Summary
Aquí, presentamos un protocolo para desarrollar y caracterizar células dendríticas tolerogénicas (TolDCs) y evaluar su utilidad de la inmunoterapia.
Abstract
El sistema inmune funciona manteniendo un equilibrio ajustado entre la coordinación de las respuestas contra antígenos extraños y mantener un estado insensible contra antígenos del uno mismo, así como los antígenos derivados de microorganismos comensales. La interrupción de esta homeostasis inmune puede conducir a la inflamación crónica y al desarrollo de autoinmunidad. Las células dendríticas (DCs) son las células presentadoras de antígeno profesionales del sistema inmune innato implicado en la activación de las células Naive T para iniciar la respuesta inmune contra antígenos extraños. Sin embargo, el DCs se pueden distinguir también en TolDCs que actúan para mantener y promover la tolerancia de la célula de T y para suprimir células efectoras contribuyendo con el desarrollo de cualquier condiciones de inflamación crónica o autoinmune. El reciente avance en nuestra comprensión de TolDCs sugiere que se puede conseguir tolerancia DC modulando sus condiciones de diferenciación. Este fenómeno ha conducido a un enorme crecimiento en el desarrollo de terapias TolDC para numerosos trastornos del sistema inmune causadas por romper en tolerancia inmunológica. Exitos estudios en modelos murinos de autoinmunidad preclínicos más han validado la utilidad inmunoterapéutico de TolDCs en el tratamiento de los trastornos autoinmunitarios. Hoy en día, TolDCs se han convertido en una herramienta prometedora de la inmunoterapia en la clínica para reintegro de tolerancia inmunológica en varios desordenes inmunes apuntando las respuestas autoinmunes patógenas dejando inmunidad protectora intacta. Aunque una variedad de estrategias ha sido propuesta por varios laboratorios para inducir TolDCs, no hay consistencia en la caracterización del fenotipo celular y funcional de estas células. Este protocolo proporciona a una guía paso a paso para el desarrollo de la médula ósea DCs en grandes números, un método único utilizado para diferenciarlos en TolDCs con un triterpenoide sintético 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic difluoro-propil-amida del ácido (CDDO-DFPA) y las técnicas utilizadas para confirmar su fenotipo, incluyendo análisis de firmas moleculares esenciales de TolDCs. Por último, os mostramos un método para evaluar la función de TolDC por prueba su respuesta inmunosupresora en vitro e in vivo en un modelo preclínico de la esclerosis múltiple.
Introduction
Las células dendríticas (DCs) son una parte integral del sistema inmune innato y primero fueron descubiertas y caracterizadas por Ralph Steinman y Zanvil Cohn en 1973 como el principal antígeno profesional que presenta las células1. DCs han demostrado jugar un papel importante en la activación inmune por presentar antígenos procesados a las células T y las células B por medio de complejos de histocompatibilidad (MHC) en órganos linfoides secundarios para vincular los sistemas inmunitarios innato y adaptativo2. En el sistema inmune mamífero, hay al menos dos categorías de DCs que se han descrito como mieloide DCs plasmacytoid DCs (PDC)3. DCs mieloides, también conocidas como DCs convencionales (CDC), se caracterizan por la expresión de CD11c y puede ser distinguido como inmaduros DCs (iDCs) in vitro de células progenitoras de médula ósea o de monocitos de sangre periférica utilizando factor del granulocyte-macrófago-estimulante de colonias (GM-CSF) e IL-4 en murinas y humanas especies, respectivamente4.
Señales de activación de 'peligro', tales como patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) o patrones moleculares asociados a daño (húmedo), conducirá CDI maduración hacia DCs inmunogénicas como DCs madurados (mDCs) vía atar varios receptores de reconocimiento de patrón la superficie DC5. Inmunogénicas DCs más prime ingenuo T proliferación y diferenciación celular a través de la regulación al alza de MHCII2ligandos coestimuladoras (CD80, CD86 y CD40)6, citocinas y otros mediadores solubles7. Una cascada de producción pro-inflamatoria del mediador de DCs inmunogénica es esencial para la diferenciación de células T mediada por citocinas. Por ejemplo, IFN-γ y la IL-12 son necesarios para la diferenciación de Th18 e IL-1, IL-6 e IL-23 son críticos para ingenuos polarización de la célula de T hacia Th17 células9. Aunque DCs madurados reaccionan ante antígenos extraños, activación incontrolada de la DC por los antígenos del uno mismo puede hacer ablación de la tolerancia y fomentar el desarrollo de enfermedades autoinmunes mediante la generación de células autorreactivas T cuya activación conduce a la destrucción del tejido10 .
Los informes recientes han proporcionado evidencia clara de la plasticidad de la DC, ejemplificado por su capacidad para interactuar con diferentes señales dentro de su microambiente del tejido y diferenciar en subgrupos distintos efector supresor DC. Los mediadores antiinflamatorios, tales como IL-1011, TGF-β12y13 de la HO-1 han demostrado jugar un papel importante en la supresión inmune induciendo tolerogénicas DCs (TolDCs). Estos TolDCs adquirir funciones reguladoras y suprimir la proliferación de la célula de T14. Además, la falta de estimulación conjunta por DCs y la producción de mediadores antiinflamatorios de TolDCs contribuyen a la inducción de células T reguladoras (Tregs) y también inhibe Th1 y Th17 diferenciación y expansión15. En más allá de dos décadas, se ha reportado el potencial terapéutico de TolDCs por varios investigadores. En estos estudios, la administración del ex-vivo genera síntomas patológicos TolDCs mejorada no sólo en diversos modelos preclínicos de enfermedades autoinmunes16 pero también condujo al desarrollo de tolerancia inmunológica en pacientes17 ,18. Curiosamente, hoy en día la terapia de TolDCs ha sido considerada como un enfoque alternativo o complementario para enfermedades autoinmunes en varios ensayos clínicos, incluyendo tipo 1 diabetes mellitus19-artritis reumatoide20, 21, esclerosis múltiple (EM)22,23,24y enfermedad25 de Crohn.
