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Medicine

Murine Tolerogenic वृक्ष कोशिकाओं के विकास और कार्यात्मक लक्षण वर्णन

Published: May 18, 2018 doi: 10.3791/57637
Automatic Translation
1, 2,3, 2,3
1Department of Biochemistry, School of Medicine, Case Western Reserve University, 2Department of Pediatrics, Division of Pediatric Hematology/Oncology, Case Western Reserve University, 3Angie Fowler Cancer Institute, Rainbow Babies & Children's Hospital, University Hospitals, Cleveland

Summary

यहां, हम विकास और tolerogenic वृक्ष कोशिकाओं (TolDCs) की विशेषता और उनके immunotherapeutic उपयोगिता का मूल्यांकन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।

Abstract

प्रतिरक्षा प्रणाली विदेशी प्रतिजनों के खिलाफ प्रतिक्रियाओं समंवय और स्वयं के खिलाफ एक अप्रतिसादी राज्य बनाए रखने के बीच एक तंग संतुलन बनाए रखने के द्वारा संचालित प्रतिजनों के रूप में अच्छी तरह से खाना खानेवाला जीवों से व्युत्पंन प्रतिजनों । इस प्रतिरक्षा homeostasis के विघटन जीर्ण सूजन और प्रतिरक्षा के विकास के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । वृक्ष कोशिकाएं (dc) पेशेवर प्रतिजन-प्रस्तुत जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली की कोशिकाओं को सक्रिय करने में शामिल भोली टी कोशिकाओं को विदेशी एंटीजन के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को आरंभ करने के लिए कर रहे हैं । हालांकि, dc भी TolDCs में अंतर किया जा सकता है कि अधिनियम को बनाए रखने और टी सेल सहिष्णुता को बढ़ावा देने और प्रभाव या तो स्व-प्रतिरक्षित या जीर्ण सूजन की स्थिति के विकास के लिए योगदान कोशिकाओं को दबाने के लिए । TolDCs की हमारी समझ में हाल ही में प्रगति का पता चलता है कि डीसी सहिष्णुता उनके भेदभाव की स्थिति संग्राहक द्वारा प्राप्त किया जा सकता है । यह घटना प्रतिरक्षा सहिष्णुता में टूट के कारण कई प्रतिरक्षा विकारों के लिए TolDC चिकित्सा के विकास में जबरदस्त वृद्धि करने के लिए नेतृत्व किया गया है । नैदानिक प्रतिरक्षा murine मॉडल में सफल अध्ययन आगे स्व-प्रतिरक्षित विकारों के उपचार में TolDCs की immunotherapeutic उपयोगिता को मान्य किया है. आज, TolDCs सुरक्षात्मक प्रतिरक्षा बरकरार छोड़ जबकि रोगजनक स्व-प्रतिरक्षित प्रतिक्रियाओं को लक्षित करके विभिन्न प्रतिरक्षा विकारों में प्रतिरक्षा सहिष्णुता reinstating के लिए क्लिनिक में एक होनहार immunotherapeutic उपकरण बन गए हैं. हालांकि रणनीतियों की एक सरणी TolDCs प्रेरित करने के लिए कई प्रयोगशालाओं द्वारा प्रस्तावित किया गया है, इन कोशिकाओं के सेलुलर और कार्यात्मक phenotype निस्र्पक में कोई निरंतरता है. इस प्रोटोकॉल अस्थि मज्जा के विकास के लिए एक कदम दर कदम गाइड बड़ी संख्या में प्राप्त dc प्रदान करता है, एक अद्वितीय उंहें एक सिंथेटिक triterpenoid 2 के साथ TolDCs में अंतर करने के लिए इस्तेमाल किया विधि-cyano-3, 12-dioxooleana-1, 9-दिएँ-28-ओआईसी अम्ल-difluoro-propyl-छुटकारे (CDDO-DFPA), और phenotype के आवश्यक आणविक हस्ताक्षरों के विश्लेषण सहित उनके TolDCs की पुष्टि करने के लिए उपयोग की गई तकनीकें. अंत में, हम विट्रो में और vivo में एकाधिक स्केलेरोसिस के एक नैदानिक मॉडल में अपने immunosuppressive प्रतिक्रिया का परीक्षण करके TolDC समारोह का आकलन करने के लिए एक विधि दिखाते हैं ।

Introduction

वृक्ष कोशिकाओं (dc) जंमजात प्रतिरक्षा प्रणाली का एक अभिंन अंग है और पहले की खोज की और १९७३ में राल्फ Steinman और Zanvil Cohn द्वारा विशेषता प्राथमिक व्यावसायिक प्रतिजन के रूप में कोशिकाओं को पेश कर रहे है1। dc के लिए सहज और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणालियों को जोड़ने के लिए माध्यमिक लसीकावत् अंगों में प्रमुख histocompatibility परिसरों (MHC) के माध्यम से कोशिकाओं और बी कोशिकाओं के लिए संसाधित एंटीजन को पेश करके प्रतिरक्षा सक्रियण में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया है2. स्तनधारी प्रतिरक्षा प्रणाली में, जो माइलॉयड dc और plasmacytoid dc (पीडीसी)3के रूप में वर्णित किया गया है dc की कम से दो श्रेणियां हैं । माइलॉयड dc, पारंपरिक dc (cDCs) के रूप में भी जाना जाता है, CD11c की अभिव्यक्ति की विशेषता है और अस्थि मज्जा जनक कोशिकाओं या परिधीय रक्त monocytes का उपयोग करने से इन विट्रो में अपरिपक्व dc (iDCs) के रूप में विभेदित किया जा सकता है granulocyte-मैक्रोफेज-कॉलोनी-उत्तेजक फैक्टर (जीएम-सीएसएफ) और murine या मानव प्रजाति में आईएल-४, क्रमशः४.

सक्रिय ' खतरे ' संकेतों, जैसे रोगज़नक़-जुड़े आणविक पैटर्न (PAMP) या नुकसान से संबंधित आणविक पैटर्न (नम), immunogenic dc की ओर iDCs परिपक्वता ड्राइव के रूप में परिपक्व dc (mDCs) के माध्यम से बाध्यकारी विभिन्न पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स पर DC सरफ़ेस5। Immunogenic के आगे प्रधानमंत्री भोली टी सेल प्रसार और MHCII2, costimulatory लाइगैंडों (CD80, CD86, और CD40)6, साइटोकिंस, और अंय घुलनशील मध्यस्थों7के विनियमन के माध्यम से भेदभाव । Immunogenic dc से समर्थक भड़काऊ मध्यस्थ उत्पादन का झरना cytokine-मध्यस्थता टी सेल भेदभाव के लिए आवश्यक है । उदाहरण के लिए, दोनों IFN-γ और il-12 Th1 भेदभाव के लिए आवश्यक है8 और आईएल-1, आईएल-6, और आईएल-23 Th17 कोशिकाओं9के प्रति भोली टी सेल ध्रुवीकरण के लिए महत्वपूर्ण हैं । हालांकि परिपक्व dc के लिए विदेशी एंटीजन प्रतिक्रिया, स्व द्वारा अनियंत्रित डीसी सक्रियकरण-एंटीजन सहिष्णुता पृथक कारण हो सकता है और प्रतिक्रियाशील टी कोशिकाओं जिसका सक्रियण ऊतक विनाश की ओर जाता है पैदा करके स्व-प्रतिरक्षित रोगों के विकास को बढ़ावा10 .

हाल ही में रिपोर्ट डीसी प्लास्टिक की स्पष्ट सबूत उनके ऊतक microenvironment भीतर अलग cues के साथ बातचीत करने की क्षमता से उदाहरण और विशिष्ट प्रभाव/दमन डीसी सबसेट में अंतर प्रदान की है । विरोधी भड़काऊ मध्यस्थों, IL-1011, TGF-β12, और हो-113 के रूप में tolerogenic (TolDCs) उत्प्रेरण द्वारा प्रतिरक्षा दमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया है. ये TolDCs विनियामक कार्य प्राप्त करते हैं और टी सेल जखीरे14को दबा देते हैं । इसके अलावा, dc द्वारा सह उत्तेजना की कमी और TolDCs से विरोधी भड़काऊ मध्यस्थों के उत्पादन दोनों विनियामक टी कोशिकाओं (Tregs) की प्रेरण करने के लिए योगदान और भी प्रभावी ढंग से दोनों Th1 और Th17 भेदभाव और विस्तार को बाधित15. पिछले दो दशकों में, TolDCs की चिकित्सीय क्षमता कई जांचकर्ताओं द्वारा सूचित की गई है । इन अध्ययनों में, पूर्व vivo के प्रशासन TolDCs जनित16 लेकिन यह भी रोगियों में प्रतिरक्षा सहिष्णुता के विकास के लिए नेतृत्व में न केवल उन्नत रोग लक्षण स्व-प्रतिरक्षित रोगों के17 ,18. दिलचस्प है, आज TolDCs चिकित्सा कई नैदानिक परीक्षणों में स्व-प्रतिरक्षित रोगों के लिए एक वैकल्पिक या सहायक दृष्टिकोण के रूप में माना गया है, प्रकार 1 सहित मधुमेह19, रुमेटी गठिया20, 21, मल्टीपल स्केलेरोसिस (एमएस)22,23,24, और Crohn की बीमारी25।

वहां प्रोटोकॉल है कि TolDCs विकसित करने के लिए नियोजित किया गया है की एक किस्म है और कई प्रयोगशालाओं पीढ़ी और TolDCs के phenotypic लक्षण वर्णन के लिए तरीकों की सूचना दी है । इन तरीकों को टेम progenitors से इन विट्रो में TolDCs उत्पंन reproducibly और छुरा उंहें vivo26,27,28,29में एक tolerogenic राज्य में बनाए रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । iDCs विभिंन इम्यूनोमॉड्यूलेटरी औषधीय एजेंटों या विरोधी भड़काऊ साइटोकिंस के लिए जोखिम द्वारा TolDCs में परिवर्तित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, विटामिन डी 3 एक प्रसिद्ध औषधीय एजेंट IL-10 उत्पादन बढ़ाने और dc से il-12 स्राव को दबाने और इस तरह उनके immunosuppressive समारोह को बढ़ावा देने के लिए जाना जाता है30. इसके अलावा, जब dc lipopolysaccharides (एलपीएस) जैसे शक्तिशाली भड़काऊ उत्तेजनाओं को उजागर कर रहे हैं, कई औषधीय एजेंटों जैसे डेक्समेतएसॉनी31, rapamycin३२, और कोर्टिकोस्टेरोइड३३ प्रेरित करने के लिए दिखाया गया है TolDC phenotype CD40, CD80, CD86, और MHCII३४के DC सरफ़ेस व्यंजक को कम करके । IL-10 और TGF-β सबसे अध्ययन विरोधी भड़काऊ साइटोकिंस है डीसी सहिष्णुता के लिए प्रेरित करने के लिए३५ और इन दोनों साइटोकिंस के लिए सहवर्ती जोखिम dc३६में एक tolerogenic phenotype प्रेरित करने के लिए दिखाया गया है ।

चूंकि tolerogenic डीसी कार्यात्मक विशेषताओं के बजाय phenotypic मार्करों द्वारा परिभाषित किया गया है, वहां एक महान सेलुलर और TolDCs के कार्यात्मक लक्षण वर्णन के लिए एक सुसंगत तरीका विकसित करने की जरूरत है । इसके अलावा, एक कठोर और लगातार प्रोटोकॉल tolerogenic डीसी phenotype के अनुरूप मूल्यांकन और लक्षण वर्णन के लिए स्थापित किया जाना चाहिए अगर हम प्रभावी ढंग से कर रहे है और reproducibly नए एजेंटों की क्षमता की तुलना में TolDC phenotype प्रेरित प्रयोगशाला. यहाँ हम चूहों के टेम progenitors से iDCs को अलग करने के लिए कदम दर कदम तरीकों के साथ एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं और बाद में TolDCs में iDCs कन्वर्ट करने के लिए उनकी क्षमता के लिए मूल्यांकन के तहत नए एजेंटों की प्रभावकारिता का विश्लेषण करने के लिए, एक मजबूत प्रदान दोनों विट्रो में और vivo मेंTolDCs के कार्यात्मक और phenotypic लक्षण वर्णन । इस विवरण में TolDCs को उनके सरफ़ेस लाइगैंडों, cytokine प्रोफ़ाइल और immunosuppressive फ़ंक्शंस इन विट्रोद्वारा चिह्नित करने के लिए एक विस्तृत विधि शामिल है । हम भी एमएस, प्रयोगात्मक स्व-प्रतिरक्षित encephalomyelitis (EAE) के एक पूर्व नैदानिक मॉडल में इन TolDCs के संभावित चिकित्सीय आवेदन का पता लगाने के लिए एक विधि का एक उदाहरण प्रदान करते हैं । यह स्थापित प्रोटोकॉल जांचकर्ताओं को TolDCs की प्रेरण को बढ़ावा देने के लिए नए एजेंटों की क्षमता का मूल्यांकन करने में मदद करेगा और TolDC चिकित्सीय विकास के दायरे को व्यापक बनाने के प्रयास की सुविधा देगा ।

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Protocol

सभी अध्ययनों का मामला वेस्टर्न रिजर्व यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रक्रियाओं के अनुपालन में प्रदर्शन किया गया.

1. अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न वृक्ष कोशिकाओं (BMDCs) तैयार

  1. autoclaving के माध्यम से सभी शल्य चिकित्सा उपकरणों को निष्फल और उपयुक्त सुरक्षा प्रक्रियाओं के साथ कक्षा द्वितीय जैविक सुरक्षा कैबिनेट में प्रयोग करते हैं ।
  2. Euthanize C57BL/6 चूहों 8-10 सप्ताह की आयु केसह 2 कक्ष का उपयोग करके । एक विदारक बोर्ड पर माउस प्लेस और ७०% इथेनॉल के साथ कुल्ला । उत्पाद शुल्क टिबिया-बहिर्जंघिका और फीमर हड्डियों एक शल्य कैंची का उपयोग करके और उंहें एक 10 सेमी संस्कृति डिश में ७०% इथेनॉल के साथ जगह है ।
  3. सर्जिकल ब्लेड और संदंश काटना ऊतक को दूर 10 सेमी संस्कृति पकवान के ढक्कन पर जितना संभव हो और tibias और femurs को अलग करने के लिए उंहें एक 6 सेमी संस्कृति पकवान में ७०% इथेनॉल के साथ जगह का प्रयोग करें ।
  4. tibias और femurs के दोनों सिरों को ट्रिम करने के लिए सर्जिकल ब्लेड का प्रयोग करें । एक 23G सुई से 3 मिलीलीटर सिरिंज में 3 एमएल पंजाबियों का उपयोग हड्डियों के एक छोर से मज्जा की सामग्री को फ्लश करने के लिए 12 मिलीलीटर पंजाबियों युक्त एक शंकु ट्यूब । हड्डियों के प्रत्येक छोर के लिए 3x इस चरण को दोहराएँ ।
  5. 5 मिनट के लिए ३०० x g पर सेल निलंबन केंद्रापसारक ।
  6. supernatant निकालें और 1 एमएल ले lysing बफर के साथ 5 मिनट के लिए लाल रक्त कोशिकाओं को हटाने के लिए सेल गोली reसस्पेंड ।
  7. 9 एमएल पंजाबियों जोड़ें lysing बफर को पतला और 5 मिनट के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक ।
  8. supernatant निकालें और 10 मिलीलीटर संस्कृति मध्यम (RPMI-१६४० प्लस एल-glutamine, 10% FBS, 1% गैर-आवश्यक अमीनो एसिड (100x), 10 मिमी HEPES, ५० एनएम β-mercaptoethanol, और 5% पेनिसिलिन/streptomycin) के साथ reसस्पैंड ।
    नोट: Endotoxin स्तर से कम ०.१ यूरोपीय संघ/एमएल में FBS है ।
  9. एक ४० माइक्रोन सेल छलनी के माध्यम से सेल निलंबन पास और cytometer का उपयोग करके जीवित कोशिकाओं की संख्या की गणना करने के लिए trypan नीले रंग के ८० µ एल के साथ सेल निलंबन और मिश्रण के 20 µ एल ले.
  10. 1 x 106 कोशिकाओं/एमएल के साथ 15 एनजी/एमएल जीएम-सीएसएफ और 10 एनजी/एमएल आईएल-4 के लिए सेल संख्या समायोजित करें ।
  11. प्लेट 1 x 106 के प्रत्येक अच्छी तरह से प्लेट में और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% co2, और सह2 मशीन में ९५% आर्द्रता में कोशिकाओं की मशीन के 3 मिलीलीटर ।
    नोट: एक चूहे से अस्थि मज्जा कोशिकाओं 3-5 x10 7 कोशिकाओं के आसपास है, यह दर्शाता है कि यह 2 से ३ ६ के लिए रखा जा सकता है अच्छी तरह से प्लेटें ।
  12. 3 दिन पर, प्रत्येक अच्छी तरह से सभी 3 मिलीलीटर संस्कृति माध्यम निकालें, प्रत्येक कुआं में 2 मिलीलीटर ताजा पंजाबियों जोड़ने, और फिर धीरे प्लेट सभी गैर अनुयाई कोशिकाओं को हटाने को सुनिश्चित करने के लिए घूमता है ।
  13. एक अच्छी तरह से 15 एनजी/एमएल जीएम-सीएसएफ और 10 एनजी/एमएल आईएल-4 के साथ 3 मिलीलीटर ताज़ा संस्कृति के माध्यम से बदलें । ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% co2, और सह में ९५% आर्द्रता2 मशीन में कोशिकाओं की मशीन ।
  14. 5 दिन पर, सीधे एक और 3 मिलीलीटर ताजा संस्कृति मध्यम के साथ 15 एनजी/एमएल जीएम-सीएसएफ और 10 एनजी/ 37 ° c, 5% कं2, और सह में ९५% आर्द्रता2 मशीन पर कोशिकाओं की मशीन ।
    नोट: प्रत्येक कुआं में कुल मात्रा अब 6 मिलीलीटर है ।
  15. 7 दिन पर, 10 मिनट के लिए बर्फ पर पूरी थाली डाल दिया । धीरे से एक अच्छी तरह से संस्कृति माध्यम पिपेट निलंबन में iDCs के रूप में लचर-अनुयाई BMDCs को उखाड़ फेंकना ।
    नोट: अनुयाई मैक्रोफेज अभी भी प्लेट से जुड़ी हुई हैं । कम तापमान और धीरे प्रक्रियाओं आगे प्रयोगों को प्रभावित करने के लिए डीसी सक्रियण से बचने के लिए महत्वपूर्ण हैं.
  16. 5 मिनट के लिए ३०० एक्स जी में सेल निलंबन केंद्रापसारक और आगे के प्रयोगों के लिए ताजा संस्कृति माध्यम के साथ reसस्पेंड ।
    नोट: BMDCs प्रवाह cytometry द्वारा प्रतिदीप्ति-लेबल CD11c एंटीबॉडी के साथ पहचाना जा सकता है और हम चित्रा 1में आगे के प्रयोगों के लिए गेटिंग की हमारी BMDCs रणनीति दिखाई ।

2. TolDC जीन और प्रोटीन प्रोफाइल की विशेषताएं

  1. प्लेट 1 x 106 BMDCs/एमएल के 2 मिलीलीटर प्रति अच्छी तरह से 6 अच्छी थाली में संस्कृति माध्यम के साथ उपस्थिति या अनुपस्थिति में 100-400 एनएम CDDO-DFPA के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 ज मशीन के लिए, 5% कं2 और सह2 मशीन में ९५% आर्द्रता ।
    नोट: CDDO-DFPA, एक सिंथेटिक triterpenoid, एक परमाणु कारक है (erythroid-व्युत्पंन 2)-जैसे-2 फैक्टर (Nrf2) उत्प्रेरण और परमाणु कारक-κB (NF-κB) अवरोध करनेवाला । iDCs से TolDCs की प्रेरण, जैसे IL-10, विटामिन D3, डेक्समेतएसॉनी या बे 11-7085 के लिए अन्य एजेंट लागू करें, और प्रत्येक एजेंट के लिए एक इष्टतम स्थिति के लिए इस चरण को संशोधित करें ।
  2. 10 या १०० एलपीएस के एनजी/मिलीलीटर की मशीनिंग के लिए जोड़ें 4-24 बजे mDCs प्रेरित करने के लिए (मशीन समय mRNA या प्रोटीन माप के कारण अलग है) ।
  3. धीरे से एक अच्छी तरह से संस्कृति माध्यम पिपेट और 1 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग करके सेल निलंबन फसल । 5 मिनट के लिए ३०० x जी में केंद्रापसारक को कोशिकाओं और supernatant, क्रमशः इकट्ठा ।
  4. प्रवाह cytometry द्वारा सेल छर्रों से सतह लाइगैंडों का विश्लेषण, जैसे stimulatory लाइगैंडों: CD40, CD80, CD86, MHC-II, OX40L, ICOSL, or निरोधात्मक लाइगैंडों: पीडी-L1, पीडी-L2, ILT3, ILT4.
  5. सेल छर्रों से आरएनए को अलग और cytokine प्रोफ़ाइल और मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (qRT-पीसीआर) और एलिसा, क्रमशः द्वारा जीन और प्रोटीन के स्तर के लिए आरएनए और supernatant नमूनों का विश्लेषण ।
    नोट: उदाहरण के लिए, भड़काऊ साइटोकिंस: TNF-α, IFNγ, EDN-1, il-6, il-12, और आईएल-23, या विरोधी भड़काऊ साइटोकिंस: आईएल-4, आईएल-10, आईएल-15, TGF-β1, और हो-1 ।

3. इन विट्रो में TolDCs के समारोह का मूल्यांकन और Vivo में

  1. टी सेल Syngeneic प्रसार परख
    1. autoclaving के माध्यम से सभी शल्य चिकित्सा उपकरणों को निष्फल और उपयुक्त सुरक्षा प्रक्रियाओं के साथ कक्षा द्वितीय जैविक सुरक्षा कैबिनेट में प्रयोग करते हैं ।
    2. ०.५% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) और ५०० मिलीलीटर पंजाब में 2 मिमी EDTA का उपयोग करते हुए एमएसीएस बफर तैयार करें । एक ०.२ µm फ़िल्टर के माध्यम से फ़िल्टर द्वारा बफर निष्फल ।
      नोट: निंनलिखित प्रयोग के दौरान बर्फ पर बफर रखें ।
    3. CD4+ टी कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए, euthanize OT-द्वितीय टी सेल रिसेप्टर (TCR) ट्रांसजेनिक चूहों उम्र के 8-10 सप्ताह का उपयोग करके सह2 चैंबर. एक विदारक बोर्ड पर माउस प्लेस और ७०% इथेनॉल के साथ कुल्ला । सर्जिकल कैंची और संदंश का उपयोग करके पेट के बाईं ओर से तिल्ली को अलग करें ।
    4. एक 6 सेमी संस्कृति पकवान में 2 मिलीलीटर पंजाबियों के साथ तिल्ली रखो और एक ४० माइक्रोन सेल छलनी गुजर द्वारा तिल्ली भरती करने के लिए 3 मिलीलीटर सिरिंज के पुश-स्टिक के पीछे का उपयोग करें ।
    5. सेल निलंबन इकट्ठा करने और 5 मिनट के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक ।
    6. एमएसीएस बफर के ४०० μl में सेल गोली reसस्पेंड ।
    7. 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर CD4+ टी सेल बायोटिन-एंटीबॉडी कॉकटेल के १०० μl जोड़ें ।
      नोट: एंटीबॉडी कॉकटेल CD4+ टी कोशिकाओं को छोड़कर अन्य सेल प्रकारों पर बाइंड कर देता है, जैसे CD8a, CD11b, CD11c, CD19, CD25, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, एंटी-MHC क्लास II, तेर-११९, और TCRγ/δ ।
    8. 10 मिनट के लिए एमएसीएस बफर और २०० μl के विरोधी-बायोटिन मोती (सामग्री की मेज) 4 डिग्री सेल्सियस पर के ३०० μl जोड़ें ।
    9. ferromagnetic क्षेत्रों (सामग्री की तालिका) और पूर्व जुदाई फिल्टर एक साथ चुंबकीय क्षेत्र में से बना स्तंभ प्लेस और एमएसीएस बफर के 3 मिलीलीटर के साथ कुल्ला ।
    10. कोशिकाओं में एमएसीएस बफर के 9 मिलीलीटर जोड़ें और 5 मिनट के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक ।
    11. एमएसीएस बफर के 3 मिलीलीटर में सेल गोली reसस्पेंड और कॉलम पर लागू होते हैं । CD4+ टी कोशिकाओं से युक्त फ्लो-थ्रू एकत्र करें ।
    12. एमएसीएस बफर के एक और 3 मिलीलीटर के साथ स्तंभ धो और भी प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा ।
    13. प्लीहा pan dc प्राप्त करने के लिए, euthanize C57BL/6 चूहों 8-10 सप्ताह की आयु के सह2 कक्ष का उपयोग करके । एक विदारक बोर्ड पर माउस प्लेस और ७०% इथेनॉल के साथ कुल्ला । सर्जिकल कैंची और संदंश का उपयोग करके पेट के बाईं ओर से तिल्ली को अलग करें । एक 6cm संस्कृति में तिल्ली रखो collagenase डी समाधान के 2 मिलीलीटर (2 मिलीग्राम/एमएल collagenase HBSS युक्त कैल्शियम, मैग्नीशियम में भंग डी) युक्त पकवान ।
    14. एक 1 मिलीलीटर सिरिंज और एक 25G सुई के साथ दो बार तिल्ली के लिए collagenase डी समाधान के 1 मिलीलीटर सुई. तिल्ली को छोटी कैंची से छोटे टुकड़ों में काट लें ।
    15. शेक और 25 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी ।
    16. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ०.५ मीटर EDTA के ५०० μl जोड़ें ।
      नोट: 3.1.13-3.1.14 से चरण dc की प्राप्ति बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण हैं ।
    17. अब पुश-3 मिलीलीटर सिरिंज के पीछे का उपयोग करने के लिए एक ४० माइक्रोन सेल छलनी पारित करने और 5 मिनट के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा सेल निलंबन इकट्ठा करने के लिए तिल्ली घोल भरती ।
    18. एमएसीएस बफर के ३५० μl में सेल गोली reसस्पेंड, FcR ब्लॉकिंग रिएजेंट के ५० μl, और 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पैन वृक्ष सेल बायोटिन-एंटीबॉडी कॉकटेल के १०० μl ।
      नोट: dc द्वारा व्यक्त नहीं किए गए एंटीजन के विरुद्ध एंटीबॉडी कॉकटेल ।
    19. एमएसीएस बफर के 9 मिलीलीटर जोड़कर कोशिकाओं को धोने और 5 मिनट के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक ।
    20. एमएसीएस बफर के ८०० μl में सेल गोली reसस्पेंड और 10 मिनट के लिए 4 ° c पर विरोधी बायोटिन मोतियों की २०० μl जोड़ें ।
    21. dc एकत्रित करने के लिए 3.1.9-3.1.11 से चरणों को दोहराएँ ।
    22. एमएसीएस बफर के एक और 3 मिलीलीटर के साथ कॉलम धो दो बार और भी प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा ।
    23. 1 hr के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 100-400 एनएम CDDO-DFPA की उपस्थिति या अनुपस्थिति में 2 x 105 dc/ml का इलाज करें । अलग, CD4+ टी कोशिकाओं को लेबल (1 x 107/ml) के साथ 1 माइक्रोन CFSE के लिए 37 ° c 15 मिनट के लिए, पंजाबियों के साथ धो , और 2 एक्स 106 टी कोशिकाओं/एमएल पर अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए खंड को समायोजित करें ।
    24. अगले, एक ९६ में अच्छी तरह से प्लेट, सह संस्कृति १०० CFSE के एक ही मात्रा के साथ इलाज वृक्ष कोशिकाओं के μl-लेबल CD4+ टी कोशिकाओं, दोनों उपरोक्त चरणों से एकत्र करने के लिए 1:10 अनुपात मिलता है । अब १०० एनजी/एमएल ovalbumin (ओवा) पेप्टाइड 323-329 प्रति अच्छी तरह से जोड़ें और प्रवाह cytometry द्वारा टी कोशिकाओं के CFSE तीव्रता को मापने के बाद 2-3 गर्मी के दिन ।
      नोट: कक्ष संख्या और dc और T कक्षों का अनुपात हमारे पिछले कार्य३७से ऑप्टिमाइज़ किया गया है ।
  2. Myelin Oligodendrocyte ग्लाइकोप्रोटीन (मोग) (35-55) के साथ स्पंदित BMDCs इंजेक्शन द्वारा निष्क्रिय EAE प्रेरित
    1. प्लेट 1 एक्स 106 BMDCs/एमएल के 2 मिलीलीटर प्रति अच्छी तरह से 6 अच्छी थाली में संस्कृति माध्यम के साथ उपस्थिति या अनुपस्थिति में 100-400 एनएम CDDO-DFPA की मशीनिंग के लिए 1 hr.
    2. 24 घंटे की मशीनिंग के लिए एलपीएस के 10 एनजी/
    3. १०० μg/एमएल के मोग (35-55) 4 घंटे की मशीन के लिए जोड़ें ।
    4. फसल सेल निलंबन और 5 मिनट के लिए ३०० x g पर केंद्रापसारक ।
    5. पंजाब के साथ सेल गोली reसस्पेंड और कोशिकाओं की गिनती ।
    6. चमड़े से २०० μl 2 x 106 कोशिकाओं के इंजेक्शन के लिए 8-10 सप्ताह पुरानी महिला C57BL/6 चूहों (१०० μl प्रत्येक हिंद पैर में) ।
    7. BMDC इंजेक्शन के दिन और ४८ बजे । बाद में, प्रत्येक माउस में कुक्कुर विष (PTX) के एनजी २०० सुई ।
    8. दोहराएँ चरण 3.2.6-3.2.7 एक बार प्रत्येक सप्ताह के लिए 4 लगातार सप्ताह.
    9. मानक मापदंड का उपयोग करके दैनिक EAE के नैदानिक लक्षणों का मूल्यांकन करें३७ (०.५-लंगड़ा पूंछ अंत, 1-लंगड़ा पूंछ, 2-उदारवादी हिंद अंग कमजोरी, 3-गंभीर हिंद अंग कमजोरी, 4-पूरा हिंद अंग पक्षाघात, 5-quadriplegia या मरणासन्न अवस्था, 6-मौत) ।

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Representative Results

भेदभाव और BMDCs का चयन:

अस्थि मज्जा जनक कोशिकाओं जीएम-सीएसएफ और आईएल-4 की उपस्थिति में पूरा RPMI माध्यम में कल्चरित थे iDCs में अंतर करने के लिए 7 दिन (चित्र 1a). 1 दिन पर, कोशिकाओं के आकार में छोटे थे और गोलाकार आकृति विज्ञान दिखाया । 3 दिन पर ताजा माध्यम के प्रतिस्थापन से पहले पंजाबियों के साथ धुलाई कोशिकाओं क्लस्टर बनाने के लिए और भी CD11c+ कोशिकाओं की जनसंख्या में वृद्धि की मदद की । 4 दिन, BMDCs आकार में बढ़े और क्लस्टर गठन शुरू किया गया । पालन मैक्रोफेज भी बदल रहे थे और एक लंबी आकार के साथ थाली के नीचे मनाया । 5 दिन, BMDCs के बड़े आकार क्लस्टर का गठन कर रहे हैं । 6 दिन, अर्द्ध अनुयाई और फ्लोटिंग BMDCs के एक बड़ी संख्या में भी मनाया गया । BMDCs 7 दिन पर काटा और murine dc के एक विशिष्ट मार्कर के रूप में CD11c अभिव्यक्ति के लिए प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया गया । जैसा कि चित्र 1bमें एक प्रतिनिधि प्रवाह cytometry प्लॉट में दिखाया गया है, लगभग ८३.६% BMDCs व्यक्त CD11c इस विधि द्वारा प्राप्त किए गए थे ।

प्रेरण और TolDCs के आनुवंशिक लक्षण वर्णन:

TolDCs के लिए प्रेरित करने के लिए जाना जाता एजेंटों में से कुछ, जैसे विटामिन डी 3३८ और डेक्समेतएसॉनी३९, नीचे MHC द्वितीय और costimulatory अणुओं, CD40, CD80, और CD86 सहित डीसी भूतल लाइगैंडों की अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए जाना जाता है । इसके विपरीत, या तो एलपीएस या CD40L-प्रेरित परिपक्वता dc के संदर्भ में, calcineurin अवरोधकों cyclosporin A और FK506 CD83, CD80, CD86, और MHC II३३की अभिव्यक्ति पर कोई प्रभाव नहीं दिखाया । के रूप में प्रवाह cytometry विश्लेषण द्वारा प्रदर्शन किया, CDDO-DFPA द्वारा TolDC के प्रेरण एलपीएस, ligand, CD80 द्वितीय, पीडी-CD86, और MHC सहित dc की L1-प्रेरित सतह CD40 अभिव्यक्ति पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव था । (चित्र 2) ।

इसके अलावा, तुलनात्मक transcriptome और cytokine विश्लेषण BMDCs के साथ या बिना CDDO-DFPA उपस्थिति या एलपीएस की अनुपस्थिति में संग्राहक भड़काऊ जीन प्रोफ़ाइल चित्रित इलाज किया । CDDO-DFPA उपचार काफी कम एलपीएस प्रेरित समर्थक भड़काऊ cytokine जीन जैसे IFN-γ, आईएल-12, EDN1, TNFα, आईएल-6, और आईएल-23 (चित्रा 3ए-3F) । ये Th1 (IFN-γ और il-12) और Th17 (il-6 और आईएल-23) सेल विभेद के लिए साइटोकिंस जाना जाता है । इसके अलावा, CDDO-DFPA इलाज BMDCs ऐसे IL-4, आईएल-10, TGF-β, और हो-1 (चित्रा 4a-4d) के रूप में विरोधी भड़काऊ cytokine जीन की अभिव्यक्ति बढ़ाया दिखाया । इन विरोधी भड़काऊ जीन Th2 (il-4) और Treg (il-10 और TGF-β) सेल विभेद को बढ़ावा देने के द्वारा प्रतिरक्षा मॉडुलन जाना जाता है । ४० यहाँ यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि विशिष्ट आईएल-१२−; IL-10+ cytokine उत्पादन३६, हो-1 अभिव्यक्ति13की प्रेरण, और EDN के निषेध-1४१ CDDO-DFPA उपचार द्वारा प्रेरित, सभी कर रहे है dc tolerogenic फ़ंक्शन को प्रमाणित करने के लिए जाना जाता है ।

सेलुलर और कार्यात्मक TolDCs के लक्षण वर्णन इन विट्रो में

डीसी मध्यस्थता टी सेल प्रसार costimulatory सतह ligand की सगाई के साथ ही साइटोकिंस और घुलनशील मध्यस्थों के स्राव के द्वारा ट्रिगर किया जा करने के लिए जाना जाता है7. हालांकि, TolDCs कई तंत्र के माध्यम से टी सेल प्रतिक्रियाओं को रोकना: टी सेल anergy उत्प्रेरण द्वारा, सक्रिय रूप से प्रतिक्रियात्मक कोशिकाओं के विलोपन को बढ़ावा देने के द्वारा और भोली टी कोशिकाओं के ध्रुवीकरण को बढ़ावा देने के द्वारा Tregs४२। हम पहले से ही CDDO-DFPA प्रेरित TolDCs३७के कार्यात्मक लक्षण वर्णन की सूचना दी है । टी सेल anergy और प्रतिप्रतिक्रियात्मक टी कोशिकाओं के विलोपन सतह मार्करों या Annexin V/7-AAD धुंधला की जांच के द्वारा स्वतंत्र रूप से विश्लेषण किया जा सकता है । हालांकि, हम अप्रत्यक्ष रूप से टी सेल प्रसार सूचकांक को मापने के द्वारा इस phenotype की पुष्टि की । इस के लिए, हम C57BL/6 OTII ट्रांसजेनिक चूहों टी कोशिकाओं का उपयोग किया और उन्हें syngeneic C57BL से निकाले गए dc को उजागर/6 चूहों और के साथ या बिना CDDO-DFPA इलाज किया. ये dc धुल गए और CFSE के साथ-साथ, ओवा पेप्टाइड से सना हुआ टी कोशिकाओं को सह-संस् कृत किया गया । हम CDDO-DFPA पूर्व इलाज dc द्वारा टी सेल प्रसार में एक उल्लेखनीय कमी मनाया, उनके tolerogenic phenotype (चित्रा 5) का सुझाव ।

vivo में प्रतिरक्षण के एक नैदानिक मॉडल में TolDCs के कार्यात्मक लक्षण वर्णन

अंत में, DFPA प्रेरित TolDCs की कार्यक्षमता में से किसी में परीक्षण किया जा सकता है vivo में नैदानिकी की एक संख्या का विशेषता स्व-प्रतिरक्षित या भड़काऊ सुविधाओं. के बाद से, EAE नैदानिक प्रतिरक्षा की एक व्यापक रूप से स्वीकार किए जाते है नैदानिक murine मॉडल-मध्यस्थता केंद्रीय तंत्रिका तंत्र रोग, एमएस४३, हम अपने वर्तमान अध्ययन में इस का उपयोग किया । आदेश में आगे की जांच करने के लिए CDDO-DFPA प्रेरित TolDCs की vivo कार्यशीलता में , हम उंहें निष्क्रिय EAE के एक नैदानिक murine मॉडल में चुनौती दी । इसके लिए BMDCs एलपीएस और मोग (35-55) की उपस्थिति में CDDO-DFPA के साथ या बिना कल्चर्ड थे । इन कोशिकाओं को फिर बार के रूप में अनुसूचित प्रोटोकॉल चित्रा 6A में चित्रित किया गया और चूहों नियमित रूप से नैदानिक लक्षण की अभिव्यक्ति के लिए मनाया गया इंजेक्शन थे । उंमीद के रूप में, एलपीएस और मोग (35-55) स्पंदित BMDCs EAE के नैदानिक लक्षण दिखाया, तथापि; CDDO-DFPA BMDCs स्वास्थ्यकर्मी समूह काफी कम नैदानिक लक्षण (चित्रा घमण्ड) के साथ रोग की देरी शुरू दिखाया. ये परिणाम CDDO-DFPA उपचार द्वारा प्रेरित TolDCs के immunosuppressive phenotype को मान्य करते हैं ।

Figure 1
चित्र 1: BMDCs का विकास और phenotypic लक्षण वर्णन: (क) अस्थि मज्जा कोशिकाओं से बाहर निकाल दिया गया टिबिया और C57BL के फीमर हड्डियों/6 चूहों और आगे BMDCs करने के लिए विभेदित. एक उपयुक्त सेल क्लस्टर गठन विभेदन की पूरी अवधि के दौरान प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा ट्रैक किया गया था (स्केल बार्स, १०० µm) । (ख) BMDCs विभेद CD11c सतह अभिव्यक्ति द्वारा पुष्टि की गई, के रूप में FACS द्वारा विश्लेषण किया गया । रेखांकन विस्तारित CD11c+ कक्ष जनसंख्या के प्रतिशत को दर्शाते हैं । (ग) BMDCs. कोशिकाओं की गेटिंग रणनीति पहले मलबे (FSC बनाम एसएससी) को बाहर करने के लिए gated थे. एक नक़ल अपवर्जन गेट singlets कोशिकाओं पर फाटक के लिए उपयोग किया गया था (FL2-W बनाम FL2-A) । स्वेटर कोशिकाओं के भीतर, जीवित कोशिकाओं 7 पर gated-AAD भूखंड (7-AAD बनाम FSC) थे । इसके बाद कोशिकाओं का और विश्लेषण किया गया और CD11c अभिव्यक्ति पर gated । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: DC कक्ष सरफ़ेस ligand व्यंजक CDDO-DFPA द्वारा अनछुए है. कोशिकाओं को पहले या तो उपस्थिति या CDDO के अभाव में इलाज किया गया-DFPA (२०० एनएम) के लिए 1 घंटे से पहले एलपीएस के साथ उत्तेजना (१०० एनजी/ CD80, CD86, MHC द्वितीय, पीडी-L1, और CD40 की कोशिका सतह अभिव्यक्ति प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया गया था । यह आंकड़ा वैज्ञानिक रिपोर्टों से संशोधित किया गया है 7, आलेख संख्या: ९८८६ (२०१७), दोी: 10.1038/s41598-017-06907-4 । reproduced और कॉपीराइट की अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: CDDO-DFPA immunogenic dc. BMDCs के आनुवंशिक और प्रोटीन phenotype बदल पूर्व में या तो उपस्थिति या CDDO के अभाव में इलाज किया गया-DFPA (50-400 एनएम) 1 घंटे के लिए पहले एलपीएस के अलावा (१०० एनजी/एमएल), और या तो आरएनए निष्कर्षण के लिए काटा (4 hrs.) या 24 घंटे के लिए शर्त संस्कृति माध्यम को अनुमति दी । cytokine विश्लेषण के लिए संग्रह करने से पहले । आईएल-12 (बी), TNFα (डी), आईएल-6 (ई), और आईएल-23 (एफ) के स्तर qRT-पीसीआर और एलिसा द्वारा मापा गया । जबकि IFN-γ (ए) का स्तर अकेले एलिसा द्वारा qRT-पीसीआर और EDN-1 (सी) द्वारा मापा गया था । परिणाम तीन प्रयोगों के अर्थ ± S.D. के रूप में व्यक्त कर रहे हैं । * p < ०.०५, * * p < ०.०१, * * * p < ०.००१ की तुलना एलपीएस-स्वास्थ्यकर्मी समूहों के साथ की गई है । न बिगड़ा छात्र टी-टेस्ट । यह आंकड़ा वैज्ञानिक रिपोर्टों से संशोधित किया गया है 7, आलेख संख्या: ९८८६ (२०१७), दोी: 10.1038/s41598-017-06907-4 । reproduced और कॉपीराइट की अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित. " कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: CDDO-DFPA प्रेरित TolDCs phenotype जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति द्वारा की पुष्टि की । BMDCs CDDO-DFPA (10-400 एनएम) की उपस्थिति या अनुपस्थिति में पूर्व इलाज किया गया 1 घंटे के लिए एलपीएस के अलावा से पहले (१०० एनजी/एमएल), और कोशिकाओं को आरएनए निष्कर्षण के बाद 24 बजे के लिए काटा गया था । il-4 (ए), आईएल-10 (बी), और TGF-β (सी) के स्तर qRT-पीसीआर द्वारा मापा गया । (घ) १२ बजे कोशिका प्रोटीन lysates एकत्र किए गए. विश्लेषण और हो-1 के स्तर के लिए, और β-actin अभिव्यक्ति पश्चिमी सोख्ता द्वारा निर्धारित किया गया था । परिणाम तीन प्रयोगों के अर्थ ± S.D. के रूप में व्यक्त कर रहे हैं । * p < ०.०५, * * p < ०.०१, * * * p < ०.००१ की तुलना एलपीएस-स्वास्थ्यकर्मी समूहों के साथ की गई है । न बिगड़ा छात्र टी-टेस्ट । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: CDDO-DFPA उजागर dc टी सेल प्रसार को रोकें । dc CDDO-DFPA (100-400 एनएम) के साथ 1 घंटे के लिए ही पूर्व इलाज किया गया, तो धोया और सह एक 1:10 अनुपात में CFSE सना हुआ टी कोशिकाओं के साथ संस्कृति । (क) प्लीहा टी कोशिकाओं और dc C57BL/6 OTII ट्रांसजेनिक चूहों और C57BL/6 चूहों, क्रमशः से अलग किया गया । CDDO-DFPA का इलाज कर रहे dc के साथ CFSE सना हुआ टी कोशिकाओं के साथ सह-प्रसंस्कृत थे (डब्ल्यू/) या बिना (w/o) मशीन के दौरान ओवा इसके अलावा । टी सेल प्रसार 2 दिन में प्रवाह cytometry द्वारा निर्धारित किया गया था । रेखांकन संख्या टी सेल विभाजन के सापेक्ष टी कोशिकाओं विभाजन का प्रतिशत दर्शाया । डेटा 3 स्वतंत्र प्रयोगों का एक प्रतिनिधित्व है । यह आंकड़ा वैज्ञानिक रिपोर्टों से संशोधित किया गया है 7, आलेख संख्या: ९८८६ (२०१७), दोी: 10.1038/s41598-017-06907-4 । reproduced और कॉपीराइट की अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: मोग प्रधानमंत्री डीसी प्रेरित निष्क्रिय EAE TolDCs द्वारा निष्प्रभाव है । (क) मोग (३५-५५) द्वारा EAE प्रेरण-स्पंदित BMDCs. परिपक्व BMDCs की उपस्थिति या CDDO-DFPA (४०० एनएम) के अभाव में इलाज किया गया और बाद में 4 घंटे के लिए मोग (35-55) के साथ स्पंदित । 2 × 106 कोशिकाओं के २०० μl की कुल चार इंजेक्शन की कुल के लिए एक बार प्रत्येक सप्ताह C57BL/6 चूहों के पार्श्व क्षेत्र में उपचर्म इंजेक्शन द्वारा प्रशासित किया गया था । हर बार, PTX आईएफसआई इंजेक्शन द्वारा प्रशासित किया गया था तुरंत और फिर से 2 दिन बाद (4 चक्र पर 0 दिन). (ख) नैदानिक स्कोर सभी चार इंजेक्शन के बाद दर्ज किए गए, मानक मानदंडों का उपयोग कर । सभी डेटा को माध्य ± S.E.M. * P < ०.०५ के रूप में प्रस्तुत किया गया था । होल्म-Sidak विश्लेषण के साथ एकाधिक t-परीक्षण (n = 7 प्रत्येक समूह में चूहों) । यह आंकड़ा वैज्ञानिक रिपोर्टों से संशोधित किया गया है 7, आलेख संख्या: ९८८६ (२०१७), दोी: 10.1038/s41598-017-06907-4 । reproduced और कॉपीराइट की अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

इस पत्र का वर्णन एक कुशल प्रोटोकॉल है कि reproducibly के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है iDCs उत्पंन करने के लिए और बाद में उंहें TolDCs में अंतर है, और हम प्रस्ताव है कि इस के लिए नए आणविक लक्ष्य एजेंटों की क्षमता का मूल्यांकन लागू किया जा सकता है TolDC प्रेरित Phenotype. के रूप में इस रिपोर्ट में वर्णित है, हम एक अनुक्रम में हम पहले प्रवाह cytometry द्वारा सतह लाइगैंडों के TolDC अभिव्यक्ति का विश्लेषण, डीसी cytokine प्रोफ़ाइल के रूप में qRT-पीसीआर और एलिसा द्वारा मापा के एक आकलन के बाद । अंत में, TolDCs के immunoregulatory समारोह में उनकी क्षमता का प्रदर्शन करने के लिए इन विट्रो में टी सेल प्रसार को कम करने और उनके प्रभावकारिता vivo में प्रतिरक्षा को दबाने के लिए, एमएस के नैदानिक murine EAE मॉडल का उपयोग करके पुष्टि की थी ।

हमारे प्रोटोकॉल में, iDCs उत्पंन और जीएम-सीएसएफ और आईएल-4 के संयोजन के साथ murine अस्थि मज्जा पुरोगामी से विभेदित किया गया । अंय प्रोटोकॉल का उपयोग किया है रूपों तरह tyrosine कळेनासे 3 लाइगैंडों (Flt3L) संस्कृति माध्यम में iDCs४४उत्पंन करने के लिए । हालांकि Flt3L के उपयोग iDCs की उपज बढ़ जाती है, इन iDCs आम तौर पर फसल के लिए 2 अधिक दिन (9 दिन) ले, जीएम सीएसएफ/IL-4 इसके अलावा (7 दिन)४४की तुलना में । इससे भी महत्वपूर्ण बात, iDC Flt3L से उत्पंन अक्सर दोनों cDCs में अंतर (सीडी 8-और सीडी 8+) औरपीडीसी ४५ कि कार्यात्मक और स्थिर करने के समकक्ष phenotypically vivo में राज्य के dc थे । हालांकि, जीएम-सीएसएफ/IL-4 हमेशा cDCs की ओर iDC के भेदभाव लाती है (सीडी 8-) केवल ४४ और परिपक्वता के दौरान, वे भड़काऊ dc ४६ के समान वर्ण का प्रदर्शन किया । यह जानना उल्लेखनीय है कि जीएम-सीएसएफ/IL-4 अक्सर नैदानिक परीक्षणों और बुनियादी अनुसंधान में प्रयोग किया जाता है क्योंकि monocytes या CD34+ progenitors४४से dc अंतर का लाभ । यह दिखाया गया है कि इन दो तरीकों से उत्पंन iDCs आकृति विज्ञान विभिंन कोशिकाओं है, जो भी अलग सेल सतह मार्करों के अधिकारी और उनके सक्रियकरण पर विभिंन cytokine प्रोफाइल प्रदर्शन उपज । इसके अलावा, इन पद्धतियों द्वारा प्रेरित TolDCs chemotactic कारकों के जवाब में स्थानांतरित करने के लिए और प्रतिजन विशिष्ट टी सेल प्रतिक्रियाओं४४,४५प्रेरित करने की क्षमता में बदलती हैं । हम समझते हैं कि सीडी 8 + dc क्रॉस-टॉलरेंस ४७ की अपनी अद्वितीय क्षमता के कारण TolDC प्रेरण में अधिक क्षमता प्रदर्शित कर सकता है । हालांकि, यह तब और आगे की आवश्यकता है Flt3L द्वारा व्युत्पंन BMDCs से छंटाई सेल विशिष्ट सीडी 8 + डीसी सबसेट की जांच करने के लिए । इसके अलावा, के बाद से, जीएम-सीएसएफ/IL-4 प्रेरित BMDCs टी सेल उत्तेजना में बेहतर है और एलपीएस उपचार के बाद भड़काऊ मध्यस्थों के उत्पादन४४,४५, हम इस रणनीति में अधिक reproducible परिणाम दिया पाया हमारे प्रयोगों.

जीएम-सीएसएफ/IL-4 से व्युत्पंन BMDCs 4 दिन के आसपास CD11c व्यक्त करने के लिए और 6४८दिन के बाद अभिव्यक्ति को समृद्ध करने के लिए शुरू । इस संस्कृति की प्रक्रिया एक दिन तक निरंतर किया जा सकता है 10-12 अस्थि मज्जा कोशिकाओं के कम चढ़ाना घनत्व के साथ और जीएमसी के एक कम खुराक-एस एफ दिन 8-10४९पर । इस प्रोटोकॉल में, CDDO-DFPA (सिंथेटिक triterpenoid) और एलपीएस क्रमशः डीसी सहिष्णुता और परिपक्वता प्रेरित करने के लिए एजेंटों के रूप में मिलकर जोड़ा गया । हमने हाल ही में बताया कि iDCs BMDC पीढ़ी के इस विधि का उपयोग संस्कृतियों से काटा एक कार्यात्मक TolDC phenotype जब CDDO के साथ इलाज-DFPA३७। यह उल्लेखनीय है कि CDDO-DFPA, जो केवल iDC हार्वेस्ट के बाद संस्कृतियों में जोड़ा गया था (7 दिवस)३७, विटामिन डी 3 की तरह एजेंटों के विपरीत, जो iDC भेदभाव के दौरान कई बार संस्कृतियों में जोड़ा जाना चाहिए (2 दिन, 4, 6)५०। इसके अलावा, विटामिन डी 3 द्वारा TolDCs की इस प्रेरण विविध तंत्र है कि दोनों के दौरान और iDC भेदभाव५१के बाद शुरू किया जाना चाहिए पर निर्भर हो सकता है । हमारे डेटा का सुझाव है कि जोड़ने CDDO-DFPA iDC भेदभाव के दौरान CD11c + dc की शुद्धता पर कोई प्रभाव नहीं था, लेकिन खुराक-निर्भर 7 दिन पर iDCs की उपज कम (डेटा नहीं दिखाया गया है) । हमारे विश्लेषण भी सुझाव है कि CDDO के उच्च एकाग्रता-DFPA इन प्रयोगों में इस्तेमाल अस्थि मज्जा जनक कोशिकाओं को विषाक्त हो सकता है, भले ही iDC CDDO के इस एकाग्रता के साथ सामान्य व्यवहार्यता दिखाया-DFPA३७. यह प्रत्याशित है कि TolDC प्रेरण समय और CDDO-DFPA जैसे एजेंटों के लिए जोखिम की लंबाई के प्रभाव के सावधान विश्लेषण द्वारा अनुकूलित किया जा सकता है ।

वैकल्पिक तरीकों और तंत्र पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है जिसके माध्यम से iDCs को दूसरों द्वारा mDCs के लिए प्रेरित किया जा सकता है, जैसे कि CD40L, TNF-α, और IFN-γ५२। एलपीएस द्वारा डीसी परिपक्वता टोल रिसेप्टर्स की तरह 4 (TLR4) के माध्यम से कई प्रतिलेखन कारकों के सक्रियकरण जाता है, परमाणु कारक सहित-κB (NF-κB), p38 mitogen-सक्रिय प्रोटीन कळेनासे (p38 MAPK), सी-जून एन-टर्मिनल कळेनासे (JNK), और extracellular सिग्नल-विनियमित प्रोटीन कळेनासे (ERK1/ CD40 और TNF रिसेप्टर्स के माध्यम से CD40L और TNF-α द्वारा dc की परिपक्वता क्रमशः NF-κB मार्ग लाती है । इसके विपरीत, IFN-γ जानुस् कळेनासे (JAK), tyrosine कळेनासे (TYK), और संकेत transducer और प्रतिलेखन प्रोटीन (आँकड़े) के उत्प्रेरक के सक्रियण सहित एक अलग मार्ग को उत्तेजित करता है, और इन बहाव प्रभाव भी सक्रियण द्वारा पूरित कर रहे हैं NF-κB मार्ग५२। इसके अलावा, जबकि CD40L/TNF-α-डीसी परिपक्वता के जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल पता चलता है कि इन dc एक Th2 सेल प्रतिक्रिया की ओर टी कोशिकाओं ध्रुवीकरण५३, डीसी IFN द्वारा परिपक्वता-γ दृढ़ता से एक Th1 सेल रिस्पांस५४की दिशा में पक्षपातपूर्ण है । इसलिए, डीसी परिपक्वता के इन अंय उत्प्रेरण जो विशिष्ट टी सेल सबसेट की ओर भेदभाव करने के लिए जुड़े रहे है इस प्रोटोकॉल में कार्यरत नहीं हैं ।

कई रिपोर्टों से पता चला है कि पूर्व vivoविभेदित dc EAE नैदानिक लक्षण और चूहों में पैथोलॉजी५५के पूर्ण स्पेक्ट्रम उत्प्रेरण करने में सक्षम हैं । पूर्व vivo सक्रिय dc द्वारा निष्क्रिय EAE प्रेरण की विधि विभिंन प्रयोगशालाओं द्वारा विभिंन संशोधनों के साथ अपनाया गया है । मोग प्राइमेड BMDCs के प्रशासन द्वारा निष्क्रिय और सक्रिय EAE प्रेरण के संयोजन, मोग और पूरा Freund के सहायक के साथ प्रतिरक्षण से पहले 7 दिन () उच्च नैदानिक लक्षण स्कोर में परिणाम (चोटी नैदानिक स्कोर: ३.५) निष्क्रिय EAE की तुलना में मोग के प्रशासन द्वारा प्रेरण अकेले BMDCs (पीक नैदानिक स्कोर: 2)५६। इस विधि के साथ परिणाम मोग प्रतिरक्षण के साथ मोग प्राइमेड BMDCs के संयोजन से पता चलता है कि रोग की शुरुआत 9 दिन पर मोग और५६के साथ प्रतिरक्षण के बाद होता है । हालांकि, के बाद से यह ज्ञात है कि EAE प्रशासन के स्थल पर महत्वपूर्ण सूजन का कारण बनता है५७, हम केवल हमारे प्रोटोकॉल में अकेले dc के प्रशासन द्वारा निष्क्रिय प्रेरण का उपयोग किया है ताकि प्रभावी ढंग से EAE के दौरान TolDCs के प्रभाव का विश्लेषण । आदेश में और TolDCs के कार्यात्मक phenotype की पुष्टि करने के लिए, एक भी उंहें सक्रिय EAE चूहों के नैदानिक लक्षणों को दबाने में परीक्षण करना चाहिए । dc का प्रशासन मार्ग भी EAE लक्षण५८की प्रेरण के लिए महत्वपूर्ण है । के रूप में हमारे प्रयोगशाला द्वारा और दूसरों के द्वारा रिपोर्ट, C57BL के पार्श्व क्षेत्र में BMDCs के चमड़े के नीचे इंजेक्शन/3-4 इंजेक्शन की कुल के लिए एक सप्ताह में एक बार एक चोटी के नैदानिक स्कोर 2 के आसपास EAE के reproducible रोग शुरुआत के साथ-2.5 दिन 11-12३७ ,५८. हम सक्रिय और निष्क्रिय EAE प्रेरण के बीच अलग नैदानिक लक्षण प्रदर्शित करने के लिए एक छोटी क्लिप प्रदान की (वीडियो 1) ।

हमारे प्रोटोकॉल की मांयता प्राप्त सीमाओं में कार्यरत तरीकों और BMDC भेदभाव के लिए एक गैर शारीरिक रूप से प्रासंगिक microenvironment पर निर्भरता के लिए आवश्यक समय शामिल हैं । हालांकि, जबकि murine तिल्ली से dc और टी कोशिकाओं के लिए संग्रह के एंटीबॉडी समृद्ध कॉलम जुदाई तरीकों अधिक समय कुशल हो सकता है, यह वांछित डीसी जनसंख्या की एक कम उपज से ग्रस्त है । इस प्रकार, अस्थि मज्जा की विधि का लाभ-डीसी विकास व्युत्पंन डीसी आबादी के लॉग पैमाने पर उच्च उपज है जब पूरी तिल्ली से एंटीबॉडी कॉलम जुदाई की तुलना में । ऊपर वर्णित के रूप में, इस विधि द्वारा इन विट्रो में उत्पंन dc cytokine पूरकता की एक उच्च एकाग्रता की आवश्यकता है जो vivo microenvironment५९ में dc के लिए प्रासंगिक नहीं है और यह भी लंबे समय तक सुनिश्चित नहीं करता है डीसी के स्थायित्व । जीएम-सीएसएफ हमारे प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया भी vivo६०में सामांय डीसी भेदभाव के लिए एक आवश्यक cytokine नहीं है । फिर भी, प्रस्तावित BMDC जनरेशन प्रोटोकॉल reproducibly कार्यात्मक TolDCs के एक उच्च अंश पैदावार और tolerogenic गुणों के साथ कार्यशील dc जनरेट करने के लिए एक उच्च विश्वसनीय और reproducible विधि के रूप में देखा जाना चाहिए ।

अंत में, यहां वर्णित प्रोटोकॉल से उत्पंन TolDCs प्रभावी ढंग से उनके जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल का आकलन द्वारा विशेषता हो सकती है, उनकी क्षमता का निर्धारण करने के लिए टी सेल पर निर्भर इन विट्रो मेंप्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को निर्धारित करके, और द्वारा vivo मेंEAE प्रेरण को दबाने के लिए एक adopter सेल थेरेपी के रूप में उनके समारोह का आकलन । हमारे प्रोटोकॉल किसी भी नए एजेंटों के मूल्यांकन के लिए एक रूपरेखा प्रदान करता है के लिए TolDCs प्रेरित क्षमता है और आगे के लिए पीठ से क्लिनिक TolDCs के लिए चिकित्सीय विकास की प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए सोचा ।

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Disclosures

कोई

Acknowledgments

हम CDDO-DFPA प्रदान करने के लिए Reata फार्मास्यूटिकल्स का शुक्रिया अदा करते हैं । हम बाल चिकित्सा कैंसर नवाचार (John Letterio) में जेन और ली Seidman चेयर के समर्थन को भी स्वीकार करते हैं । यह काम रक्षा विभाग द्वारा समर्थित किया गया [W81XWH-12-1-0452]; इस मामले में एंजी बहेलिया किशोर और युवा वयस्क कैंसर अनुसंधान पहल व्यापक कैंसर केंद्र; और F.J. Callahan फाउंडेशन से Hsi-जू वेई के लिए Callahan ग्रेजुएट विद्वान पुरस्कार ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CDDO-DFPA (RTA-408) Reata Pharmaceuticals in house synthesis Cell culture
Mouse GM-CSF Peprotech Inc. 315-03 BMDC differentiation
Mouse IL-4 Peprotech Inc. 214-14 BMDC differentiation
Lipopolysaccharides (LPS) Sigma Aldrich Inc. L2880 Cell culture
β-mercaptoethanol Sigma Aldrich Inc. 516732 Cell culture
Pertussis toxin (PTX) R&D systems 3097 EAE induction
MOG (35–55) peptide 21stCentury Biochemicals in house synthesis EAE induction
Trypan blue Gibco, Life Technologies 15250-061 Cell culture
RPMI-1640 plus L-glutamine ThermoFisher Scientific 11875-093 Cell culture
Non-essential amino acid (100X) ThermoFisher Scientific 11140050 Cell culture
HEPES ThermoFisher Scientific 15630080 Cell culture
penicillin/streptomycin ThermoFisher Scientific 15140122 Cell culture
40 μm cell strainer Corning 352340 Cell isolation
PE-conjugated CD80 BD Biosciences 557227 Flow cytometry
PE-conjugated CD86 BD Biosciences 555665 Flow cytometry
PE-conjugated PD-L1 BioLegend 124307 Flow cytometry
APC-conjugated MHCII Miltenyi Biotec Inc. 130-112-388 Flow cytometry
APC-conjugated CD11c BD Biosciences 340544 Flow cytometry
Isotype matched PE Miltenyi Biotec Inc. 130-091-835 Flow cytometry
Isotype matched APC Miltenyi Biotec Inc. 130-091-836 Flow cytometry
CFSE BioLegend 423801 T cell proliferation assay
Pan dendritic cell isolation kit Miltenyi Biotec Inc. 130-100-875 T cell proliferation assay
FcR Blocking Reagent Miltenyi Biotec Inc. 130-100-875 T cell proliferation assay
Pan Dendritic Cell Biotin-Antibody Cocktail Miltenyi Biotec Inc. 130-100-875 T cell proliferation assay
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi Biotec Inc. 130-100-875 T cell proliferation assay
CD4+ T cell isolation kit Miltenyi Biotec Inc. 130-104-454 T cell proliferation assay
CD4+ T cell Biotin-Antibody Cocktail Miltenyi Biotec Inc. 130-104-454 T cell proliferation assay
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi Biotec Inc. 130-104-454 T cell proliferation assay
ACK lysing buffer ThermoFisher Scientific A1049201 BMDC differentiation
1 ml syringe BD Biosciences 309626 T cell proliferation assay
3 ml syringe BD Biosciences 309588 BMDC differentiation
25G needle BD Biosciences 309626 T cell proliferation assay
23G needle BD Biosciences 309588 BMDC differentiation
BSA Sigma Aldrich Inc. A2058 T cell proliferation assay
EDTA ThermoFisher Scientific 15575020 T cell proliferation assay
LS Column Miltenyi Biotec Inc. 130-042-401 T cell proliferation assay
Pre-Separation Filter Miltenyi Biotec Inc. 130-095-823 T cell proliferation assay
collagenase D Sigma Aldrich Inc. 11088858001 T cell proliferation assay
HBSS ThermoFisher Scientific 14025076 T cell proliferation assay
ovalbumin (OVA) peptide 323–329 Sigma Aldrich Inc. O1641 T cell proliferation assay
Mouse IFN-γ TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm01168134_m1 qRT-PCR
Mouse IL-12a TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm00434165 qRT-PCR
Mouse IL-12 p70 DuoSet ELISA R&D systems DY419-05 ELISA
Mouse EDN-1 ELISA RayBiotech ELM-EDN1-1 ELISA
TNF-α TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm00443258 qRT-PCR
Mouse TNF-α Quantikine ELISA Kit R&D systems MTA00B ELISA
IL-6 TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm00446190 qRT-PCR
Mouse IL-6 Quantikine ELISA Kit R&D systems M6000B ELISA
IL-23a TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm01160011 qRT-PCR
Mouse IL-23 DuoSet ELISA R&D systems DY1887-05 ELISA
IL-4 TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm99999154_m1 qRT-PCR
IL-10 TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm01288386_m1 qRT-PCR
TGF-β TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm01178820_m1 qRT-PCR
Anti-Heme Oxygenase 1 antibody Abcam ab13248 Western blotting
Anti-β-actin antibody Abcam ab8226 Western blotting
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System Bio-Rad Inc. qRT-PCR
BD FACSCalibur Cell Analyzer BD Biosciences Flow cytometry

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References

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चिकित्सा अंक १३५ Tolerogenic वृक्ष कोशिकाओं (TolDCs) अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न वृक्ष कोशिकाओं (BMDCs) प्रयोगात्मक स्व-प्रतिरक्षित Encephalomyelitis (EAE) प्रतिरक्षा दमन साइटोकिंस उन्मुक्ति
Murine Tolerogenic वृक्ष कोशिकाओं के विकास और कार्यात्मक लक्षण वर्णन
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Wei, H. J., Letterio, J. J., Pareek, … More

Wei, H. J., Letterio, J. J., Pareek, T. K. Development and Functional Characterization of Murine Tolerogenic Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (135), e57637, doi:10.3791/57637 (2018).

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