحية عن طريق التعقيم وإجراء التجربة في فئة السلامة البيولوجية الثاني مجلس الوزراء مع إجراءات السلامة المعتمدة.
    2. إعداد أجهزة ماكينتوش المخزن المؤقت باستخدام 0.5% ألبومين المصل البقري (BSA) و 2 مم يدتا في 500 مل برنامج تلفزيوني. تعقيم المخزن المؤقت عن طريق التصفية عن طريق فلتر 0.2 ميكرون.
      ملاحظة: الاحتفاظ المخزن المؤقت على الجليد خلال التجربة التالية.
    3. للحصول على خلايا CD4+ تي euthanize الخلايا، OT-تي الثاني خلية الفئران المعدلة وراثيا مستقبلات (تكر) 8-10 أسابيع عمر باستخدام الدائرة2 CO. ضع الماوس على متنها تشريح وشطف مع الإيثانول 70%. عزل الطحال من الجانب الأيسر للبطن باستخدام المقص الجراحي والملقط.
    4. وضع الطحال مع 2 مل برنامج تلفزيوني في صحن ثقافة 6 سم واستخدام الجزء الخلفي من دفع عصا محقن 3 مللي فرم الطحال بتمرير مصفاة خلية 40 ميكرومتر.
    5. جمع في تعليق خلية وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 5 دقائق.
    6. ريسوسبيند بيليه الخلية في ميكروليتر 400 من المخزن المؤقت لأجهزة ماكينتوش.
    7. إضافة 100 ميكروليتر من خلايا CD4+ "كوكتيل" البيوتين-جسم الخلية T عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: ربط جسم كوكتيل في أنواع الخلايا الأخرى ما عدا خلايا CD4 خلايا+ T، مثل CD8a، CD11b، CD11c، CD19، CD25، CD45R (B220)، CD49b (DX5)، CD105، MHC مكافحة الدرجة الثانية، مكررا ثانيا-119، و TCRγ/δ.
    8. إضافة 300 ميكروليتر من المخزن المؤقت لأجهزة ماكينتوش و 200 ميكروليتر من حبات البيوتين المضادة (جدول المواد) عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    9. مكان يتألف العمود من المجالات المغناطيسية (جدول المواد) وفصل ما قبل "تصفية" معا في المغناطيسي الميدانية وشطفه مع 3 مل من المخزن المؤقت لأجهزة ماكينتوش.
    10. إضافة 9 مل من المخزن المؤقت لأجهزة ماكينتوش في الخلايا وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 5 دقائق.
    11. ريسوسبيند بيليه الخلية في 3 مل من المخزن المؤقت لأجهزة ماكينتوش وتطبيقه على العمود. جمع التدفق من خلال خلايا CD4 التي تحتوي على+ تي الخلايا.
    12. أغسل العمود مع آخر 3 مل من المخزن المؤقت لأجهزة ماكينتوش وجمع أيضا التدفق من خلال.
    13. للحصول على وحدات تحكم المجال Dc عموم الطحال، euthanize الفئران C57BL/6 8-10 أسابيع عمر باستخدام الدائرة2 CO. ضع الماوس على متنها تشريح وشطف مع الإيثانول 70%. عزل الطحال من الجانب الأيسر للبطن باستخدام المقص الجراحي والملقط. وضع الطحال في صحن ثقافة 6 سم يحتوي على 2 مل من محلول كولاجيناز د (2 مغ/مل كولاجيناز د حله في حبس المحتوية على الكالسيوم والمغنيسيوم).
    14. حقن 1 مل من محلول كولاجيناز د إلى الطحال مرتين مع 1 مل حقنه وابرة 25 جرام. قطع الطحال إلى قطع صغيرة مع مقص صغير.
    15. اهتز واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 25 دقيقة.
    16. إضافة 500 ميكروليتر يدتا 0.5 م في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: الخطوات من 3.1.13-3.1.14 ذات أهمية حاسمة لزيادة العائد من وحدات تحكم المجال Dc.
    17. الآن استخدام الجزء الخلفي من دفع عصا محقن 3 مللي فرم الملاط الطحال بتمرير مصفاة خلية 40 ميكرومتر وجمع تعليق خلية سينتريفوجينج على 300 غرام x لمدة 5 دقائق.
    18. ريسوسبيند بيليه الخلية في ميكروليتر 350 المخزن المؤقت لأجهزة ماكينتوش، 50 ميكروليتر من كاشف حظر FcR و 100 ميكروليتر من الخلية الجذعية عموم جسم البيوتين "كوكتيل" عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
      ملاحظة: جسم كوكتيل ضد المستضدات التي لا يتم التعبير عنها بوحدات تحكم المجال Dc.
    19. غسل الخلايا بإضافة 9 مل من المخزن المؤقت لأجهزة ماكينتوش وأجهزة الطرد المركزي في 300 غرام x لمدة 5 دقائق.
    20. ريسوسبيند بيليه الخلية في ميكروليتر 800 من المخزن المؤقت لأجهزة ماكينتوش وإضافة 200 ميكروليتر من حبات البيوتين المضادة عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    21. كرر الخطوات من 3.1.9-3.1.11 لجمع وحدات تحكم المجال Dc.
    22. أغسل العمود مع آخر 3 مل من المخزن المؤقت لأجهزة ماكينتوش مرتين وجمع أيضا التدفق من خلال.
    23. علاج 2 × 105 وحدات تحكم المجال Dc/مل في وجود أو عدم وجود خلايا تي 100-400 نانومتر كدو-مديرة في 37 درجة مئوية للتسمية CD4، بشكل منفصل في الساعة 1+ (1 × 107/ml) مع 1 ميكرومتر كفسي في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، ويغسل مع برنامج تلفزيوني ، وإعادة ضبط وحدة التخزين للحصول على التركيز النهائي في6 ر 2 x 10 خلايا/مل.
    24. المقبل، في لوحة 96، حسنا، الثقافة شارك 100 ميكروليتر من الخلايا الجذعية تعامل مع نفس الحجم من المسمى كفسي CD4 الخلايا+ T، سواء التي تم جمعها من الخطوات المذكورة أعلاه للحصول على 01:10 نسبة. الآن إضافة 100 نانوغرام/مليلتر الببتيد أوفالبومين (OVA) 323-329 كل بئر وقياس كثافة كفسي الخلايا T بالتدفق الخلوي بعد 2-3 أيام للحضانة.
      ملاحظة: الأرقام الخلية ونسبة من وحدات تحكم المجال Dc و T وقد تم تحسين الخلايا من أن العمل السابق37.
  2. حمل السلبي ع عن طريق حقن بمدكس نابض بروتين سكري Oligodendrocyte المايلين (موج) (35-55)
    1. لوحة 2 مل من 1 × 106 بمدكس/مل كل بئر في البئر 6-لوحة مع الثقافة المتوسطة في وجود أو عدم وجود 100-400 نانومتر كدو-مديرة لحضانة 1 ساعة.
    2. إضافة 10 نانوغرام/مل من لبس تحضين 24 ساعة.
    3. إضافة 100 ميكروغرام/مل من موج (35-55) تحضين 4 ساعات.
    4. الحصاد في تعليق خلية وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 5 دقائق.
    5. ريسوسبيند بيليه الخلية مع برنامج تلفزيوني وحساب الخلايا.
    6. تحت الجلد حقن 200 ميكروليتر من 2 × 106 خلايا للفئران C57BL/6 الإناث 8-10 أسابيع من العمر (100 ميكروليتر في كل الساق الخلفية).
    7. في اليوم من حقن بمدك و 48 ساعة. في وقت لاحق، ضخ 200 نانوغرام من السعال الديكي السمية (PTX) في كل الماوس.
    8. كرر الخطوات 3.2.6-3.2.7 مرة كل أسبوع لمدة 4 أسابيع متتالية.
    9. تقييم الأعراض السريرية من ع يوميا باستخدام المعايير القياسية37 (0.5-يعرج ذيل، الذيل 1-يعرج، ضعف أطرافهم هند 2-معتدلة، أطرافهم هند 3-شديدة الضعف، والشلل أطرافهم هند 4 كاملة، الدولة 5-الرباعي أو تحتضر، 6-وفاة).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