Hay una variedad de protocolos que han sido empleados para el desarrollo de TolDCs y varios laboratorios han informado de métodos para la generación y caracterización fenotípica de TolDCs. Estos métodos pueden utilizarse para generar reproducible TolDCs en vitro de progenitores hematopoyéticos y mantener estable en un tolerogénicas estado en vivo26,27,28,29. El CDI se puede convertir en TolDCs por la exposición a diversos agentes farmacológicos inmunomoduladores o citoquinas antiinflamatorias. Por ejemplo, la vitamina D3 es un conocido agente farmacológico conocido para aumentar la producción de IL-10 y suprimir la secreción de IL-12 de DCs y así potenciar su función inmunosupresora30. Por otra parte, cuando DCs están expuestos a estímulos inflamatorios potentes, como los lipopolisacáridos (LPS), varios agentes farmacológicos tales como dexametasona31, rapamicina32y33 de los corticosteroides han demostrado para inducir la Fenotipo TolDC reduciendo la expresión de superficie de DC de CD40, CD80, CD86 y MHCII34. IL-10 y TGF-β son las citocinas antiinflamatorias más estudiado para inducir tolerancia de DC35 y la exposición concomitante a cada una de estas citoquinas se han demostrado para inducir un fenotipo tolerogénicas en DCs36.
Desde el tolerogénicas que DC se define por características funcionales en lugar de marcadores fenotípicos, hay una gran necesidad de desarrollar un método consistente para celular y caracterización funcional de TolDCs. Por otra parte, un protocolo riguroso y consistente debe establecerse para la constante evaluación y caracterización del fenotipo DC tolerogénicas sea eficaz y reproducible comparar la capacidad de nuevos agentes para inducir el fenotipo de TolDC en el laboratorio. Aquí proporcionamos un protocolo detallado con métodos paso a paso para aislar CDI de progenitores hematopoyéticos de ratones y posteriormente analizar la eficacia de nuevos agentes bajo evaluación de su capacidad para convertir CDI TolDCs, proporcionando una sólida caracterización fenotípica y funcional de TolDCs in vitro e in vivo. Esta descripción incluye un elaborado método para caracterizar la TolDCs por sus ligandos de superficie, perfil del cytokine y funciones inmunosupresoras en vitro. También ofrecemos un ejemplo de un método para explorar la posible aplicación terapéutica de estas TolDCs en un modelo preclínico de la EM, la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE). Este protocolo establecido ayudará a los investigadores a evaluar la capacidad de nuevos agentes para promover la inducción de TolDCs y facilitará el esfuerzo por ampliar el alcance del desarrollo terapéutico TolDC.
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Protocol
Todos los estudios se realizaron en cumplimiento de procedimientos aprobados por del caso Western Reserve University School of Medicine institucional Animal cuidado y uso.
1. preparación de células dendríticas derivadas de la médula ósea (BMDCs)
- Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos a través de autoclave y realizar el experimento en clase con los procedimientos de seguridad apropiados de seguridad biológica II.
- Eutanasia a ratones C57BL/6 8-10 semanas de edad mediante el uso de CO2 cámara. Coloque el ratón sobre una tabla de disección y enjuagar con etanol al 70%. Impuestos especiales-tibia-peroné y fémur huesos usando una tijera quirúrgica y colocarlos con etanol al 70% en una placa de cultivo de 10 cm.
- Utilizar hojas para bisturí y pinzas para disecar tejido lejos tanto como sea posible en la tapa del 10 cm plato de la cultura y aislar las tibias y fémures colocarlos con etanol al 70% en una placa de cultivo de 6 cm.
- Utilice láminas quirúrgicas para recortar ambos extremos de la tibia y fémur. Use 3 mL de PBS en jeringa de 3 ml con una aguja de 23G para vaciar el contenido de médula ósea de uno de los extremos de los huesos a un tubo cónico que contiene 12 ml de PBS. Repetir la operación 3 x cada extremo de los huesos.
- Centrifugue la suspensión de células a 300 x g durante 5 minutos.
- Quite el sobrenadante y resuspender el sedimento celular con 1 ml del tampón lisis de ACK por 5 minutos eliminar las células de sangre rojas.
- Añadir 9 ml de PBS para diluir el buffer lisis ACK y centrifugar a 300 x g durante 5 minutos.
- Quite el sobrenadante y resuspender con 10 ml medio de cultivo (RPMI-1640 más L-glutamina, 10% FBS, 1% no esenciales aminoácidos (100 x), 10 mM HEPES, 50 nM β-mercaptoetanol y 5% penicilina/estreptomicina).
Nota: Nivel de endotoxinas debe ser inferior a 0,1 UE/ml de SBF. - Pasar la suspensión celular a través de un tamiz de 40 μm celular y tomar 20 μl de la suspensión celular y se mezclan con 80 μl de trypan azul para contar el número de células vivas mediante el uso de citometría.
- Ajustar el número de celular a 1 x 106 células/ml con GM-CSF de 15 ng/ml y 10 ng/ml de IL-4.
- 3 ml de 1 x 106 células/ml en cada pocillo de la placa de 6 pozos de la placa e incubar a las células a 37 ° C, 5% CO2y 95% de humedad en la incubadora de CO2 .
Nota: Las células de la médula ósea de un ratón es alrededor de 3-5 x 107 células, indicando que se puede colocar de 2 a 3 placas de 6 pozos. - El día 3, quitar todo medio de cultivo de 3 ml de cada bien, agregar 2 ml PBS fresco en cada pozo, y luego agitar suavemente la placa para asegurarse de eliminar todas las células no adherentes.
- Vuelva a colocar 3 ml medio de cultivo fresco con GM-CSF de 15 ng/ml y 10 ng/ml de IL-4 en cada pozo. Incube las células a 37 ° C, 5% CO2y 95% de humedad en la incubadora de CO2 .
