Summary
Здесь мы представляем протокол к развивать и характеризуют tolerogenic дендритных клеток (TolDCs) и оценить их иммунотерапевтических полезности.
Abstract
Иммунная система работает, поддерживая туго баланс между координации реакции против иностранных антигенов и поддержание отвечать государства против себя антигены, а также антигены от синантропных организмов. Нарушение этого иммунного гомеостаза может привести к хроническому воспалению и развития аутоиммунных заболеваний. Дендритные клетки (DCs) являются профессиональные антиген представляющих клеток иммунной системы участвует в активации наивно T клетки инициировать иммунного ответа против иностранных антигенов. Однако DCs, также могут быть продифференцированы в TolDCs, которые действуют для поддержания и поощрения терпимости Т-клеток и подавить эффекторных клеток, способствуя развитию условий либо аутоиммунных или хронического воспаления. Недавние улучшения в нашем понимании TolDCs предполагает, что DC толерантность может быть достигнуто путем модулирования условий их дифференциация. Это явление привело к огромным ростом развивающихся TolDC терапии для многочисленных иммунных, причиненный из-за перерыва в иммунной толерантности. Успешные исследования в доклинических аутоиммунитета мышиных моделях дополнительно подтверждена иммунотерапевтических утилита TolDCs в лечении аутоиммунных заболеваний. Сегодня TolDCs стали перспективным иммунотерапевтических инструментом в клинике для восстановления иммунной толерантности в различных иммунных ориентации патогенных аутоиммунных реакций, оставляя нетронутыми защитного иммунитета. Хотя массив стратегии было предложено несколько лабораторий, чтобы побудить TolDCs, не существует согласия в характеристике сотовой и функциональных фенотип этих клеток. Этот протокол обеспечивает пошаговое руководство для развития костного мозга, полученных DCs в больших количествах, уникальный метод, используемый, чтобы отличить их в TolDCs с синтетическими тритерпеновые 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic кислота difluoro пропил Амид (CDDO-ОАФК) и методы, используемые для подтверждения их фенотип, включая анализ основных молекулярной подписей TolDCs. Наконец мы покажем метод для оценки TolDC функции путем проверки их иммуносупрессивные ответ в пробирке и в естественных условиях в доклинических модели рассеянного склероза.
Introduction
Дендритные клетки (DCs) являются неотъемлемой частью иммунной системы и были впервые обнаружены и характеризуется Ральф Стейнман и Zanvil кон в 1973 году как основной профессиональный антиген представляющих клеток1. Показано, что РСУ, играть важную роль в иммунной активации, представив обработанные антигенам Т-клетки и клетки B через комплексов гистосовместимости (MHC) в средних лимфоидных органов связать врожденная и адаптивного иммунитета2. В иммунной системе млекопитающих существует по крайней мере две категории DCs, которые были описаны как миелоидного DCs и плазмоцитарная контроллеров домена (PDC)3. Миелоидные DCs, также известный как обычных DCs (cDCs), характеризуются проявлением CD11c и можно дифференцировать как незрелых DCs (ОРС) в пробирке прогениторных клеток костного мозга и периферической крови моноциты с помощью Гранулоцитарно макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) и Ил-4 в мышиных или человеческого вида, соответственно4.
Активация «угроза» сигналы, такие как патоген связанные молекулярные структуры (PAMP) или повреждения связанные молекулярные модели (сырой), будет управлять созревания ОРС к иммуногенность DCs как зрелые DCs (офицеров) через обязательную различных рецепторов признание шаблон DC поверхности5. Иммуногенность DCs далее премьер наивные Т-клеток пролиферации и дифференцировки через upregulation MHCII2, костимуляторных лигандами (CD80, CD86 и CD40)6, цитокины, и других растворимых медиаторов7. Каскад производства про воспалительных посредника от иммуногенных DCs имеет важное значение для дифференциации cytokine опосредованной Т-клеток. К примеру ИФН γ и Ил-12, необходимые для Th1 дифференцировки8 и IL-1, IL-6 и IL-23 имеют решающее значение для наивного поляризации Т-клеток к Th17 клетки9. Хотя пожилые DCs реагируют на иностранных антигены, неконтролируемая DC активации self-антигенами может привести к терпимости абляции и содействовать развитию аутоиммунных заболеваний путем создания аутореактивная T-клетки, чьи Активация приводит к разрушению тканей10 .
Недавние доклады представили четкие доказательства DC пластичности, подтверждается их способности взаимодействовать с различными подсказками в пределах их микроокружения ткани и дифференцироваться в различных эффекторных/подавитель DC подмножеств. Было показано, что противовоспалительное посредников, как Ил-1011, TGF-β12и Хо-113 играть важную роль в иммуносупрессия, вызывая tolerogenic DCs (TolDCs). Эти TolDCs приобретают функции регулирования и пресечения распространения клеток T14. Кроме того отсутствие сотрудничества стимуляции, DCs производство противовоспалительных медиаторов из TolDCs способствовать индукции регулирующих Т-клеток (Tregs) и также эффективно подавляют дифференциации и расширения Th1 и Th1715. В последние два десятилетия, терапевтический потенциал TolDCs было зарегистрировано несколько следователей. В этих исследованиях администрация экс vivo сгенерирована различных доклинических моделей аутоиммунных заболеваний16 TolDCs не только улучшили патологических симптомов, но и привели к развитию иммунной толерантности больных17 ,18. Интересно, что сегодня TolDCs терапии было рассматривать как альтернативные или добавочной подход для аутоиммунных заболеваний в нескольких клинических испытаний, в том числе тип 1 сахарный диабет19, ревматоидный артрит20, 21, рассеянный склероз (РС)22,23,24и болезнь Крона25.
Существует множество протоколов, которые были использованы для разработки TolDCs и несколько лаборатории сообщили методы для генерации и фенотипические характеристики TolDCs. Эти методы могут использоваться для герметизации создания TolDCs в пробирке из гемопоэтических прародителями и стабильно поддерживать их в tolerogenic государства в vivo26,27,28,29. ОРС могут быть преобразованы в TolDCs под воздействием различных фармакологических агентов иммуномодулирующих или противовоспалительных цитокинов. Например витамин D3 является хорошо известных фармакологических агент, известный для увеличения производства Ил-10 и подавляют секрецию Ил-12 от РСУ и тем самым увеличить их иммуносупрессивные функции30. Кроме того, когда DCs подвергаются мощной воспалительных раздражителей, таких как липополисахаридов (LPS), несколько фармакологических агентов, таких как дексаметазон31,32rapamycin и кортикостероиды33 было показано побудить TolDC фенотип путем сокращения поверхности выражение DC CD40, CD80, CD86 и MHCII34. Ил-10 и TGF-β-это было показано, что наиболее изучены противовоспалительных цитокинов побудить DC терпимости35 и сопутствующей подверженности обоих этих цитокинов побудить tolerogenic фенотип в DCs36.