بالتمايز واختيار بمدكس:

كانت مثقف خلايا السلف نخاع العظام في إكمال المتوسطة ربمي حضور GM-CSF، وايل-4 تفرق في البلدان الجزرية النامية لمدة 7 أيام (الشكل 1A). في اليوم 1، كانت صغيرة في حجم الخلايا وأظهرت مورفولوجيا كروية. الغسيل مع برنامج تلفزيوني قبل استبدال متوسطة جديدة في يوم 3 ساعد الخلايا على شكل مجموعات، وزاد أيضا عدد سكان CD11c+ الخلايا. في يوم 4، جرى توسيع حجم بمدكس وبدأ تشكيل التكتلات. أيضا تحويل الضامة التقيد بها ولاحظ في الجزء السفلي من اللوحة بشكل مطول. في يوم 5، يتم تشكيل مجموعات كبيرة الحجم من بمدكس. في يوم 6، لوحظت أيضا عدد كبير من بمدكس شبه ملتصقة والعائمة. كانت تحصد في يوم 7 بمدكس وتحليلها بواسطة التدفق الخلوي للتعبير CD11c كعلامة معينة من وحدات تحكم المجال Dc موريني. كما هو موضح في مؤامرة الخلوي تدفق ممثل في الشكل 1B، حوالي 83.6% بمدكس التعبير عن CD11c تحققت بهذا الأسلوب.

التعريف والتوصيف الوراثي من تولدكس:

بعض الوكلاء معروفة لحمل تولدكس، مثل فيتامين D338 والديكساميتازون39، معروفة لأسفل-تنظيم التعبير عن العاصمة يغاندس السطحية، بما في ذلك الثاني MHC وجزيئات كوستيمولاتوري، CD40، CD80، و CD86. على النقيض من ذلك، أظهرت مثبطات calcineurin A السيكلوسبورين و FK506 في سياق لبس أما أو النضوج الناجم عن CD40L من وحدات تحكم المجال Dc، أي تأثير على التعبير عن CD83، CD80، CD86، والثاني MHC33. كما يتبين من تحليل التدفق الخلوي، قد تقلد تولدك حسب كدو-مديرة أي تأثير كبير على التعبير يجند السطحية التي يسببها لبس من البلدان النامية، بما في ذلك CD80، CD86 والثاني MHC، PD-L1 و CD40. (الشكل 2).

وعلاوة على ذلك، التحليل المقارن الترنسكربيتوم وسيتوكين من بمدكس تعامل مع أو بدون كدو-مديرة في وجود أو عدم وجود لبس يصور الشخصية المعدلة الجينات التحريضية. العلاج كدو-مديرة انخفاضا كبيرا لبس الناجمين عن سيتوكين برو التحريضية الجينات مثل IFN-γ، إيل-12، EDN1، TNFα، وايل-6، وايل-23 (الشكل 3 ألف-3F). وهذه معروفة السيتوكينات Th1 (IFN-γ وايل-12) و Th17 (6 إيل وايل-23) تمايز الخلية. وعلاوة على ذلك، يعامل كدو-مديرة بمدكس أظهرت زيادة التعبير عن الجينات سيتوكين المضادة للالتهابات مثل إيل-4، إيل-10، TGF-β، وهو-1 (الشكل 4A-4D). تعرف هذه الجينات المضادة للالتهابات المغير المناعة الذاتية عن طريق تعزيز Th2 (إيل-4) وتمايز خلية تريغ (إيل-10 و TGF-β). 40 هنا أنه من المهم ملاحظة أن إيل-12 المميزة−؛ وإنتاج سيتوكين إيل-10+ 36واستحثاث 1 هو التعبير13وتثبيط EDN-141 الناجمة عن العلاج كدو-مديرة، وكلها المعروف أن المصادقة على وحدات تحكم المجال Dc توليروجينيك الدالة.

وصف تولدكس الخلوية والوظيفية في المختبر

انتشار DC بوساطة الخلايا T المعروف أنها ناتجة عن انخراط يجند السطحية كوستيمولاتوري فضلا عن إفراز السيتوكينات والوسطاء للذوبان7. ولكن تولدكس تمنع ردود الخلية T من خلال عدة آليات: بحمل استعطال خلية T، بنشاط على تعزيز حذف الخلايا أوتوريكتيفي وعن طريق تعزيز الاستقطاب في ساذج تي الخلايا إلى تريجس42. لقد سبق أن أبلغ توصيف وظيفي من كدو-مديرة المستحث تولدكس37. استعطال خلية تي وحذف الخلايا أوتوريكتيفي تي يمكن تحليلها بشكل مستقل عن طريق التحقق من علامات السطحية أو تلطيخ Annexin V/7-عاد. ومع ذلك، أكدنا غير مباشر هذا النمط الظاهري عن طريق قياس مؤشر انتشار الخلايا T. لهذا، تستخدم الفئران المعدلة وراثيا "أوتيي" C57BL/6 خلايا تي، ويعرضهم لوحدات تحكم المجال Dc سينجينيك المستخرجة من الفئران C57BL/6 وتعامل مع أو بدون كدو-مديرة. هذه وحدات تحكم المجال Dc تم غسلها ومثقف يشترك مع كفسي الملون خلايا تي مع الببتيد البويضات. لاحظنا انخفاض كبير في انتشار الخلايا T قبل كدو-مديرة DCs قبل المعالجة، مما يوحي النمط الظاهري توليروجينيك (الشكل 5).