- El día 5, directamente agregar otro medio de cultivo fresco de 3 ml con GM-CSF de 15 ng/ml y 10 ng/ml de IL-4 en cada pozo. Incube las células a 37° C, 5% CO2 y 95% de humedad en la incubadora de CO2 .
Nota: El volumen total en cada pozo es ahora 6 ml. - En el día 7, poner toda la placa de hielo durante 10 minutos. Pipetee suavemente el medio de cultivo en cada pozo para desalojar el ligeramente adherente BMDCs como CDI en suspensión.
Nota: Los macrófagos adherentes estén fijados a la placa. Procedimientos y suavemente la baja temperatura son la clave para evitar la activación de la DC para más experimentos. - Centrifugue la suspensión de células a 300 x g durante 5 minutos y resuspender con medio fresco de cultivo para experimentos adicionales.
Nota: BMDCs puede identificarse con el anticuerpo marcado con fluorescencia de CD11c por citometría de flujo y mostramos nuestra estrategia bloquea de BMDCs para otros experimentos en la figura 1.
2. caracterizar el perfil de proteína y gen TolDC
- Placa de 2 ml de 1 x 106 BMDCs/ml por pozo de placa de 6 pozos con medio de cultivo en la presencia o ausencia de 100-400 nM DFPA CDDO para incubar 1 h a 37 ° C, 5% CO2 y 95% de humedad en la incubadora de CO2 .
Nota: CDDO-DFPA, un triterpenoide sintético, es un factor nuclear (derivados del eritroide 2) - como - 2 inductor de factor (Nrf2) y el inhibidor del factor nuclear-κB (NF-κB). Aplicar a otros agentes para la inducción de TolDCs de la CDI, como IL-10, vitamina D3, dexametasona o Bahía 11-7085 y modificar este paso a una condición óptima para cada agente. - Añadir 10 o 100 ng/ml de LPS para incubar 4-24 horas para inducir la mDCs (tiempo de incubación es diferente debido a la medición de mRNA o proteína).
- Pipetear el medio de cultivo en cada pozo y la suspensión de células de la cosecha utilizando la pipeta de 1 ml. Centrifugar a 300 x g durante 5 minutos recoger las células y del sobrenadante, respectivamente.
- Analizar los ligandos de la superficie de los pellets de células por citometría de flujo, como ligandos estimulantes: CD40, CD80, CD86, MHC-II, OX40L, ICOSL o ligandos inhibidores: PD-L1, PD-L2, ILT3 ILT4.
- Aislar el RNA de los pellets de célula y analizar las RNA y sobrenadante muestras de los niveles del cytokine perfil y gene y proteína por PCR en tiempo real cuantitativa (qRT-PCR) y ELISA, respectivamente.
Nota: por ejemplo, citoquinas proinflamatorias: TNF-α, IFNγ, EDN-1, IL-6, IL-12 y IL-23 o antiinflamatorias citoquinas: IL-4, IL-10, IL-15, el TGF-β1 y la HO-1.
3. evaluar la función de TolDCs In Vitro e In Vivo
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Ensayo de Syngeneic de la proliferación de células T
- Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos a través de autoclave y realizar el experimento en clase con los procedimientos de seguridad apropiados de seguridad biológica II.
- Preparar el tampón de Mac utilizando 0.5% albúmina de suero bovino (BSA) y 2 mM de EDTA en 500 ml de PBS. Esterilizar el búfer por filtración a través de un filtro de 0.2 μm.
Nota: Mantenga el buffer en el hielo durante el siguiente experimento. - Para obtener CD4+ T células, eutanasia ratones transgénicos de OT-II T-cell receptor (TCR) 8-10 semanas de edad mediante el uso de CO2 cámara. Coloque el ratón sobre una tabla de disección y enjuagar con etanol al 70%. Aislar el bazo del lado izquierdo del abdomen mediante el uso de fórceps y tijeras quirúrgicas.
- Poner el bazo con 2 ml de PBS en una placa de cultivo de 6 cm y la parte posterior de la varilla de empuje de la jeringa de 3 ml para picar el bazo por pasar un tamiz de 40 μm células.
- Recoge las suspensión y centrifugar a 300 x g durante 5 minutos.
- Resuspender el precipitado de células en 400 μl de tampón de MACS.
- Añada 100 μl de CD4+ T Cell biotina anticuerpo cóctel a 4° C por 5 minutos.
Nota: El cóctel de anticuerpos se une a otros tipos de células excepto CD4+ T de las células, tales como CD8a, CD11b, CD11c, CD19, CD25, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, Anti-MHC de clase II, Ter-119 y TCRγ/δ. - Añadir 300 μl de tampón de MACS y 200 μl de anti-biotina granos (Tabla de materiales) a 4° C durante 10 minutos.
- Lugar la columna compuesta de esferas ferromagnéticas (Tabla de materiales) y el filtro de separación previa en el magnético campo y enjuagar luego con 3 ml de tampón de MACS.
- Añadir 9 ml de tampón de MACS en las células y centrifugar a 300 x g durante 5 minutos.
- Resuspender el precipitado de células en 3 ml de tampón de MACS y se aplican sobre la columna. Recoge paso con CD4+ T las células.
- Lavar la columna con otro 3 ml de tampón de MACS y recoger también el flujo a través.
- Para obtener el pan bazo DCs, eutanasia ratones C57BL/6 8-10 semanas de edad mediante el uso de CO2 cámara. Coloque el ratón sobre una tabla de disección y enjuagar con etanol al 70%. Aislar el bazo del lado izquierdo del abdomen mediante el uso de fórceps y tijeras quirúrgicas. Poner el bazo en una placa de cultivo de 6cm que contiene 2 ml de solución de colagenasa D (colagenasa de 2 mg/ml D disuelto en HBSS conteniendo calcio, magnesio).
- Inyectar 1 ml de solución de colagenasa D el bazo dos veces con una jeringa de 1 ml y una aguja de 25G. Corte del bazo en trozos pequeños con unas tijeras pequeñas.
- Agitar e incubar a temperatura ambiente durante 25 minutos.
- Añadir 500 μl de EDTA de 0,5 M a temperatura ambiente durante 5 minutos.
Nota: Los pasos de 3.1.13-3.1.14 son fundamentales para aumentar el rendimiento de DCs. - Ahora uso la parte trasera de la varilla de empuje de la jeringa de 3 ml a moler la mezcla de bazo por pasar un tamiz de 40 μm células y recoger la suspensión de células por centrifugación a 300 x g durante 5 minutos.
- Resuspender el precipitado de células en 350 μl de tampón de MACS, 50 μl de reactivo de bloqueo de FcR y 100 μl de Pan biotina anticuerpo de célula dendríticas cóctel a 4° C durante 10 minutos.
Nota: El anticuerpo cóctel contra los antígenos que se expresan no por DCs. - Lavar las células añadiendo 9 ml de tampón de MACS y centrifugar a 300 x g durante 5 minutos.
- Resuspender el precipitado de células en 800 μl de tampón Mac y agregar 200 μl de anti-biotina cuentas a 4 ° C durante 10 minutos.
- Repita los pasos del 3.1.9-3.1.11 para recoger DCs.
- Lavar la columna con otro 3 ml de tampón de Mac dos veces y también recoger el flujo a través.
- Tratar el 2 x 105 DCs/ml en la presencia o ausencia de células de T de 100-400 nM CDDO-DFPA a 37 ° C por 1 hr. por separado, etiqueta el CD4+ (1 x 107/ml) con 1 μM CFSE a 37 ° C durante 15 minutos, lavar con PBS y vuelva a ajustar el volumen para obtener la concentración final en 2 x 106 T células/ml.
- A continuación, en una placa de 96 pocillos, co cultura 100 μl de las células dendríticas tratadas con el mismo volumen de CFSE-labeled CD4+ T de las células, tanto de los pasos anteriores para conseguir 1:10 cociente. Ahora se añadirá 100 péptidos de ovoalbúmina (OVA) 323-329 ng/mL por pozo y medir la intensidad de la CFSE de los linfocitos T por citometría de flujo 2-3 días de incubación.
Nota: El número de células y el cociente de DCs y T, las células han sido optimizadas de nuestro anterior trabajo37.
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Pasivo de inducir EAE inyectando BMDCs pulsada con la glicoproteína del Oligodendrocyte del Myelin (MOG) (35-55)
- Placa de 2 ml de 1 x 106 BMDCs/ml por pozo de placa de 6 pozos con medio de cultivo en la presencia o ausencia de 100-400 nM DFPA CDDO para incubar 1 hora.
- Añadir 10 ng/ml de LPS para incubación de 24 hrs.
- Añadir 100 μg/ml de MOG (35-55) para incubación de 4 horas.
- La cosecha la suspensión y centrifugar a 300 x g durante 5 minutos.
- Resuspender el precipitado de células con PBS y contar las células.
- Inyectar por vía subcutánea 200 μl de 2 x 106 células a ratones C57BL/6 femeninos de 8-10 semanas (100 μl en cada pata trasera).
- En el día de la inyección de BMDC y 48 hrs. más tarde, inyectar 200 ng de toxina de pertussis (PTX) en cada ratón.
- Repita los pasos 3.2.6-3.2.7 una vez por semana durante 4 semanas consecutivas.
- Evaluar los síntomas clínicos de EAE diario utilizando criterios estándar37 (final 0.5-cojera, blando 1 cola, 2-moderada extremidades debilidad, debilidad de extremidades 3-severo, parálisis de extremidades 4-completo, estado 5-tetraplejía o moribundo, 6-muerte).
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Representative Results
La diferenciación y selección de BMDCs:
Las células progenitoras de médula ósea fueron cultivadas en Medio RPMI completo en presencia de GM-CSF e IL-4 se diferencian en CDI por 7 días (figura 1A). El día 1, las células eran de tamaño pequeñas y demostraron morfología esférica. Lavado con PBS antes de la sustitución de medio fresco en 3 días ayudó a las células a clusters de forma y también aumentó la población de CD11c+ las células. El día 4, BMDCs fueron agrandadas de tamaño e inició la formación de grupos. Macrófagos adheridos también fueron convertidos y observados en la parte inferior de la placa con una forma alargada. El día 5, se forman racimos de tamaño grandes de BMDCs. El día 6, también se observaron un gran número de BMDCs semi-adherentes y flotantes. BMDCs fueron cosechadas en el día 7 y analizadas por citometría de flujo para la expresión de CD11c como un marcador específico de DCs murinos. Como se muestra en una parcela de citometría de flujo representativo en la figura 1B, alrededor 83,6% de la BMDCs expresión de CD11c fueron obtenidos por este método.
Inducción y caracterización genética de TolDCs:
Algunos de los agentes que se sabe para inducir TolDCs, como la vitamina D338 y dexametasona39, se saben que abajo-regulan la expresión de ligandos de superficie de DC, incluyendo MHC II y moléculas coestimuladoras, CD40, CD80 y CD86. Por el contrario, en el contexto de LPS u o CD40L inducida por la maduración de DCs, inhibidores de la calcineurina ciclosporina A y FK506 no mostraron efecto sobre la expresión de CD83, CD80, CD86 y MHC II33. Según lo demostrado por análisis de citometría de flujo, la inducción de TolDC por CDDO-DFPA no tuvo efectos significativos sobre la expresión del ligando de superficie inducida por LPS de DCs, incluyendo CD80, CD86, MHC II, PD-L1 y CD40. (Figura 2).
Por otra parte, el análisis comparativo del transcriptoma y del cytokine de BMDCs tratados con o sin CDDO-DFPA en presencia o ausencia de LPS había representado perfil gen inflamatorias modulada. CDDO-DFPA tratamiento redujo significativamente LPS inducidas genes de citoquinas pro inflamatorias como IFN-γ, IL-12, EDN1, TNFα, IL-6 e IL-23 (Figura 3A-3F). Se conocen citoquinas de Th1 (IFN-γ y la IL-12) y Th17 (IL-6 e IL-23) diferenciación celular. Además, CDDO-DFPA tratados BMDCs demostradas la mayor expresión de genes de citoquinas antiinflamatorias como IL-4, IL-10, TGF-β y HO-1 (Figura 4A-4D). Estos genes antiinflamatorios son conocidos modulador de autoinmunidad por promoción de Th2 (IL-4) y diferenciación de las células Treg (IL-10 y TGF-β). 40 aquí es importante tener en cuenta que el distintivo de la IL-12−; IL-10+ cytokine producción36, la inducción de la HO-1 expresión13y la inhibición de la EDN-141 inducida por tratamiento CDDO-DFPA, son todos conocido para autenticar DCs tolerogénicas función.
Celular y caracterización funcional de TolDCs in vitro
Proliferación de células T mediada por la DC se conoce mediante la contratación de costimulatory ligando superficial así como la secreción de citoquinas y mediadores solubles7. Sin embargo, TolDCs inhibir respuestas de células T a través de varios mecanismos: mediante la inducción de anergia de células T, promoviendo activamente la eliminación de células autorreactivas y promoviendo la polarización de la ingenua T las células Tregs42. Ya hemos reportado la caracterización funcional de DFPA CDDO inducida por TolDCs37. Anergia de células t y la eliminación de células autorreactivas T pueden ser analizadas independientemente de verificación marcadores superficiales o manchas de anexina V/7-AAD. Sin embargo, se confirmó indirectamente este fenotipo mediante la medición de índice de proliferación de células T. Para ello, utilizaron ratones transgénicos C57BL/6 OTII células T y expuestos a DCs syngeneic extraído de ratones C57BL/6 y tratados con o sin CDDO-DFPA. Estos DCs lavadas y cultivadas conjuntamente con CFSE teñido de células T con el péptido de OVA. Se observó una reducción significativa en la proliferación de la célula de T por DCs tratadas previamente CDDO-DFPA, sugiriendo su fenotipo de tolerogénicas (figura 5).
En vivo caracterización funcional de TolDCs en un modelo preclínico de la autoinmunidad
Por último, la funcionalidad de TolDCs DFPA-inducida puede probarse en cualquiera de una serie de preclínica en vivo modelos caracterizados autoinmunes o inflamatorias características. Desde entonces, EAE es un ampliamente aceptado modelo murino preclínico de la enfermedad clínica inmune-mediada del sistema nervioso central, MS43, utilizamos esto en nuestro estudio actual. Con el fin de examinar más lejos el en vivo funcionalidad de DFPA CDDO inducida por TolDCs, desafió en un modelo murino preclínico de EAE pasiva. Para esto, BMDCs fueron cultivados con o sin CDDO-DFPA en presencia de LPS y MOG (35-55). Estas células fueron inyectadas luego repetidamente como protocolo programado representado en la figura 6A y ratones se observaron sistemáticamente para la manifestación de signos clínicos. Como era de esperar, LPS y MOG (35-55) pulsada BMDCs mostraron síntomas clínicos de la EAE, sin embargo; CDDO-DFPA había cebada BMDCs tratados grupo mostrada la aparición retardada de la enfermedad con síntomas clínicos significativamente reducidas (Figura 6B). Estos resultados validan el fenotipo inmunosupresor de TolDCs inducida por el tratamiento de DFPA CDDO.
Figura 1: desarrollo y caracterización fenotípica de BMDCs: (A) médula ósea fueron arrastrada de los huesos de tibia y fémur de ratones C57BL/6 y más distinguido al BMDCs. Una formación de grupos de célula apropiada fue rastreado por microscopia ligera durante todo el periodo de diferenciación (barras de escala, 100μm). (B) la diferenciación de BMDCs fue confirmada por la expresión superficial de CD11c, como analiza por FACS. Gráficas representan el porcentaje de CD11c ampliado+ población de la célula. Gating (C) estrategia de BMDCs. células primero fueron cerrada para excluir los residuos (FSC y SSC). Una puerta de exclusión doblete fue utilizada para la puerta en Maillots células (FL2-W vs FL2-A). Dentro de las células de la camiseta, células vivas fueron bloqueadas en la parcela 7-AAD (7-AAD vs FSC). Entonces las células eran más analizadas y cerradas sobre la expresión de CD11c. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: la expresión del ligand superficie celular DC es inalterada por CDDO-DFPA. Las células fueron tratadas previamente en la presencia o ausencia de DFPA CDDO (200 nM) por 1 hora antes de la estimulación con LPS (100 ng/ml) durante 24 horas. Expresión superficial de la célula de CD80, CD86, MHC II, PD-L1 y CD40 fue analizada por citometría de flujo. Esta figura ha sido modificada desde Informes científicos 7, número de artículo: 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. Reproducido y republicado con permiso del autor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: CDDO-DFPA altera el fenotipo genético y proteínas del sistema inmunitario DCs. BMDCs fueron tratados previamente en la presencia o ausencia de CDDO-DFPA (50-400 nM) durante 1 hora antes de la adición de LPS (100 ng/ml), y ya sea para la extracción de RNA (4 hrs.) o medio de cultivo de la condición de 24 hrs. antes de la recogida para el análisis del cytokine. Se midieron los niveles de IL-12 (B), D de TNFα, IL-6 (E) y IL-23 (F) por qRT-PCR y ELISA. Mientras que el nivel de IFN-γ (A) se midió por qRT-PCR y EDN-1 (C) por ELISA solo. Los resultados se expresan como media ± D.S. de tres experimentos. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 en comparación con los grupos tratados con LPS. Prueba t de student no pareado. Esta figura ha sido modificada desde Informes científicos 7, número de artículo: 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. Reproducido y republicado con el permiso de derechos de autor". Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: CDDO-DFPA inducida por fenotipo de TolDCs confirmada por la expresión de genes y proteínas. BMDCs fueron tratadas previamente en la presencia o ausencia de CDDO-DFPA (10-400 nM) durante 1 hora antes de la adición de LPS (100 ng/ml), y las células se cosecharon para extracción de RNA después de 24 hrs. Se midieron los niveles de IL-4 (A), IL-10 (B) y TGF-β (C) por qRT-PCR. (D) de la célula proteína lisados fueron recogidos a las 12 hrs. para el análisis y los niveles de HO-1 y β-actina expresión determinó por borrar occidental. Los resultados se expresan como media ± D.S. de tres experimentos. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 en comparación con los grupos tratados con LPS. Prueba t de student no pareado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: CDDO-DFPA expuesto DCs suprimir la proliferación de célula T. DCs fueron tratadas previamente con CDDO-DFPA (100-400 nM) por 1 hora solamente se lavado y co cultivada con CFSE tiñe las células de T en un 1:10 cociente. (A) esplénico células T y DCs fueron aislados de ratones transgénicos C57BL/6 OTII y ratones C57BL/6, respectivamente. CDDO-DFPA pretratados DCs fueron cultivadas conjuntamente con CFSE teñido de células T (w) o sin (sin) además de los huevos durante la incubación. Proliferación de la célula de t fue determinada por citometría de flujo en el día 2. Gráficas representan el porcentaje de división de las células de T con respecto a números de división de la célula de T. Los datos están una representación de 3 experimentos independientes. Esta figura ha sido modificada desde Informes científicos 7, número de artículo: 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. Reproducido y republicado con permiso del autor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: MOG preparado DC-inducida pasiva EAE es abrogado por TolDCs. (A) inducción de EAE por MOG (35-55)-pulsado BMDCs. BMDCs maduros fueron tratados en la presencia o ausencia de DFPA CDDO (400 nM) y posteriormente pulsada con MOG (35-55) para 4 hrs. Un total de 200 μl de 2 x 106 células fue administrado por inyección subcutánea en la región de flanco de ratones C57BL/6 una vez por semana para un total de cuatro inyecciones. Cada vez, PTX fue administrado por inyección i.p. de inmediato y otra vez 2 días después (día 0 en el 4 º ciclo). (B) puntuaciones clínicas fueron registradas después de las cuatro inyecciones, utilizando criterios estándar. Todos los datos fueron presentados como la media ± SEM * P < 0.05. Múltiples pruebas t con el análisis de Holm-Sidak (n = 7 ratones de cada grupo). Esta figura ha sido modificada desde Informes científicos 7, número de artículo: 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. Reproducido y republicado con permiso del autor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este papel describe un protocolo eficiente que puede utilizarse para reproducible en generar CDI y posteriormente diferenciarlas en TolDCs, y proponemos que esto se puede aplicar para evaluar la capacidad de los nuevos agentes diana molecular para inducir a la TolDC fenotipo. Como se describe en este informe, hemos seguido una secuencia en la que Analizábamos primero TolDC expresión de ligandos de superficie por citometría de flujo, seguido de una evaluación del perfil de citoquina de CC medida por qRT-PCR y ELISA. Finalmente, la función de inmunoregulador de TolDCs fue confirmada demostrando su capacidad para reducir la proliferación de la célula de T en vitro y su eficacia para suprimir la autoinmunidad en vivo, usando el modelo EAE murino preclínico de MS.
En nuestro protocolo, CDI generaron y diferenciados a partir de precursores de médula ósea murina con la combinación de GM-CSF e IL-4. Otros protocolos han utilizado ligandos de formas-como tirosina quinasa 3 (Flt3L) en el medio de cultivo para generar CDI44. Aunque el uso de Flt3L aumenta el rendimiento de CDI, estos CDI suelen tener 2 días (9 días) para la cosecha, en comparación con el GM-CSF/IL-4 adición (7 días)44. Más importante aún, iDC generado a partir de Flt3L a menudo se diferencian en dos cDCs (CD8– y CD8+) y PDC45 que eran funcionalmente y fenotípicamente equivalente a estado estacionario DCs en vivo. Sin embargo, GM-CSF/IL-4 induce invariablemente la diferenciación de iDC hacia cDCs (CD8–) sólo44 y durante la maduración, manifestaron caracteres similares de inflamatoria DCs46. Es importante saber que GM-CSF/IL-4 se utiliza a menudo en ensayos clínicos y la investigación básica debido a la ventaja de diferenciar DCs de monocitos o CD34+ progenitores44. Se ha demostrado que CDI generados a partir de estos dos métodos de produce las células morfológicamente diferentes, que también poseen marcadores de superficie de diferentes células y exhiben perfiles de citocinas distintas a su activación. Además, TolDCs inducidas por estos métodos varían en su capacidad de migrar en respuesta a factores quimiotácticos y para inducir a la célula de T antígeno-específica respuestas44,45. Entendemos que CD8+ DCs puede exhibir más potencial en la inducción de TolDC debido a su capacidad única de tolerancia cruzada47. Sin embargo, entonces se necesita más la célula clasificación de BMDCs derivados por Flt3L para investigar el CD8 específicas+ DC subconjunto. Además, desde entonces, GM-CSF/IL-4 inducida por BMDCs son superiores a la estimulación de células T y la producción de mediadores inflamatorios después de LPS tratamiento44,45, encontramos esta estrategia dio resultados más reproducibles en nuestros experimentos.
BMDCs derivados de GM-CSF/IL-4 Inicio expresan CD11c alrededor del día 4 y enriquecer la expresión después del día 648. Este procedimiento de cultura pueda mantenerse hasta el día 10-12 con una menor densidad de placas de células de médula ósea y una baja dosis de GMC-SF día 8-1049. En este protocolo, CDDO-DFPA (triterpenoides sintético) y LPS fueron agregados en tándem como agentes para inducir tolerancia DC y maduración, respectivamente. Nos informó recientemente que la CDI de culturas utilizando este método de generación de BMDC exhibe un fenotipo de TolDC funcional cuando pretratados con DFPA CDDO37. Es de destacar que CDDO-DFPA, que fue agregado solamente a culturas después de iDC de la cosecha (día 7)37, en contraste con agentes como la vitamina D3 que se debe añadir a las culturas varias veces durante el iDC diferenciación (día 2, 4, 6)50. Por otra parte, esta inducción de TolDCs por la vitamina D3 puede depender de diversos mecanismos que deben ser iniciados durante y después de la diferenciación de iDC51. Nuestros datos sugieren que la adición de DFPA CDDO durante la diferenciación de iDC no tuvo ningún impacto en la pureza de CD11c + DCs pero dosis dependiente bajar el rendimiento de la CDI en el día 7 (datos no mostrados). Nuestros análisis también sugieren que la mayor concentración de CDDO-DFPA utilizado en estos experimentos puede ser tóxica para las células progenitoras de médula ósea, aunque iDC demostró viabilidad normal con esta concentración de DFPA CDDO37. Se prevé que TolDC inducción puede ser optimizada por el cuidadoso análisis del impacto de la sincronización y duración de la exposición a agentes como CDDO-DFPA.
Es importante considerar los métodos alternativos y mecanismos a través del cual CDI puede ser inducida a MDC por otros que LPS, como CD40L, TNF-α y IFN-γ52. Maduración de DC por LPS a través de receptores Toll-like 4(TLR4) conduce a la activación de varios factores de transcripción, incluyendo el factor nuclear-κB (NF-κB), kinase de proteína mitogen-activados p38 (p38 MAPK), c-Jun N-terminal quinasa (JNK) y extracelular kinase de proteína regulada por señal (ERK1/2). Respectivamente, la maduración de DCs de CD40L y TNF-α a través de receptores de CD40 y TNF induce la vía del NF-κB. En cambio, IFN-γ estimula una vía diferente, incluyendo la activación de la cinasa Janus (JAK), tirosina quinasa (TYK) y el transductor de señal y activador de proteínas de transcripción (STATs), y estos efectos aguas abajo también se complementaron con la activación de la vía NF-κB52. Además, mientras que el perfil de expresión génica de maduración CD40L/TNF-α-base DC sugiere que estos DCs polarizan las células T hacia una de respuesta celular Th253, maduración de DC por IFN-γ está sesgada fuertemente hacia células Th1 respuesta54. Por lo tanto, en este Protocolo no se emplean estos otros inductores de la maduración de DC que están relacionados con la diferenciación hacia células específicas T subconjuntos.
Varios informes han demostrado que ex vivo-DCs diferenciadas son capaces de inducir todo el espectro de síntomas clínicos de la EAE y la patología en ratones55. Se ha adoptado el método de la inducción de EAE pasiva por DCs ex vivo activados con diversas modificaciones por diferentes laboratorios. La combinación de la inducción de EAE pasiva y activa por administración de MOG cebada BMDCs, 7 días antes de la inmunización con MOG y completa adyuvante de Freund (CFA) da lugar a mayores puntuaciones de los síntomas clínicos (máximo puntuación clínica: 3.5) en comparación con la EAE pasiva inducción por la administración de MOG cebada BMDCs solamente (máximo puntuación clínica: 2)56. Resultados con este método combina la MOG cebada BMDCs con MOG inmunización sugiere que inicio de la enfermedad ocurre en el día 9 después de la inmunización con MOG y CFA56. Sin embargo, ya se sabe que el CFA causa inflamación significativa en el sitio de administración57, hemos utilizado pasiva inducción de EAE administración de DCs solamente en nuestro protocolo para analizar eficazmente el efecto de TolDCs durante la EAE. Para confirmar más el fenotipo funcional de TolDCs, uno debe también prueba en suprimir los síntomas clínicos de ratones EAE activadas. La vía de administración de DCs es también crítica para la inducción de EAE síntomas58. Como se informó por nuestro laboratorio y por otros, la inyección subcutánea de BMDCs en la región de flanco de ratones C57BL/6 una vez por semana para un total de 3-4 inyecciones induce una puntuación clínica pico de EAE alrededor de 2-2.5 con inicio de enfermedad reproducible en día 11-1237 ,58. Proporcionamos un breve clip para demostrar los diferentes síntomas clínicos entre activa y pasiva inducción de EAE (Video 1).
Las limitaciones reconocidas de nuestro protocolo incluyen el tiempo requerido por los métodos empleados y la dependencia de un microambiente fisiológico no relevante para la diferenciación de BMDC. Sin embargo, mientras que el anticuerpo enriquecido métodos de separación de la columna de la colección para DCs y las células de T de bazo de ratón pueden ser eficiente más tiempo, sufre de un bajo rendimiento de la población deseada de DC. Así, la ventaja del método de desarrollo DC derivadas de la médula ósea es la producción más alta de la escala log de las poblaciones de CC en comparación con la separación de columnas anticuerpo del bazo entero. Como se señaló anteriormente, el DCs generadas en vitro por este método requiere una alta concentración de suplementación de citoquinas que no es fisiológicamente relevante para DCs en vivo microambiente59 y también asegura a largo plazo sostenibilidad de DC. También, el GM-CSF utilizado en nuestro protocolo no es una citocina esencial para la normal diferenciación DC en vivo60. Sin embargo, el protocolo propuesto de generación BMDC reproducible rinde una alta fracción de funcionalmente TolDCs y debe ser visto como un método altamente confiable y reproducible para la generación de DCs funcionales con propiedades tolerogénicas.
En conclusión, los TolDCs generados por el protocolo descrito aquí puede efectivamente caracterizarse mediante la evaluación de sus perfiles de expresión génica y proteínas, mediante la determinación de su capacidad para modular las respuestas inmunes dependientes de células T en vitroy por evaluar su función como terapia celular adoptiva para suprimir la inducción de EAE en vivo. Nuestro protocolo proporciona un marco para la evaluación de nuevos agentes cree que la capacidad para inducir TolDCs y para acelerar aún más el proceso de desarrollo terapéutico para TolDCs de banco a la clínica.
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Disclosures
Ninguno
Acknowledgments
Agradecemos a productos farmacéuticos Jalale para proporcionar CDDO-DFPA. También reconocemos el apoyo de la Jane y Lee Seidman Cátedra de innovación de cáncer pediátrico (John Letterio). Este trabajo fue financiado por el Departamento de defensa [W81XWH-12-1-0452]; la iniciativa de investigación de cáncer en adultos, Angie Fowler adolescentes y jóvenes, en el caso centro integral del cáncer; y el premio académico graduado de Callahan Hsi-Ju Wei de F.J. Callahan Fundación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CDDO-DFPA (RTA-408) | Reata Pharmaceuticals | in house synthesis | Cell culture |
| Mouse GM-CSF | Peprotech Inc. | 315-03 | BMDC differentiation |
| Mouse IL-4 | Peprotech Inc. | 214-14 | BMDC differentiation |
| Lipopolysaccharides (LPS) | Sigma Aldrich Inc. | L2880 | Cell culture |
| β-mercaptoethanol | Sigma Aldrich Inc. | 516732 | Cell culture |
| Pertussis toxin (PTX) | R&D systems | 3097 | EAE induction |
| MOG (35–55) peptide | 21stCentury Biochemicals | in house synthesis | EAE induction |
| Trypan blue | Gibco, Life Technologies | 15250-061 | Cell culture |
| RPMI-1640 plus L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 11875-093 | Cell culture |
| Non-essential amino acid (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | Cell culture |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630080 | Cell culture |
| penicillin/streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | Cell culture |
| 40 μm cell strainer | Corning | 352340 | Cell isolation |
| PE-conjugated CD80 | BD Biosciences | 557227 | Flow cytometry |
| PE-conjugated CD86 | BD Biosciences | 555665 | Flow cytometry |
| PE-conjugated PD-L1 | BioLegend | 124307 | Flow cytometry |
| APC-conjugated MHCII | Miltenyi Biotec Inc. | 130-112-388 | Flow cytometry |
| APC-conjugated CD11c | BD Biosciences | 340544 | Flow cytometry |
| Isotype matched PE | Miltenyi Biotec Inc. | 130-091-835 | Flow cytometry |
| Isotype matched APC | Miltenyi Biotec Inc. | 130-091-836 | Flow cytometry |
| CFSE | BioLegend | 423801 | T cell proliferation assay |
| Pan dendritic cell isolation kit | Miltenyi Biotec Inc. | 130-100-875 | T cell proliferation assay |
| FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotec Inc. | 130-100-875 | T cell proliferation assay |
| Pan Dendritic Cell Biotin-Antibody Cocktail | Miltenyi Biotec Inc. | 130-100-875 | T cell proliferation assay |
| Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec Inc. | 130-100-875 | T cell proliferation assay |
| CD4+ T cell isolation kit | Miltenyi Biotec Inc. | 130-104-454 | T cell proliferation assay |
| CD4+ T cell Biotin-Antibody Cocktail | Miltenyi Biotec Inc. | 130-104-454 | T cell proliferation assay |
| Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec Inc. | 130-104-454 | T cell proliferation assay |
| ACK lysing buffer | ThermoFisher Scientific | A1049201 | BMDC differentiation |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309626 | T cell proliferation assay |
| 3 ml syringe | BD Biosciences | 309588 | BMDC differentiation |
| 25G needle | BD Biosciences | 309626 | T cell proliferation assay |
| 23G needle | BD Biosciences | 309588 | BMDC differentiation |
| BSA | Sigma Aldrich Inc. | A2058 | T cell proliferation assay |
| EDTA | ThermoFisher Scientific | 15575020 | T cell proliferation assay |
| LS Column | Miltenyi Biotec Inc. | 130-042-401 | T cell proliferation assay |
| Pre-Separation Filter | Miltenyi Biotec Inc. | 130-095-823 | T cell proliferation assay |
| collagenase D | Sigma Aldrich Inc. | 11088858001 | T cell proliferation assay |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14025076 | T cell proliferation assay |
| ovalbumin (OVA) peptide 323–329 | Sigma Aldrich Inc. | O1641 | T cell proliferation assay |
| Mouse IFN-γ TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm01168134_m1 | qRT-PCR |
| Mouse IL-12a TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm00434165 | qRT-PCR |
| Mouse IL-12 p70 DuoSet ELISA | R&D systems | DY419-05 | ELISA |
| Mouse EDN-1 ELISA | RayBiotech | ELM-EDN1-1 | ELISA |
| TNF-α TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm00443258 | qRT-PCR |
| Mouse TNF-α Quantikine ELISA Kit | R&D systems | MTA00B | ELISA |
| IL-6 TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm00446190 | qRT-PCR |
| Mouse IL-6 Quantikine ELISA Kit | R&D systems | M6000B | ELISA |
| IL-23a TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm01160011 | qRT-PCR |
| Mouse IL-23 DuoSet ELISA | R&D systems | DY1887-05 | ELISA |
| IL-4 TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm99999154_m1 | qRT-PCR |
| IL-10 TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm01288386_m1 | qRT-PCR |
| TGF-β TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm01178820_m1 | qRT-PCR |
| Anti-Heme Oxygenase 1 antibody | Abcam | ab13248 | Western blotting |
| Anti-β-actin antibody | Abcam | ab8226 | Western blotting |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad Inc. | qRT-PCR | |
| BD FACSCalibur Cell Analyzer | BD Biosciences | Flow cytometry |
References
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