Начиная с tolerogenic, DC определяется функциональных характеристик, а не фенотипические маркеры, есть большой необходимо разработать согласованный метод для сотовых и функциональных характеристик TolDCs. Кроме того, строгого и последовательного протокола должен быть создан для постоянной оценки и характеристика tolerogenic DC фенотип, если мы хотим эффективно и можно воспроизвести сравнить новых агентов способность вызывать TolDC фенотип в Лаборатория. Здесь мы предоставляем подробный протокол с шаг за шагом методы изолировать ОРС из гемопоэтических прародителями мышей и впоследствии анализировать эффективность новых агентов по оценке для их способность преобразовать ОРС в TolDCs, обеспечивая надежный функциональные и фенотипические характеристики TolDCs в пробирке и в естественных условиях. Это описание включает метод разработки характеризовать TolDCs их поверхности лигандов, цитокинового профиля и иммуносупрессивные функции в пробирке. Мы также предоставляем пример метода, позволяющего исследовать потенциал терапевтического применения этих TolDCs в доклинических модели МС, Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (EAE). Этот протокол будет помочь следователям для оценки новых агентов способность содействовать индукции TolDCs и облегчит усилия по расширению сферы развития терапевтического TolDC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все исследования были проведены в соответствии с процедурами, утвержденными случае Вестерн Резерв школы медицины университета в институциональный уход животных и использования Комитетом.
1. Подготовьте костного мозга-производные дендритных клеток (BMDCs)
- Стерилизовать всех хирургических инструментов через автоклавирования и выполнить эксперимент в классе II биологической безопасности кабинета с присвоенным безопасности процедур.
- Усыпить мышей C57BL/6 возраст 8-10 недель с помощью CO2 камеры. Поместите курсор мыши на доске рассечения и промыть 70% этиловом спирте. Акцизный малоберцовой кости берцовой и бедренной костей с помощью хирургические ножницы и место их с 70% этанола в 10 см культуры блюдо.
- Использовать хирургические лезвия и щипцы для рассечения тканей от как можно больше на крышке 10 см культуры блюдо и изоляции tibias и бедра, чтобы разместить их с 70% этанола в 6 см культуры блюдо.
- Используйте хирургические лезвия для обрезки обоих концах tibias и бедра. Используйте 3 мл PBS в шприц 3 мл с иглой 23G, чтобы очистить содержимое костного мозга от одного конца костей в коническую пробирку, содержащую 12 мл PBS. Повторите этот шаг 3 x для каждого конца костей.
- Центрифуга суспензию клеток на 300 g x 5 мин.
- Удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки лепешка с 1 мл ACK лизировать буфер для 5 минут для удаления красных кровяных клеток.
- Добавьте 9 мл PBS для разбавления ACK лизировать буфер и центрифуги на 300 x g за 5 минут.
- Удалить супернатант и Ресуспензируйте с 10 мл питательной среды (RPMI 1640 плюс L-глютамина, 10% FBS, 1% несущественные аминокислот (100 x), 10 мм HEPES, 50 Нм β-меркаптоэтанол и 5% пенициллина/стрептомицина).
Примечание: Эндотоксина уровень должен быть менее 0,1 ЕС/мл в FBS. - Передайте суспензию клеток через стрейнер клетки 40 мкм и принять 20 мкл суспензии клеток и смешать с 80 мкл Трипановый синий подсчитать количество живых клеток с помощью цитометр.
- Регулировать количество клеток до 1 x 106 клеток/мл с ГМ-КСФ 15 нг/мл и 10 нг/мл Ил-4.
- Пластина 3 мл 1 х 106 клеток/мл в каждую лунку 6-ну пластины и инкубации клеток при 37 ° C, 5% CO2и 95% влажности в инкубаторе CO2 .
Примечание: Клетки костного мозга от одной мыши составляет около 3-5 x 107 клеток, указав, что его можно разместить от 2 до 3 6-ну пластины. - На третий день удалить все 3 мл питательной среды из каждой скважины, добавить 2 мл свежего PBS в каждой скважине, и затем слегка взболтать пластину для обеспечения удаления всех клеток не сторонник.
- Замените 3 мл свежей питательной среды 15 нг/мл ГМ-КСФ и 10 нг/мл Ил-4 в каждой скважине. Инкубируйте клетки при 37 ° C, 5% CO2и 95% влажности в инкубаторе CO2 .
- На 5 день напрямую добавьте еще 3 мл свежей питательной среды с ГМ-КСФ 15 нг/мл и 10 нг/мл Ил-4 в каждой скважине. Инкубируйте клетки при 37° C, 5% CO2 и 95% влажности в инкубаторе CO2 .
Примечание: Общий объем в каждой скважине теперь составляет 6 мл. - На 7 день Положите всю пластину на льду за 10 минут. Аккуратно Пипетка питательной среды в каждой скважине выбить слабо сторонник BMDCs как ОРС в подвеска.
Примечание: По-прежнему адэрентных макрофаги прикреплены к пластине. Низкая температура и аккуратно процедуры являются ключом к избежать DC активации влияют на дальнейших экспериментов. - Центрифуга суспензию клеток на 300 g x 5 минут и Ресуспензируйте с свежей питательной среды для дальнейших экспериментов.
Примечание: BMDCs может быть идентифицирован с флуоресцировани обозначенного антитела CD11c проточной цитометрии и мы показали наши стробирования стратегия BMDCs для дальнейших экспериментов на рисунке 1.
2. охарактеризовать ген TolDC и профиль белка
- Пластина 2 мл 1 х 106 BMDCs/мл за хорошо в 6 скважин плита с питательной среды в присутствии или отсутствии 100-400 Нм CDDO-ОАФК для инкубации 1 ч при 37 ° C, 5% CO2 и 95% влажности воздуха в инкубаторе CO2 .
Примечание: CDDO-ОАФК, синтетические тритерпеновые, является ядерный фактор (эритроидные производные 2) - как - 2 индуктором фактор (Nrf2) и ингибитор ядерный фактор κB (NF-κB). Применить другие агенты для индукции TolDCs от ОРС, как Ил-10, витамин D3, дексаметазона или залив 11-7085 и изменять этот шаг до оптимального состояния для каждого агента. - Добавьте 10 или 100 нг/мл ПЛАСТИНОК для инкубации 4-24 часа, чтобы побудить офицеров (время инкубации отличается за счет измерения mRNA или белка).
- Аккуратно Пипетка питательной среды в каждой скважине и урожай суспензию клеток с помощью пипетки 1 мл. Центрифуга на 300 g x 5 минут собрать клетки и супернатанта, соответственно.
- Анализ поверхности лигандов из клеток гранулы подачей cytometry, таких как стимулирующее лигандов: CD40, CD80, CD86, MHC-II, OX40L, ICOSL или тормозящее лигандам: PD-L1, PD-L2, ILT3, ILT4.
- Изолировать РНК из клеток окатышей и анализировать РНК и супернатанта образцов для цитокинового профиля и генов и белков уровней Количественная ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) и ИФА, соответственно.
Примечание: например, воспалительных цитокинов: EDN-1, Ил-6, Ил-12 и Ил-23 или противовоспалительные цитокины ФНО α, IFNγ,: IL-4, Ил-10, IL-15, TGF-β1 и Хо-1.
3. оценить функцию TolDCs In Vitro и In Vivo
-
Т-клеток сингенных распространения Assay
- Стерилизовать всех хирургических инструментов через автоклавирования и выполнить эксперимент в классе II биологической безопасности кабинета с присвоенным безопасности процедур.
- Подготовьте MACS буфер с помощью 0,5% бычьим сывороточным альбумином (БСА) и 2 мм ЭДТА в 500 мл PBS. Стерилизуйте буфера путем фильтрации через фильтр 0.2 мкм.
Примечание: Сохраняйте буфер на льду во время следующий эксперимент. - Для получения CD4+ T клетки, усыпить OT-II Т-клеточный рецептор (TCR) трансгенных мышей возраст 8-10 недель с помощью CO2 камеры. Поместите курсор мыши на доске рассечения и промыть 70% этиловом спирте. Изолируйте селезенки с левой стороны живота, используя Ножницы хирургические и пинцет.
- Поставьте селезенки с 2 мл PBS в 6 см культуры блюдо и используйте задней толкающую палку шприц 3 мл для фарша селезенки, передав стрейнер клеток 40 мкм.
- Собирайте суспензию клеток и центрифуги на 300 x g за 5 минут.
- Ресуспензируйте Пелле клеток в 400 мкл буфера MACS.
- Добавить 100 мкл CD4 Т-клеток биотин-антитела коктейль+ при температуре 4° C за 5 минут.
Примечание: Коктейль антитело связывает на другие типы клеток, за исключением CD4 клеток+ T, например CD45R, CD11c, CD8a, CD19, CD25, CD11b (B220), CD49b (DX5), CD105, анти-гистосовместимости, Тер-119 и TCRγ/δ. - Добавьте 300 мкл буфера MACS и 200 мкл анти биотина бусины (Таблица материалов) при 4° C на 10 минут.
- Место столбца в составе ферромагнитных сфер (Таблица материалов) и разделительный фильтр вместе в магнитного поля и промойте его с 3 мл MACS буфера.
- Добавьте 9 мл MACS буфера в клетки и центрифуги на 300 x g за 5 минут.
- Ресуспензируйте Пелле клеток в 3 мл буфера MACS и применять на столбце. Сбор через поток содержащий CD4+ T клетки.
- Промойте колонку с другой 3 мл буфера MACS и также собирать потока через.
- Чтобы получить селезеночной Пан DCs, усыпить мышей C57BL/6 возраст 8-10 недель с помощью CO2 камеры. Поместите курсор мыши на доске рассечения и промыть 70% этиловом спирте. Изолируйте селезенки с левой стороны живота, используя Ножницы хирургические и пинцет. Положите селезенки в 6 см культуры блюдо с 2 мл раствора коллагеназы D (2 мг/мл коллагеназы D растворяют в HBSS, содержащих кальций, магний).
- Придать 1 мл раствора коллагеназы D к селезенке два раза с 1 мл шприца и иглы 25G. Селезенка мелко нарежьте небольшой ножницами.
- Встряхнуть и инкубации при комнатной температуре в течение 25 минут.
- Добавьте 500 мкл ЭДТА 0,5 М при комнатной температуре в течение 5 минут.
Примечание: Шаги от 3.1.13-3.1.14 имеют решающее значение для увеличения урожайности DCs. - Теперь используйте задней толкающую палку шприц 3 мл фарш пульпы селезенки, передав стрейнер клетки 40 мкм и собирать суспензию клеток центрифугированием при 300 x g за 5 минут.
- Ресуспензируйте Пелле клеток в 350 мкл буфера MACS, 50 мкл Реагента блокирование FcR и 100 мкл Пан дендритных клеток биотин-антитела коктейль на 4° C на 10 минут.
Примечание: Антитела коктейль против антигенов, которые не выражаются DCs. - Вымойте клетки путем добавления 9 мл буфера MACS и центрифуги на 300 x g за 5 минут.
- Ресуспензируйте Пелле клеток в 800 мкл буфера MACS и добавить 200 мкл анти биотина бусы на 4 ° C на 10 минут.
- Повторите шаги от 3.1.9-3.1.11 для сбора DCs.
- Промойте колонку с другой 3 мл буфера MACS два раза и также собирать потока через.
- Лечить 2 x 105 DCs/мл в наличие или отсутствие 100-400 Нм CDDO-ОАФК при 37 ° C за 1 час отдельно, лейбл CD4+ Т-клеток (1 x 107/мл) с 1 мкм CFSE при 37 ° C в течение 15 минут, промойте PBS и скорректировать объем для получения конечной концентрации в 2 x 10 Т6 клеток/мл.
- Далее, в 96-луночных плита, совместно культуры 100 мкл лечение дендритных клеток с такой же объем CFSE-меченых CD4 клеток+ T, оба полученные выше шаги, чтобы получить 1:10 соотношение. Теперь добавьте 100 нг/мл пептид овальбумина (OVA) 323-329 в колодец и мера интенсивности CFSE Т-клеток подачей cytometry после 2-3 дня инкубации.
Примечание: Числа клеток и соотношение DCs и T клетки были оптимизированы с нашей предыдущей работы37.
-
Побудить пассивный ЕАЕ путем инъекций BMDCs импульсного с миелина Олигодендроциты гликопротеина (MOG) (35-55)
- Пластина 2 мл 1 х 106 BMDCs/мл за хорошо в 6 скважин плита с питательной среды в наличие или отсутствие 100-400 Нм CDDO-ОАФК для инкубации 1 hr.
- Добавить 10 нг/мл ПЛАСТИНОК для инкубирования 24 часов.
- Добавить 100 мкг/мл MOG (35-55) для инкубирования 4 часов.
- Урожай суспензию клеток и центрифуги на 300 x g за 5 минут.
- Ресуспензируйте клетки лепешка с PBS и подсчитать количество ячеек.
- Подкожно вводить 200 мкл 2 х 106 клеток до 8-10 недель самок мышей C57BL/6 (100 мкл в каждом задняя нога).
- В день BMDC впрыска и 48 часов. позже, придать 200 нг коклюша токсина (PTX) в каждой мыши.
- Повторите шаги 3.2.6-3.2.7 один раз в неделю 4 недель подряд.
- Оцените клинические симптомы ЕАЕ ежедневно с помощью стандартных критериев37 (0,5 хромать хвост конце, 1-хромать хвост, 2-вмеру задние конечности слабость, слабость 3-тяжелые задних конечностей, 4-комплект задних конечностей паралич, 5-квадриплегией или устаревшей состояние, 6-смерть).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Дифференциация и выбор BMDCs:
Клетки-предшественники костного мозга были культивировали в полной RPMI среде в присутствии ГМ-КСФ и Ил-4, чтобы дифференцироваться в ОРС в течение 7 дней (рис. 1A). День 1 клетки были небольшими по размеру и показал сферических морфологии. Мойка с PBS, перед заменой свежей среды на 3 день помогли клетки в форме кластеров и также увеличил численность населения CD11c+ клеток. На 4 день BMDCs были увеличены в размерах и начало формирования кластера. Приклеенная макрофаги были также преобразованы и наблюдается в нижней части пластины с удлиненной формы. На 5 день образуются больших размеров кластеров BMDCs. На 6 день также наблюдалось большое количество полу сторонником и плавающей BMDCs. BMDCs были собраны на 7 день и анализируемой проточной цитометрии для выражения CD11c как маркер конкретных мышиных DCs. Как показано в участке цитометрии представитель потока на рисунке 1B, около 83,6% BMDCs, выражая CD11c были получены этим методом.
Индукция и генетических характеристик TolDCs:
Известно, что некоторые из агентов, известных побудить TolDCs, таких как витамин D338 и дексаметазона39, вниз регулировать выражение DC поверхности лигандов, включая MHC II и костимуляторных молекул, CD40, CD80 и CD86. Напротив в контексте либо ЛПС или CD40L-индуцированной созревания DCs, ингибиторов кальциневрина циклоспорина A и FK506 показал никакого эффекта на выражение CD83, CD80, CD86 и MHC II-33. Как показал анализ цитометрия потоков, индукции TolDC по CDDO-ОАФК не оказало существенного влияния на LPS-индуцированной поверхности лигандом выражение DCs, включая CD80, CD86, MHC II, PD-L1 и CD40. (Рисунок 2).
Кроме того сравнительный анализ транскриптом и цитокина BMDCs лечение с или без CDDO-ОАФК в присутствии или отсутствие LPS изображен профиль модуляции воспалительной ген. CDDO-ОАФК лечения значительно сократила генов провоспалительных цитокинов LPS индуцированной например ИФН γ, Ил-12, EDN1, TNFα, IL-6 и IL-23 (Рисунок 3А-3F). Они известны цитокинов Th1 (ИФН γ и IL-12) и Th17 (IL-6 и IL-23) клетки дифференциации. Кроме того, CDDO-ОАФК лечение BMDCs показали повышение экспрессии генов противовоспалительных цитокинов, например Ил-4, Ил-10, TGF-β и Хо-1 (рис. 4Aсостав). Эти противовоспалительное гены известны модулятор аутоиммунных заболеваний путем поощрения Th2 (Ил-4) и дифференцировки клеток Treg (Ил-10 и TGF-β). 40 здесь важно отметить, что отличительной Ил-12−; производство цитокинов ИЛ-10+ 36, индукции Хо-1 выражение13и ингибирование EDN-141 индуцированных CDDO-ОАФК лечения, все известные для аутентификации DCs tolerogenic функции.
Сотовая и функциональных характеристик TolDCs в пробирке
DC-опосредованной T пролиферации известно быть вызвано как участие костимуляторных поверхности лиганд, так и секрецию цитокинов и растворимых медиаторов7. Однако, TolDCs ингибируют Т-клеток ответы через несколько механизмов:, вызывая анергия Т-клеток, активно содействуя исключить аутореактивная клеток и содействуя поляризации наивно T клетки до Tregs42. Мы уже сообщали, что функциональная характеристика CDDO-ОАФК индуцированных TolDCs37. Анергия т-клеток и удаления аутореактивная Т-клеток могут быть проанализированы самостоятельно проверив поверхностных маркеров или Annexin V/7-AAD окрашивание. Однако мы косвенно подтвердил этот фенотип путем измерения распространения индекс Т-клеток. Для этого мы использовали трансгенных мышей C57BL/6 OTII Т-клеток и подвергается сингенных DCs извлечено от мышей C57BL/6 и с или без CDDO-ОАФК. Эти DCs были вымыты и совместно культивируемых с CFSE пятнами Т-клеток с пептидной OVA. Мы наблюдали значительное снижение пролиферации клеток T, CDDO-ОАФК предварительно очищенной DCs, предлагая их tolerogenic фенотип (рис. 5).
В естественных условиях функциональная характеристика TolDCs в доклинических модели аутоиммунных заболеваний
Наконец можно тестировать функциональность ОАФК индуцированной TolDCs любой из ряда доклинических в естественных условиях модели характеризуются аутоиммунные воспалительные функции или. Поскольку ЕАЕ широко признанных доклинических мышиных модель болезни клинических иммунной системы центральной нервной системы, MS43, мы использовали это в нашем текущем исследовании. В целях дальнейшего изучения в vivo функциональность CDDO-ОАФК индуцированных TolDCs, мы оспорили их в доклинических мышиных модели пассивной ЕАЕ. Для этого BMDCs были культивируемых с или без CDDO-ОАФК в присутствии ПЛАСТИНОК и MOG (35-55). Эти клетки затем вводили неоднократно, как регулярные протокол, изображенные в рисунке 6A и мышей регулярно наблюдались на проявление клинических признаков. Как и ожидалось, ПЛАСТИНОК и MOG (35-55) пульсирующий BMDCs, клинические симптомы ЕАЕ, однако; CDDO-ОАФК загрунтовать BMDCs относились группы показали задержки начала заболевания с значительно снижение клинических симптомов (Рисунок 6B). Эти результаты проверки иммуносупрессивные фенотипа TolDCs, индуцированных CDDO-ОАФК лечения.
Рисунок 1: развитие и фенотипические характеристики BMDCs: (A) костного мозга клетки были промыть из берцовой и бедренной костей мышей C57BL/6 и далее продифференцировано BMDCs. Формирования кластера соответствующей ячейки было считано световой микроскопии весь период дифференциации (шкала баров, 100µm). (B) BMDCs дифференциация была подтверждена CD11c поверхности выражение, как анализ СУИМ. Графики показывают процент расширенной CD11c+ клеток населения. (C) Gating стратегия BMDCs. клеток были впервые закрытого исключить мусора (FSC против SSC). Дуплет изоляции ворота был использован для ворот на фуфайки клетки (FL2-W против FL2-A). В ячейках синглет живые клетки были закрытого на участке 7-AAD (7-AAD против FSC). Затем клетки были далее проанализированы и условного выражения CD11c. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: DC клеток поверхности лигандом выражение неизменной по CDDO-ОАФК. Клетки были предварительно обработаны в наличие или отсутствие CDDO-ОАФК (200 Нм) за 1 час до стимуляции с ПЛАСТИНОК (100 нг/мл) для 24 часов. Клеток поверхности выражение CD80, CD86, MHC II, PD-L1 и CD40 был проанализирован проточной цитометрии. Эта цифра была изменена из Научных докладов 7, номер статьи: 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. Воспроизведены и переизданы с авторского разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: CDDO-ОАФК изменены генетические и белка фенотип иммуногенность DCs. BMDCs были предварительно обработанных в наличие или отсутствие CDDO-ОАФК (50-400 Нм) за 1 час до того ПЛАСТИНОК (100 нг/мл), и либо собирают для извлечение RNA (4 ч.) или разрешено состояние питательной среды для 24 часов. до сбора для анализа цитокина. QRT ПЦР и ИФА были измерены уровни IL-12 (B), TNFα (D), IL-6 (Е) и Ил-23 (F). В то время как уровень ИФН γ (A) был измерен qRT-PCR и EDN-1 (C) по ELISA одиночку. Результаты выражаются как среднее ± с.д. трех экспериментов. * P < 0,05, ** P < 0.01, *** P < 0,001 по сравнению с группами LPS-лечение. Непарные студент t теста. Эта цифра была изменена из Научных докладов 7, номер статьи: 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. Воспроизведены и переиздано с авторского разрешения.» Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: CDDO-ОАФК индуцированных TolDCs фенотип подтверждены выражением генов и белков. BMDCs были предварительно обработаны в наличие или отсутствие CDDO-ОАФК (10-400 Нм) за 1 час до того ПЛАСТИНОК (100 нг/мл), и клетки были собраны за извлечение RNA после 24 часов. Уровни IL-4 (A), Ил-10 (B) и TGF-β (C) были измерены qRT-ПЦР. (D) lysates клетки белки были собраны в 12 часов. для анализа и уровни Хо-1 и β-актина выражение определяется Западный blotting. Результаты выражаются как среднее ± с.д. трех экспериментов. * P < 0,05, ** P < 0.01, *** P < 0,001 по сравнению с группами LPS-лечение. Непарные студент t теста. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: CDDO-ОАФК подвергаются DCs подавлять пролиферацию клеток Т. РСУ были предварительно обработаны с CDDO-ОАФК (100-400 Нм) только 1 час, затем промывают и совместно культивируемых с CFSE пятнами Т-клеток в 1:10 соотношение. (A) splenic клетки T и DCs были изолированы от трансгенных мышей C57BL/6 OTII и мышей C57BL/6, соответственно. CDDO-ОАФК предварительно обработанные DCs были совместно культивируемых с CFSE пятнами Т-клеток с (ш / в) или без (искл) OVA дополнение во время инкубации. Пролиферация клеток t определяется проточной цитометрии в день 2. Графы изображают процент делящиеся клетки T относительно числа Т-клеточного деления. Данных является представлением 3 независимых экспериментов. Эта цифра была изменена из Научных докладов 7, номер статьи: 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. Воспроизведены и переизданы с авторского разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: MOG загрунтовать DC-индуцированной пассивный ЕАЕ отменен, TolDCs. (A) ЕАЕ индукции, MOG (35-55)-пульсирующий BMDCs. Зрелые BMDCs лечили в наличие или отсутствие CDDO-ОАФК (400 Нм) и впоследствии импульсного с MOG (35-55) для 4 часов. В общей сложности 200 мкл 2 × 106 клеток в ведении подкожно в область фланг мышей C57BL/6 раз каждую неделю в общей сложности четыре инъекции. Каждый раз, PTX в ведении инъекций и.п., сразу и снова 2 дней (день 0 на 4 цикла). (B) клинические результаты были записанные после всех четырех инъекции, используя стандартные критерии. Все данные были представлены как среднее ± S.E.M. * P < 0,05. Несколько t тесты с Holm-Sidak анализ (n = 7 мышей в каждой группе). Эта цифра была изменена из Научных докладов 7, номер статьи: 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. Воспроизведены и переизданы с авторского разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом документе описывается эффективный протокол, который может использоваться для герметизации для создания ОРС и различать их впоследствии в TolDCs, и мы предлагаем, что это может применяться для оценки новых молекулярных целевых агентов способность заставить TolDC фенотип. Как описано в настоящем докладе, мы следовали последовательность, в которой мы впервые проанализированы TolDC выражение поверхности лигандов проточной цитометрии, последующую оценку DC цитокинового профиля как измеряется qRT ПЦР и ИФА. Наконец было подтверждено иммунорегуляторное функция TolDCs, продемонстрировав свою способность уменьшить Т-клеток распространения в пробирке и их эффективности, чтобы подавить аутоиммунные заболевания в естественных условиях, с использованием доклинические мышиных ЕАЕ модели МС.
В нашем протокол ОРС были создается и продифференцировано от костного мозга мышиных прекурсоров с сочетанием ГМ-КСФ и Ил-4. Другие протоколы использовали лигандами формы как тирозин киназа 3 (Flt3L) в питательную среду для создания ОРС44. Хотя использование Flt3L увеличивает доходность ОРС, эти ОРС обычно принимают 2 дней (9 дней), чтобы урожай, по сравнению с ГМ-КСФ/Ил-4 сложения (7 дней)44. Что еще более важно, iDC, созданный из Flt3L часто дифференцироваться в обоих cDCs (CD8– и CD8+) и pDCs45 , что функционально и фенотипически эквиваленты для статических контроллеров домена в естественных условиях. Однако, ГМ-КСФ/Ил-4 неизменно вызывает дифференциация iDC к cDCs (CD8–) только44 и во время созревания, они продемонстрировали аналогичные знаки воспалительных DCs46. Примечательно, чтобы знать, что ГМ-КСФ/Ил-4 часто используется в клинических испытаний и фундаментальных исследований за преимущество дифференциации DCs от моноцитов или CD34+ прародителями44. Было показано, что ОРС, созданный из этих двух методов производят морфологически различные клетки, которые также обладают разные ячейки поверхностных маркеров и выставку собственный цитокинового профиля после их активации. Кроме того TolDCs, вызванных эти методы различаются в их способности мигрируют в ответ эозинофилов факторов и побудить антиген специфические Т-клеток ответов44,45. Мы понимаем, что CD8+ DCs может exhibit больше потенциал в индукции TolDC из-за их уникальных возможностей cross-tolerance47. Однако, затем необходимо далее ячейку Сортировка от BMDCs производных Flt3L расследовать конкретные CD8+ DC подмножества. Кроме того, так как, ГМ-КСФ/Ил-4 индуцированных BMDCs превосходят в стимуляции Т-клеток и производство воспалительных медиаторов, после LPS лечения44,45, мы обнаружили, что эта стратегия дала более воспроизводимые результаты нашей эксперименты.
BMDCs производные от ГМ-КСФ/Ил-4 начала выразить CD11c вокруг дней 4 и обогатить выражение после день 648. Эта культура процедура может продолжаться до тех пор, пока день 10-12 с более низкой плотностью покрытия клеток костного мозга и низкой дозе GMC-SF день 8-10-49. В этом протоколе CDDO-ОАФК (синтетические тритерпеновые) и ЛПС были добавлены в тандеме как агентов, чтобы стимулировать толерантность DC и созревания, соответственно. Недавно мы сообщили, что ОРС, добываемых из культур, используя этот метод BMDC поколения демонстрируют функциональные TolDC фенотип, когда предварительно обработанных с CDDO-ОАФК37. Примечательно, что CDDO-ОАФК, который только добавил к культур после того, как iDC урожай (день 7)37, в отличие от агентов как витамин D3, который должен быть добавлен к культур несколько раз во время iDC дифференциации (2, 4, 6 день)50. Кроме того это индукции TolDCs, витамин D3 может зависеть от различных механизмов, которые должны инициироваться как во время, так и после iDC дифференциация51. Наши данные предполагают, что добавление CDDO-ОАФК во время дифференциация iDC не оказало влияния на чистоту CD11c + РС, но доза зависим снизить доходность ОРС на 7 день (данные не показаны). Нашего анализа также показывают, что более высокая концентрация CDDO-ОАФК используется в этих экспериментах могут быть токсичными для прогениторных клеток костного мозга, даже несмотря на то, что iDC показало нормальное жизнеспособности этой концентрации CDDO-ОАФК37. Предполагается, что TolDC индукции могут быть оптимизированы путем тщательного анализа последствий сроков и продолжительности воздействия агентов как CDDO-ОАФК.
Важно рассмотреть альтернативные методы и механизмы, через которые ОРС может быть вызвана для офицеров других чем LPS, например CD40L, ФНО α и ИФН γ52. DC созревания LPS через Толл подобные рецепторы 4(TLR4) приводит активации нескольких факторов транскрипции, включая ядерный фактор κB (NF-κB), p38 Митоген активированный протеин киназы (p38 MAPK), c-Jun N-терминальный киназы (JNK) и внеклеточной сигнал регулируемых протеинкиназы (ERK1/2). Созревания DCs CD40L и ФНО α через CD40 и ФНО рецепторы соответственно индуцирует путь NF-κB. В противоположность этому ИФН γ стимулирует различные пути, включая активацию Janus киназа (Як), тирозин киназы (TYK), и сигнал датчика и активатор транскрипции белков (статистика), и эти вниз по течению эффекты дополняются активации NF-κB путь52. Кроме того в то время как профиль выражение гена CD40L ФНО α-на основе/DC созревания свидетельствует о том, что эти DCs поляризовать клетки T к реакции клеток Th253, DC созревания, ИФН γ сильно смещены в сторону Th1 клеток ответ54. Таким образом эти другие индукторов DC созревания, которые связаны с дифференциации к Т-клеток конкретных подмножеств не работают в этом протоколе.
Несколько отчетов показали, что ex vivo-дифференцированной DCs способны индуцировать полный спектр клинических симптомов ЕАЕ и патологии в мышей55. Метод пассивного ЕАЕ индукции, ex vivo активация DCs была принята с различными изменениями в различных лабораториях. Сочетание пассивных и активных ЕАЕ индукции администрацией MOG загрунтовать BMDCs, за 7 дней до иммунизации с MOG и полный Фройнд в адъювантной (CFA) приводит к более высокие оценки клинических симптомов (пик клиническая оценка: 3.5) по сравнению с пассивной ЕАЕ индукции администрацией MOG загрунтовать BMDCs только (пик клиническая оценка: 2)56. Результаты с помощью этого метода, сочетая MOG загрунтовать BMDCs с MOG иммунизации свидетельствует о том, что заболевания происходит на 9 день после иммунизации с56MOG и CFA. Однако поскольку известно, что CFA вызывает значительное воспаление на сайте администрации57, мы использовали пассивный ЕАЕ индукции администрацией только в наш протокол РС для того, чтобы эффективно анализировать влияние TolDCs во время ЕАЕ. Для дальнейшего подтверждения функциональной фенотипа TolDCs, необходимо также проверить их в подавление клинических симптомов активных ЕАЕ мышей. Администрирования маршрут DCs также имеет решающее значение для индукции ЕАЕ симптомы58. Как сообщили в нашей лаборатории и других, подкожной инъекции BMDCs в регионе фланг мышей C57BL/6 раз в неделю для в общей сложности 3-4 инъекции индуцирует пик клиническая оценка ЕАЕ вокруг 2-2,5 с воспроизводимые заболевания на день 11-1237 ,58. Мы предоставили короткий клип, чтобы продемонстрировать различные клинические симптомы между активным и пассивным ЕАЕ индукции (1 видео).
Признанные ограничения нашего протокола включают время, необходимое на методы, используемые и зависимость от-физиологически соответствующих микроокружение для дифференциации BMDC. Однако в то время как антитела обогатили методы разделения столбцов коллекции для DCs и Т-клетки из мышиных селезенки может быть больше времени эффективной, она страдает от низкой доходности желаемого DC населения. Таким образом преимущество метода костного мозга, полученных DC развития является журнал масштаба высокую доходность DC населения по сравнению с разделения столбца антитела от всего селезенка. Как отмечалось выше, DCs генерируется в пробирке , этот метод требует высокой концентрации цитокинов добавок, которая физиологически не относится к DCs в vivo микроокружения59 и также не обеспечивает долгосрочного устойчивость DC. ГМ-КСФ, используемые в нашей протокол также не является необходимым цитокина для нормальной DC дифференциации в vivo60. Тем не менее предлагаемый протокол BMDC поколения можно воспроизвести дает высокий процент функционально TolDCs и следует рассматривать как весьма надежных и воспроизводимых метод для генерации функциональных DCs с tolerogenic свойствами.
В заключение TolDCs, созданный из протокола, описанные здесь может быть эффективно характеризуется путем оценки их профили выражение генов и белков, определения их способность модулировать Т клеток зависимых иммунных реакций в пробиркеи Оценка их функции как приемные клеточной терапии подавить ЕАЕ индукции в естественных условиях. Наш протокол обеспечивает основу для оценки каких-либо новых агентов, мысли иметь способность заставить TolDCs и дальнейшего ускорения процесса развития терапевтических для TolDCs от скамьи в клинику.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет
Acknowledgments
Мы благодарим повестования Фармацевтика за предоставление CDDO-ОАФК. Мы также признаем поддержку Джейн и ли Сейдман кафедры педиатрического рака инноваций (Джон Letterio). Эта работа была поддержана Министерством обороны [W81XWH-12-1-0452]; Энджи Фаулер подростков и молодых взрослых рака исследовательская инициатива в случае всеобъемлющем онкологический центр; и Каллахан выпускник Академии награду за Hsi Цзюй Вэй F.J. Каллахан фонда.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CDDO-DFPA (RTA-408) | Reata Pharmaceuticals | in house synthesis | Cell culture |
| Mouse GM-CSF | Peprotech Inc. | 315-03 | BMDC differentiation |
| Mouse IL-4 | Peprotech Inc. | 214-14 | BMDC differentiation |
| Lipopolysaccharides (LPS) | Sigma Aldrich Inc. | L2880 | Cell culture |
| β-mercaptoethanol | Sigma Aldrich Inc. | 516732 | Cell culture |
| Pertussis toxin (PTX) | R&D systems | 3097 | EAE induction |
| MOG (35–55) peptide | 21stCentury Biochemicals | in house synthesis | EAE induction |
| Trypan blue | Gibco, Life Technologies | 15250-061 | Cell culture |
| RPMI-1640 plus L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 11875-093 | Cell culture |
| Non-essential amino acid (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | Cell culture |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630080 | Cell culture |
| penicillin/streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | Cell culture |
| 40 μm cell strainer | Corning | 352340 | Cell isolation |
| PE-conjugated CD80 | BD Biosciences | 557227 | Flow cytometry |
| PE-conjugated CD86 | BD Biosciences | 555665 | Flow cytometry |
| PE-conjugated PD-L1 | BioLegend | 124307 | Flow cytometry |
| APC-conjugated MHCII | Miltenyi Biotec Inc. | 130-112-388 | Flow cytometry |
| APC-conjugated CD11c | BD Biosciences | 340544 | Flow cytometry |
| Isotype matched PE | Miltenyi Biotec Inc. | 130-091-835 | Flow cytometry |
| Isotype matched APC | Miltenyi Biotec Inc. | 130-091-836 | Flow cytometry |
| CFSE | BioLegend | 423801 | T cell proliferation assay |
| Pan dendritic cell isolation kit | Miltenyi Biotec Inc. | 130-100-875 | T cell proliferation assay |
| FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotec Inc. | 130-100-875 | T cell proliferation assay |
| Pan Dendritic Cell Biotin-Antibody Cocktail | Miltenyi Biotec Inc. | 130-100-875 | T cell proliferation assay |
| Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec Inc. | 130-100-875 | T cell proliferation assay |
| CD4+ T cell isolation kit | Miltenyi Biotec Inc. | 130-104-454 | T cell proliferation assay |
| CD4+ T cell Biotin-Antibody Cocktail | Miltenyi Biotec Inc. | 130-104-454 | T cell proliferation assay |
| Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec Inc. | 130-104-454 | T cell proliferation assay |
| ACK lysing buffer | ThermoFisher Scientific | A1049201 | BMDC differentiation |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309626 | T cell proliferation assay |
| 3 ml syringe | BD Biosciences | 309588 | BMDC differentiation |
| 25G needle | BD Biosciences | 309626 | T cell proliferation assay |
| 23G needle | BD Biosciences | 309588 | BMDC differentiation |
| BSA | Sigma Aldrich Inc. | A2058 | T cell proliferation assay |
| EDTA | ThermoFisher Scientific | 15575020 | T cell proliferation assay |
| LS Column | Miltenyi Biotec Inc. | 130-042-401 | T cell proliferation assay |
| Pre-Separation Filter | Miltenyi Biotec Inc. | 130-095-823 | T cell proliferation assay |
| collagenase D | Sigma Aldrich Inc. | 11088858001 | T cell proliferation assay |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14025076 | T cell proliferation assay |
| ovalbumin (OVA) peptide 323–329 | Sigma Aldrich Inc. | O1641 | T cell proliferation assay |
| Mouse IFN-γ TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm01168134_m1 | qRT-PCR |
| Mouse IL-12a TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm00434165 | qRT-PCR |
| Mouse IL-12 p70 DuoSet ELISA | R&D systems | DY419-05 | ELISA |
| Mouse EDN-1 ELISA | RayBiotech | ELM-EDN1-1 | ELISA |
| TNF-α TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm00443258 | qRT-PCR |
| Mouse TNF-α Quantikine ELISA Kit | R&D systems | MTA00B | ELISA |
| IL-6 TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm00446190 | qRT-PCR |
| Mouse IL-6 Quantikine ELISA Kit | R&D systems | M6000B | ELISA |
| IL-23a TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm01160011 | qRT-PCR |
| Mouse IL-23 DuoSet ELISA | R&D systems | DY1887-05 | ELISA |
| IL-4 TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm99999154_m1 | qRT-PCR |
| IL-10 TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm01288386_m1 | qRT-PCR |
| TGF-β TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm01178820_m1 | qRT-PCR |
| Anti-Heme Oxygenase 1 antibody | Abcam | ab13248 | Western blotting |
| Anti-β-actin antibody | Abcam | ab8226 | Western blotting |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad Inc. | qRT-PCR | |
| BD FACSCalibur Cell Analyzer | BD Biosciences | Flow cytometry |
References
- Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).
- Inaba, K., et al. Efficient presentation of phagocytosed cellular fragments on the major histocompatibility complex class II products of dendritic cells. J Exp Med. 188 (11), 2163-2173 (1998).
- Banchereau, J., et al. Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol. 18, 767-811 (2000).
- Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 179 (4), 1109-1118 (1994).
- Hemmi, H., Akira, S. TLR signalling and the function of dendritic cells. Chem Immunol Allergy. 86, 120-135 (2005).
- Caux, C., et al. B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells. J Exp Med. 180 (5), 1841-1847 (1994).
- Chastain, E. M., Duncan, D. S., Rodgers, J. M., Miller, S. D. The role of antigen presenting cells in multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 265-274 (2011).
- Smeltz, R. B., Chen, J., Ehrhardt, R., Shevach, E. M. Role of IFN-gamma in Th1 differentiation: IFN-gamma regulates IL-18R alpha expression by preventing the negative effects of IL-4 and by inducing/maintaining IL-12 receptor beta 2 expression. J Immunol. 168 (12), 6165-6172 (2002).
- Gyulveszi, G., Haak, S., Becher, B. IL-23-driven encephalo-tropism and Th17 polarization during CNS-inflammation in vivo. Eur J Immunol. 39 (7), 1864-1869 (2009).
- Kronenberg, M., Rudensky, A. Regulation of immunity by self-reactive T cells. Nature. 435 (7042), 598-604 (2005).
- Boks, M. A., et al. IL-10-generated tolerogenic dendritic cells are optimal for functional regulatory T cell induction--a comparative study of human clinical-applicable DC. Clin Immunol. 142 (3), 332-342 (2012).
- Anderson, A. E., et al. Tolerogenic dendritic cells generated with dexamethasone and vitamin D3 regulate rheumatoid arthritis CD4+ T cells partly via transforming growth factor-beta1. Clin Exp Immunol. 187 (1), 113-123 (2017).
- Chauveau, C., et al. Heme oxygenase-1 expression inhibits dendritic cell maturation and proinflammatory function but conserves IL-10 expression. Blood. 106 (5), 1694-1702 (2005).
- Maldonado, R. A., von Andrian, U. H. How tolerogenic dendritic cells induce regulatory T cells. Adv Immunol. 108, 111-165 (2010).
- Schmidt, S., Nino-Castro, A., Schultze, J. Regulatory dendritic cells: there is more than just immune activation. Frontiers in Immunology. 3 (274), (2012).
- Hilkens, C. M., Isaacs, J. D., Thomson, A. W. Development of dendritic cell-based immunotherapy for autoimmunity. Int Rev Immunol. 29 (2), 156-183 (2010).
- Dhodapkar, M. V., Steinman, R. M. Antigen-bearing immature dendritic cells induce peptide-specific CD8(+) regulatory T cells in vivo in humans. Blood. 100 (1), 174-177 (2002).
- Dhodapkar, M. V., Steinman, R. M., Krasovsky, J., Munz, C., Bhardwaj, N. Antigen-specific inhibition of effector T cell function in humans after injection of immature dendritic cells. J Exp Med. 193 (2), 233-238 (2001).
- Giannoukakis, N., Phillips, B., Finegold, D., Harnaha, J., Trucco, M. Phase I (safety) study of autologous tolerogenic dendritic cells in type 1 diabetic patients. Diabetes Care. 34 (9), 2026-2032 (2011).
- Benham, H., et al. Citrullinated peptide dendritic cell immunotherapy in HLA risk genotype-positive rheumatoid arthritis patients. Sci Transl Med. 7 (290), 290ra287 (2015).
- Bell, G. M., et al. Autologous tolerogenic dendritic cells for rheumatoid and inflammatory arthritis. Ann Rheum Dis. 76 (1), 227-234 (2017).
- University Hospital, A. A "Negative" Dendritic Cell-based Vaccine for the Treatment of Multiple Sclerosis: a First-in-human Clinical Trial (MS tolDC). ClinicalTrials.gov. , (2015).
- Pujol, F. I. G. T. i Tolerogenic Dendritic Cells as a Therapeutic Strategy for the Treatment of Multiple Sclerosis Patients (TOLERVIT-MS) (TOLERVIT-MS). ClinicalTrials.gov. , (2016).
- Varea, S. Treatment of Multiple Sclerosis and Neuromyelitis Optica With Regulatory Dendritic Cell: Clinical Trial Phase 1 B. ClinicalTrials.gov. , (2017).
- Jauregui-Amezaga, A., et al. Intraperitoneal Administration of Autologous Tolerogenic Dendritic Cells for Refractory Crohn's Disease: A Phase I Study. J Crohns Colitis. 9 (12), 1071-1078 (2015).
- Mahnke, K., Schmitt, E., Bonifaz, L., Enk, A. H., Jonuleit, H. Immature, but not inactive: the tolerogenic function of immature dendritic cells. Immunol Cell Biol. 80 (5), 477-483 (2002).
- Lutz, M. B., Schuler, G. Immature, semi-mature and fully mature dendritic cells: which signals induce tolerance or immunity? Trends Immunol. 23 (9), 445-449 (2002).
- Suciu-Foca, N., et al. Molecular characterization of allospecific T suppressor and tolerogenic dendritic cells: review. Int Immunopharmacol. 5 (1), 7-11 (2005).
- Wakkach, A., et al. Characterization of dendritic cells that induce tolerance and T regulatory 1 cell differentiation in vivo. Immunity. 18 (5), 605-617 (2003).
- Szeles, L., et al. 1,25-dihydroxyvitamin D3 is an autonomous regulator of the transcriptional changes leading to a tolerogenic dendritic cell phenotype. J Immunol. 182 (4), 2074-2083 (2009).
- Unger, W. W., Laban, S., Kleijwegt, F. S., vander Slik, A. R., Roep, B. O. Induction of Treg by monocyte-derived DC modulated by vitamin D3 or dexamethasone: differential role for PD-L1. Eur J Immunol. 39 (11), 3147-3159 (2009).
- Reichardt, W., et al. Impact of mammalian target of rapamycin inhibition on lymphoid homing and tolerogenic function of nanoparticle-labeled dendritic cells following allogeneic hematopoietic cell transplantation. J Immunol. 181 (7), 4770-4779 (2008).
- Woltman, A. M., et al. The effect of calcineurin inhibitors and corticosteroids on the differentiation of human dendritic cells. Eur J Immunol. 30 (7), 1807-1812 (2000).
- Hackstein, H., Thomson, A. W. Dendritic cells: emerging pharmacological targets of immunosuppressive drugs. Nat Rev Immunol. 4 (1), 24-34 (2004).
- Torres-Aguilar, H., Blank, M., Jara, L. J., Shoenfeld, Y. Tolerogenic dendritic cells in autoimmune diseases: crucial players in induction and prevention of autoimmunity. Autoimmun Rev. 10 (1), 8-17 (2010).
- Rutella, S., Danese, S., Leone, G. Tolerogenic dendritic cells: cytokine modulation comes of age. Blood. 108 (5), 1435-1440 (2006).
- Wei, H. J., Pareek, T. K., Liu, Q., Letterio, J. J. A unique tolerizing dendritic cell phenotype induced by the synthetic triterpenoid CDDO-DFPA (RTA-408) is protective against EAE. Sci Rep. 7 (1), 9886 (2017).
- van Etten, E., Mathieu, C. Immunoregulation by 1,25-dihydroxyvitamin D3: basic concepts. J Steroid Biochem Mol Biol. 97 (1-2), 93-101 (2005).
- Pan, J., et al. Dexamethasone inhibits the antigen presentation of dendritic cells in MHC class II pathway. Immunol Lett. 76 (3), 153-161 (2001).
- Zhu, J., Paul, W. E. Heterogeneity and plasticity of T helper cells. Cell Res. 20 (1), 4-12 (2010).
- Spirig, R., et al. TLR2 and TLR4 agonists induce production of the vasoactive peptide endothelin-1 by human dendritic cells. Mol Immunol. 46 (15), 3178-3182 (2009).
- Walton, E. L. Make immunological peace not war: Potential applications of tolerogenic dendritic cells. Biomed J. 40 (2), 77-79 (2017).
- Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). Br J Pharmacol. 164 (4), 1079-1106 (2011).
- Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking. J Immunol. 179 (11), 7577-7584 (2007).
- Angelov, G. S., Tomkowiak, M., Marcais, A., Leverrier, Y., Marvel, J. Flt3 ligand-generated murine plasmacytoid and conventional dendritic cells differ in their capacity to prime naive CD8 T cells and to generate memory cells in vivo. J Immunol. 175 (1), 189-195 (2005).
- Lowes, M. A., et al. Increase in TNF-alpha and inducible nitric oxide synthase-expressing dendritic cells in psoriasis and reduction with efalizumab (anti-CD11a). Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (52), 19057-19062 (2005).
- Schnorrer, P., et al. The dominant role of CD8+ dendritic cells in cross-presentation is not dictated by antigen capture. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (28), 10729-10734 (2006).
- Wang, W., Li, J., Wu, K., Azhati, B., Rexiati, M. Culture and Identification of Mouse Bone Marrow-Derived Dendritic Cells and Their Capability to Induce T Lymphocyte Proliferation. Med Sci Monit. 22, 244-250 (2016).
- Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J Immunol Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
- Griffin, M. D., et al. Dendritic cell modulation by 1alpha,25 dihydroxyvitamin D3 and its analogs: a vitamin D receptor-dependent pathway that promotes a persistent state of immaturity in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (12), 6800-6805 (2001).
- Bscheider, M., Butcher, E. C. Vitamin D immunoregulation through dendritic cells. Immunology. 148 (3), 227-236 (2016).
- Castiello, L., et al. Monocyte-derived DC maturation strategies and related pathways: a transcriptional view. Cancer Immunol Immunother. 60 (4), 457-466 (2011).
- Decker, W. K., et al. Deficient T(H)-1 responses from TNF-alpha-matured and alpha-CD40-matured dendritic cells. J Immunother. 31 (2), 157-165 (2008).
- Longhi, M. P., et al. Dendritic cells require a systemic type I interferon response to mature and induce CD4+ Th1 immunity with poly IC as adjuvant. J Exp Med. 206 (7), 1589-1602 (2009).
- Link, H., Huang, Y. M., Xiao, B. G. Dendritic cells in experimental allergic encephalomyelitis and multiple sclerosis. J Neuroimmunol. 100 (1-2), 102-110 (1999).
- Leech, M. D., et al. Cutting edge: IL-6-dependent autoimmune disease: dendritic cells as a sufficient, but transient, source. J Immunol. 190 (3), 881-885 (2013).
- Saul, L., Besusso, D., Mellanby, R. J. LPS-matured CD11c+ bone marrow-derived dendritic cells can initiate autoimmune pathology with minimal injection site inflammation. Lab Anim. 51 (3), 292-300 (2017).
- Aghdami, N., Gharibdoost, F., Moazzeni, S. M. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) induced by antigen pulsed dendritic cells in the C57BL/6 mouse: influence of injection route. Exp Anim. 57 (1), 45-55 (2008).
- Wilson, H. L. Limitations with in vitro production of dendritic cells using cytokines. J Leukoc Biol. 75 (4), 600-603 (2004).
- Ni, K., O'Neill, H. C. Development of dendritic cells from GM-CSF-/- mice in vitro : GM-CSF enhances production and survival of cells. Dev Immunol. 8 (2), 133-146 (2001).
