Summary
ここでは、開発し免疫寛容樹状細胞 (TolDCs) の特徴し、その免疫療法の有用性を評価するためのプロトコルを提案する.
Abstract
外国の抗原に対する調整の応答のタイトなバランスを維持することによって免疫システムが作動して共生生物に由来する抗原と同様に自己抗原に対する応答のない状態を維持します。この免疫恒常性の中断は、慢性炎症、自己免疫疾患の開発につながることができます。樹状細胞 (Dc) は、外国の抗原に対する免疫応答を開始するナイーブ T 細胞を活性化に関与する生得の免疫組織のプロフェッショナルな抗原提示細胞です。しかし、Dc は行動を維持し T 細胞寛容を促進し、どちらか自己免疫または慢性炎症状態の発展に貢献するエフェクター細胞を抑制する TolDCs にも区別できます。TolDCs の私達の理解の最近の進歩は、その分化条件を調節することによって DC 耐性が得られることを示唆しています。この現象は、多数の免疫疾患で免疫寛容を破る原因の TolDC 療法の開発の途方もない成長につながっています。臨床免疫マウスモデルで成功した研究はさらに自己免疫疾患の治療に TolDCs の免疫療法の有用性を検証しました。今日、TolDCs 防御免疫をそのまま残しながら病原性自己免疫反応をターゲットに様々 な免疫疾患における免疫寛容を回復のための診療所で有望な免疫療法のツールとなっています。TolDCs を誘導するために複数のラボで戦略の配列が提案されているが、これらの細胞の機能的な細胞の表現型を特徴付けることは一貫性はありません。このプロトコルは、大量合成部の 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic と TolDCs にそれらを区別するために使用される一意のメソッド内の骨髄由来の Dc の開発のステップ バイ ステップ ガイドを提供します酸-フッ素-プロピル-アミド (CDDO DFPA)、および TolDCs の必須の分子シグネチャの分析を含む、彼らの表現型を確認するための技術。最後に、我々 は多発性硬化症の前臨床モデルでの免疫応答の in vitroとin vivoのテストで TolDC 関数を評価する手法を示す.
Introduction
樹状細胞 (Dc) 生来の免疫システムの不可欠な部分し最初発見され1主プロフェッショナルな抗原提示細胞として、1973 年にラルフ ・ スタインマンと Zanvil コーンによって特徴付けられます。Dc リンク自然免疫と適応免疫システム2に二次リンパ器官の T 細胞と B 細胞で主要組織適合遺伝子複合体 (MHC) に処理された抗原提示することで免疫活性化に重要な役割を果たすことが示されています。哺乳類の免疫系に骨髄の Dc、Dc (Pdc)3形質としてされている Dc の少なくとも 2 つのカテゴリがあります。従来の Dc (cDCs) CD11c 表現によって特徴付けられる未熟な Dc (Idc)体外骨髄前駆細胞や末梢血単球を用いたからと区別することができますと呼ばれ、また、骨髄性の Dc顆粒球マクロファージ ・ コロニー刺激因子 (GM-CSF) と IL-4 マウスや人間種、それぞれ4で。
『 危険 』 を活性化信号を病原体関連分子パターン (種緑化) または損傷関連分子パターン (湿気がある)、様々 なパターン認識受容体結合を介して成熟した Dc (Mdc) として免疫原性 Dc に向けて Idc 成熟をドライブするなど、DC の表面5。さらに免疫原性 Dc プライム ナイーブ T 細胞の増殖・分化アップレギュレーションを介して MHCII2、共刺激リガンド (CD80、CD86、CD40)6サイトカイン、その他水溶性メディエーター7。免疫原性 DCs からプロ炎症性仲介人の生産のカスケードは、サイトカインを介した T 細胞の分化に不可欠です。たとえば、IFN-γ および il-12 が th1 細胞分化8と IL-1, 必要な IL-6 と IL-23 は重要ナイーブ T 細胞 Th17 細胞9に向かって偏光です。成熟した Dc は、外国の抗原に反応する、自己抗原による自由な DC の活性化が耐アブレーションを原因し、その活性化組織破壊10 につながる自己反応性 T 細胞を生成することによって自己免疫疾患の開発の促進.
最近の報告では、DC の可塑性、その組織微小環境の内で異なるキューとやり取りして異なるエフェクター/サプレッサー DC サブセットに区別するために彼らの能力によって例示の明確な証拠を提供しています。IL-1011TGF-β12HO 113などの抗炎症メディエーターは、Dc (TolDCs) 免疫寛容を誘導することによって免疫抑制に重要な役割を再生する示されています。これらの TolDCs は、規制機能を取得し、14T 細胞増殖を抑制します。また、Dc による共刺激の欠如と TolDCs から抗炎症メディエーターの生産両方は制御性 T 細胞 (Treg) の誘導に貢献、Th1 と th17 細胞分化と拡大15も効果的に抑制します。過去の二十年でに、TolDCs の治療の可能性はいくつかの調査で、報告されています。これらの研究でex vivoの管理自己免疫疾患16の異なる前臨床モデルで TolDCs の改善だけでなく病的症状を生成がまた17 の患者で免疫の許容の開発につながった ,18。興味深いことに、今日 TolDCs 療法として考えられている代替または補助アプローチを含む、いくつかの臨床試験で自己免疫疾患のタイプ 1 糖尿病19、関節リウマチ20, 21、多発性硬化症 (MS)22,23,24Crohn 病25。
各種 TolDCs の開発に採用されているプロトコルがあり、いくつかの研究所は、生成と TolDCs の表現型特性の方法を報告しています。造血前駆細胞からの in vitro TolDCs 再現性をもって生成し、安定して免疫寛容状態体内26,27,28,29でそれらを維持するために、これらのメソッドを使用することができます。Idc は、様々 な免疫調節薬剤や抗炎症性サイトカインへの露出によって TolDCs に変換できます。たとえば、ビタミン D3 は IL-10 生産を増大させる、DCs から IL 12 分泌を抑制し、それにより免疫抑制機能30を後押しする知られているよく知られている薬剤です。また、Dc がリポ多糖 (LPS) などの強力な炎症性刺激にさらされるデキサメタゾン31、ラパマイシン32、コルチコステロイド33などいくつかの薬剤が示されているを誘発する、CD40、CD80、CD86、MHCII34DC 表面発現を減らすことによって TolDC の表現型。IL-10 および TGF-β が DC 耐性35とこれらのサイトカインの両方に複合暴露を誘導するためにほとんど研究抗炎症性サイトカインが Dc36抗原の表現型を誘導するために示されています。
免疫寛容の表現型マーカーではなく、DC は機能特性によって定義される偉大な TolDCs の細胞および機能特性評価のための一貫した方法を開発する必要があります。厳格かつ一貫性のあるプロトコルが一貫性のある評価と免疫寛容 DC 表現型の特性の確立必要があります我々 効果的かつ再現性をもって TolDC の表現型を誘導する新しいエージェントの能力を比較している場合さらに、実験室。ここで提供詳細なプロトコル マウスの造血前駆細胞から Idc を分離してその後 TolDCs、Idc に変換する能力の評価の下で新しいエージェントの有効性を分析するステップ バイ ステップのメソッドを提供する堅牢ですTolDCs の機能および表現型特性の in vitroとin vivoの両方。この説明には、その表面配位子、サイトカインのプロファイル、および体外免疫機能によって TolDCs を特徴づける精巧なメソッドが含まれています。我々 も MS、実験的自己免疫性脳脊髄炎 (EAE) の前臨床モデルでこれらの TolDCs の潜在的な治療上のアプリケーションを探索する方法の例を提供します。この確立されたプロトコルは TolDCs の誘導を促進するために新しいエージェントのキャパシティを評価する調査官を助け、TolDC 治療開発の範囲を拡大するための努力を容易に。
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Protocol
ケース ウェスタン リザーブ大学医学部の制度的動物ケアおよび使用委員会によって承認された手続きに準拠してすべての研究を行った。
1. 骨髄由来樹状細胞 (黒谷)
- オートクレーブを介してすべての手術器具を滅菌し、クラス II 生物学的安全キャビネット充当安全手順で実験を実行します。
- 8-10 週齢の c57bl/6 マウスを安楽死させる CO2箱を用いた。解離性の基板上にマウスを置くし、70% エタノールでリンスします。外科はさみを用いて脛骨腓骨、大腿骨の骨を切除し、10 cm 培養皿の中の 70% のエタノールで配置します。
- ティッシュを解剖する外科ブレードと鉗子を使用して 10 cm の蓋の上可能な限り、料理の文化し、脛骨と大腿骨 6 cm 培養皿の中の 70% のエタノールのそれらを置くに分離します。
- 脛骨と大腿骨の両方の端をトリミングするのにには、外科ブレードを使用します。12 ml の PBS を含む円錐管に骨の一方の端から骨髄の内容をフラッシュするのに 23 G 針付き 3 ml シリンジ 3 mL PBS を使用します。骨の両端の 3 倍この手順を繰り返します。
- 5 分間 300 x g で細胞懸濁液を遠心します。
- 上澄みを除去し、赤の血液細胞を削除する 5 分の 1 ml ACK 溶解バッファーで細胞ペレットを再懸濁します。
- 9 ml PBS ACK 溶解バッファーと 300 x g で 5 分間遠心を希釈するを追加します。
- 上澄みを除去し、10 ml の培地 (RPMI 1640 プラス L-グルタミン、10 %fbs、1% 非必須アミノ酸 (100 x)、10 mM HEPES、50 nM β-メルカプトエタノール、および 5% ペニシリン/ストレプトマイシン) で再懸濁します。
注: エンドトキシン濃度は、FBS で 0.1 未満 EU/ml をなければなりません。 - 細胞懸濁液を 40 μ m の細胞ストレーナを通過しの細胞懸濁液 20 μ l を取るし、トリパン ブルーの cytometer による生きているセルの数をカウントするの 80 μ l で混ぜます。
- 1 x 10 の6セル/15 ng/ml GM-CSF と 10 ng/ml IL 4 ml に細胞数を調整します。
- 1 x 106セル/6 ウェル プレートの各ウェルに ml の 3 ml をプレートし、37 ° C、5% CO2、および CO2インキュベーターの湿度 95% でセルを孵化させなさい。
注: 1 つのマウスの骨髄細胞は周辺 3 6 ウェル プレート 2 から配置することができることを示す 10 の7セル × 3-5。 - 3 日目、各ウェルに 2 ml の新鮮な PBS を追加各ウェルからすべて 3 ml の培養液を削除し、すべての非付着性のセルを削除することを確認するプレートを軽く渦巻き模様します。
- 15 ng/ml GM-CSF と 10 ng/ml 各ウェルに IL 4 3 ml の新鮮な培養液を交換してください。37 ° C、5% CO2、および CO2インキュベーターの湿度 95% でセルを孵化させなさい。
- 5 日各ウェルで 15 ng/ml GM-CSF と 10 ng/ml IL 4 別 3 ml の新鮮な培養液を直接追加します。37 ° C、5% CO2、および CO2インキュベーターの湿度 95% でセルを孵化させなさい。
注: 各ウェルの容量は 6 ml では今です。 - 7 日には、10 分間氷の上プレート全体を置きます。優しく各 Idc として懸濁液に、緩く付着黒谷を取り除くために培養液をピペットします。
注: 付着性マクロファージはまだプレートに接続されています。低温と優しく手順は、さらに実験に影響を与える DC の活性化を避けるためにキーです。 - 5 分の 300 x g で細胞懸濁液を遠心し、さらに実験のための新鮮な培養液で再懸濁します。
注: 黒谷は、フローサイトメトリーによる CD11c 抗体の蛍光標識で識別できる、図 1でのさらなる実験の黒谷のゲーティング方針を示した。
2. TolDC 遺伝子とタンパク質のプロファイルを特徴します。
- 37 ° C、5% CO2および CO2インキュベーターの湿度 95% で 1 時間インキュベート培と 100-400 nM の CDDO DFPA の有無で 1 × 106黒谷/ml 6 ウェル プレートのウェルあたり 2 ml をプレートします。
注: CDDO-DFPA、合成部核因子 (赤血球由来 2) - のようだ - 2 の要因 (Nrf2) 誘導と核因子 κ B (NF-κ B) の阻害剤Idc、IL-10、ビタミン D3、デキサメタゾン湾 11-7085 などから TolDCs の誘導のために他のエージェントを適用し、この手順を各エージェントのための最適な条件を変更します。 - Mdc (インキュベーション時間は mRNA やタンパク質の測定により異なります) を誘発する 4 24 時間インキュベート LPS の 10 または 100 ng/ml を追加します。
- 軽く各ウェルに培養液をピペット、1 ml ピペットを用いて細胞懸濁液を収穫します。それぞれ細胞や培養上清を収集するために 5 分の 300 × g で遠心分離機します。
- 刺激リガンドなどのフローサイトメトリーによる細胞ペレットから表面配位子を分析: CD40、CD80、CD86、MHC-II、OX40L、ICOSL、または抑制配位子: PD L1、L2 PD、ILT3、ILT4。
- 細胞ペレットからの RNA を隔離し、RNA および量的なリアルタイム PCR (qRT PCR)、ELISA、サイトカイン プロフィール、遺伝子やタンパク質の培養上清中のサンプルをそれぞれ分析します。
注: たとえば、炎症性サイトカイン: TNF-α、肝腎、edn 誌 1、IL-6、イリノイ-12 と IL-23、または抗炎症サイトカイン: IL 4, IL-10 IL 15、TGF-β 1 と HO-1。
3 TolDCs の機能を評価するIn VitroとIn Vivo
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T 細胞の同系の拡散の試金
- オートクレーブを介してすべての手術器具を滅菌し、クラス II 生物学的安全キャビネット充当安全手順で実験を実行します。
- 0.5% ウシ血清アルブミン (BSA) と 500 ml の PBS に 2 ミリメートルの EDTA を使用して MAC バッファーを準備します。0.2 μ m フィルターを介してフィルタ リング バッファーを滅菌します。
注: は、次の実験中に氷の上バッファーを保持します。 - CD4 を取得する+ T 細胞、安楽死 OT II T 細胞受容体 (TCR) 遺伝子組換えマウス 8-10 週齢 CO2箱を用いた。解離性の基板上にマウスを置くし、70% エタノールでリンスします。外科はさみとピンセットを使用して腹部の左側から脾臓を分離します。
- 6 cm 培養皿に 2 ml の PBS で脾臓を入れ、40 μ m の細胞ストレーナーを渡すことによって脾臓をミンチに 3 ml シリンジの押し棒の後ろに使用します。
- 細胞懸濁液と 300 x g で 5 分間遠心を収集します。
- MAC バッファーの 400 μ l 細胞ペレットを再懸濁します。
- CD4 の 100 μ l を追加+ T 細胞ビオチン抗体カクテル 4 ° C、5 分で。
注: 抗体カクテル バインド CD4 を除く他のセルタイプに+ T 細胞、CD8a、CD11b、CD11c、CD19、CD25、CD45R など (B220)、CD49b (DX5) CD105、反 MHC クラス II、テル-119、および TCRγ/δ。 - 10 分のための 4 ° C での MAC バッファー 300 μ l、200 μ l 抗ビオチン ビーズ (材料表) を追加します。
- 強磁性球 (材料表) の列で構成される場所と磁気で一緒に事前色分解フィルター フィールド、MAC バッファーの 3 ml でそれをすすいでください。
- 9 ml の MAC バッファーを加えて、細胞と 300 × g で 5 分間遠心します。
- 3 ml の MAC バッファーで細胞ペレットを再懸濁します、列に適用されます。収集の流れを含む CD4+ T 細胞。
- MAC バッファーの 3 ml の別列を洗っても流れを収集します。
- 脾のパンの Dc を得るためには、CO2箱を用いた 8-10 週齢 c57bl/6 マウスを安楽死します。解離性の基板上にマウスを置くし、70% エタノールでリンスします。外科はさみとピンセットを使用して腹部の左側から脾臓を分離します。D コラゲナーゼ溶液 2 ml を含む 6 cm 培養皿で脾臓を置く (2 mg/ml コラゲナーゼ D はカルシウム、マグネシウムを含む HBSS で解散)。
- 1 ml シリンジ、25 G 針 2 回脾臓にコラゲナーゼ D 溶液 1 ml を注入します。小さなハサミで小さな断片に脾臓をカットします。
- 振るし、25 分間室温でインキュベートします。
- 5 分間室温で 0.5 M の EDTA の 500 μ l を追加します。
注: 3.1.13-3.1.14 からのステップは、DCs の収率を増加させるための重要なです。 - 今 40 μ m の細胞ストレーナーを渡すことによって脾臓スラリーをミンチし、5 分の 300 × g で遠心分離して細胞懸濁液を収集する 3 ml シリンジの押し棒の裏を使用します。
- 350 μ l MAC バッファー、FcR ブロッキング試薬 50 μ l、100 μ l パン樹状細胞ビオチン抗体カクテルの 10 分のための 4 ° C でので細胞ペレットを再懸濁します。
注: カクテルの Dc によって表されない抗原に対する抗体。 - 5 分間 300 x g で MAC バッファーおよび遠心分離機の 9 ml を追加してセルを洗浄します。
- MAC バッファーの 800 μ l 細胞ペレットを再懸濁します、10 分のための 4 ° C で反ビオチン ビードの 200 μ l を追加します。
- Dc を収集する 3.1.9-3.1.11 からの手順を繰り返します。
- 別 3 ml の MAC バッファーの列 2 回洗っても流れを収集します。
- 15 分の 37 ° C で 1 μ M CFSE と 100-400 nM CDDO DFPA 37 ° C で 1 時間別々、ラベル CD4+ T 細胞 (1 x 107/ml) の有無で 2 x 105 Dc/ml を扱う、PBS で洗浄、2 x 106 T 細胞/ml で最終濃度を取得するボリュームを再調整するとします。
- 次に、96 ウェル プレートで共培養 CD4 の CFSE ラベルの同じボリュームの処理樹状細胞の 100 μ l+ T 細胞、1:10 を取得する上記の手順から収集した両方の比率。今孵化の 2 〜 3 日後 100 ng/mL 卵白アルブミン (OVA) ペプチド 323-329 あたりとフローサイトメトリーによる T 細胞の CFSE 強度測定を追加します。
注: セル番号と比による Dc の T 細胞に私たちの以前の仕事37から最適化されています。
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パッシブを誘発する黒谷を注入することにより EAE パルス ミエリン オリゴデンドロ サイト糖タンパク質 (モグ) (35-55)
- 板 1 × 106黒谷/ml 6 ウェル プレートのウェルあたり 2 ml 培養液 100-400 nM の CDDO DFPA の有無で 1 時間インキュベート。
- 追加 10 ng/ml LPS のインキュベーターの 24 時間。
- 100 μ g/ml 追加 MOG (35-55) のインキュベーターの 4 時間。
- 細胞懸濁液を収穫、300 x g で 5 分間遠心します。
- PBS の細胞ペレットを再懸濁し、セルをカウントします。
- 8-10 週古い女性 c57bl/6 マウス (各後ろ足に 100 μ l) に 2 x 10 の6セルの 200 μ l を皮下注入します。
- 腎不全注入と 48 日に時間。200 を注入後、百日咳毒素 (PTX) それぞれのマウスの ng。
- 4 週連続で毎週 1 回の手順 3.2.6-3.2.7 を繰り返します。
- 標準的な基準37 (0.5 ぐったり最後尾、1 ぐったり尾、2 適当な後肢虚弱、3 重度後肢虚弱、4-完全な後肢麻痺、5 四肢または瀕死状態、6 死) を使用して毎日 EAE の臨床症状を評価します。
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Representative Results
分化と黒谷の選択:
骨髄前駆細胞は、GM-CSF と il-4 による (図 1 a) の 7 日間の Idc に分化するの存在下で完全 RPMI 培地で培養しました。1 日目、セル サイズが小さかったと球状の形態を示した。3 日目の新鮮な媒体の交換クラスターを形成する細胞を助け、また CD11c の人口を増加する前に PBS で洗浄+細胞。4 日目、黒谷はサイズに拡大された、クラスターの形成を開始しました。付着マクロファージも変換され下部に細長い形状を有する板の観察。5 日に黒谷の大規模なサイズのクラスターが形成されます。6 日半付着性と浮動黒谷の多数も観察されました。黒谷は 7 日で収穫され、マウス Dc の特異的マーカーとして CD11c 表現のためのフローサイトメトリーで分析しました。図 1 bの代表的な流れ cytometry プロットのように、約 CD11c 表現する黒谷の 83.6% がこのメソッドによって得られました。
誘導と TolDCs の遺伝学的解析:
TolDCs、ビタミン D3 の38とデキサメタゾンの39などに誘導するために知られているエージェントのダウンは、MHC II と共刺激分子、CD40、CD80、CD86 など DC 表面配位子の表現を規制するため知られています。対照的に、いずれかの組合のコンテキストまたは Dc の成熟の CD40L 誘起、カルシニューリン阻害薬シクロスポリン A と FK506 を示さなかった CD83、CD80、CD86、MHC II33の発現に及ぼす影響。フローサイトメトリー分析による実証と CDDO DFPA による TolDC の誘導 CD80、CD86、MHC II、PD L1 の CD40 を含む Dc の LPS 誘導性表面配位子式に大きな影響はなかった。(図 2)。
また、黒谷の比較トランスクリプトームとサイトカイン解析処理の存在下で CDDO DFPA の有無や LPS の不在に変調された炎症性遺伝子プロファイルが描かれています。CDDO DFPA 治療が IFN-γ、イリノイなどによる LPS プロ炎症性サイトカイン遺伝子を大幅に削減-12、EDN1、tnf α、IL-6 と IL-23 (図 3 a-3F)。これらは th1 細胞のサイトカインを知られている (IFN-γ および il-12) と th17 細胞 (IL-6 と IL-23) 細胞分化。さらに、CDDO DFPA 扱わ IL-4 など抗炎症サイトカイン遺伝子の発現を示した黒谷 IL-10、TGF-β、HO-1 (図 4 a-4D)。これらの抗炎症遺伝子は Th2 を促進することによって自己免疫変調器を知られている (IL-4) ・ (IL-10 および TGF-β) Treg 細胞の分化。ここで40は、独特の IL 12−; IL-10+サイトカイン生産36HO 1 式13の誘導と EDN 141阻害 CDDO DFPA 処理による、すべてを注意してください。Dc 免疫寛容関数を認証する知られています。
TolDCs の携帯電話と機能評価体外
DC を介した T 細胞の増殖は、サイトカインと溶性メディエーター7の分泌と同様、共刺激表面配位子の婚約によって引き起こされる知られています。ただし、TolDCs は、いくつかのメカニズムを介して T 細胞の反応を阻害する: 自己反応性細胞の削除を積極的に推進し、Treg42ナイーブ T 細胞の分極を促進することによって T 細胞アネルギーの誘導によって。我々 はすでに CDDO DFPA の機能解析による TolDCs37を報告しています。T 細胞アネルギーと自己反応性 T 細胞の削除することができます分析独立して表面マーカーや染色アネキシン V/7-AAD をチェックしています。しかし、我々 直接確認されたこの表現型 T 細胞拡散度を指標を測定することによって。このため、C57BL/6 OTII トランスジェニック マウス T 細胞、c57bl/6 マウスから抽出され、CDDO DFPA の有無を扱われる同系の Dc にさらされます。これらの Dc は、洗浄し、CFSE 染色 OVA ペプチドを T 細胞と共培養しました。自分の免疫寛容の表現型 (図 5) を示唆している CDDO DFPA 前処理 Dc によって T 細胞の増殖を大幅に削減を見ました。
生体内で自己免疫の前臨床モデルにおける TolDCs の機能解析
最後に、DFPA による TolDCs の機能は、体内の前臨床モデル特徴自己免疫・炎症性機能の数のいずれかでテストできます。以来、EAE は MS43臨床免疫介在性中枢神経系疾患の広く受け入れられている前臨床マウスモデル、私たちは私たちの現在の研究ではこれを利用します。さら生体内で調査するために CDDO DFPA の機能による TolDCs、我々 はパッシブ EAE の前臨床マウスモデルでそれらを挑戦します。このため、黒谷は LPS とモグ (35-55) の存在下で CDDO DFPA の有無を培養しました。これらの細胞は図 6 aに描かれているスケジュールされたプロトコルとして繰り返し投与し、マウスは臨床徴候の明示のため日常的に観察されました。予想通り、LPS とモグ (35-55) パルス黒谷、EAE の臨床症状を示した。CDDO DFPA は、大幅に削減臨床症状 (図 6 b) 病気の黒谷治療群で遅発性を準備万端。これらの結果は、CDDO DFPA 処理による TolDCs の免疫表現型を検証します。
図 1: 開発と黒谷の表現型特性評価:(A) 骨髄細胞は c57bl/6 マウスの脛骨と大腿骨の骨からフラッシュされ、黒谷をさらに区別します。適切な細胞のクラスター形成は、分化 (尺度バー、100 μ m) の全体の期間中に光学顕微鏡検査によって追跡されました。(B) 黒谷分化 FACS を用いて CD11c の表面表現によって確認されました。グラフを描く展開 CD11c の割合+セルの人口。黒谷。 細胞のゲーティング (C) 戦略はあった最初破片 (FSC 対 SSC) を除外するゲート。ダブレット除外ゲートは、ゲート用のシングレットに細胞 (FL2-A 対 FL2 W) に利用されました。一重項の細胞内で生きているセルは 7 AAD プロット (FSC 対 7 AAD) のゲートだった。その後、セルをさらに分析し、CD11c 表現のゲートします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: DC 細胞表面のリガンド発現は CDDO DFPA では変更されません。細胞が CDDO DFPA の有無どちらかで前処理 (200 nM) LPS 刺激の前に 1 時間 (100 ng/ml) 24 時間。CD80、CD86、MHC II、PD L1、CD40 の細胞表面発現をフローサイトメトリーによって調べた。この図は、科学的なレポート7、資料番号から変更されている: 9886 (2017) doi:10.1038/s41598-017-06907-4。再現されと再版された著作権の許可。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: CDDO DFPA dc 黒谷免疫原性の遺伝子および蛋白質の表現の変更CDDO DFPA (50-400 nM) の有無どちらかの LP の追加前に 1 時間の処理を行った (100 ng/ml)、RNA の抽出 (4 の収穫かとhrs.)24 の培地条件を許可または時間。前にサイトカイン解析のコレクションです。IL 12 (B)、tnf α (D)、IL-6 (E)、IL 23 (F) のレベルは、qRT PCR および elisa 法により測定しました。対し、IFN-γ (A) のレベルは、qRT PCR および単独で elisa 法による EDN-1 (C) によって測定しました。結果は、3 つの実験の平均 ± 標準偏差で表されます。* P < 0.05、* * P < 0.01、* * * P LPS 投与群と比較して < 0.001。独立スチューデント t 検定。この図は、科学的なレポート7、資料番号から変更されている: 9886 (2017) doi:10.1038/s41598-017-06907-4。再現し、著作権の許可と再版される」。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: CDDO DFPA による TolDCs 表現型遺伝子および蛋白質の表現によって確認します。黒谷は、LP の追加前に 1 時間 CDDO DFPA (10-400 nM) の有無で前処理 (100 ng/ml) とセルを 24 後 RNA 抽出のため収穫された時間。QRT PCR による IL 4 (A)、IL-10 (B)、および TGF-β (C) のレベルを測定しました。(タンパク質の D) セル lysates を採取した 12 時間。解析と HO-1 および β-アクチンのレベルの式は、西部にしみが付くことによって決定されました。結果は、3 つの実験の平均 ± 標準偏差で表されます。* P < 0.05、* * P < 0.01、* * * P LPS 投与群と比較して < 0.001。独立スチューデント t 検定。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: CDDO DFPA は、Dc を公開される T 細胞の増殖を抑制します。DCs は、1 時間のみ、CDDO DFPA (100-400 nM) と前処理、洗浄と培養液に CFSE、1:10 で T 細胞を染色する比率。(A) 脾臓の T 細胞および Dc から分離された C57BL/6 OTII トランスジェニック マウス c57bl/6 マウス、それぞれ。CDDO DFPA 前処理 DCs 共同培養と CFSE 染色 (ワット) と T 細胞の有無 (w/o) 潜伏中の OVA の追加。T 細胞の増殖は、2 日目でフローサイトメトリーによって決定されました。グラフには、T 細胞分裂の数値を基準にして T 細胞分裂の割合が描かれています。データは、3 の独立実験の表現です。この図は、科学的なレポート7、資料番号から変更されている: 9886 (2017) doi:10.1038/s41598-017-06907-4。再現されと再版された著作権の許可。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: モグ プライミング EAE は TolDCs によって廃止 DC によるパッシブ。(モグ (35-55) A) EAE 誘導-パルス黒谷。 熟女黒谷 CDDO DFPA の有無で扱われた (400 nM) およびその後 4 MOG (35-55) とパルス時間。200 μ l の 2 × 106セルの合計を腹部に c57bl/6 マウスの皮下注射 4 回の注射の合計のために毎週 1 回投与。毎回、PTX 投与した i. p. すぐに、再び 2 日後 (日 0 4 サイクル)。(B) 臨床スコアは標準的な基準を使用して、記録された結局 4 注射だったすべてのデータは、平均 ± S.E.M. として提示された * P < 0.05。ホルム Sidak による複数の t-テスト (n = 7 マウス各グループで)。この図は、科学的なレポート7、資料番号から変更されている: 9886 (2017) doi:10.1038/s41598-017-06907-4。再現されと再版された著作権の許可。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
Idc を生成し、その後 TolDCs にそれらを区別するために再現性をもって使用できる効率的なプロトコルについて述べるし、この可能性があります、TolDC を誘導する新規分子標的薬の能力の評価に適用することを提案します。表現型。このレポートに記載されている、我々 は、我々 まず表面配位子の TolDC 式フローサイトメトリーで分析した、qRT PCR および elisa 法で測定された DC サイトカイン プロフィールの評価が続くシーケンスを追った。最後に、TolDCs の免疫調節機能は T 細胞増殖体外と体内は、MS の臨床マウス EAE モデルを用いた自己免疫を抑制する効力を削減するための能力を示すことによって確認されました。
プロトコル、Idc が生成され、GM-CSF と il-4 によると組み合わせてマウス骨髄前駆体から区別されます。他のプロトコルは、培養液中で Idc44を生成するのにフォームのようなチロシン キナーゼ 3 配位子 (Flt3L) を使用しています。Flt3L の使用には、Idc の収量が増加しますが、これらの Idc は通常取る 2 日 (9 日)、収穫する GM-CSF/IL-4 加算 (7 日間)44に比べています。もっと重要なは、頻繁に Flt3L から生成される iDC は両方 cDCs 分化 (CD8-および CD8+) 機能的された Pdc45と、定常状態の Dc を体内に同等表現型。しかし、GM-CSF/IL-4 常分化を誘導するない cDCs に向かって iDC の (CD8-) のみ44との成熟の間に彼らは炎症性 Dc46の類似文字を示した。単球または CD34 から Dc の区別の利点のため GM CSF/IL 4 をしばしば使用臨床試験および基礎研究を知る注目すべきは+前駆細胞44。これら 2 つのメソッドから生成された Idc が異なるセル表面のマーカーを持っている、起動時にその異なるサイトカインの展示も、形態学的に異なる細胞を生成することが示されています。さらに、これらのメソッドによる TolDCs は遊走因子の応答で移行して抗原特異的 T 細胞応答44,45を誘発する能力によって異なります。我々 は理解して CD8+の Dc は、交差耐性の47のユニークな能力のための TolDC 誘導以上の可能性を示すことがあります。さらに細胞、しかし、それが必要な特定の CD8 を調査する Flt3L によって派生した黒谷から並べ替え+ DC サブセット。さらに、以来、GM-CSF/IL-4 誘導黒谷は T 細胞の刺激と炎症性メディエーター LPS 治療44,45次の生産に優れている、我々 はこの戦略より再現性のある結果を与えた発見した私たち実験。
黒谷 GM-CSF/IL-4 開始 4 日目周り CD11c を表現して 6 日目48後表情を豊かに由来します。日 10-12 骨髄細胞の低密度が低いめっきと線量 GMC SF 日 8-1049まで、この文化の手順を維持できます。このプロトコルでは CDDO DFPA (合成部) および LP それぞれ DC 耐性と成熟を誘導するためにエージェントとしてタンデムに追加しました。我々 は最近、Idc 腎不全世代のこの法を用いた培養から収穫が CDDO DFPA37で前処理したときの機能の TolDC 表現型を示すことを報告しました。CDDO-DFPA にのみ追加された文化 iDC (7 日目)37, iDC 分化 (日 2、4、6)50中文化に複数回追加される必要がありますビタミン D3 のような業者とは対照的の収穫後、注目すべきです。さらに、ビタミン D3 による TolDCs のこの誘導時および iDC 分化51後に開始する必要があります多様なメカニズム異なります。我々 のデータは、iDC の分化に CDDO DFPA を追加 CD11c + Dc の純度に影響はなかったが、7 日 Idc (データは示されていない) の収量を低くした用量依存的をお勧めします。私たちの分析はまた、iDC CDDO DFPA37のこの集中と正常な生存力を示したにもかかわらず、高濃度 CDDO DFPA これらの実験で使用されるの骨髄前駆細胞に有毒である可能性がありますをお勧めします。TolDC 誘導可能性があります CDDO DFPA のような代理店への露出の長さやタイミングの影響で分析して最適化することも予想されます。
代替方法とメカニズム、Idc が LP、CD40L、TNF-α、インターフェロン-γ52などよりも他の人が Mdc を誘起することを考慮することが重要です。DC の成熟 Toll 様受容体を介して LPS によって 4(TLR4) リード核因子 κ B (NF-κ B)、p38 マイトジェン活性化プロテインキナーゼ (p38 MAPK)、c-6 月 N 末端キナーゼ (JNK) など、いくつかの転写因子の活性化と細胞外信号調節タンパク質キナーゼ (ERK1/2)。CD40 と TNF 受容体を介して CD40L と TNF α によって Dc の成熟には、NF-κ B 経路それぞれ誘導します。対照的に、IFN-γ は Janus のキナーゼ (JAK)、チロシンのキナーゼ (TYK) と信号のトランスデューサーの活性化と転写タンパク質 (統計) の活性化を含む異なる経路を刺激し、これらの下流の効果の活性化によって補完されてもNF-κ B 経路52。また、CD40L/TNF-α-基づく DC の成熟の遺伝子表現のプロフィールでは、Th2 細胞応答53に向かって T 細胞をこれらの Dc に分極を示唆している、IFN-γ によって DC の成熟は強く偏って Th1 細胞応答54。したがってへ特異的 T 細胞サブセット分化にリンクされている、DC の成熟のこれら他の誘導では、このプロトコルでは採用されていません。
いくつかのレポートは、その前のヴィヴォ示されている-差別化された Dc が EAE 臨床症状と病理マウス55の完全なスペクトルを誘導することができます。Ex vivo活性化 Dc によるパッシブ EAE 誘導法は、異なる研究所が様々 な修正を採用されています。モグの管理によるパッシブとアクティブの EAE 誘導の組み合わせプライミング黒谷、MOG で予防接種する前に 7 日間とフロイント完全アジュバント (CFA) の結果より高い臨床症状スコア (ピークの臨床スコア: 3.5) パッシブ EAE と比較してモグの投与により誘導下塗りだけで黒谷 (ピークの臨床スコア: 2)56。この方法でモグを組み合わせた結果プライミング黒谷モグと予防接種を示唆その発症はモグと CFA56予防接種後 9 日目に起こる。ただし、CFA が管理57のサイトで重要な炎症を引き起こすことがわかっているので我々 Dc プロトコル単独での投与によるパッシブ EAE 誘導を活用 EAE の中に TolDCs の効果を効果的に分析するためにしています。TolDCs の機能の表現型をさらに確認するために 1 つはまたアクティブ EAE マウスの臨床症状の抑制でそれらをテストする必要があります。Dc の投与経路は、EAE 症状58の誘導も欠かせません。黒谷の c57bl/6 マウスの腹部に皮下注射 3 4 注射の合計は週に一度が周り EAE のピークの臨床スコアを誘発するとして、私たちの研究室で、他の人を報告 2-2.5 日 11-1237 で再現性のある疾患発症と、58。我々 は、アクティブおよびパッシブ EAE 誘導 (ビデオ 1) 間さまざまな臨床症状を示すための短いクリップを提供しました。
プロトコルの認識の制限には、手法に必要な時間と腎不全の差別化のため非生理的関連微小環境への依存があります。ただし、抗体濃縮カラム分離法の Dc のコレクションのマウス脾臓からの T 細胞は効率的なより多くの時間をあるかもしれない間、それは必要な DC 人口の低収量から苦しんでいます。したがって、骨髄由来の DC 開発の方法の利点は、DC 集団全体の脾臓から抗体カラム分離と比較した場合のログ スケール高い利回りです。上述したように、生成される Dcの in vitroこのメソッドによって必要があります Dc生体内微小環境59に関連する生理学的ではないし、またを長期的に確保していないサイトカイン補充の高濃度DC の持続性。我々 のプロトコルで使われる GM-CSF はまた通常 DC 分化体内の60のため重要なサイトカインではないです。それにもかかわらず、腎不全世代提案は再現性をもって機能的 TolDCs の高い割合を生成し、免疫寛容性機能 Dc を生成するための高い信頼性と再現性のある方法として表示する必要があります。
結論としては、ここで説明されているプロトコルから生成された TolDCs 特徴付けることができる効果的に自分の遺伝子やタンパク質の発現を評価することによって、T 細胞依存性免疫反応の in vitro、調整するための能力を決定することによってのEAE 誘導体内を抑制する養子細胞療法として彼らの機能を評価します。我々 のプロトコルは、エージェントの評価、新しい能力を持っていると考えられて TolDCs を誘導するために診療所にベンチから TolDCs の治療開発プロセスを促進するフレームワークを提供します。
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Disclosures
どれも
Acknowledgments
我々 はリアータ医薬品が CDDO DFPA を提供することをありがちましょう。また、ジェーンと小児がんの革新 (ジョン Letterio) 李 Seidman 椅子のサポートを認めます。この作品は、米国防総省 [W81XWH-12-1-0452]; によって支えられました。ケース包括的がんセンターでアンジーの野鳥捕獲者の青年や若い成人期のがん研究イニシアチブHsi じゅ魏/キャラハン財団からキャラハン研究科学者賞を受賞。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CDDO-DFPA (RTA-408) | Reata Pharmaceuticals | in house synthesis | Cell culture |
| Mouse GM-CSF | Peprotech Inc. | 315-03 | BMDC differentiation |
| Mouse IL-4 | Peprotech Inc. | 214-14 | BMDC differentiation |
| Lipopolysaccharides (LPS) | Sigma Aldrich Inc. | L2880 | Cell culture |
| β-mercaptoethanol | Sigma Aldrich Inc. | 516732 | Cell culture |
| Pertussis toxin (PTX) | R&D systems | 3097 | EAE induction |
| MOG (35–55) peptide | 21stCentury Biochemicals | in house synthesis | EAE induction |
| Trypan blue | Gibco, Life Technologies | 15250-061 | Cell culture |
| RPMI-1640 plus L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 11875-093 | Cell culture |
| Non-essential amino acid (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | Cell culture |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630080 | Cell culture |
| penicillin/streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | Cell culture |
| 40 μm cell strainer | Corning | 352340 | Cell isolation |
| PE-conjugated CD80 | BD Biosciences | 557227 | Flow cytometry |
| PE-conjugated CD86 | BD Biosciences | 555665 | Flow cytometry |
| PE-conjugated PD-L1 | BioLegend | 124307 | Flow cytometry |
| APC-conjugated MHCII | Miltenyi Biotec Inc. | 130-112-388 | Flow cytometry |
| APC-conjugated CD11c | BD Biosciences | 340544 | Flow cytometry |
| Isotype matched PE | Miltenyi Biotec Inc. | 130-091-835 | Flow cytometry |
| Isotype matched APC | Miltenyi Biotec Inc. | 130-091-836 | Flow cytometry |
| CFSE | BioLegend | 423801 | T cell proliferation assay |
| Pan dendritic cell isolation kit | Miltenyi Biotec Inc. | 130-100-875 | T cell proliferation assay |
| FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotec Inc. | 130-100-875 | T cell proliferation assay |
| Pan Dendritic Cell Biotin-Antibody Cocktail | Miltenyi Biotec Inc. | 130-100-875 | T cell proliferation assay |
| Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec Inc. | 130-100-875 | T cell proliferation assay |
| CD4+ T cell isolation kit | Miltenyi Biotec Inc. | 130-104-454 | T cell proliferation assay |
| CD4+ T cell Biotin-Antibody Cocktail | Miltenyi Biotec Inc. | 130-104-454 | T cell proliferation assay |
| Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec Inc. | 130-104-454 | T cell proliferation assay |
| ACK lysing buffer | ThermoFisher Scientific | A1049201 | BMDC differentiation |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309626 | T cell proliferation assay |
| 3 ml syringe | BD Biosciences | 309588 | BMDC differentiation |
| 25G needle | BD Biosciences | 309626 | T cell proliferation assay |
| 23G needle | BD Biosciences | 309588 | BMDC differentiation |
| BSA | Sigma Aldrich Inc. | A2058 | T cell proliferation assay |
| EDTA | ThermoFisher Scientific | 15575020 | T cell proliferation assay |
| LS Column | Miltenyi Biotec Inc. | 130-042-401 | T cell proliferation assay |
| Pre-Separation Filter | Miltenyi Biotec Inc. | 130-095-823 | T cell proliferation assay |
| collagenase D | Sigma Aldrich Inc. | 11088858001 | T cell proliferation assay |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14025076 | T cell proliferation assay |
| ovalbumin (OVA) peptide 323–329 | Sigma Aldrich Inc. | O1641 | T cell proliferation assay |
| Mouse IFN-γ TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm01168134_m1 | qRT-PCR |
| Mouse IL-12a TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm00434165 | qRT-PCR |
| Mouse IL-12 p70 DuoSet ELISA | R&D systems | DY419-05 | ELISA |
| Mouse EDN-1 ELISA | RayBiotech | ELM-EDN1-1 | ELISA |
| TNF-α TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm00443258 | qRT-PCR |
| Mouse TNF-α Quantikine ELISA Kit | R&D systems | MTA00B | ELISA |
| IL-6 TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm00446190 | qRT-PCR |
| Mouse IL-6 Quantikine ELISA Kit | R&D systems | M6000B | ELISA |
| IL-23a TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm01160011 | qRT-PCR |
| Mouse IL-23 DuoSet ELISA | R&D systems | DY1887-05 | ELISA |
| IL-4 TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm99999154_m1 | qRT-PCR |
| IL-10 TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm01288386_m1 | qRT-PCR |
| TGF-β TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm01178820_m1 | qRT-PCR |
| Anti-Heme Oxygenase 1 antibody | Abcam | ab13248 | Western blotting |
| Anti-β-actin antibody | Abcam | ab8226 | Western blotting |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad Inc. | qRT-PCR | |
| BD FACSCalibur Cell Analyzer | BD Biosciences | Flow cytometry |
References
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