في فيفو توصيف وظيفي تولدكس في نموذج الإكلينيكية للمناعة الذاتية

أخيرا، يمكن اختبار الأداء الوظيفي لتولدكس الناجمة عن مديرة في أي عدد من السريري في فيفو نماذج تتسم المناعة الذاتية أو تحريضية الميزات. منذ ذلك الحين، إي نموذج موريني الإكلينيكية مقبولة على نطاق واسع من الأمراض السريرية المناعية بوساطة الجهاز العصبي المركزي، مرض التصلب العصبي المتعدد43، يمكننا استخدام هذا في دراستنا الحالية. وبغية مواصلة النظر في فيفو الناجم عن وظيفة مديرة كدو تولدكس، وطالبنا منهم في نموذج مورين الإكلينيكية من ع السلبي. لهذا، كان مثقف بمدكس مع أو بدون كدو-مديرة في وجود لبس وموج (35-55). ثم تم حقن هذه الخلايا مرارا وتكرارا كبروتوكول المجدولة التي صورت في الشكل 6A والفئران لوحظت بشكل روتيني للمجاهرة بعلامات سريرية. كما هو متوقع، لبس وموج (35-55) نابض بمدكس أعراض سريرية من إي، ومع ذلك؛ كدو-مديرة معبي بمدكس تعامل المجموعة أظهرت تأخر ظهور المرض مع انخفاض ملحوظ الأعراض السريرية (الشكل 6B). هذه النتائج التحقق من صحة النمط الظاهري كآبته من تولدكس الناجمة عن العلاج كدو-مديرة.

Figure 1
رقم 1: التنمية وتحديد خصائصها المظهرية بمدكس: (A) يخرجوا من عظام الساق والفخذ من الفئران C57BL/6 خلايا النخاع العظمى وكذلك متباينة إلى بمدكس. وكان تتبعها تشكيل كتلة خلية مناسبة الخفيفة الميكروسكوب خلال كامل فترة التمايز (مقياس الحانات، 100µm). (ب) التمايز بمدكس أكد التعبير السطحي CD11c، كما تحليلها من قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية. تصوير الرسوم البيانية نسبة CD11c الموسعة+ خلية السكان. كانت بوابات استراتيجية (ج) جاتينج بمدكس-الخلايا أولاً لاستبعاد الحطام (FSC مقابل SSC). واستخدم بوابة إقصاء يبنوا للبوابة على نوع الخلايا (FL2 W مقابل FL2-A). داخل خلايا القميص، كانت بوابات الخلايا الحية على الأرض 7-عاد (عاد 7 مقابل منتدى التعاون الأمني). ثم كذلك تحليل الخلايا وبوابات في التعبير CD11c. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: هو دون تغيير التعبير السطحي يجند خلية العاصمة قبل كدو-مديرة- كانت الخلايا ما قبل المعالجة في وجود أو عدم وجود كدو-مديرة (200 nM) لمدة ساعة واحدة قبل التحفيز مع لبس (100 نانوغرام/ملليلتر) ل 24 ساعة. وقد تم تحليل التعبير سطح الخلية CD80، CD86، والثاني MHC، PD-L1 و CD40 بالتدفق الخلوي. وقد تم تعديل هذا الرقم من التقارير العلمية 7، المادة رقم: 9886 (2017)، doi:10.1038/s41598-017-06907-4. المستنسخة ونشرها مع إذن حقوق التأليف والنشر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: كدو-مديرة تغيير النمط الظاهري الوراثية والبروتين من مكسبه DCs. بمدكس يعاملون مسبقاً في وجود أو عدم وجود كدو-مديرة (50-400 نانومتر) لمدة ساعة واحدة قبل إضافة للبس (100 نانوغرام/مل)، وأما المقطوع لاستخراج الحمض النووي الريبي (4 ساعة). أو السماح بشرط الثقافة المتوسطة ل 24 ساعة. قبل جمع لتحليلات سيتوكين. تم قياس مستويات إيل-12 (ب)، TNFα (د)، وايل-6 (ه)، وايل-23 (و) قرة-بكر وإليزا. وفي حين تم قياس مستوى IFN-γ (A) بكر قرة و EDN-1 (C) من أليسا وحدها. يتم التعبير عن النتائج يعني ± التنمية المستدامة من ثلاث تجارب. * ف < 0.05، * * ف < 0.01، * * * ف < 0.001 بالمقارنة مع المجموعات المعالجة بلبس. اختبار t مزاوج الطالب. وقد تم تعديل هذا الرقم من التقارير العلمية 7، المادة رقم: 9886 (2017)، doi:10.1038/s41598-017-06907-4. المستنسخة ونشرها مع إذن حقوق التأليف والنشر ". الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: كدو-مديرة الناجم عن النمط الظاهري تولدكس أكده تعبير الجينات والبروتين. بمدكس كانت مرحلة ما قبل المعالجة في وجود أو عدم وجود كدو-مديرة (10-400 نانومتر) لمدة ساعة واحدة قبل إضافة للبس (100 نانوغرام/مل)، والتي كانت تحصد الخلايا لاستخراج الحمض النووي الريبي بعد 24 ساعة. تم قياس مستويات إيل-4 (A)، وايل-10 (ب)، و TGF-β (C) ببكر قرت. (د) الخلية البروتين ليساتيس جمعت في 12 ساعة. للتحاليل والمستويات هو 1، و β-أكتين تحددها التعبير النشاف الغربية. يتم التعبير عن النتائج يعني ± التنمية المستدامة من ثلاث تجارب. * ف < 0.05، * * ف < 0.01، * * * ف < 0.001 بالمقارنة مع المجموعات المعالجة بلبس. اختبار t مزاوج الطالب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: كدو-مديرة تعرض وحدات تحكم المجال Dc قمع انتشار الخلايا تي- كانت وحدات تحكم المجال Dc قبل المعالجة مع كدو-مديرة (100-400 نانومتر) لمدة ساعة واحدة فقط، ثم الملون كفسي غسلها ومثقف يشترك مع خلايا تي في 01:10 نسبة. (أ) الطحال الخلايا T ووحدات تحكم المجال Dc كانت معزولة من الفئران المعدلة وراثيا "أوتي" C57BL/6 والفئران C57BL/6، على التوالي. كدو-مديرة pretreated وحدات تحكم المجال Dc قد شارك مثقف مع كفسي الملون الخلايا T مع (ث) أو بدون (ث/س) إضافة البويضات أثناء الحضانة. تكاثر الخلايا t تحددها التدفق الخلوي في اليوم الثاني. رسومات تصور النسبة المئوية لتقسيم الخلايا T بالنسبة لأرقام انقسام الخلايا T. البيانات عبارة عن تمثيل للتجارب المستقلة 3. وقد تم تعديل هذا الرقم من التقارير العلمية 7، المادة رقم: 9886 (2017)، doi:10.1038/s41598-017-06907-4. المستنسخة ونشرها مع إذن حقوق التأليف والنشر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
رقم 6: موج معبي السلبي الناجم عن العاصمة هو إلغاؤها ع طريق تولدكس- (A) إي التعريفي بموج (35-55)-نابض بمدكس. بمدكس ناضجة يعاملون في وجود أو عدم وجود كدو-مديرة (400 نانومتر) ونابض في وقت لاحق مع موج (35-55) 4 ساعات. إجمالي 200 ميكروليتر من 2 × 106 خلايا تدار عن طريق الحقن تحت الجلد في منطقة الجناح للفئران C57BL/6 مرة واحدة كل أسبوع لما مجموعة أربع حقن. في كل مرة، كان يدير PTX حقن القائمة فورا ومرة أخرى 2 بعد أيام (يوم 0 في الدورة الرابعة). (ب) السريرية كانت مسجل الحقن بعد كل أربع، باستخدام المعايير القياسية. وقدمت جميع البيانات ك ± يعني S.E.M. * P < 0.05. T-اختبارات متعددة مع تحليل صداق هولم (n = 7 الفئران في كل مجموعة). وقد تم تعديل هذا الرقم من التقارير العلمية 7، المادة رقم: 9886 (2017)، doi:10.1038/s41598-017-06907-4. المستنسخة ونشرها مع إذن حقوق التأليف والنشر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وتصف هذه الورقة على بروتوكول فعالة التي يمكن استخدامها لتكاثر لتوليد البلدان الجزرية النامية وبعد ذلك التفريق بينهم في تولدكس، ونقترح أن هذا يمكن تطبيقها على تقييم قدرة وكلاء الهدف جزيئية جديدة للحث تولدك النمط الظاهري. وكما هو مبين في هذا التقرير، تابعنا تسلسل التي نحن أولاً تحليل التعبير تولدك من يغاندس السطحية بالتدفق الخلوي، يليه تقييم للشخصية سيتوكين DC مقاسا qRT-بكر وإليزا. وأخيراً، أكد وظيفة إيمونوريجولاتوري تولدكس مما يدل على قدرتها على خفض تي خلية انتشار في المختبر وفعاليتها لقمع المناعة الذاتية الحية، باستخدام نموذج ع مورين الإكلينيكية لمرض التصلب العصبي المتعدد.

لدينا بروتوكول، ولدت البلدان الجزرية النامية ومتباينة من السلائف موريني نخاع العظام مع المزيج من GM-CSF، وايل-4. استخدمت بروتوكولات أخرى مثل أشكال تيروزين كيناز 3 يغاندس (Flt3L) في الأجلين المتوسط والثقافة لإنشاء44من البلدان الجزرية النامية. على الرغم من أن استخدام Flt3L يزيد العائد من البلدان الجزرية النامية، هذه البلدان الجزرية النامية عادة ما تأخذ 2 أيام (9 أيام) للحصاد، بالمقارنة مع GM-CSF/إيل-4 إضافة (7 أيام)44. الأهم من ذلك، تفرق iDC المتولدة من Flt3L في كثير من الأحيان في كلا المؤلفان (CD8– و CD8+) و pDCs45 التي كانت وظيفيا ومكافئات للحالة المستقرة DCs المجراة في فينوتيبيكالي. غير أن يستحث GM-CSF/إيل-4 دائماً التفريق بين مركز البيانات الدولي تجاه المؤلفان (CD8–) إلا44 وأثناء النضج، أظهروا أحرف مشابهة ل وحدات تحكم المجال Dc التحريضية46. جدير بالذكر أن تعرف أن GM-CSF/إيل-4 غالباً ما تستخدم في التجارب السريرية والبحوث الأساسية بسبب الاستفادة من التمييز بين وحدات تحكم المجال Dc وحيدات أو CD34+ المتكفل44. فقد ثبت أن البلدان الجزرية النامية المتولدة من هاتين الطريقتين إنتاج خلايا مختلفة شكلياً، التي تمتلك علامات سطح خلية مختلفة أيضا ويحمل ملامح متميزة سيتوكين عند انتهاء التنشيط. وعلاوة على ذلك، تولدكس الناجم عن هذه الأساليب تختلف في قدرتها على ترحيل استجابة لعوامل تشيموتاكتيك والحث على خلية محددة مستضد تي الردود44،45. ونحن نفهم أن CD8+ وحدات تحكم المجال Dc قد يحمل إمكانيات أكبر في تحريض تولدك بسبب قدرتها الفريدة على كروستوليرانسي47. بيد أنه مطلوب ثم كذلك الخلية الفرز من بمدكس المستمدة من Flt3L للتحقيق CD8 محددة+ DC فرعية. وبالإضافة إلى ذلك، منذ ذلك الحين، التي يسببها GM-CSF/إيل-4 بمدكس متفوقة في تحفيز الخلايا T وإنتاج وسطاء التهابات بعد لبس المعاملة44،45، وجدنا أن هذه الاستراتيجية أعطت المزيد من النتائج استنساخه أعمالنا التجارب.

بمدكس المستمدة من البداية GM-CSF/إيل-4 للتعبير عن CD11c حول يوم 4 وإثراء التعبير بعد يوم 648. يمكن أن يستمر هذا الإجراء الثقافة حتى اليوم 10-12 مع أقل كثافة طلاء من خلايا نخاع العظام وانخفاض جرعة من جي أم سي-سادس يوم 8-1049. في هذا البروتوكول، أضيفت كدو-مديرة (triterpenoid الاصطناعية) ولبس بالترادف كوكلاء للحث على التسامح DC والنضج، على التوالي. ونحن أفادت مؤخرا أن البلدان الجزرية النامية حصادها من الثقافات استخدام هذا الأسلوب من جيل بمدك المعرض تولدك وظيفية النمط الظاهري عند pretreated مع كدو-مديرة37. جدير بالذكر أن كدو-مديرة، الذي أضيفت فقط للثقافات بعد الحصاد أي دي سي (يوم 7)37، خلافا لعوامل مثل فيتامين D3 التي يجب أن تضاف إلى ثقافات عدة مرات خلال iDC التمايز (اليوم 2، 4، 6)50. وعلاوة على ذلك، قد يتوقف هذا تحريض تولدكس من فيتامين D3 على الآليات المتنوعة التي يجب أن تبدأ على حد سواء أثناء وبعد iDC التمايز51. البيانات المتوفرة لدينا تشير إلى أن إضافة كدو-مديرة خلال التمايز iDC لم يكن له تأثير على نقاء CD11c + "وحدات تحكم المجال Dc"، لكن الجرعة [دبندنتلي] انخفاض العائد من البلدان الجزرية النامية في يوم 7 (البيانات لا تظهر). تحليلاتنا تشير أيضا إلى أن تركيز أعلى من كدو-مديرة المستخدمة في هذه التجارب قد تكون سامة للخلايا السلف نخاع العظام، على الرغم من أن iDC أظهر بقاء طبيعية مع هذا التركز من كدو-مديرة37. ومن المتوقع أنه يمكن تحسين التعريفي تولدك بتحليلات دقيقة أثر توقيت ومدة التعرض لعوامل مثل كدو-مديرة.

من المهم النظر في طرق بديلة والآليات التي من خلالها يمكن أن يتسبب البلدان الجزرية النامية على مدكس قبل الآخرين من لبس، مثل CD40L وتنف-α, IFN-γ52. نضوج DC بلبس من خلال المستقبلات الشبيهة بعدد القتلى 4(TLR4) يؤدي تنشيط عدة عوامل النسخ، بما في ذلك النووية عامل-κB (NF-κB)، وبروتين mitogen تنشيط p38 كيناز (p38 MAPK)، كيناز ج-ن يونيو--المحطة الطرفية (جنك)، وخارج الخلية ينظم إشارة البروتين كيناز (ERK1/2). نضوج وحدات تحكم المجال Dc CD40L وتنف-α عن طريق مستقبلات CD40 وتنف الحث على التوالي في مسار NF-κB. وفي المقابل، IFN-γ يحفز طريقا مختلفة بما في ذلك تفعيل يانوس كيناز (جاك)، تيروزين كيناز (تيك)، ومحول الإشارات والمنشط البروتينات النسخ (إحصائيات)، وهذه الآثار المصب تكملها أيضا تنشيط من مسار NF-κB52. وباﻹضافة إلى ذلك، بينما الشخصية التعبير الجيني نضج DC CD40L/تنف-α-تعتمد يوحي بأن هذه وحدات تحكم المجال Dc استقطاب الخلايا T نحو استجابة خلايا Th253، نضوج DC ب IFN-γ هو بقوة منحازة استجابة خلايا Th154. ولذلك، وهذه المحرضات الأخرى من النضج DC التي ترتبط بالتمايز تجاه مجموعات فرعية محددة T الخلية لا يعمل في هذا البروتوكول.

وقد أظهرت عدة تقارير أن السابقين فيفو-DCs متمايزة قادرة على استحثاث الطيف الكامل من ع الأعراض السريرية وعلم الأمراض في الفئران55. وقد اعتمد أسلوب الحث ع السلبي السابقين فيفو تنشيط وحدات تحكم المجال Dc مع تعديلات مختلفة من قبل مختبرات مختلفة. مزيج الاستقراء ع السلبي والإيجابي بإدارة موج معبي بمدكس، 7 أيام قبل التحصين مع موج والنتائج كاملة فروند الشعبية adjuvant (CFA) في أعلى درجات الأعراض السريرية (ذروة نقاط سريرية: 3.5) مقارنة ع السلبي التعريفي بإدارة موج معبي بمدكس وحدها (ذروة نقاط سريرية: 2)56. النتائج مع هذا الأسلوب يجمع بين موج معبي بمدكس بموج تقترح التحصين يحدث أن ظهور المرض في يوم 9 بعد التحصين مع موج وفرنكات الجماعة المالية الأفريقية56. ومع ذلك، حيث من المعروف أن فرنكات الجماعة المالية الأفريقية يسبب التهاباً كبيرا في موقع الإدارة57، نحن استخدمت السلبي ع التعريفي الإدارة من وحدات تحكم المجال Dc وحدها في لدينا بروتوكول بغية تحليل فعالية تأثير تولدكس خلال ع. بغية زيادة تأكيد النمط الظاهري الوظيفية من تولدكس، أحد يجب أيضا اختبار لهم في قمع الأعراض السريرية النشطة EAE الفئران. مسار الإدارة من وحدات تحكم المجال Dc الأهمية أيضا إلى تنظيم دورات تعريفية ل الأعراض ع58. كما ذكرت لدينا مختبر وآخرون، يستحث الحقن تحت الجلد من بمدكس في منطقة الجناح في الفئران C57BL/6 مرة واحدة في أسبوع لمدة 3-4 حقن نقاط ذروة سريرية من ع حول 2-2.5 مع بداية المرض استنساخه في اليوم 11-1237 ،58. وقدمنا مقطع قصير لإظهار أعراض سريرية مختلفة بين الإيجابي والسلبي EAE التعريفي (1 فيديو).

وتشمل القيود المعترف بها لدينا بروتوكول الوقت المطلوب بالأساليب المستخدمة، والاعتماد على المكروية ذات صلة غير الفيزيولوجية للتمايز بمدك. ومع ذلك، بينما أثرت الجسم عمود فصل أساليب جمع لوحدات تحكم المجال Dc وخلايا تي من مورين الطحال قد يكون الوقت أكثر كفاءة، فإنه يعاني من عائد منخفض من سكان العاصمة المنشودة. وهكذا، هو استفادة أسلوب تنمية العاصمة المشتقة من نخاع العظم سجل مقياس العائد أعلى من سكان العاصمة عند مقارنتها بجسم العمود فصل عن الطحال كلها. وكما لوحظ أعلاه، وحدات تحكم المجال Dc التي تم إنشاؤها في المختبر باستخدام هذه الطريقة يتطلب تركيزات عالية من مكملات سيتوكين التي ليست ذات الصلة الفيزيولوجية لوحدات تحكم المجال Dc في فيفو المكروية59 وأيضا لا ضمان على المدى الطويل الاستدامة للعاصمة. الخدمات القطرية الآلية المستخدمة في البروتوكول لدينا أيضا ليست سيتوكين أساسية العادية DC التمايز في فيفو60. ومع ذلك، البروتوكول المقترح في جيل بمدك تكاثر تعطي نسبة عالية من تولدكس وظيفيا وينبغي أن ينظر إليها كوسيلة موثوق بها للغاية واستنساخه لتوليد DCs الوظيفية مع خصائص توليروجينيك.

وفي الختام، تولدكس المتولدة من البروتوكول هو موضح هنا يمكن فعالة تتسم بتقييم ملفاتهم تعبير الجينات والبروتين وتحديد قدرتها على أن تعدل خلية T-تعتمد على الاستجابات المناعية في المختبر، تقييم وظيفتها كعلاج خلية التبني لقمع ع التعريفي في فيفو. لدينا بروتوكول يوفر إطارا لتقييم أي العوامل الجديدة التي يعتقد أن لها القدرة للحث على تولدكس وكذلك التعجيل بعملية التنمية العلاجية تولدكس من مقاعد البدلاء إلى العيادة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

لا شيء

Acknowledgments

ونحن نشكر "ريتا المستحضرات الصيدلانية" لتوفير كدو-مديرة. كما نعترف بالدعم لجين ولي الرئاسة سيدمان في "طب السرطان الابتكار" (جون ليتيريو). هذا العمل كان تدعمها وزارة الدفاع [W81XWH-12-1-0452]؛ مبادرة بحوث السرطان الكبار فاولر إنجي المراهقين والشباب في مركز السرطان الشامل في القضية؛ وجائزة الباحث خريج كالاهان وي جو الجمعيتان من مؤسسة كالاهان إف جي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CDDO-DFPA (RTA-408) Reata Pharmaceuticals in house synthesis Cell culture
Mouse GM-CSF Peprotech Inc. 315-03 BMDC differentiation
Mouse IL-4 Peprotech Inc. 214-14 BMDC differentiation
Lipopolysaccharides (LPS) Sigma Aldrich Inc. L2880 Cell culture
β-mercaptoethanol Sigma Aldrich Inc. 516732 Cell culture
Pertussis toxin (PTX) R&D systems 3097 EAE induction
MOG (35–55) peptide 21stCentury Biochemicals in house synthesis EAE induction
Trypan blue Gibco, Life Technologies 15250-061 Cell culture
RPMI-1640 plus L-glutamine ThermoFisher Scientific 11875-093 Cell culture
Non-essential amino acid (100X) ThermoFisher Scientific 11140050 Cell culture
HEPES ThermoFisher Scientific 15630080 Cell culture
penicillin/streptomycin ThermoFisher Scientific 15140122 Cell culture
40 μm cell strainer Corning 352340 Cell isolation
PE-conjugated CD80 BD Biosciences 557227 Flow cytometry
PE-conjugated CD86 BD Biosciences 555665 Flow cytometry
PE-conjugated PD-L1 BioLegend 124307 Flow cytometry
APC-conjugated MHCII Miltenyi Biotec Inc. 130-112-388 Flow cytometry
APC-conjugated CD11c BD Biosciences 340544 Flow cytometry
Isotype matched PE Miltenyi Biotec Inc. 130-091-835 Flow cytometry
Isotype matched APC Miltenyi Biotec Inc. 130-091-836 Flow cytometry
CFSE BioLegend 423801 T cell proliferation assay
Pan dendritic cell isolation kit Miltenyi Biotec Inc. 130-100-875 T cell proliferation assay
FcR Blocking Reagent Miltenyi Biotec Inc. 130-100-875 T cell proliferation assay
Pan Dendritic Cell Biotin-Antibody Cocktail Miltenyi Biotec Inc. 130-100-875 T cell proliferation assay
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi Biotec Inc. 130-100-875 T cell proliferation assay
CD4+ T cell isolation kit Miltenyi Biotec Inc. 130-104-454 T cell proliferation assay
CD4+ T cell Biotin-Antibody Cocktail Miltenyi Biotec Inc. 130-104-454 T cell proliferation assay
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi Biotec Inc. 130-104-454 T cell proliferation assay
ACK lysing buffer ThermoFisher Scientific A1049201 BMDC differentiation
1 ml syringe BD Biosciences 309626 T cell proliferation assay
3 ml syringe BD Biosciences 309588 BMDC differentiation
25G needle BD Biosciences 309626 T cell proliferation assay
23G needle BD Biosciences 309588 BMDC differentiation
BSA Sigma Aldrich Inc. A2058 T cell proliferation assay
EDTA ThermoFisher Scientific 15575020 T cell proliferation assay
LS Column Miltenyi Biotec Inc. 130-042-401 T cell proliferation assay
Pre-Separation Filter Miltenyi Biotec Inc. 130-095-823 T cell proliferation assay
collagenase D Sigma Aldrich Inc. 11088858001 T cell proliferation assay
HBSS ThermoFisher Scientific 14025076 T cell proliferation assay
ovalbumin (OVA) peptide 323–329 Sigma Aldrich Inc. O1641 T cell proliferation assay
Mouse IFN-γ TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm01168134_m1 qRT-PCR
Mouse IL-12a TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm00434165 qRT-PCR
Mouse IL-12 p70 DuoSet ELISA R&D systems DY419-05 ELISA
Mouse EDN-1 ELISA RayBiotech ELM-EDN1-1 ELISA
TNF-α TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm00443258 qRT-PCR
Mouse TNF-α Quantikine ELISA Kit R&D systems MTA00B ELISA
IL-6 TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm00446190 qRT-PCR
Mouse IL-6 Quantikine ELISA Kit R&D systems M6000B ELISA
IL-23a TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm01160011 qRT-PCR
Mouse IL-23 DuoSet ELISA R&D systems DY1887-05 ELISA
IL-4 TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm99999154_m1 qRT-PCR
IL-10 TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm01288386_m1 qRT-PCR
TGF-β TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm01178820_m1 qRT-PCR
Anti-Heme Oxygenase 1 antibody Abcam ab13248 Western blotting
Anti-β-actin antibody Abcam ab8226 Western blotting
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System Bio-Rad Inc. qRT-PCR
BD FACSCalibur Cell Analyzer BD Biosciences Flow cytometry

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).
  2. Inaba, K., et al. Efficient presentation of phagocytosed cellular fragments on the major histocompatibility complex class II products of dendritic cells. J Exp Med. 188 (11), 2163-2173 (1998).
  3. Banchereau, J., et al. Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol. 18, 767-811 (2000).
  4. Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 179 (4), 1109-1118 (1994).
  5. Hemmi, H., Akira, S. TLR signalling and the function of dendritic cells. Chem Immunol Allergy. 86, 120-135 (2005).
  6. Caux, C., et al. B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells. J Exp Med. 180 (5), 1841-1847 (1994).
  7. Chastain, E. M., Duncan, D. S., Rodgers, J. M., Miller, S. D. The role of antigen presenting cells in multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 265-274 (2011).
  8. Smeltz, R. B., Chen, J., Ehrhardt, R., Shevach, E. M. Role of IFN-gamma in Th1 differentiation: IFN-gamma regulates IL-18R alpha expression by preventing the negative effects of IL-4 and by inducing/maintaining IL-12 receptor beta 2 expression. J Immunol. 168 (12), 6165-6172 (2002).
  9. Gyulveszi, G., Haak, S., Becher, B. IL-23-driven encephalo-tropism and Th17 polarization during CNS-inflammation in vivo. Eur J Immunol. 39 (7), 1864-1869 (2009).
  10. Kronenberg, M., Rudensky, A. Regulation of immunity by self-reactive T cells. Nature. 435 (7042), 598-604 (2005).
  11. Boks, M. A., et al. IL-10-generated tolerogenic dendritic cells are optimal for functional regulatory T cell induction--a comparative study of human clinical-applicable DC. Clin Immunol. 142 (3), 332-342 (2012).
  12. Anderson, A. E., et al. Tolerogenic dendritic cells generated with dexamethasone and vitamin D3 regulate rheumatoid arthritis CD4+ T cells partly via transforming growth factor-beta1. Clin Exp Immunol. 187 (1), 113-123 (2017).
  13. Chauveau, C., et al. Heme oxygenase-1 expression inhibits dendritic cell maturation and proinflammatory function but conserves IL-10 expression. Blood. 106 (5), 1694-1702 (2005).
  14. Maldonado, R. A., von Andrian, U. H. How tolerogenic dendritic cells induce regulatory T cells. Adv Immunol. 108, 111-165 (2010).
  15. Schmidt, S., Nino-Castro, A., Schultze, J. Regulatory dendritic cells: there is more than just immune activation. Frontiers in Immunology. 3 (274), (2012).
  16. Hilkens, C. M., Isaacs, J. D., Thomson, A. W. Development of dendritic cell-based immunotherapy for autoimmunity. Int Rev Immunol. 29 (2), 156-183 (2010).
  17. Dhodapkar, M. V., Steinman, R. M. Antigen-bearing immature dendritic cells induce peptide-specific CD8(+) regulatory T cells in vivo in humans. Blood. 100 (1), 174-177 (2002).
  18. Dhodapkar, M. V., Steinman, R. M., Krasovsky, J., Munz, C., Bhardwaj, N. Antigen-specific inhibition of effector T cell function in humans after injection of immature dendritic cells. J Exp Med. 193 (2), 233-238 (2001).
  19. Giannoukakis, N., Phillips, B., Finegold, D., Harnaha, J., Trucco, M. Phase I (safety) study of autologous tolerogenic dendritic cells in type 1 diabetic patients. Diabetes Care. 34 (9), 2026-2032 (2011).
  20. Benham, H., et al. Citrullinated peptide dendritic cell immunotherapy in HLA risk genotype-positive rheumatoid arthritis patients. Sci Transl Med. 7 (290), 290ra287 (2015).
  21. Bell, G. M., et al. Autologous tolerogenic dendritic cells for rheumatoid and inflammatory arthritis. Ann Rheum Dis. 76 (1), 227-234 (2017).
  22. University Hospital, A. A "Negative" Dendritic Cell-based Vaccine for the Treatment of Multiple Sclerosis: a First-in-human Clinical Trial (MS tolDC). ClinicalTrials.gov. , (2015).
  23. Pujol, F. I. G. T. i Tolerogenic Dendritic Cells as a Therapeutic Strategy for the Treatment of Multiple Sclerosis Patients (TOLERVIT-MS) (TOLERVIT-MS). ClinicalTrials.gov. , (2016).
  24. Varea, S. Treatment of Multiple Sclerosis and Neuromyelitis Optica With Regulatory Dendritic Cell: Clinical Trial Phase 1 B. ClinicalTrials.gov. , (2017).
  25. Jauregui-Amezaga, A., et al. Intraperitoneal Administration of Autologous Tolerogenic Dendritic Cells for Refractory Crohn's Disease: A Phase I Study. J Crohns Colitis. 9 (12), 1071-1078 (2015).
  26. Mahnke, K., Schmitt, E., Bonifaz, L., Enk, A. H., Jonuleit, H. Immature, but not inactive: the tolerogenic function of immature dendritic cells. Immunol Cell Biol. 80 (5), 477-483 (2002).
  27. Lutz, M. B., Schuler, G. Immature, semi-mature and fully mature dendritic cells: which signals induce tolerance or immunity? Trends Immunol. 23 (9), 445-449 (2002).
  28. Suciu-Foca, N., et al. Molecular characterization of allospecific T suppressor and tolerogenic dendritic cells: review. Int Immunopharmacol. 5 (1), 7-11 (2005).
  29. Wakkach, A., et al. Characterization of dendritic cells that induce tolerance and T regulatory 1 cell differentiation in vivo. Immunity. 18 (5), 605-617 (2003).
  30. Szeles, L., et al. 1,25-dihydroxyvitamin D3 is an autonomous regulator of the transcriptional changes leading to a tolerogenic dendritic cell phenotype. J Immunol. 182 (4), 2074-2083 (2009).
  31. Unger, W. W., Laban, S., Kleijwegt, F. S., vander Slik, A. R., Roep, B. O. Induction of Treg by monocyte-derived DC modulated by vitamin D3 or dexamethasone: differential role for PD-L1. Eur J Immunol. 39 (11), 3147-3159 (2009).
  32. Reichardt, W., et al. Impact of mammalian target of rapamycin inhibition on lymphoid homing and tolerogenic function of nanoparticle-labeled dendritic cells following allogeneic hematopoietic cell transplantation. J Immunol. 181 (7), 4770-4779 (2008).
  33. Woltman, A. M., et al. The effect of calcineurin inhibitors and corticosteroids on the differentiation of human dendritic cells. Eur J Immunol. 30 (7), 1807-1812 (2000).
  34. Hackstein, H., Thomson, A. W. Dendritic cells: emerging pharmacological targets of immunosuppressive drugs. Nat Rev Immunol. 4 (1), 24-34 (2004).
  35. Torres-Aguilar, H., Blank, M., Jara, L. J., Shoenfeld, Y. Tolerogenic dendritic cells in autoimmune diseases: crucial players in induction and prevention of autoimmunity. Autoimmun Rev. 10 (1), 8-17 (2010).
  36. Rutella, S., Danese, S., Leone, G. Tolerogenic dendritic cells: cytokine modulation comes of age. Blood. 108 (5), 1435-1440 (2006).
  37. Wei, H. J., Pareek, T. K., Liu, Q., Letterio, J. J. A unique tolerizing dendritic cell phenotype induced by the synthetic triterpenoid CDDO-DFPA (RTA-408) is protective against EAE. Sci Rep. 7 (1), 9886 (2017).
  38. van Etten, E., Mathieu, C. Immunoregulation by 1,25-dihydroxyvitamin D3: basic concepts. J Steroid Biochem Mol Biol. 97 (1-2), 93-101 (2005).
  39. Pan, J., et al. Dexamethasone inhibits the antigen presentation of dendritic cells in MHC class II pathway. Immunol Lett. 76 (3), 153-161 (2001).
  40. Zhu, J., Paul, W. E. Heterogeneity and plasticity of T helper cells. Cell Res. 20 (1), 4-12 (2010).
  41. Spirig, R., et al. TLR2 and TLR4 agonists induce production of the vasoactive peptide endothelin-1 by human dendritic cells. Mol Immunol. 46 (15), 3178-3182 (2009).
  42. Walton, E. L. Make immunological peace not war: Potential applications of tolerogenic dendritic cells. Biomed J. 40 (2), 77-79 (2017).
  43. Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). Br J Pharmacol. 164 (4), 1079-1106 (2011).
  44. Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking. J Immunol. 179 (11), 7577-7584 (2007).
  45. Angelov, G. S., Tomkowiak, M., Marcais, A., Leverrier, Y., Marvel, J. Flt3 ligand-generated murine plasmacytoid and conventional dendritic cells differ in their capacity to prime naive CD8 T cells and to generate memory cells in vivo. J Immunol. 175 (1), 189-195 (2005).
  46. Lowes, M. A., et al. Increase in TNF-alpha and inducible nitric oxide synthase-expressing dendritic cells in psoriasis and reduction with efalizumab (anti-CD11a). Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (52), 19057-19062 (2005).
  47. Schnorrer, P., et al. The dominant role of CD8+ dendritic cells in cross-presentation is not dictated by antigen capture. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (28), 10729-10734 (2006).
  48. Wang, W., Li, J., Wu, K., Azhati, B., Rexiati, M. Culture and Identification of Mouse Bone Marrow-Derived Dendritic Cells and Their Capability to Induce T Lymphocyte Proliferation. Med Sci Monit. 22, 244-250 (2016).
  49. Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J Immunol Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
  50. Griffin, M. D., et al. Dendritic cell modulation by 1alpha,25 dihydroxyvitamin D3 and its analogs: a vitamin D receptor-dependent pathway that promotes a persistent state of immaturity in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (12), 6800-6805 (2001).
  51. Bscheider, M., Butcher, E. C. Vitamin D immunoregulation through dendritic cells. Immunology. 148 (3), 227-236 (2016).
  52. Castiello, L., et al. Monocyte-derived DC maturation strategies and related pathways: a transcriptional view. Cancer Immunol Immunother. 60 (4), 457-466 (2011).
  53. Decker, W. K., et al. Deficient T(H)-1 responses from TNF-alpha-matured and alpha-CD40-matured dendritic cells. J Immunother. 31 (2), 157-165 (2008).
  54. Longhi, M. P., et al. Dendritic cells require a systemic type I interferon response to mature and induce CD4+ Th1 immunity with poly IC as adjuvant. J Exp Med. 206 (7), 1589-1602 (2009).
  55. Link, H., Huang, Y. M., Xiao, B. G. Dendritic cells in experimental allergic encephalomyelitis and multiple sclerosis. J Neuroimmunol. 100 (1-2), 102-110 (1999).
  56. Leech, M. D., et al. Cutting edge: IL-6-dependent autoimmune disease: dendritic cells as a sufficient, but transient, source. J Immunol. 190 (3), 881-885 (2013).
  57. Saul, L., Besusso, D., Mellanby, R. J. LPS-matured CD11c+ bone marrow-derived dendritic cells can initiate autoimmune pathology with minimal injection site inflammation. Lab Anim. 51 (3), 292-300 (2017).
  58. Aghdami, N., Gharibdoost, F., Moazzeni, S. M. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) induced by antigen pulsed dendritic cells in the C57BL/6 mouse: influence of injection route. Exp Anim. 57 (1), 45-55 (2008).
  59. Wilson, H. L. Limitations with in vitro production of dendritic cells using cytokines. J Leukoc Biol. 75 (4), 600-603 (2004).
  60. Ni, K., O'Neill, H. C. Development of dendritic cells from GM-CSF-/- mice in vitro : GM-CSF enhances production and survival of cells. Dev Immunol. 8 (2), 133-146 (2001).

Tags

الطب، 135 قضية، والخلايا الجذعية توليروجينيك (تولدكس)، والمشتقة من نخاع العظام الخلايا الجذعية (بمدكس)، النخاع الذاتية التجريبية (ع)، قمع المناعة، السيتوكينات، والمناعة الذاتية
التنمية وتوصيف وظيفي للخلايا الجذعية مورين توليروجينيك
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wei, H. J., Letterio, J. J., Pareek, … More

Wei, H. J., Letterio, J. J., Pareek, T. K. Development and Functional Characterization of Murine Tolerogenic Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (135), e57637, doi:10.3791/57637 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter