Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

פיתוח ואפיון פונקציונאלי של תאים דנדריטים מאתר Tolerogenic

Published: May 18, 2018 doi: 10.3791/57637

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לפתח, איפיון תאים דנדריטים tolerogenic (TolDCs), להעריך את השירות immunotherapeutic שלהם.

Abstract

מערכת החיסון פועלת על ידי שמירה על איזון הדוק בין תיאום תגובות נגד אנטיגנים זרים, שמירה על מצב שאינו מגיב נגד אנטיגנים העצמי, כמו גם אנטיגנים נגזר מאורגניזמים commensal. שיבוש הומאוסטזיס החיסון הזה יכול להוביל לדלקת כרונית להתפתחות של מחלת חיסון עצמי. תאים דנדריטים (Dc) הם תאים אנטיגן מקצועיים של מערכת החיסון המולדת הכרוכה בהפעלתו תמים T תאים ליזום תגובות מערכת החיסון כנגד אנטיגנים זרים. עם זאת, ניתן להבחין DCs גם לתוך TolDCs שפועלים כדי לשמר ולקדם את תא T סובלנות וכדי לדכא את התאים אפקטור תורמים להתפתחות של תנאים או דלקת אוטואימונית או כרונית. ההתקדמות האחרונה בהבנה שלנו של TolDCs מרמז כי DC סובלנות יכולה להיות מושגת על ידי להתכוונן מצבם בידול. תופעה זו הובילה לצמיחה אדירה בפיתוח טיפולים TolDC רבים כשל חיסוני נגרמת בשל לפרוץ סובלנות המערכת החיסונית. להצלחה בלימודים במודלים מאתר פרה מחלת חיסון עצמי יש נוספת לאמת את התועלת immunotherapeutic של TolDCs בטיפול של הפרעות אוטואימוניות. היום, TolDCs הפכו כלי immunotherapeutic מבטיח במרפאה עבור החזרתו של רגישות המערכת החיסונית בהפרעות חיסוניים שונים על ידי מיקוד תגובות אוטואימוניות פתוגניים תוך השארת חיסון הגנתי ללא פגע. למרות מגוון של אסטרטגיות הוצע על ידי מעבדות מרובים כדי לגרום TolDCs, יש אין עקביות באפיון של פנוטיפ הסלולר ופונקציונליים של תאים אלה. פרוטוקול זה מספק מדריך צעד אחר צעד להתפתחות של מח עצם-derived DCs במספרים גדולים, שיטה ייחודית המשמשת כדי להבדיל אותם לתוך TolDCs עם triterpenoid סינתטי 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic חומצה-difluoro-propyl-אמיד (CDDO-DFPA), של טכניקות השתמשו כדי לאשר פנוטיפ שלהם, כולל ניתוחים של חיוניות חתימות מולקולרית של TolDCs. לבסוף, אנו מראים שיטה להערכת הפונקציה TolDC על-ידי בדיקת שלהם לדיכוי המערכת החיסונית בתגובה במבחנה וב -vivo במודל של פרה של טרשת נפוצה.

Introduction

תאים דנדריטים (Dc) הם חלק אינטגרלי של מערכת החיסון המולדת, היו ראשית גילה, מאופיין על ידי ראלף שטיינמן, כהן Zanvil בשנת 1973 כמו הצגת אנטיגן מקצועיים ראשי תאים1. DCs הוכחו לשחק תפקיד חשוב בהפעלת מערכת החיסון על ידי הצגת אנטיגנים מעובד על תאי T ותאי B באמצעות קומפלקסים histocompatibility הגדולות (MHC) באיברים הלימפה משני כדי לקשר את מולדת ומערכות החיסון מסתגלת2. המערכת החיסונית יונקים, יש לפחות שתי קטגוריות של בקרי קבוצת מחשבים אשר תוארו מיאלואידית DCs ו- plasmacytoid בקרי קבוצת מחשבים (שיתפקדו)3. תאים מיאלואידים DCs, ידוע גם בשם DCs קונבנציונאלי (cDCs), מאופיינים על ידי הביטוי של CD11c, ניתן להבחין כמו בקרי קבוצת מחשבים (iDCs) לא בוגר חוץ גופית בתוך מח העצם ובתאים או ומונוציטים דם היקפיים באמצעות פקטור גרנולוציט-מקרופאג-המושבה-מגרה (GM-CSF) ו- IL-4 במאתר או מין אנושי, בהתאמה4.

הפעלת 'סכנה' אותות, כגון פתוגן-הקשורים לתבניות מולקולרית (PAMP) או נזק-הקשורים דפוסי מולקולרית (רטיבות), יניעו ההבשלה iDCs לכיוון immunogenic DCs בתור בוגר בקרי קבוצת מחשבים (mDCs) דרך מחייבות קולטנים שונים של זיהוי תבנית DC משטח5. Immunogenic Dc נוסף פריים התפשטות תא T נאיבי ובידול דרך קולטנים upregulation של MHCII2, ליגנדים costimulatory (CD80, CD86 ו- CD40)6, ציטוקינים מגשרים מסיסים אחרים7. מפל של המתווך הפרו דלקתיים הפקה של Dc Immunogenic חיוני עבור תא T בתיווך ציטוקין בידול. לדוגמה, IFN-γ ו- IL-12 נחוצים Th1 בידול8 ו- IL-1, IL-6, ו- IL-23 הם קריטיים עבור תמים קיטוב תא T לכיוון תאי Th179. למרות DCs בוגרת מגיבים אנטיגנים זרים, הפעלת DC לא מבוקרת על ידי העצמי-אנטיגנים עלול לגרום סובלנות אבלציה ולטפח התפתחות מחלות אוטואימוניות על ידי יצירת autoreactive T תאים אשר הפעלת מוביל הרס רקמות10 .

דיווחים אחרונים סיפקו ראיות ברורות של DC פלסטיות, ומעוררות את יכולתם לתקשר ברמזים שונים בתוך microenvironment רקמות שלהם וכדי להבדיל לערכות אפקטור ברורים/DC מדכא. המתווכים אנטי-דלקתי, כגון IL-1011, TGF-β12והו-113 הוכחו לשחק תפקיד חשוב בדיכוי המערכת החיסונית על ידי גרימת tolerogenic בקרי קבוצת מחשבים (TolDCs). TolDCs אלה לרכוש פונקציות רגולטוריות, לדכא את תא T התפשטות14. יתר על כן, העדר גירוי משותף על-ידי בקרי ואת הייצור של מגשרים אנטי דלקתיות של TolDCs לתרום אינדוקציה של הרגולציה ותאי T (Tregs) והן גם ביעילות לעכב Th1 והן Th17 בידול והתרחבות15. אחרי שני עשורים, הפוטנציאל הטיפולי של TolDCs דווח על ידי מספר חוקרים. במחקרים אלה, הממשל של לשעבר-vivo המופקים סימפטומים פתולוגיים TolDCs לא רק יושבחו במודלים פרה שונה של מחלות אוטואימוניות16 אבל גם הוביל את הפיתוח של רגישות המערכת החיסונית בחולי17 ,18. מעניין, היום הטיפול TolDCs נחשב כמו גישה חלופית או משלים עבור מחלות אוטואימוניות בניסויים קליניים מספר, כולל מסוג 1 סוכרת19, דלקת מפרקים שגרונית20, 21, טרשת נפוצה (MS)22,23,24, ו- מחלת קרוהן25.

ישנם מגוון של פרוטוקולים נועדה לפתח TolDCs, מספר מעבדות דיווחו על שיטות הדור, אפיון פנוטיפי של TolDCs. שיטות אלה ניתן לייצר reproducibly TolDCs במבחנה אבות hematopoietic, לשמור אותם על stably tolerogenic המדינה ויוו26,27,28,29. ניתן להמיר את iDCs TolDCs על ידי חשיפה שונים immunomodulatory סוכנים תרופתי או ציטוקינים אנטי דלקתיות. לדוגמה, ויטמין D3 הוא סוכן תרופתי ידוע ידוע אל להגדיל ייצור IL-10, לדכא את הפרשת IL-12 מ- Dc, ובכך להגביר את הפונקציה לדיכוי המערכת החיסונית שלהם30. יתר על כן, כאשר DCs חשופים לגירויים דלקתי חזק, כגון lipopolysaccharides (LPS), מספר סוכנים תרופתי כגון דקסמתזון31, rapamycin32קורטיקוסטרואידים33 הוכחו כדי לעודד פנוטיפ TolDC על-ידי הפחתת ביטוי משטח DC CD40, CD80, CD86 ו- MHCII34. IL-10 ו- TGF-β הן רוב: לימודי ציטוקינים אנטי דלקתיות לזירוז DC סובלנות35 , חשיפה והמצוות הן של ציטוקינים אלה הוכחו לגרום פנוטיפ tolerogenic ב Dc36.

מאז tolerogenic ש-DC מוגדרת על-ידי מאפיינים פונקציונליים ולא על ידי סמנים פנוטיפי, שם הוא נהדר צריך לפתח שיטה עקבית של אפיון הסלולר ופונקציונליים של TolDCs. יתר על כן, נוהל קפדני ועקבית יש ליצור את אפיון פנוטיפ tolerogenic DC והערכת עקבי אם אנחנו רוצים ביעילות, reproducibly להשוות את היכולת של סוכנים חדשים כדי לעודד את פנוטיפ TolDC ב מעבדה. כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט עם שיטות שלב אחר שלב כדי לבודד את iDCs של אבות hematopoietic של עכברים וכדי לאחר מכן לנתח את היעילות של סוכנים חדשים תחת הערכת היכולת שלהם להמיר iDCs TolDCs, מתן של חזקים אפיון פנוטיפי פונקציונלי של TolDCs גם במבחנה וגם בתוך vivo. תיאור זה כולל שיטה משוכללת כדי לאפיין את TolDCs על ידי שלהם ליגנדים משטח, ציטוקינים בפרופיל פונקציות לדיכוי המערכת החיסונית במבחנה. אנו מספקים גם דוגמה של שיטה כדי לחקור את היישום טיפולית פוטנציאל של אלה TolDCs במודל של ניסויים פרה-קליניים של MS, ניסיוני אוטואימוניות דלקת המוח וחוט השדרה (EAE). פרוטוקול הוקמה זה יסייע החוקרים להעריך את היכולת של סוכנים חדשים כדי לקדם את אינדוקציה של TolDCs, יקל על המאמץ להרחיב את היקף הפיתוח טיפוליות TolDC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל מחקרים בוצעו בהתאם הליכים שאושרו על-ידי את Case Western Reserve הספר לרפואה של אוניברסיטת של אכפת לי חיה המוסדית והוועדה שימוש.

1. מכינים תאים דנדריטים הנגזרות מח העצם (BMDCs)

  1. לעקר את כל מכשירי הניתוח באמצעות autoclaving, לבצע את הניסוי ב- class II בטיחות ביולוגית ארון עם נהלי בטיחות הופקעו.
  2. המתת חסד C57BL/6 עכברים בגיל 8-10 שבועות באמצעות CO2 קאמרית. הנח את העכבר על לוח ויבתר ולשטוף עם 70% אתנול. לסלק עצמות השוקה-שוקית, עצם הירך באמצעות מספריים כירורגיים ולמקם אותם עם 70% אתנול בצלחת תרבות 10 ס מ.
  3. השתמש להבים כירורגי, מלקחיים לנתח רקמות משם ככל האפשר על המכסה של 10 ס מ תרבות מאכל ובידוד tibias ועצמות ירך כדי למקם אותם עם 70% אתנול בצלחת תרבות 6 ס מ.
  4. השתמש להבים כירורגי כדי לקצץ בשני הקצוות של tibias ועצמות ירך. השתמש 3 מ"ל PBS במזרק 3 מ עם מחט 23 גרם לרוקן את התוכן של מח מקצה אחד של עצמות כדי צינור חרוטי המכיל 12 ml PBS. חזור על שלב 3 x בכל קצה של עצמות.
  5. Centrifuge התליה תא ב g x 300 במשך 5 דקות.
  6. הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בגדר תא עם 1 מ"ל ACK מאגר lysing במשך 5 דקות להסיר תאי דם אדומים.
  7. להוסיף 9 מ ל PBS לדלל מאגר lysing ACK, צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות.
  8. הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בינונית תרבות 10 מ"ל (RPMI-1640 פלוס -גלוטמין, 10% FBS, חומצת אמינו שאינן הכרחיות 1% (100 x), 10 מ מ HEPES, 50 ננומטר β-mercaptoethanol ו- 5% פניצילין/סטרפטומיצין).
    הערה: רמת אנדוטוקסין חייב להיות פחות מ 0.1 האיחוד האירופי/מ ל FBS.
  9. לעבור התליה תא דרך מסננת תא 40 μm לקחת 20 µl תא השעיה, לערבב עם µl 80 של trypan כחול כדי לספור את מספר תאים חיים על-ידי שימוש cytometer.
  10. התאם מספר תאים לעונה 1 פרק 106 תאים למ"ל ng/ml 15 GM-CSF, 10 ננוגרם למ"ל IL-4.
  11. צלחת 3 מ"ל של עונה 1 פרק 106 תאים למ"ל בבאר בכל צלחת 6-ובכן, דגירה התאים ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2ו- 95% הלחות בחממה2 CO.
    הערה: תאי מח העצם של עכבר אחד הוא סביב 3-5 x 107 תאים, המציין כי זה יכול להיות ממוקם 2 כדי 3 צלחות 6-. טוב.
  12. ביום 3, הסר כל 3 מ ל תרבות בינוני מכל קידוח, להוסיף PBS טריים 2 מ"ל כל היטב, ואז בעדינות מערבולת את הצלחת כדי להבטיח הסרת כל התאים שאינם מחסידי.
  13. החלף בינוני תרבות טריים 3 מ ל 15 ננוגרם למ"ל GM-CSF ו 10 ננוגרם למ"ל IL-4 כל היטב. דגירה התאים ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2ו- 95% הלחות בחממה2 CO.
  14. יום 5, ישירות להוסיף עוד 3 מ"ל טריים תרבות בינוני עם 15 ננוגרם למ"ל GM-CSF ו 10 ננוגרם למ"ל IL-4 מכל קידוח. דגירה התאים ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, ו- 95% הלחות בחממה2 CO.
    הערה: הנפח הכולל כל היטב זה עכשיו 6 מ.
  15. יום 7, לשים את הצלחת על קרח במשך 10 דקות. בעדינות pipette המדיום תרבות בבאר כל מכך באופן רופף-כנצרות BMDCs כמו iDCs לתוך ההשעיה.
    הערה: המקרופאגים חסיד עדיין מחוברים לצלחת. טמפרטורה נמוכה ובעדינות ההליכים הם המפתח כדי למנוע DC הפעלה להשפיע עוד ניסויים.
  16. Centrifuge התליה תא ב g x 300 במשך 5 דקות, resuspend טריים בינונית תרבות לניסויים נוספים.
    הערה: BMDCs יכול להיות מזוהה עם התווית על-ידי קרינה פלואורסצנטית נוגדן CD11c על ידי cytometry זרימה, הראנו את האסטרטגיה שלנו חסימה של BMDCs לניסויים נוספים באיור1.

2. איפיון TolDC ג'ין ופרופיל חלבון

  1. צלחת ml 2 של עונה 1 פרק 106 BMDCs/ml לכל באר היטב 6-צלחת עם תרבות במדיום נוכחות או היעדרות של 100-400 nM CDDO-DFPA עבור המקננת h 1-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 ו- 95% הלחות בחממה2 CO.
    הערה: CDDO-DFPA, triterpenoid סינתטי, מהווה גורם גרעיני (נגזר erythroid 2) - כמו - 2 פקטור (Nrf2) משרן והמעכב הפקטור הגרעיני-κB (NF-κB). להחיל סוכנים אחרים עבור אינדוקציה של TolDCs מתוך iDCs, כגון IL-10, ויטמין D3, דקסמתזון או מפרץ 11-7085, ולשנות את שלב זה כדי תנאי האופטימלי עבור כל סוכן.
  2. להוסיף 10 או 100 ננוגרם למ"ל של LPS עבור המקננת 4-24 שעות כדי לגרום mDCs (זמן הדגירה היא שונה בשל מדידה mRNA או חלבון).
  3. בעדינות pipette המדיום תרבות בבאר כל ולקצור התליה תא באמצעות פיפטה 1 מ"ל. צנטריפוגה-300 גרם x עבור 5 דקות לאסוף את התאים ואת תגובת שיקוע, בהתאמה.
  4. לנתח את ליגנדים משטח של כדורי תא ידי cytometry זרימה, כגון ליגנדים מופחתים: CD40, CD80, CD86, MHC-II, OX40L, ICOSL או מעכבות ליגנדים: PD-L1, PD-L2, ILT3, ILT4.
  5. לבודד את הרנ א מ כדורי תא ולנתח את ה-RNA ודוגמאות supernatant עבור ציטוקין פרופיל, גנים וחלבונים הרמות על ידי PCR כמותי בזמן אמת (לרביעיית-PCR) ואליסה, בהתאמה.
    הערה: לדוגמה, ציטוקינים דלקתיים: TNF-α, IFNγ, ציטוקינים EDN-1, IL-6, IL-12, ו- IL-23 או אנטי דלקתיות: IL-4, IL-10, IL-15, TGF-β1, הו-1.

3. להעריך את תפקוד TolDCs במבחנה , In Vivo

  1. תא T התפשטות Syngeneic Assay
    1. לעקר את כל מכשירי הניתוח באמצעות autoclaving, לבצע את הניסוי ב- class II בטיחות ביולוגית ארון עם נהלי בטיחות הופקעו.
    2. להכין מאגר MACS באמצעות 0.5% אלבומין שור (BSA) ו- 2 מ מ EDTA 500 מ"ל PBS. לעקר את המאגר על-ידי סינון דרך מסנן 0.2 µm.
      הערה: לשמור על המאגר על הקרח במהלך הניסוי הבא.
    3. כדי להשיג CD4+ T תאים, המתת חסד OT-II T-cell קולטן (TCR) העכברים הטרנסגניים בגיל 8-10 שבועות באמצעות CO2 קאמרית. הנח את העכבר על לוח ויבתר ולשטוף עם 70% אתנול. לבודד את הטחול מהצד השמאלי של הבטן באמצעות מספריים כירורגיים וחדים.
    4. הכניסו את הטחול עם 2 מ"ל PBS לצלחת תרבות 6 ס מ ולהשתמש האחורי של דחיפה-מקל של מזרק 3 מ"ל מינצ הטחול על-ידי העברת מסננת תא 40 μm.
    5. לאסוף את ההשעיה תא צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות.
    6. Resuspend בגדר תא ב- 400 μl מאגר מקינטוש.
    7. להוסיף 100 μl של CD4+ תא T ביוטין-נוגדן קוקטייל ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
      הערה: קוקטייל הנוגדן נקשר על סוגי תאים אחרים מלבד CD4+ T תאים, כגון CD8a, CD11b, CD11c, CD19, CD25, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, אנטי-MHC class II, טר-119, TCRγ/אלפא.
    8. הוסף μl 300 MACS מאגר μl 200 של חרוזים אנטי ביוטין (טבלה של חומרים) ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
    9. מקום חיבר העמודה של הספירות פרומגנטי (טבלה של חומרים) ומסנן הכנה להפרדות צבע ביחד על המגנטי שדה, לשטוף אותו עם 3 מ"ל של מאגר מקינטוש.
    10. מוסיפים 9 מ של מקינטוש מאגר התאים ואת צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות.
    11. Resuspend בגדר תא ב- 3 מ"ל של מאגר MACS, החל על העמודה. לאסוף זרימה דרך CD4 המכיל+ T תאים.
    12. לשטוף את העמודה עם עוד 3 מ"ל של מקינטוש מאגר ולאסוף גם את הזרימה דרך.
    13. כדי להשיג DCs פאן הטחול, המתת חסד C57BL/6 עכברים בגיל 8-10 שבועות באמצעות CO2 קאמרית. הנח את העכבר על לוח ויבתר ולשטוף עם 70% אתנול. לבודד את הטחול מהצד השמאלי של הבטן באמצעות מספריים כירורגיים וחדים. הכניסו את הטחול לצלחת תרבות 6 ס"מ המכילה 2 מ"ל של פתרון collagenase D (2 מ"ג/מ"ל collagenase D מומס HBSS המכילים סידן, מגנזיום).
    14. להזריק 1 מ"ל collagenase D לפתרון הטחול פעמיים עם מזרק 1 מ"ל, מחט 25 גרם. לחתוך הטחול לחתיכות קטנות עם מספריים קטנות.
    15. לנער, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 25 דקות.
    16. להוסיף 500 μl של 0.5 M EDTA בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
      הערה: השלבים של 3.1.13-3.1.14 הם קריטיים להגדלת היבול של בקרי תחום.
    17. כעת להשתמש האחורי של דחיפה-מקל של מזרק 3 מ"ל מינצ slurry את הטחול על-ידי העברת מסננת תא 40 μm ולאסוף התליה תא על-ידי צריך שתוציאו ב g x 300 במשך 5 דקות.
    18. Resuspend בגדר תא ב- 350 μl של מקינטוש מאגר, 50 μl של ה-FcR חסימת ריאגנט μl 100 של פאן הדנדריטים תאים ביוטין-נוגדן קוקטייל ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
      הערה: נוגדן קוקטייל נגד אנטיגנים זה אינם מבוטאים על-ידי בקרי.
    19. לשטוף את התאים על-ידי הוספת 9 מ של מאגר MACS, צנטריפוגה ב g x 300 במשך 5 דקות.
    20. Resuspend בגדר תא ב- 800 μl MACS המאגר ולהוסיף 200 μl של אנטי ביוטין חרוזים ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
    21. חזור על השלבים של 3.1.9-3.1.11 כדי לאסוף DCs.
    22. לשטוף עמודה עם עוד 3 מ"ל של מקינטוש מאגר פעמיים, גם לאסוף את הזרימה דרך.
    23. לפנק את 2 x 105 Dc/ml נוכחות או היעדרות של 100-400 nM CDDO-DFPA ב C ° 37 עבור 1 מר בנפרד, תווית CD4+ תאי T (1 x 107/ml) עם 1 μM CFSE ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות, לשטוף עם PBS , והתאם את עוצמת הקול כדי להשיג ריכוז סופי 2 x 106 T תאים/מ ל....
    24. בשלב הבא, בצלחת 96-ובכן, בשיתוף תרבות 100 μl של התאים הדנדריטים שטופלו באותו אמצעי אחסון של CD4 התווית על-ידי CFSE+ T תאים, שניהם שנאסף על השלבים שלעיל כדי לקבל 1:10 יחס. עכשיו להוסיף 100 ננוגרם למ"ל אובלבומין (פשוט) פפטיד 323-329 לכל טוב, למדוד עוצמת CFSE של תאי T על ידי cytometry זרימה לאחר 2-3 ימי דגירה.
      הערה: את מספרי הטלפון הנייד ואת יחס של DCs ו- T תאים מוטבו מן העבודה הקודמת שלנו37.
  2. זירוז פסיבית EAE באמצעות הזרקת BMDCs פעמו עם מיאלין אוליגודנדרוציטים גליקופרוטאין (ש א) (35-55)
    1. צלחת ml 2 של עונה 1 פרק 106 BMDCs/ml לכל טוב טוב 6-צלחת בינונית-תרבות ב נוכחות או היעדרות של 100-400 nM CDDO-DFPA עבור המקננת 1שעות.
    2. להוסיף 10 ng/ml של LPS עבור ומוכנסות 24 שעות.
    3. להוסיף 100 μg/ml של ש. א. (35-55) עבור ומוכנסות 4 שעות.
    4. לקצור את הבולם תא, צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות.
    5. Resuspend בגדר תא עם PBS ולספור את התאים.
    6. Subcutaneously להזריק μl 200 2 x 106 תאים עכברים C57BL/6 נקבה בת 8-10 שבועות (100 μl לתוך כל רגל).
    7. ביום של הזרקת BMDC ו- 48 שעות. מאוחר יותר, להזריק 200 ng של שעלת רעל (PTX) כל עכבר.
    8. חזור על צעדים 3.2.6-3.2.7 פעם בשבוע, למשך 4 שבועות רצופים.
    9. להעריך את הסימפטומים הקליניים של EAE מדי יום באמצעות הקריטריונים הסטנדרטיים37 (0.5-רפוי הזנב, הזנב 1-צליעה, חולשה של הגפיים האחוריות 2 בינוני, חולשה של הגפיים האחוריות 3-חמור, שיתוק גפיים הינד 4-שלמה, 5-quadriplegia או אדעך המדינה, 6-מוות).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בידול ובחירה של BMDCs:

מח עצם ובתאים היו תרבותי שלם בינוני RPMI בנוכחות GM-CSF ו- IL-4 כדי להתמיין iDCs במשך 7 ימים (איור 1 א'). יום 1, התאים היו קטנים בגודלם, הראו מורפולוגיה כדורית. כביסה עם PBS לפני ההחלפה של בינוני טריים יום 3 עזר תאים לאשכולות טופס, גם הגדילה את אוכלוסיית CD11c+ תאים. ביום 4, BMDCs הורחבו במידה ויזם הקמת אשכול. מודבקת מקרופאגים היו גם המרה, נצפתה בתחתית לצלחת עם צורה מוארכת. יום 5, נוצרות אשכולות גדולים בגודל של BMDCs. יום 6, נצפו גם מספר רב של חסיד למחצה, צף BMDCs. BMDCs היו קצרו ביום 7, נותחו על ידי cytometry זרימה עבור ביטוי CD11c כסמן ספציפי של מאתר Dc. כפי שמוצג מגרש cytometry זרימה נציג איור 1B, בסביבות 83.6% BMDCs לבטא CD11c התקבלו על ידי שיטה זו.

אינדוקציה ואפיון גנטי של TolDCs:

חלק מהסוכנים מוכרת TolDCs, כגון ויטמין D338 ו דקסמתזון39, ידועים למטה-לווסת את הביטוי של ליגנדים משטח DC, לרבות MHC II, מולקולות costimulatory, CD40, CD80 ו- CD86. לעומת זאת, בהקשר של LPS או או CD40L-induced התבגרותם של בקרי קבוצת מחשבים, מעכבי calcineurin וציקלוספורין A ו- FK506 הראו השפעה על הביטוי של CD83, CD80, CD86 ו- MHC II33. כפי שמתואר על ידי ניתוח cytometry זרימה, אינדוקציה של TolDC על ידי CDDO-DFPA היה אין השפעה משמעותית על הביטוי LPS-induced ליגנד משטח של בקרי קבוצת מחשבים, כולל CD80, CD86, MHC II, PD-L1 ו- CD40. (איור 2).

יתר על כן, ניתוח transcriptome, ציטוקינים השוואתית של BMDCs מטופלים עם או בלי CDDO-DFPA בנוכחות או היעדר LPS מתואר פרופיל מאופנן גנים דלקתיים. הטיפול CDDO-DFPA משמעותית LPS מושרה גנים ציטוקינים פרו-דלקתיים כגון IFN-γ, IL-12, EDN1, TNFα, IL-6 ו- IL-23 (איור 3 א-3F). אלו ציטוקינים ידועים Th1 (IFN-γ ו- IL-12) ואת Th17 (IL-6 ו- IL-23) תא בידול. יתר על כן, CDDO-DFPA שטופלו BMDCs הראה משופרת ביטוי של גנים ציטוקין דלקתי כגון IL-4, IL-10, TGF-β, הו-1 (איור 4A-4D). גנים אנטי דלקתיות אלה ידועים אפנן מחלת חיסון עצמי באמצעות קידום Th2 (IL-4), Treg (IL-10 ו- TGF-β) תאית התמיינות. 40 כאן חשוב לציין כי את IL-12 ייחודי; ייצור ציטוקינים IL-10+ 36, את תנאי הגיוס של הו-1 ביטוי13ועיכוב של EDN-141 המושרה על ידי טיפול CDDO-DFPA, הם כל ידוע לאימות DCs tolerogenic פונקציה.

אפיון הסלולר ופונקציונליים של TolDCs חוץ גופית בתוך

בתיווך DC תא T התפשטות ידוע להיות מופעלות על ידי מעורבותם של ליגנד משטח costimulatory, כמו גם את הפרשת ציטוקינים ומגשרים מסיסים7. עם זאת, TolDCs לעכב תגובות תא T באמצעות כמה מנגנונים: על ידי גרימת anergy תא T, על ידי פעיל בקידום את המחיקה של תאים autoreactive על ידי קידום של קיטוב תמים T תאים Tregs42. אנחנו כבר דיווחו על שאפיון פונקציונלי CDDO-DFPA המושרה TolDCs37. תא t anergy ומחיקה של autoreactive T תאים ניתן לנתח באופן עצמאי על-ידי בדיקת סמני פני השטח או צביעת Annexin V/7-מ. עם זאת, אנחנו אישר פנוטיפ זה באופן עקיף על ידי מדידת תא T התפשטות אינדקס. לשם כך, אנו מנוצל העכברים הטרנסגניים OTII C57BL/6 תאי T, חשופה אותם syngeneic Dc המופק C57BL/6 עכברים ומטופל עם או בלי CDDO-DFPA. DCs אלה היו נשטפים, תרבותי משותף עם CFSE צבעונית בתאי T עם ביצית פפטיד. אנחנו נצפתה ירידה משמעותית תא T התפשטות על-ידי בקרי מראש שטופלו CDDO-DFPA, מציעה שלהם פנוטיפ tolerogenic (איור 5).

אין ויוו אפיון פונקציונלי TolDCs במודל של פרה של מחלת חיסון עצמי

לבסוף, הפונקציונליות של TolDCs DFPA-induced יכול להיבדק בכל מספר של פרה ויוו מודלים מאופיין אוטואימוניות או דלקתיים תכונות. מאז, EAE הוא מודל מאתר פרה מוסכמת של המחלה הקליני מערכת העצבים המרכזית בתיווך החיסון, MS43, אנחנו מנוצל זה במחקר הנוכחי שלנו. כדי לבחון עוד יותר את ויוו הפונקציונליות של CDDO-DFPA המושרה TolDCs, אנחנו מאותגרים אותם במודל של מאתר פרה של EAE פסיבי. בשביל זה, BMDCs היו תרבותי עם או בלי CDDO-DFPA בנוכחות של LPS ו ש א (35-55). תאים אלה ואז הוזרקו שוב ושוב כפרוטוקול מתוזמנת מצטיירת דמות 6A , עכברים נצפו באופן שגרתי לשכיחות הגבוהה של סימנים קליניים. כצפוי, LPS ו ש א (35-55) פעמו BMDCs הראה תסמינים קליניים של EAE, עם זאת; CDDO-DFPA בשלה BMDCs התייחסו מושהית הקבוצה הראתה הופעת מחלה עם סימפטומים קליניים מופחתת באופן משמעותי (איור 6B). תוצאות אלו לאמת את ותפקיד לדיכוי המערכת החיסונית של TolDCs הנגרמת על ידי טיפול CDDO-DFPA.

Figure 1
איור 1: פיתוח ואפיון פנוטיפי של BMDCs: (א) תאים במח העצם היו סמוקים החוצה מן העצמות השוקה, עצם הירך של עכברים C57BL/6, הבדיל עוד יותר כדי BMDCs. מערך תאים מתאים לאשכול היה במעקב על ידי מיקרוסקופ אור במהלך התקופה של בידול (סרגלי קנה מידה, 100µm). (ב) הבידול BMDCs אושר על-ידי הביטוי משטח CD11c, כפי נותחו על ידי FACS. גרפים מתארים את אחוז CD11c המורחב+ תא האוכלוסייה. (ג) Gating אסטרטגיה של תאים BMDCs. היו מגודרת קודם להוציא פסולת (FSC לעומת האס). שער הדרה כפיל היה מנוצל לשער על ללבישה תאים (FL2-W לעומת FL2-A). בתוך התאים גופיה, תאים חיים היו פיקוח על מגרש 7-מ (7-מ לעומת FSC). לאחר מכן התאים היו עוד יותר ניתח, פיקוח על ביטוי CD11c. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: DC לתא השטח ליגנד הביטוי הוא מסקרן על-ידי-CDDO-DFPA. התאים היו מראש שטופלו נוכחות או היעדרות של CDDO-DFPA (200 ננומטר) למשך שעה לפני גירוי עם LPS (100 ng/ml) עבור 24 שעות. הבעת פני שטח התא CD80 ', ' CD86 ', ' MHC II ', PD-L1, CD40 נותחה על ידי cytometry זרימה. דמות זו שונתה מ דו חות מדעיים 7, מספר המאמר: 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. לשכפל ולפרסם עם בעלי הזכויות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: CDDO-DFPA שינו את ותפקיד גנטיות וחלבון של immunogenic DCs-BMDCs מראש טופלו נוכחות או היעדרות של CDDO-DFPA (50-400 ננומטר) למשך שעה לפני תוספת של LPS (100 ng/ml), גם וקצרו לחילוץ RNA (4 שעות.) או רשאי תנאי התרבות בינונית עבור 24 שעות. לפני איסוף עבור ניתוחים ציטוקין. הרמות של IL-12 (B), TNFα (D), IL-6 (ה) ו- IL-23 (נ) נמדדו על ידי לרביעיית-PCR ELISA. ואילו הרמה של IFN-γ (א) נמדדה על ידי לרביעיית-PCR ו- EDN-1 (C) מאת אליסה לבד. התוצאות מבוטא זאת אומרת ± ש של 3 ניסויים. * P < 0.05, * * P < 0.01, * * * P < 0.001 לעומת הקבוצות שטופלו LPS. סטודנט אינטראקצית-t-test. דמות זו שונתה מ דו חות מדעיים 7, מספר המאמר: 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. לשכפל ולפרסם עם בעלי הזכויות." אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: CDDO-DFPA המושרה פנוטיפ TolDCs אושרה על-ידי ביטוי גנים וחלבונים. BMDCs היו מראש שטופלו ב נוכחות או היעדרות של CDDO-DFPA (10-400 ננומטר) למשך שעה לפני תוספת של LPS (100 ng/ml), ואת התאים נבצרו לחילוץ RNA לאחר 24 שעות. הרמות של IL-4 (א), IL-10 (B) ו- TGF-β (C) נמדדו על ידי לרביעיית-PCR. (ד) תא חלבון lysates נאספו ב-12 שעות. עבור ניתוחים ואת רמות HO-1, וβ-אקטין ביטוי נקבע על ידי סופג המערבי. התוצאות מבוטא זאת אומרת ± ש של 3 ניסויים. * P < 0.05, * * P < 0.01, * * * P < 0.001 לעומת הקבוצות שטופלו LPS. סטודנט אינטראקצית-t-test. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: CDDO-DFPA חשוף DCs לדכא את התפשטות תאים T. בקרי קבוצת מחשבים היו מראש מטופלים עם CDDO-DFPA (100-400 ננומטר) למשך שעה בלבד, ואז שטף, תרבותי משותף עם CFSE צבעונית בתאי T-1:10 יחס. (א) הטחול תאי T ו- DCs הם בודדו אותנו מהמתרחש C57BL/6 OTII העכברים הטרנסגניים ועכברים C57BL/6, בהתאמה. CDDO-DFPA pretreated DCs היו תרבותי משותף עם CFSE צבעונית בתאי T עם (עם) או בלי (ללא) תוספת ביצית בזמן הדגירה. תא t התפשטות נקבע על ידי cytometry זרימה-יום 2. גרפים מתארים את האחוז של חלוקת תאי T ביחס מספרי חלוקה תא T. הנתונים הם ייצוג של 3 ניסויים עצמאית. דמות זו שונתה מ דו חות מדעיים 7, מספר המאמר: 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. לשכפל ולפרסם עם בעלי הזכויות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: ש א בשלה פסיבי DC-induced EAE הוא יושב על-ידי TolDCs. (א) EAE אינדוקציה מאת ש א (35-55)-חזק פעמו BMDCs. BMDCs בוגרת טופלו נוכחות או היעדרות של CDDO-DFPA (400 ננומטר), לאחר מכן פעמו עם ש. א. (35-55) במשך 4 שעות. סכום כולל של 200 μl של 2 × 106 תאים היה מנוהל על ידי הזרקה תת-עוריים לתוך האזור האגף של עכברים C57BL/6 פעם אחת בכל שבוע עבור סכום של ארבע זריקות. בכל פעם, PTX היה מנוהל על ידי i.p. זריקה מיד, שוב יומיים לאחר מכן (יום 0 במחזור ה-4). (ב) תוצאות קליניות היו זריקות ארבע אחרי הכל מוקלט, באמצעות הקריטריונים הסטנדרטיים. כל הנתונים הוצגו גם זאת אומרת ± S.E.M. * P < 0.05. T-בדיקות מרובות עם ניתוח הולם-Sidak (n = 7 עכברים בכל קבוצה). דמות זו שונתה מ דו חות מדעיים 7, מספר המאמר: 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. לשכפל ולפרסם עם בעלי הזכויות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מאמר זה מתאר פרוטוקול יעיל זה עשוי לשמש reproducibly ליצירת iDCs, לאחר מכן להבדיל אותם לתוך TolDCs, אנו מציעים כי זה ניתן להחיל כדי להעריך את היכולת של סוכנים היעד מולקולריים חדשים כדי לעודד את TolDC פנוטיפ. כפי שמתואר בדו ח זה, עקבנו רצף שבו קודם ניתחנו ביטוי TolDC של ליגנדים פני השטח על ידי cytometry זרימה, ואחריו הערכה של הפרופיל ציטוקין DC כפי שנמדד על-ידי לרביעיית-PCR ELISA. לבסוף, הפונקציה immunoregulatory של TolDCs אושר על ידי הפגנת יכולת שלהם כדי להפחית את תא T התפשטות במבחנה והיעילות שלהם לדכא את מחלת חיסון עצמי ויוו, הדגם EAE מאתר פרה של MS.

בפרוטוקול שלנו, iDCs שנוצר, תריז מבשרי מאתר מח עצם עם השילוב של GM-CSF ו- IL-4. פרוטוקולים אחרים השתמשו דמוי טפסים טירוזין קינאז 3 ליגנדים (Flt3L) במדיום תרבות כדי ליצור iDCs44. למרות השימוש Flt3L מגדילה את היבול של iDCs, iDCs אלה בדרך כלל לקחת 2 עוד ימים (9 ימים) הקציר, בהשוואה ל- GM-CSF/IL-4 תוספת (7 ימים)44. וחשוב מכך, המרכז הבינתחומי המופקים Flt3L לעיתים קרובות להתמיין cDCs שני (CD8 ו CD8+), שיתפקדו45 שהיו פונקציונלית ושווי phenotypically על מצב יציב בקרי תחום ויוו. עם זאת, GM-CSF/IL-4 תמיד גורם הבידול של המרכז הבינתחומי לכיוון cDCs (CD8) רק44 במהלך ההבשלה, הם הדגימו דומים לדמויות DCs דלקתיות46. ראוי לציין לדעת כי GM-CSF/IL-4 משמשת לעיתים קרובות בהודעות ניסויים קליניים ומחקר בסיסי בגלל היתרון של הבחנה DCs ומונוציטים או CD34+ אבות44. הוכח, כי iDCs שנוצר בין שני המתודות הללו לייצר תאים שונים מורפולוגית, אשר גם בעלי סמנים משטח תאים שונים ולהציג פרופילים ציטוקין ברורים בעת ההפעלה שלהם. יתר על כן, TolDCs המושרה על ידי שיטות אלה משתנים ביכולתם להעביר בתגובה גורמים chemotactic, כדי לעודד את תא T אנטיגן ספציפי תגובות44,45. אנחנו מבינים את זה CD8+ DCs עשוי להפגין יותר פוטנציאל אינדוקציה TolDC בשל יכולת ייחודית שלהם של יצירת47. עם זאת, הוא אז נחוץ עוד תא המיון BMDCs הנגזרים Flt3L לחקור את CD8 ספציפי+ DC משנה. בנוסף, מאז, GM-CSF/IL-4 המושרה BMDCs עדיפים על גירוי תא T ואת הייצור של מתווכים דלקתיים בעקבות LPS טיפול44,45, מצאנו אסטרטגיה זו נתן עוד תוצאות לשחזור שלנו ניסויים.

BMDCs נגזר GM-CSF/IL-4 מתחילים לבטא CD11c סביב יום 4 להעשיר את הביטוי שאחרי יום 648. הליך זה תרבות יכול להתקיים עד היום 10-12 עם צפיפות ציפוי תחתון של תאים במח העצם, נמוך מנה של GMC-SF ביום 8-1049. ב פרוטוקול זה, CDDO-DFPA (triterpenoid סינתטי) ו LPS נוספו במשולב כסוכני לזירוז ההבשלה, סובלנות DC בהתאמה. לאחרונה דיווחנו כי iDCs שנקטפו מתרבויות בשיטה זו של הדור BMDC התערוכה הפנוטיפ TolDC פונקציונלי כאשר pretreated עם CDDO-DFPA37. ראוי לציין כי CDDO-DFPA, אשר רק נוספו תרבויות אחרי המרכז הבינתחומי הקציר (יום 7)37, בניגוד סוכנים כמו ויטמין D3 אשר להתווסף תרבויות מספר פעמים במהלך המרכז הבינתחומי בידול (יום 2, 4, 6)50. יתר על כן, זה אינדוקציה של TolDCs על ידי ויטמין D3 עשויים תלויים מנגנונים מגוונים חייב להיות יזם במהלך ואחרי המרכז הבינתחומי בידול51. הנתונים מראים כי הוספת CDDO-DFPA במהלך התמיינות המרכז הבינתחומי לא הייתה השפעה כלשהי על טהרת CD11c + Dc אבל מינון-dependently להוריד את התשואה של iDCs ביום 7 (נתונים לא מוצג). הבדיקות שלנו גם מראים כי ריכוז גבוה יותר של CDDO-DFPA שימוש בניסויים אלה עשוי להיות רעיל מח עצם ובתאים, אף-על-פי iDC הראה הכדאיות נורמלי בריכוז זה של CDDO-DFPA37. הוא צפוי כי אינדוקציה TolDC עשוי להיות אופטימיזציה על ידי ניתוח זהיר של השפעת עיתוי ואורך של חשיפה לסוכנים כמו CDDO-DFPA.

חשוב לשקול את שיטות אלטרנטיביות ואת מנגנוני שדרכו iDCs יכולה להיגרם כדי mDCs על ידי אחרים מאשר LPS, כגון CD40L, TNF-α ו- IFN-γ52. DC התבגרות מאת LPS דרך רצפטורים כמו אגרה 4(TLR4) מוביל את ההפעלה של מספר גורמי שעתוק, כולל הפקטור הגרעיני-κB (NF-κB), p38 מופעל mitogen קינאז (p38 MAPK), קינאז c-Jun N-מסוף (JNK), וחוץ-תאית האות מוסדר קינאז (ERK1/2). ההבשלה של בקרי קבוצת מחשבים על-ידי CD40L ו- TNF-α דרך רצפטורים CD40 ו- TNF גורם בהתאמה מסלול NF-κB. לעומת זאת, IFN-γ מעוררת שביל שונים כולל את ההפעלה של ג'אנוס קינאז (JAK), טירוזין קינאז (TYK), אות מתמר activator של שעתוק חלבונים (סטטיסטיקה), אפקטים במורד הזרם אלה גם מלווה הפעלה מסלול NF-κB52. בנוסף, בעוד לפרופיל ביטוי גנים של DC CD40L/TNF-α מבוססי ההבשלה מרמז כי אלה DCs polarize תאי T לכיוון Th2 תא תגובה53, DC ההבשלה על ידי IFN-γ חריפה מוטה לטובת Th1 תאים תגובה54. לכן, אלה inducers אחרים של DC התבגרות אשר מקושרים בידול כלפי קבוצות משנה תא T ספציפי הם לא מועסקים פרוטוקול זה.

מספר דיווחים הראו כי ex-vivo-DCs הבדיל המסוגלים גרימת רחב של סימפטומים קליניים EAE, פתולוגיה של עכברים55. שיטת האינדוקציה EAE פסיבית על-ידי בקרי vivo לשעבר הופעל אומץ עם שינויים שונים על ידי מעבדות שונות. השילוב של אינדוקציה EAE פסיבי ואקטיבי על ידי מינהל ש א בשלה BMDCs, 7 ימים לפני חיסון ש א ותוצאות פרוינד שלמה של אדג'וונט (CFA) תסמין קליני ציונים גבוהים יותר (שיא הציון הקליני: 3.5) בהשוואה של EAE פסיבי אינדוקציה על-ידי המינהל של ש א בשלה BMDCs לבד (שיא הציון הקליני: 2)56. תוצאות בשיטה זו שילוב ש א בשלה BMDCs עם ש א התחסנות מרמז על תחילת המחלה זה קורה ביום 9 לאחר חיסון ש א ו פרנק56. עם זאת, כיוון שידוע כי פרנק גורמת דלקת משמעותית באתר של מינהל57, אנחנו נעזרו אינדוקציה EAE פסיבית על ידי מינהל DCs לבד בפרוטוקול שלנו על מנת ביעילות לנתח את השפעת TolDCs במהלך EAE. על מנת לאשר עוד יותר את ותפקיד פונקציונלי של TolDCs, אחד צריך גם לבדוק אותם בדיכוי סימפטומים קליניים של עכברים EAE פעיל. תוואי ניהול בקרי תחום חיוני גם אינדוקציה של EAE הסימפטומים58. כפי שדווח על ידי המעבדה שלנו על ידי אחרים, בזריקה תת עורית של BMDCs לתוך האזור האגף של עכברים C57BL/6 פעם בשבוע עבור סכום כולל של 3-4 זריקות המניע ציון קליני שיא של EAE סביב 2-2.5 עם תחילת המחלה לשחזור על יום 11-1237 ,58. סיפקנו קליפ קצר כדי להדגים את סימפטומים קליניים שונים בין אינדוקציה EAE פעיל וסביל (Video 1).

המגבלות המוכרים של פרוטוקול שלנו כוללים את הזמן הנדרש על ידי השיטות את התלות microenvironment שאינה פיזיולוגית הרלוונטיים עבור בידול BMDC. עם זאת, בעוד הנוגדן מועשר עמודה שיטות הפרדה של אוסף עבור בקרי תחום תאי T מן הטחול מאתר עשוי להיות יעיל יותר זמן, זה סובל תשואה נמוכה של האוכלוסייה DC הרצוי. לפיכך, היתרון של שיטת התפתחות DC הנגזרות מח עצם הוא יומן בקנה מידה התשואה גבוהה יותר של אוכלוסיות DC בהשוואה נוגדן טור פרידה הטחול כולו. כאמור לעיל, בקרי התחום שנוצר במבחנה בשיטה זו דורשת ריכוז גבוה של תוספי ציטוקינים, אשר אינה רלוונטית פיזיולוגית DCs ויוו microenvironment59 ולהבטיח גם לא לטווח ארוך הקיימות של DC. GM-CSF בשימוש פרוטוקול שלנו היא גם לא ציטוקין חיוני נורמלי DC בידול ויוו60. למרות זאת, הפרוטוקול המוצע של הדור BMDC reproducibly התשואות שבריר פונקציונלית TolDCs גבוהה, צריך להיות שנצפו כשיטה לשחזור ואמין מאוד ליצירת Dc פונקציונאלי עם מאפיינים tolerogenic.

לסיכום, TolDCs שנוצר מתוך הפרוטוקול המתואר כאן יכול ביעילות להתאפיין על-ידי הערכת פרופילי ביטוי גנים וחלבונים שלהם, על-ידי קביעת שלהם היכולת לווסת את תא T תלוית תגובות מערכת החיסון במבחנה, ועל -ידי הערכת תפקוד שלהם כמו טיפול בתא המאמצת לדכא EAE אינדוקציה ויוו. פרוטוקול שלנו מספק מסגרת עבור הערכת כל סוכנים חדשים יש את היכולת לגרום TolDCs, להאיץ עוד יותר את תהליך הפיתוח טיפולית עבור TolDCs מן הספסל למרפאה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אף אחד

Acknowledgments

אנו מודים ריאטה תרופות על מתן CDDO-DFPA. אנו גם להכיר את התמיכה של ג'יין, לי כיסא זיידמן בחדשנות סרטן בילדים (ג'ון Letterio). עבודה זו נתמכה על ידי משרד ההגנה [W81XWH-12-1-0452]; יוזמת המחקר אנג'י פאולר המתבגר ויאנג של סרטן מבוגרים, בכל מקרה מקיף במרכז לחקר הסרטן; ופרס קלהאן בוגר מלומד עבור מצב Hsi-ג'ו ווי מקרן F.J. קלהאן.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CDDO-DFPA (RTA-408) Reata Pharmaceuticals in house synthesis Cell culture
Mouse GM-CSF Peprotech Inc. 315-03 BMDC differentiation
Mouse IL-4 Peprotech Inc. 214-14 BMDC differentiation
Lipopolysaccharides (LPS) Sigma Aldrich Inc. L2880 Cell culture
β-mercaptoethanol Sigma Aldrich Inc. 516732 Cell culture
Pertussis toxin (PTX) R&D systems 3097 EAE induction
MOG (35–55) peptide 21stCentury Biochemicals in house synthesis EAE induction
Trypan blue Gibco, Life Technologies 15250-061 Cell culture
RPMI-1640 plus L-glutamine ThermoFisher Scientific 11875-093 Cell culture
Non-essential amino acid (100X) ThermoFisher Scientific 11140050 Cell culture
HEPES ThermoFisher Scientific 15630080 Cell culture
penicillin/streptomycin ThermoFisher Scientific 15140122 Cell culture
40 μm cell strainer Corning 352340 Cell isolation
PE-conjugated CD80 BD Biosciences 557227 Flow cytometry
PE-conjugated CD86 BD Biosciences 555665 Flow cytometry
PE-conjugated PD-L1 BioLegend 124307 Flow cytometry
APC-conjugated MHCII Miltenyi Biotec Inc. 130-112-388 Flow cytometry
APC-conjugated CD11c BD Biosciences 340544 Flow cytometry
Isotype matched PE Miltenyi Biotec Inc. 130-091-835 Flow cytometry
Isotype matched APC Miltenyi Biotec Inc. 130-091-836 Flow cytometry
CFSE BioLegend 423801 T cell proliferation assay
Pan dendritic cell isolation kit Miltenyi Biotec Inc. 130-100-875 T cell proliferation assay
FcR Blocking Reagent Miltenyi Biotec Inc. 130-100-875 T cell proliferation assay
Pan Dendritic Cell Biotin-Antibody Cocktail Miltenyi Biotec Inc. 130-100-875 T cell proliferation assay
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi Biotec Inc. 130-100-875 T cell proliferation assay
CD4+ T cell isolation kit Miltenyi Biotec Inc. 130-104-454 T cell proliferation assay
CD4+ T cell Biotin-Antibody Cocktail Miltenyi Biotec Inc. 130-104-454 T cell proliferation assay
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi Biotec Inc. 130-104-454 T cell proliferation assay
ACK lysing buffer ThermoFisher Scientific A1049201 BMDC differentiation
1 ml syringe BD Biosciences 309626 T cell proliferation assay
3 ml syringe BD Biosciences 309588 BMDC differentiation
25G needle BD Biosciences 309626 T cell proliferation assay
23G needle BD Biosciences 309588 BMDC differentiation
BSA Sigma Aldrich Inc. A2058 T cell proliferation assay
EDTA ThermoFisher Scientific 15575020 T cell proliferation assay
LS Column Miltenyi Biotec Inc. 130-042-401 T cell proliferation assay
Pre-Separation Filter Miltenyi Biotec Inc. 130-095-823 T cell proliferation assay
collagenase D Sigma Aldrich Inc. 11088858001 T cell proliferation assay
HBSS ThermoFisher Scientific 14025076 T cell proliferation assay
ovalbumin (OVA) peptide 323–329 Sigma Aldrich Inc. O1641 T cell proliferation assay
Mouse IFN-γ TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm01168134_m1 qRT-PCR
Mouse IL-12a TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm00434165 qRT-PCR
Mouse IL-12 p70 DuoSet ELISA R&D systems DY419-05 ELISA
Mouse EDN-1 ELISA RayBiotech ELM-EDN1-1 ELISA
TNF-α TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm00443258 qRT-PCR
Mouse TNF-α Quantikine ELISA Kit R&D systems MTA00B ELISA
IL-6 TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm00446190 qRT-PCR
Mouse IL-6 Quantikine ELISA Kit R&D systems M6000B ELISA
IL-23a TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm01160011 qRT-PCR
Mouse IL-23 DuoSet ELISA R&D systems DY1887-05 ELISA
IL-4 TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm99999154_m1 qRT-PCR
IL-10 TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm01288386_m1 qRT-PCR
TGF-β TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm01178820_m1 qRT-PCR
Anti-Heme Oxygenase 1 antibody Abcam ab13248 Western blotting
Anti-β-actin antibody Abcam ab8226 Western blotting
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System Bio-Rad Inc. qRT-PCR
BD FACSCalibur Cell Analyzer BD Biosciences Flow cytometry

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).
  2. Inaba, K., et al. Efficient presentation of phagocytosed cellular fragments on the major histocompatibility complex class II products of dendritic cells. J Exp Med. 188 (11), 2163-2173 (1998).
  3. Banchereau, J., et al. Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol. 18, 767-811 (2000).
  4. Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 179 (4), 1109-1118 (1994).
  5. Hemmi, H., Akira, S. TLR signalling and the function of dendritic cells. Chem Immunol Allergy. 86, 120-135 (2005).
  6. Caux, C., et al. B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells. J Exp Med. 180 (5), 1841-1847 (1994).
  7. Chastain, E. M., Duncan, D. S., Rodgers, J. M., Miller, S. D. The role of antigen presenting cells in multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 265-274 (2011).
  8. Smeltz, R. B., Chen, J., Ehrhardt, R., Shevach, E. M. Role of IFN-gamma in Th1 differentiation: IFN-gamma regulates IL-18R alpha expression by preventing the negative effects of IL-4 and by inducing/maintaining IL-12 receptor beta 2 expression. J Immunol. 168 (12), 6165-6172 (2002).
  9. Gyulveszi, G., Haak, S., Becher, B. IL-23-driven encephalo-tropism and Th17 polarization during CNS-inflammation in vivo. Eur J Immunol. 39 (7), 1864-1869 (2009).
  10. Kronenberg, M., Rudensky, A. Regulation of immunity by self-reactive T cells. Nature. 435 (7042), 598-604 (2005).
  11. Boks, M. A., et al. IL-10-generated tolerogenic dendritic cells are optimal for functional regulatory T cell induction--a comparative study of human clinical-applicable DC. Clin Immunol. 142 (3), 332-342 (2012).
  12. Anderson, A. E., et al. Tolerogenic dendritic cells generated with dexamethasone and vitamin D3 regulate rheumatoid arthritis CD4+ T cells partly via transforming growth factor-beta1. Clin Exp Immunol. 187 (1), 113-123 (2017).
  13. Chauveau, C., et al. Heme oxygenase-1 expression inhibits dendritic cell maturation and proinflammatory function but conserves IL-10 expression. Blood. 106 (5), 1694-1702 (2005).
  14. Maldonado, R. A., von Andrian, U. H. How tolerogenic dendritic cells induce regulatory T cells. Adv Immunol. 108, 111-165 (2010).
  15. Schmidt, S., Nino-Castro, A., Schultze, J. Regulatory dendritic cells: there is more than just immune activation. Frontiers in Immunology. 3 (274), (2012).
  16. Hilkens, C. M., Isaacs, J. D., Thomson, A. W. Development of dendritic cell-based immunotherapy for autoimmunity. Int Rev Immunol. 29 (2), 156-183 (2010).
  17. Dhodapkar, M. V., Steinman, R. M. Antigen-bearing immature dendritic cells induce peptide-specific CD8(+) regulatory T cells in vivo in humans. Blood. 100 (1), 174-177 (2002).
  18. Dhodapkar, M. V., Steinman, R. M., Krasovsky, J., Munz, C., Bhardwaj, N. Antigen-specific inhibition of effector T cell function in humans after injection of immature dendritic cells. J Exp Med. 193 (2), 233-238 (2001).
  19. Giannoukakis, N., Phillips, B., Finegold, D., Harnaha, J., Trucco, M. Phase I (safety) study of autologous tolerogenic dendritic cells in type 1 diabetic patients. Diabetes Care. 34 (9), 2026-2032 (2011).
  20. Benham, H., et al. Citrullinated peptide dendritic cell immunotherapy in HLA risk genotype-positive rheumatoid arthritis patients. Sci Transl Med. 7 (290), 290ra287 (2015).
  21. Bell, G. M., et al. Autologous tolerogenic dendritic cells for rheumatoid and inflammatory arthritis. Ann Rheum Dis. 76 (1), 227-234 (2017).
  22. University Hospital, A. A "Negative" Dendritic Cell-based Vaccine for the Treatment of Multiple Sclerosis: a First-in-human Clinical Trial (MS tolDC). ClinicalTrials.gov. , (2015).
  23. Pujol, F. I. G. T. i Tolerogenic Dendritic Cells as a Therapeutic Strategy for the Treatment of Multiple Sclerosis Patients (TOLERVIT-MS) (TOLERVIT-MS). ClinicalTrials.gov. , (2016).
  24. Varea, S. Treatment of Multiple Sclerosis and Neuromyelitis Optica With Regulatory Dendritic Cell: Clinical Trial Phase 1 B. ClinicalTrials.gov. , (2017).
  25. Jauregui-Amezaga, A., et al. Intraperitoneal Administration of Autologous Tolerogenic Dendritic Cells for Refractory Crohn's Disease: A Phase I Study. J Crohns Colitis. 9 (12), 1071-1078 (2015).
  26. Mahnke, K., Schmitt, E., Bonifaz, L., Enk, A. H., Jonuleit, H. Immature, but not inactive: the tolerogenic function of immature dendritic cells. Immunol Cell Biol. 80 (5), 477-483 (2002).
  27. Lutz, M. B., Schuler, G. Immature, semi-mature and fully mature dendritic cells: which signals induce tolerance or immunity? Trends Immunol. 23 (9), 445-449 (2002).
  28. Suciu-Foca, N., et al. Molecular characterization of allospecific T suppressor and tolerogenic dendritic cells: review. Int Immunopharmacol. 5 (1), 7-11 (2005).
  29. Wakkach, A., et al. Characterization of dendritic cells that induce tolerance and T regulatory 1 cell differentiation in vivo. Immunity. 18 (5), 605-617 (2003).
  30. Szeles, L., et al. 1,25-dihydroxyvitamin D3 is an autonomous regulator of the transcriptional changes leading to a tolerogenic dendritic cell phenotype. J Immunol. 182 (4), 2074-2083 (2009).
  31. Unger, W. W., Laban, S., Kleijwegt, F. S., vander Slik, A. R., Roep, B. O. Induction of Treg by monocyte-derived DC modulated by vitamin D3 or dexamethasone: differential role for PD-L1. Eur J Immunol. 39 (11), 3147-3159 (2009).
  32. Reichardt, W., et al. Impact of mammalian target of rapamycin inhibition on lymphoid homing and tolerogenic function of nanoparticle-labeled dendritic cells following allogeneic hematopoietic cell transplantation. J Immunol. 181 (7), 4770-4779 (2008).
  33. Woltman, A. M., et al. The effect of calcineurin inhibitors and corticosteroids on the differentiation of human dendritic cells. Eur J Immunol. 30 (7), 1807-1812 (2000).
  34. Hackstein, H., Thomson, A. W. Dendritic cells: emerging pharmacological targets of immunosuppressive drugs. Nat Rev Immunol. 4 (1), 24-34 (2004).
  35. Torres-Aguilar, H., Blank, M., Jara, L. J., Shoenfeld, Y. Tolerogenic dendritic cells in autoimmune diseases: crucial players in induction and prevention of autoimmunity. Autoimmun Rev. 10 (1), 8-17 (2010).
  36. Rutella, S., Danese, S., Leone, G. Tolerogenic dendritic cells: cytokine modulation comes of age. Blood. 108 (5), 1435-1440 (2006).
  37. Wei, H. J., Pareek, T. K., Liu, Q., Letterio, J. J. A unique tolerizing dendritic cell phenotype induced by the synthetic triterpenoid CDDO-DFPA (RTA-408) is protective against EAE. Sci Rep. 7 (1), 9886 (2017).
  38. van Etten, E., Mathieu, C. Immunoregulation by 1,25-dihydroxyvitamin D3: basic concepts. J Steroid Biochem Mol Biol. 97 (1-2), 93-101 (2005).
  39. Pan, J., et al. Dexamethasone inhibits the antigen presentation of dendritic cells in MHC class II pathway. Immunol Lett. 76 (3), 153-161 (2001).
  40. Zhu, J., Paul, W. E. Heterogeneity and plasticity of T helper cells. Cell Res. 20 (1), 4-12 (2010).
  41. Spirig, R., et al. TLR2 and TLR4 agonists induce production of the vasoactive peptide endothelin-1 by human dendritic cells. Mol Immunol. 46 (15), 3178-3182 (2009).
  42. Walton, E. L. Make immunological peace not war: Potential applications of tolerogenic dendritic cells. Biomed J. 40 (2), 77-79 (2017).
  43. Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). Br J Pharmacol. 164 (4), 1079-1106 (2011).
  44. Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking. J Immunol. 179 (11), 7577-7584 (2007).
  45. Angelov, G. S., Tomkowiak, M., Marcais, A., Leverrier, Y., Marvel, J. Flt3 ligand-generated murine plasmacytoid and conventional dendritic cells differ in their capacity to prime naive CD8 T cells and to generate memory cells in vivo. J Immunol. 175 (1), 189-195 (2005).
  46. Lowes, M. A., et al. Increase in TNF-alpha and inducible nitric oxide synthase-expressing dendritic cells in psoriasis and reduction with efalizumab (anti-CD11a). Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (52), 19057-19062 (2005).
  47. Schnorrer, P., et al. The dominant role of CD8+ dendritic cells in cross-presentation is not dictated by antigen capture. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (28), 10729-10734 (2006).
  48. Wang, W., Li, J., Wu, K., Azhati, B., Rexiati, M. Culture and Identification of Mouse Bone Marrow-Derived Dendritic Cells and Their Capability to Induce T Lymphocyte Proliferation. Med Sci Monit. 22, 244-250 (2016).
  49. Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J Immunol Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
  50. Griffin, M. D., et al. Dendritic cell modulation by 1alpha,25 dihydroxyvitamin D3 and its analogs: a vitamin D receptor-dependent pathway that promotes a persistent state of immaturity in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (12), 6800-6805 (2001).
  51. Bscheider, M., Butcher, E. C. Vitamin D immunoregulation through dendritic cells. Immunology. 148 (3), 227-236 (2016).
  52. Castiello, L., et al. Monocyte-derived DC maturation strategies and related pathways: a transcriptional view. Cancer Immunol Immunother. 60 (4), 457-466 (2011).
  53. Decker, W. K., et al. Deficient T(H)-1 responses from TNF-alpha-matured and alpha-CD40-matured dendritic cells. J Immunother. 31 (2), 157-165 (2008).
  54. Longhi, M. P., et al. Dendritic cells require a systemic type I interferon response to mature and induce CD4+ Th1 immunity with poly IC as adjuvant. J Exp Med. 206 (7), 1589-1602 (2009).
  55. Link, H., Huang, Y. M., Xiao, B. G. Dendritic cells in experimental allergic encephalomyelitis and multiple sclerosis. J Neuroimmunol. 100 (1-2), 102-110 (1999).
  56. Leech, M. D., et al. Cutting edge: IL-6-dependent autoimmune disease: dendritic cells as a sufficient, but transient, source. J Immunol. 190 (3), 881-885 (2013).
  57. Saul, L., Besusso, D., Mellanby, R. J. LPS-matured CD11c+ bone marrow-derived dendritic cells can initiate autoimmune pathology with minimal injection site inflammation. Lab Anim. 51 (3), 292-300 (2017).
  58. Aghdami, N., Gharibdoost, F., Moazzeni, S. M. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) induced by antigen pulsed dendritic cells in the C57BL/6 mouse: influence of injection route. Exp Anim. 57 (1), 45-55 (2008).
  59. Wilson, H. L. Limitations with in vitro production of dendritic cells using cytokines. J Leukoc Biol. 75 (4), 600-603 (2004).
  60. Ni, K., O'Neill, H. C. Development of dendritic cells from GM-CSF-/- mice in vitro : GM-CSF enhances production and survival of cells. Dev Immunol. 8 (2), 133-146 (2001).

Tags

רפואה גיליון 135 Tolerogenic תאים דנדריטים (TolDCs) מח עצם נגזר תאים דנדריטים (BMDCs) ניסיוני אוטואימוניות דלקת המוח וחוט השדרה (EAE) דיכוי המערכת החיסונית ציטוקינים מחלת חיסון עצמי
פיתוח ואפיון פונקציונאלי של תאים דנדריטים מאתר Tolerogenic
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wei, H. J., Letterio, J. J., Pareek, More

Wei, H. J., Letterio, J. J., Pareek, T. K. Development and Functional Characterization of Murine Tolerogenic Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (135), e57637, doi:10.3791/57637 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter