Summary
Qui, presentiamo un protocollo per sviluppare e caratterizzare le cellule dendritiche tollerogeniche (TolDCs) e valutare la loro utilità di immunoterapia.
Abstract
Il sistema immunitario opera mantenendo un equilibrio stretto tra coordinamento risposte contro antigeni estranei e mantenere uno stato non rispondono contro autoantigeni come pure gli antigeni derivati da organismi commensali. La rottura di questa omeostasi immunitaria può portare a un'infiammazione cronica e lo sviluppo dell'autoimmunità. Le cellule dendritiche (DCs) sono le cellule presentanti l'antigene professionale del sistema immunitario innato coinvolto nell'attivazione di cellule T naïve per avviare le risposte immunitarie contro antigeni estranei. Tuttavia, DCs possono essere differenziate anche in TolDCs che agiscono per mantenere e promuovere la tolleranza delle cellule T e di sopprimere le cellule effettrici che contribuiscono allo sviluppo di entrambi condizioni di infiammazione cronica o autoimmune. Il recente progresso nella nostra comprensione di TolDCs suggerisce che tolleranza DC può essere realizzato modulando le loro condizioni di differenziazione. Questo fenomeno ha portato ad una crescita enorme nello sviluppo di terapie TolDC per numerosi disturbi del sistema immunitario causati dovuto rompere in tolleranza immunitaria. Studio di successo in modelli murini di autoimmunità preclinici ulteriormente hanno convalidato l'utilità immunoterapia di TolDCs nel trattamento dei disordini autoimmuni. Oggi, TolDCs sono diventati uno strumento promettente immunoterapia nella clinica per reintegrare la tolleranza immunitaria in vari disordini immuni mirando ai patogene risposte autoimmuni mantenendo intatti l'immunità protettiva. Anche se una matrice delle strategie è stato proposto da vari laboratori per indurre TolDCs, c'è alcuna coerenza nel caratterizzare il fenotipo cellulare e funzionale di queste cellule. Questo protocollo fornisce una guida passo passo per lo sviluppo di derivate da midollo osseo DCs in gran numero, un unico metodo utilizzato per differenziarli in TolDCs con un triterpenoide sintetico 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic acido-difluoro-propil-ammide (CDDO-DFPA) e le tecniche utilizzate per confermare il loro fenotipo, incluse le analisi di firme molecolari essenziali di TolDCs. Infine, vi mostriamo un metodo per valutare la funzione TolDC testando loro immunosopressiva risposta in vitro e in vivo in un modello preclinico di sclerosi multipla.
Introduction
Cellule dendritiche (DCs) sono parte integrante del sistema immunitario innato e sono stati scoperti e caratterizzate da Ralph Steinman e Zanvil Cohn nel 1973 come antigene professionale primario che presenta cellule1. DCs hanno dimostrato di svolgere un ruolo importante nell'attivazione del sistema immunitario con la presentazione di antigeni processati a cellule T e cellule di B via complessi di istocompatibilità (MHC) negli organi linfoidi secondari per collegare il sistema immunitario innato e adattivo2. Nel sistema immunitario mammifero, ci sono almeno due categorie di DCs che sono stati descritti come DCs mieloidi e plasmacytoid DCs (PDC)3. DCs mieloidi, noto anche come DCs convenzionali (cDCs), sono caratterizzati dall'espressione di CD11c e possono essere differenziati come immaturi DCs (IDC) in vitro da cellule progenitrici del midollo osseo o monociti del sangue periferico mediante del granulocyte-macrofago-colony-stimulating factor (GM-CSF) e IL-4 in specie murina o umano, rispettivamente4.
Segnali di attivazione «pericolo», come pattern molecolari associati (PAMP) o pattern molecolari associati danni (umido), guiderà iDCs maturazione verso immunogeno DCs come DC mature (MDC) via vincolanti per diversi recettori di riconoscimento di pattern la superficie di DC5. Proliferazione delle cellule T naive e differenziazione con il upregulation di MHCII2, ligandi costimolazione (CD80, CD86 e CD40)6, citochine e altri mediatori solubili7prime immunogeno DCs ulteriormente. Una cascata di produzione mediatore pro-infiammatorio da DCs immunogeno è essenziale per il differenziamento di citochina-mediata delle cellule di T. Ad esempio, sia di IFN-γ e di IL-12 sono necessari per Th1 differenziazione8 e il-1, IL-6 e IL-23 sono critici per ingenuo polarizzazione delle cellule T nei confronti di cellule Th179. Anche se DC mature reagire agli antigeni stranieri, attivazione incontrollata di DC di auto-antigeni può causare ablazione di tolleranza e favorire lo sviluppo delle malattie autoimmuni tramite la generazione di cellule T autoreattive cui attivazione porta alla distruzione del tessuto10 .
I rapporti recenti hanno fornito prove evidenti della plasticità DC, esemplificato dalla loro capacità di interagire con diversi spunti nel loro microambiente di tessuto e di differenziarsi in sottogruppi distinti dell'effettore/soppressore DC. I mediatori anti-infiammatori, quali IL-10,11, TGF-β12e13 di HO-1 hanno dimostrati di giocare un ruolo importante nella soppressione immune inducendo tollerogeniche DCs (TolDCs). Questi TolDCs acquisire funzioni di regolamentazione e sopprimere la proliferazione di cellule T14. Inoltre, la mancanza di co-stimolazione di DCs e la produzione di mediatori anti-infiammatori da TolDCs sia contribuire all'induzione di cellule T regolatorie (Treg) e anche efficacemente inibire la differenziazione e l'espansione sia Th1 e Th1715. In oltre due decenni, il potenziale terapeutico di TolDCs è stato segnalato da parecchi ricercatori. In questi studi, la somministrazione di ex vivo generata TolDCs non solo ha migliorato i sintomi patologici in diversi modelli preclinici di malattie autoimmuni16 ma inoltre ha condotto allo sviluppo della tolleranza immunitaria nei pazienti17 ,18. È interessante notare che, oggi la terapia TolDCs è stata considerata come un approccio alternativo o adjunctive per le malattie autoimmuni in diversi studi clinici, tra cui tipo 1 diabete mellito19, artrite reumatoide20, 21, sclerosi a placche (MS)22,23,24e di malattia di Crohn25.
Ci sono una varietà di protocolli che sono stati impiegati per sviluppare TolDCs e diversi laboratori sono segnalati i metodi per la generazione e caratterizzazione fenotipica di TolDCs. Questi metodi possono essere utilizzati per generare riproducibile TolDCs in vitro da progenitori ematopoietici e per mantenerli stabilmente in un tollerogeniche stato vivo26,27,28,29. Il iDCs può essere convertito in TolDCs tramite l'esposizione ai vari agenti farmacologici immunomodulatori o citochine antinfiammatorie. Ad esempio, la vitamina D3 è un noto agente farmacologico noto per aumentare la produzione di IL-10 e sopprimere la secrezione di IL-12 da DCs e quindi Spinta loro funzione immunosopressiva30. Inoltre, quando DCs sono esposte a stimoli infiammatori potenti, quali i lipopolisaccaridi (LPS), diversi agenti farmacologici quali desametasone31, rapamicina32e corticosteroidi33 sono stati indicati per indurre la Fenotipo TolDC riducendo l'espressione di superficie di CD40, CD80, CD86 e MHCII34DC. IL-10 e TGF-β sono le citochine antinfiammatorie più studiato per indurre tolleranza di DC35 e l'esposizione concomitante ad entrambe queste citochine sono state indicate per indurre un fenotipo tollerogeniche in DCs36.
Dal tollerogeniche DC è definito dalle caratteristiche funzionali piuttosto che di marcatori fenotipici, c'è un grande bisogno di sviluppare un metodo coerente per caratterizzazione cellulare e funzionale di TolDCs. Inoltre, occorre stabilire un protocollo rigoroso e coerenza per la costante valutazione e caratterizzazione del fenotipo di cellule DC tollerogeniche se siamo in modo efficace e riproducibile confrontare la capacità di nuovi agenti di indurre il fenotipo di TolDC nella laboratorio. Qui forniamo un protocollo dettagliato con metodi dettagliati per isolare iDCs da progenitori ematopoietici dei topi e successivamente analizzare l'efficacia di nuovi agenti nell'ambito della valutazione per la loro capacità di convertire iDCs in TolDCs, che fornisce un robusto caratterizzazione fenotipica e funzionale di TolDCs sia in vitro che in vivo. Questa descrizione include un metodo elaborato per caratterizzare il TolDCs da loro leganti di superficie, il profilo di citochina e funzioni immunosoppressive in vitro. Forniamo anche un esempio di un metodo per esplorare il potenziale applicazione terapeutica di questi TolDCs in un modello preclinico di MS, encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE). Questo protocollo stabilito aiuterà i ricercatori a valutare la capacità di nuovi agenti per promuovere l'induzione di TolDCs e faciliterà lo sforzo per ampliare l'ambito di sviluppo terapeutico TolDC.
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Protocol
Tutti gli studi sono stati effettuati nel rispetto delle procedure approvate dal comitato di uso e cura degli animali istituzionale della Case Western Reserve University School of Medicine.
1. preparare le cellule dendritiche derivate da midollo osseo (BMDCs)
- Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici tramite autoclave ed eseguire l'esperimento in classe II biologica sicurezza gabinetto con le procedure di sicurezza appropriate.
- Eutanasia topi C57BL/6 8-10 settimane di età usando CO2 camera. Posizionare il mouse su un bordo di dissezione e sciacquare con etanolo al 70%. Asportare le ossa tibia-perone e femore utilizzando una forbice chirurgica e metterli con etanolo al 70% in una piastra di coltura di 10 cm.
- Utilizzare lame chirurgiche e forcipe per dissecare tessuto via quanto possibile sul coperchio di 10 cm cultura piatto e isolare delle tibie e femori di inserirli con etanolo al 70% in una piastra di coltura di 6 cm.
- Utilizzare lame chirurgiche per tagliare entrambe le estremità delle tibie e femori. Utilizzare 3 mL di PBS in siringa da 3 ml con un ago di 23G per svuotare il contenuto del midollo da un'estremità delle ossa in una provetta conica contenente 12 ml di PBS. Ripetere questo passaggio 3x per ciascuna estremità delle ossa.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g per 5 min.
- Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet cellulare con 1 ml di tampone lisante per ACK per 5 minuti rimuovere le cellule di anima rosse.
- Aggiungere 9 ml di PBS per diluire il tampone lisante ACK e centrifugare a 300 x g per 5 minuti.
- Rimuovere il supernatante e risospendere con 10 ml terreno di coltura (RPMI-1640 plus L-Glutammina, 10% FBS, 1% non essenziali aminoacidi (100x), 10 mM HEPES, 50 nM β-mercaptoetanolo e 5% di penicillina/streptomicina).
Nota: Il livello dell'endotossina dev'essere inferiore a 0,1 EU/ml in FBS. - Passare la sospensione cellulare attraverso un colino di cella 40 μm e prendere 20 µ l di sospensione cellulare e mescolare con 80 µ l di trypan blu per contare il numero di cellule vive di citometro.
- Regolare il numero di cellulare a 1 x 106 cellule/ml a 15 ng/ml GM-CSF e 10 ng/ml IL-4.
- Piastra 3 ml di 1 x 106 cellule/ml in ciascun pozzetto della piastra a 6 pozzetti e incubare le cellule al 95% di umidità nell'incubatore CO2 , 37 ° C e 5% CO2.
Nota: Le cellule del midollo osseo da un mouse è intorno 3-5 x 107 cellule, indicando che può essere collocato da 2 a 3 piastre da 6 pozzetti. - Il giorno 3, rimuovere tutti i 3 ml di terreno di cultura da ogni pozzetto, aggiungere 2 ml di PBS fresco in ciascun pozzetto e quindi ruotare delicatamente la piastra per garantire la rimozione di tutte le cellule non-aderenti.
- Sostituire 3 ml terreno di coltura nuovo con 15 ng/ml GM-CSF e 10 ng/ml IL-4 in ciascun pozzetto. Incubare le cellule al 95% di umidità nell'incubatore CO2 , 37 ° C e 5% CO2.
- Il giorno 5, aggiungere direttamente un altro 3 ml terreno di coltura fresco con 15 ng/ml GM-CSF e 10 ng/ml IL-4 in ciascun pozzetto. Incubare le cellule a 37° C, 5% CO2 e 95% di umidità nell'incubatore CO2 .
Nota: Il volume totale in ciascun pozzetto è ora 6 ml. - Il giorno 7, mettere l'intera piastra in ghiaccio per 10 minuti. Pipettare delicatamente il terreno di coltura in ogni pozzetto per sloggiare il vagamente-aderente BMDCs come iDCs in sospensione.
Nota: I macrofagi aderenti sono ancora collegati alla piastra. Procedure e delicatamente a bassa temperatura sono la chiave per evitare l'attivazione delle DC per interessare ulteriori esperimenti. - Centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g per 5 minuti e risospendere con terreno di coltura fresco per ulteriori esperimenti.
Nota: BMDCs può essere identificato con anticorpo marcato con fluorescenza di CD11c tramite flusso cytometry e ci ha mostrato la nostra strategia di gating di BMDCs per ulteriori esperimenti in Figura 1.
2. caratterizzare il Gene TolDC e profilo proteico
- Piastra 2 ml di 1 x 106 BMDCs/ml per pozzetto in 6-piastra con terreno di coltura in presenza o assenza di 100-400 nM CDDO-DFPA per l'incubazione di 1 h a 37 ° C e 95% di umidità nell'incubatore CO2 e 5% CO2 .
Nota: CDDO-DFPA, un triterpenoide sintetico, è un fattore nucleare (derivato degli eritrociti 2) - come - 2 induttore di fattore (Nrf2) e fattore-κB nucleare (n-f-κB) inibitore. Applicare altri agenti per l'induzione di TolDCs da IDC, quali IL-10, vitamina D3, desametasone o BAY 11-7085 e modificare questo passaggio a una condizione ottima per ogni agente. - Aggiungere 10 o 100 ng/ml di LPS per l'incubazione di 4-24 ore per indurre MDC (tempo di incubazione è diverso a causa della misura di mRNA e proteina).
- Delicatamente Pipettare il terreno di coltura in ciascun pozzetto e raccogliere la sospensione cellulare mediante pipetta da 1 ml. Centrifugare a 300 x g per 5 minuti raccogliere le cellule e il surnatante, rispettivamente.
- Analizzare i leganti di superficie dai pellet cellulare mediante citometria a flusso, come stimolatore ligandi: CD40, CD80, CD86, MHC-II, OX40L, ICOSL o inibitori ligandi: PD-L1, L2-PD, ILT3, ILT4.
- Isolare il RNA dai pellet cellulare e analizzare il RNA e il surnatante campioni per i livelli di profilo e gene e della proteina di cytokine di PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR) ed ELISA, rispettivamente.
Nota: per esempio, le citochine infiammatorie: TNF-α, IFNγ, EDN-1, IL-6, IL-12 e IL 23 o anti-infiammatori citochine: IL-4, IL-10, IL-15, TGF-β1 e HO-1.
3. valutare la funzione di TolDCs In Vitro e In Vivo
-
Analisi di proliferazione Syngeneic della T-cellula
- Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici tramite autoclave ed eseguire l'esperimento in classe II biologica sicurezza gabinetto con le procedure di sicurezza appropriate.
- Preparare il tampone di Mac utilizzando 0,5% albumina di siero bovino (BSA) e 2 mM EDTA in 500 ml di PBS. Sterilizzare il buffer filtrando attraverso un filtro da 0,2 µm.
Nota: Mantenere il buffer sul ghiaccio durante il seguente esperimento. - Per ottenere CD4+ T cellule, eutanasia topi transgenici di OT-II T-cell receptor (TCR) 8-10 settimane di età usando CO2 camera. Posizionare il mouse su un bordo di dissezione e sciacquare con etanolo al 70%. Isolare la milza dal lato sinistro dell'addome utilizzando pinze e forbici chirurgiche.
- Mettere la milza con 2 ml di PBS in una piastra di coltura di 6 cm e utilizzare il retro della bacchetta di spinta della siringa da 3 ml per tritare la milza passando un colino di cella 40 μm.
- Raccogliere la sospensione cellulare e centrifugare a 300 x g per 5 minuti.
- Risospendere il pellet cellulare in 400 μl di tampone di MACS.
- Aggiungere 100 μl di CD4 T Cell biotina-anticorpo Cocktail+ a 4° C per 5 minuti.
Nota: L'anticorpo cocktail lega su altri tipi di cellule tranne CD4+ T cellule, quali CD8a, CD11b, CD11c, CD19, CD25, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, Anti-MHC di classe II, Ter-119 e TCRγ/δ. - Aggiungere 300 μl di tampone di MACS e 200 μl di perline anti-biotina (Tabella materiali) a 4° C per 10 minuti.
- Luogo la colonna composto di sfere ferromagnetici (Tabella materiali) e filtro pre-separazione insieme in magnetico campo e sciacquarlo con 3 ml di tampone di MACS.
- Aggiungere 9 ml di buffer di Mac nelle cellule e centrifugare a 300 x g per 5 minuti.
- Risospendere il pellet cellulare in 3 ml di tampone di MACS e applicare sulla colonna. Raccogliere flusso-attraverso CD4 contenenti+ T cellule.
- Lavare la colonna con un altro 3 ml di tampone Mac e anche raccogliere il flusso continuo.
- Per ottenere il pan splenica DCs, eutanasia topi C57BL/6 8-10 settimane di età usando CO2 camera. Posizionare il mouse su un bordo di dissezione e sciacquare con etanolo al 70%. Isolare la milza dal lato sinistro dell'addome utilizzando pinze e forbici chirurgiche. Mettere la milza in una piastra di coltura 6cm contenente 2 ml di soluzione della collagenosi D (collagenasi 2 mg/ml D disciolto in HBSS contenenti calcio, magnesio).
- Iniettare 1 ml di soluzione di collagenasi D alla milza due volte con una siringa da 1 ml e un ago 25G. Tagliate la milza a pezzetti con piccole forbici.
- Agitare ed incubare a temperatura ambiente per 25 minuti.
- Aggiungere 500 μl di EDTA 0.5 M a temperatura ambiente per 5 minuti.
Nota: I passaggi da 3.1.13-3.1.14 sono fondamentali per aumentare la resa di DCs. - Ora è possibile utilizzare il retro della bacchetta di spinta della siringa da 3 ml per tritare il liquame di milza passando un colino di cella 40 μm e raccogliere la sospensione cellulare mediante centrifugazione a 300 x g per 5 minuti.
- Risospendere il pellet cellulare in 350 μl di tampone MACS, 50 μl di Reagente Bloccante FcR e 100 μl di Pan dendritiche cella biotina-anticorpo Cocktail a 4° C per 10 minuti.
Nota: L'anticorpo cocktail contro gli antigeni che non sono espressi da DCs. - Lavare le cellule con l'aggiunta di 9 ml di buffer di MACS e centrifugare a 300 x g per 5 minuti.
- Risospendere il pellet cellulare in 800 μl di tampone di MACS e aggiungere 200 μl di anti-biotina perline a 4 ° C per 10 minuti.
- Ripetere i passaggi da 3.1.9-3.1.11 per raccogliere DCs.
- Lavare la colonna con un altro 3 ml di tampone di MACS due volte e anche raccogliere il flusso continuo.
- Trattare il 2 x 105 DCs/ml in presenza o assenza di cellule di T di 100-400 nM CDDO-DFPA a 37 ° C per 1 ora separatamente, etichetta il CD4+ (1 x 107/ml) con 1 μM CFSE a 37 ° C per 15 minuti, lavare con PBS e regolare il volume per ottenere la concentrazione finale a 2 x 106 T cellule/ml.
- Successivamente, in una piastra a 96 pozzetti, co-cultura 100 μl di cellule dendritiche trattate con lo stesso volume di CFSE-labeled CD4 cellule+ T, entrambi raccolti dai passaggi precedenti per ottenere 01:10 ratio. Ora aggiungere 100 ng/mL ovoalbumina (uova) peptide 323-329 al bene e misura l'intensità CFSE delle T cellule tramite flusso cytometry dopo 2-3 giorni di incubazione.
Nota: I numeri di cellulare e rapporto di DCs e T cellule sono state ottimizzate dal nostro precedente lavoro37.
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Indurre il passivo EAE iniettando BMDCs pulsata con Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG) (35-55)
- Piastra da 2 ml di 1 x 106 BMDCs/ml per pozzetto in 6-piastra con terreno di coltura in presenza o assenza di 100-400 nM CDDO-DFPA per l'incubazione di 1 ora.
- Aggiungere 10 ng/ml di LPS per incubazione 24 hrs.
- Aggiungere 100 μg/ml di MOG (35-55) per incubazione 4 hrs.
- Raccogliere la sospensione cellulare e centrifugare a 300 x g per 5 minuti.
- Risospendere il pellet cellulare con PBS e contare le celle.
- Iniettare per via sottocutanea 200 μl di 2 x 106 cellule ai topi C57BL/6 femminili di 8-10 settimane vecchio (100 μl in ogni gamba posteriore).
- Il giorno dell'iniezione di BMDC e 48 hrs. più tardi, iniettare 200 ng di tossina della pertosse (PTX) in ogni mouse.
- Ripetere i passaggi 3.2.6-3.2.7 una volta a settimana per 4 settimane consecutive.
- Valutare i sintomi clinici di EAE quotidianamente utilizzando criteri standard37 (0,5-zoppicare coda, coda 1-zoppicare, debolezza dell'arto posteriore di 2-moderato, 3-severa dell'arto debolezza, paralisi dell'arto posteriore 4-completare, stato 5-quadriplegia o moribondo, 6-morte).
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Representative Results
La differenziazione e la selezione di BMDCs:
Cellule progenitrici del midollo osseo sono state coltivate in terreno RPMI completo in presenza di GM-CSF e IL-4 di differenziarsi in IDC per 7 giorni (Figura 1A). Il giorno 1, cellule erano di piccole dimensioni ed ha mostrato la morfologia sferica. Lavaggio con PBS prima la sostituzione del mezzo fresco il giorno 3 aiutato cellule ai cluster di forma e inoltre ha aumentato la popolazione di CD11c+ cellule. Il giorno 4, BMDCs furono ampliati in dimensione e ha avviato la creazione del cluster. Macrofagi aderiti inoltre sono stati convertiti e osservati nella parte inferiore della piastra con una forma allungata. Il giorno 5, si formano grandi dimensioni cluster di BMDCs. Il giorno 6, un gran numero di semi-aderente e galleggiante BMDCs inoltre sono stato osservato. BMDCs sono state raccolte il giorno 7 e analizzati tramite flusso cytometry per CD11c espressione come un indicatore specifico del DCs murino. Come mostrato in una trama di citometria a flusso rappresentativo in Figura 1B, circa 83,6% di BMDCs esprimendo CD11c sono stati ottenuti da questo metodo.
Induzione e caratterizzazione genetica di TolDCs:
Alcuni degli agenti noti per indurre TolDCs, ad esempio vitamina D338 e desametasone39, sono noti per down-regolano l'espressione dei leganti di superficie DC, tra cui MHC II e molecole di costimolazione, CD40, CD80 e CD86. Al contrario, nel contesto di LPS o o maturazione di CD40L-indotta di DCs, inibitori della calcineurina, ciclosporina A e FK506 ha mostrato alcun effetto sull'espressione di CD83, CD80, CD86 e MHC II33. Come dimostrato dall'analisi di citometria a flusso, l'induzione di TolDC di CDDO-DFPA non avuto alcun effetto significativo sull'espressione di DCs, tra cui CD80, CD86, MHC II, PD-L1 e CD40 ligando superficie indotta da LPS. (Figura 2).
Inoltre, l'analisi del trascrittoma e citochina comparativa dei BMDCs trattati con o senza CDDO-DFPA in presenza o assenza di LPS raffigurato il profilo gene infiammatorio modulato. CDDO-DFPA trattamento ha ridotto significativamente LPS indotto geni di citochine pro-infiammatorie quali IFN-γ, IL-12, EDN1, TNFα, IL-6 e IL-23 (Figura 3A-3F). Questi sono conosciuti citochine per Th1 (IFN-γ e IL-12) e Th17 (IL-6 e IL-23) differenziazione cellulare. Inoltre, CDDO-DFPA trattamento BMDCs ha mostrato una maggiore espressione dei geni delle citochine anti-infiammatorie quali IL-4, IL-10, TGF-β e HO-1 (Figura 4A-4D). Questi geni anti-infiammatori sono noti modulatore di autoimmunità promuovendo Th2 (IL4) e differenziazione delle cellule Treg (IL-10 e TGF-β). 40 qui è importante notare che il distintivo di IL-12−; IL-10+ cytokine produzione36, l'induzione di HO-1 espressione13e l'inibizione di EDN-141 indotta dal trattamento CDDO-DFPA, sono tutti noto per autenticare funzione tollerogenica DCs.
Caratterizzazione cellulare e funzionale di TolDCs in vitro
Proliferazione di DC-mediata delle cellule di T è noto per essere innescato dal fidanzamento di costimolazione superficie ligando, come pure la secrezione di citochine e mediatori solubili7. Tuttavia, TolDCs inibiscono le risposte delle cellule T attraverso meccanismi diversi: attraverso l'induzione di anergia delle cellule T, promuovendo attivamente l'eliminazione delle cellule autoreattive e promuovendo la polarizzazione delle cellule T naive a Treg42. Abbiamo già segnalato che la caratterizzazione funzionale di CDDO-DFPA indotto TolDCs37. Anergia delle cellule t e l'eliminazione di cellule T autoreattive può essere analizzati in modo indipendente controllando gli indicatori di superficie o di Annexin V/7-AAD colorazione. Tuttavia, abbiamo confermato indirettamente questo fenotipo misurando l'indice di proliferazione delle cellule T. Per questo, abbiamo utilizzato topi transgenici C57BL/6 Paolo cellule T e li ha esposti a DCs syngeneic estratte da topi C57BL/6 e trattati con o senza CDDO-DFPA. Questi controller di dominio sono stati lavati e co-coltivate con CFSE macchiato le cellule di T con il peptide OVA. Abbiamo osservato una riduzione significativa nella proliferazione delle cellule T di CDDO-DFPA DCs pre-trattati, suggerendo loro fenotipo tollerogenica (Figura 5).
In vivo caratterizzazione funzionale di TolDCs in un modello preclinico di autoimmunità
Infine, la funzionalità di TolDCs DFPA-indotto può essere testata in qualsiasi numero di preclinici in vivo modelli caratterizzati autoimmuni o infiammatorie caratteristiche. Poiché, EAE è un modello murino preclinico ampiamente accettato della malattia immune-mediata del sistema clinico nervoso centrale, MS43, questo abbiamo utilizzato nel nostro studio corrente. Al fine di esaminare ulteriormente l' in vivo funzionalità di CDDO-DFPA indotto TolDCs, li abbiamo sfidato in un modello murino preclinico di EAE passiva. Per questo, BMDCs sono state coltivate con o senza CDDO-DFPA in presenza di LPS e MOG (35-55). Queste cellule allora sono state iniettate ripetutamente come protocollo pianificata raffigurato in Figura 6A e topi sono stati osservati ordinariamente per la manifestazione dei segni clinici. Come previsto, LPS e MOG (35-55) pulsata BMDCs ha mostrato i sintomi clinici di EAE, tuttavia; CDDO-DFPA innescato BMDCs trattati gruppo ha mostrato in ritardo di inizio della malattia con sintomi clinici significativamente ridotti (Figura 6B). Questi risultati convalidano il fenotipo immunosoppressivo di TolDCs indotta dal trattamento CDDO-DFPA.
Figura 1: sviluppo e caratterizzazione fenotipica di BMDCs: (A) cellule del midollo osseo erano risciacquate da tibia e femore ossa dei topi C57BL/6 e ulteriormente differenziate al BMDCs. Una formazione di cluster di cella appropriata e ' stata seguita da microscopia chiara durante l'intero periodo di differenziazione (barre della scala, 100 µm). (B) la differenziazione di BMDCs è stata confermata dall'espressione di superficie di CD11c, analizzata da FACS. Grafici rappresentano la percentuale del CD11c espanso+ popolazione. (C) Gating strategia di BMDCs. cellule erano prima gated per escludere detriti (FSC e SSC). Un cancello di esclusione del doppietto è stato utilizzato per cancello su camiciole cellule (FL2-W vs FL2-A). All'interno delle cellule di singoletto, cellule vive sono state gated su terreno 7-AAD (7-AAD vs FSC). Quindi le cellule sono stati ulteriormente analizzate e gated CD11c espressione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: espressione di superficie ligando delle cellule DC è inalterato da CDDO-DFPA. Le cellule sono state pretrattate in presenza o assenza di CDDO-DFPA (200 nM) per 1 ora prima della stimolazione con LPS (100 ng/ml) per 24 ore. Espressione di CD80, CD86, MHC II, PD-L1 e CD40 superficie delle cellule è stata analizzata tramite flusso cytometry. Questa figura è stata modificata da Relazioni scientifiche 7, numero di articolo: 9886 (2017), DOI: 10.1038 / s41598-017-06907-4. Riprodotta e ristampato con permesso d'autore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: CDDO-DFPA alterato il fenotipo genetico e proteina di immunogeno DCs. BMDCs sono stati pre-trattati in presenza o assenza di CDDO-DFPA (50-400 nM) per 1 ora prima dell'aggiunta di LPS (100 ng/ml), e sia raccolti per l'estrazione del RNA (4 HRS.) o autorizzati a condizione di terreno di coltura per 24 ore. prima della raccolta per le analisi di cytokine. I livelli di IL-12 (B), TNFα (D), IL-6 (E) e IL-23 (F) sono stati misurati mediante qRT-PCR ed ELISA. Considerando che il livello di IFN-γ (A) è stato misurato da qRT-PCR ed EDN-1 (C) da ELISA da solo. I risultati sono espressi come media ± SD di tre esperimenti. * P < 0,05, * * P < 0.01, * * * P < 0,001 rispetto ai gruppi trattati con LPS. Test t di student spaiati. Questa figura è stata modificata da Relazioni scientifiche 7, numero di articolo: 9886 (2017), DOI: 10.1038 / s41598-017-06907-4. Riprodotta e ristampato con permesso d'autore". Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: CDDO-DFPA indotto fenotipo TolDCs confermato di espressione genica e proteica. BMDCs sono stati pretrattati in presenza o assenza di CDDO-DFPA (10-400 nM) per 1 ora prima dell'aggiunta di LPS (100 ng/ml), e le cellule sono state raccolte per l'estrazione di RNA dopo 24 ore. I livelli di IL-4 (A), IL-10 (B) e TGF-β (C) sono stati misurati mediante qRT-PCR. (D) proteina lisati sono stati raccolti a 12 ore. per le analisi e i livelli di HO-1 e β-actina espressione è stata determinata mediante Western blotting. I risultati sono espressi come media ± SD di tre esperimenti. * P < 0,05, * * P < 0.01, * * * P < 0,001 rispetto ai gruppi trattati con LPS. Test t di student spaiati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: CDDO-DFPA esposti DCs sopprimere la proliferazione delle cellule di T. Controller di dominio sono stati pretrattati con CDDO-DFPA (100-400 nM) per 1 ora solo, poi lavati e co-coltivate con CFSE macchiato le cellule T a un 01:10 ratio. (A) splenico delle cellule T e DCs sono stati isolati da topi transgenici C57BL/6 Paolo e topi C57BL/6, rispettivamente. CDDO-DFPA DCs pretrattati sono state co-coltivate con CFSE macchiato con le cellule di T (w) o senza (aggiunta di uova durante l'incubazione w/o). Proliferazione delle cellule t è stata determinata tramite flusso cytometry al giorno 2. Grafici rappresentano la percentuale di divisione delle cellule di T rispetto a numeri di divisione delle cellule T. I dati sono una rappresentazione di 3 esperimenti indipendenti. Questa figura è stata modificata da Relazioni scientifiche 7, numero di articolo: 9886 (2017), DOI: 10.1038 / s41598-017-06907-4. Riprodotta e ristampato con permesso d'autore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: MOG innescato indotta da DC passivo EAE è abrogata da TolDCs. (A) induzione EAE da MOG (35-55)-pulsata BMDCs. BMDCs Mature sono stati trattati in presenza o assenza di CDDO-DFPA (400 nM) e successivamente ha pulsato con MOG (35-55) per 4 ore. Un totale di 200 μl di 2 × 106 celle è stato amministrato per via sottocutanea nella regione fianco dei topi C57BL/6 una volta a settimana per un totale di quattro iniezioni. Ogni volta, PTX è stato amministrato da i.p. l'iniezione immediatamente e ancora 2 giorni più tardi (giorno 0 il 4 ° ciclo). (B) cliniche punteggi sono state registrate dopo tutto quattro iniezioni, usando criteri standard. Tutti i dati sono stati presentati come la media ± s.e.m. * P < 0.05. T-test multipli con Holm-Sidak analisi (n = 7 topi in ogni gruppo). Questa figura è stata modificata da Relazioni scientifiche 7, numero di articolo: 9886 (2017), DOI: 10.1038 / s41598-017-06907-4. Riprodotta e ristampato con permesso d'autore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo documento descrive un efficiente protocollo che può essere utilizzato per riproducibile per generare iDCs e successivamente li differenziano in TolDCs, e proponiamo che questo può essere applicato per valutare la capacità di nuovi agenti a bersaglio molecolare per indurre il TolDC fenotipo. Come descritto in questo rapporto, abbiamo seguito una sequenza in cui abbiamo analizzato prima TolDC espressione di leganti di superficie tramite flusso cytometry, seguito da una valutazione del profilo di citochina DC come misurato mediante qRT-PCR ed ELISA. Infine, la funzione immunoregulatory di TolDCs è stata confermata dimostrando loro capacità di ridurre la proliferazione delle cellule T in vitro e la loro efficacia per sopprimere l'autoimmunità in vivo, utilizzando il modello murino preclinico di EAE di MS.
Nel nostro protocollo, iDCs sono stati generati e differenziato da precursori del midollo osseo murino con la combinazione di GM-CSF e IL-4. Altri protocolli hanno utilizzato ligandi di forme-come tirosina chinasi 3 (Flt3L) nel terreno di coltura per generare iDCs44. Anche se l'uso di Flt3L aumenta il rendimento di IDC, questi iDCs solito prendere 2 giorni (9 giorni) alla raccolta, rispetto a GM-CSF/IL-4 aggiunta (7 giorni)44. Ancora più importante, iDC generato da Flt3L spesso differenziarsi in entrambi cDCs (CD8– e CD8+) e PDC45 che erano funzionalmente e fenotipico equivalenti a DCs allo steady-state in vivo. Tuttavia, GM-CSF/IL-4 induce invariabilmente la differenziazione di iDC verso cDCs (CD8–) solo44 e durante la maturazione, hanno dimostrato caratteri simili di infiammatorio DCs46. È degno di sapere che GM-CSF/IL-4 è spesso utilizzato negli studi clinici e di ricerca di base a causa del vantaggio di differenziazione DCs da monociti o CD34+ progenitori44. È stato dimostrato che iDCs generato da questi due metodi producono cellule morfologicamente diverse, che inoltre possiedono gli indicatori di superficie differenti delle cellule ed esibiscono profili di cytokine distinti al momento della loro attivazione. Inoltre, TolDCs indotta da questi metodi variano nella loro capacità di migrare in risposta a fattori chemiotattici e di indurre cellule T antigene-specifiche risposte44,45. Comprendiamo che CD8+ DCs possono esibire più potenziale nell'induzione di TolDC a causa della loro capacità unica di tolleranza crociata47. Tuttavia, è quindi necessario ulteriore cella ordinamento da BMDCs derivato da Flt3L per indagare il CD8 specifici+ DC sottoinsieme. Inoltre, da allora, GM-CSF/IL-4 ha indotto BMDCs sono superiori alla stimolazione delle cellule T e la produzione dei mediatori infiammatori dopo trattamento LPS44,45, abbiamo trovato questa strategia ha dato altri risultati riproducibili nostro esperimenti.
BMDCs derivato dall'inizio di GM-CSF/IL-4 di esprimere CD11c intorno giorno 4 e di arricchire l'espressione dopo giorno 648. Questa procedura di cultura può essere sostenuta fino al giorno 10-12 con una minore densità di placcatura di cellule del midollo osseo ed una bassa dose di GMC-SF il giorno 8-1049. In questo protocollo, CDDO-DFPA (triterpenoide sintetico) e LPS sono stati aggiunti in tandem come agenti per indurre tolleranza DC e maturazione, rispettivamente. Recentemente abbiamo riferito che iDCs raccolto da colture che utilizzano questo metodo di generazione di BMDC presentano un fenotipo TolDC funzionale quando pretrattati con CDDO-DFPA37. È interessante nota quello CDDO-DFPA, che è stato solo aggiunto a colture dopo iDC raccolto (giorno 7)37, in contrasto con agenti come vitamina D3 che deve essere aggiunto alle culture più volte durante l'iDC differenziazione (giorno 2, 4, 6)50. Inoltre, questa induzione di TolDCs di vitamina D3 può dipendere da diversi meccanismi che devono essere iniziate sia durante che dopo iDC differenziazione51. I nostri dati suggeriscono che l'aggiunta di CDDO-DFPA durante la differenziazione di iDC ha avuto alcun impatto sulla purezza del CD11c + DCs ma dose-dipendente ha fatto abbassare il rendimento del iDCs il giorno 7 (dati non mostrati). Le nostre analisi suggeriscono anche che la maggiore concentrazione di CDDO-DFPA utilizzato in questi esperimenti potrebbe essere tossica alle cellule progenitrici del midollo osseo, anche se iDC ha mostrato vitalità normale con questa concentrazione di CDDO-DFPA37. Si prevede che TolDC induzione potrebbe essere ottimizzato da un'attenta analisi dell'impatto della tempistica e durata dell'esposizione agli agenti come CDDO-DFPA.
È importante considerare i metodi alternativi e i meccanismi attraverso cui iDCs possono essere indotte a MDC di altri utenti di LPS, quali CD40L, TNF-α e IFN-γ52. Maturazione delle DC di LPS attraverso recettori Toll-like 4(TLR4) conduce l'attivazione di parecchi fattori di trascrizione, compreso il fattore-κB nucleare (n-f-κB), chinasi di proteina mitogene-attivata p38 (p38 MAPK), c-Jun N-terminal kinase (JNK) ed extracellulare chinasi segnale-regolata (ERK1/2). La maturazione delle DC di CD40L e TNF-α attraverso recettori TNF e CD40 induce rispettivamente il pathway di NF-κB. Al contrario, IFN-γ stimola una via differente tra cui l'attivazione di chinasi Janus (JAK), chinasi della tirosina (TYK) e il trasduttore di segnale e attivatore delle proteine trascrizione (statistiche), e questi effetti a valle sono anche integrati da attivazione del pathway NF-κB52. Inoltre, mentre il profilo di espressione genica di maturazione delle DC CD40L/TNF-α-basato suggerisce che queste DCs polarizzare cellule T verso una di risposta delle cellule Th253, maturazione delle DC di IFN-γ è fortemente sbilanciata verso una risposta di cellule Th154. Di conseguenza, questi altri induttori di maturazione delle DC che sono legati al differenziamento verso sottoinsiemi a cellula T specifici non sono impiegati in questo protocollo.
Parecchi rapporti hanno indicato che ex vivo-DCs differenziate sono in grado di indurre l'intero spettro di sintomi clinici di EAE e patologia in topi55. Il metodo di induzione di EAE passiva di ex vivo attivato DCs è stato adottato con varie modifiche da diversi laboratori. La combinazione di induzione di EAE passivo e attivo con la somministrazione di MOG innescato BMDCs, 7 giorni prima l'immunizzazione con MOG e adiuvante di Freund completo (CFA) si traduce in più alti punteggi di sintomo clinico (Punteggio clinico di picco: 3,5) rispetto all'EAE passiva induzione da parte dell'amministrazione di MOG innescato BMDCs da solo (Punteggio clinico di picco: 2)56. Risultati con questo metodo di combinazione di MOG innescato BMDCs con MOG immunizzazione suggerisce che l'esordio della malattia avviene il giorno 9 dopo l'immunizzazione con MOG e CFA56. Tuttavia, poiché è noto che i CFA provoca notevole infiammazione al sito di amministrazione57, abbiamo utilizzato passiva ad induzione EAE dall'amministrazione di DCs da soli nel nostro protocollo al fine di analizzare in modo efficace l'effetto di TolDCs durante EAE. Al fine di confermare ulteriormente il fenotipo funzionale di TolDCs, uno dovrebbe anche verificare nella soppressione dei sintomi clinici dei topi EAE attivi. La via di somministrazione di DCs è anche fondamentale per l'induzione dell'EAE sintomi58. Come riportato dal nostro laboratorio e da altri, iniezione sottocutanea di BMDCs nella regione fianco dei topi C57BL/6 una volta a settimana per un totale di 3-4 iniezioni induce un punteggio clinico di picco di EAE intorno 2-2.5 con l'esordio della malattia riproducibile il giorno 11-1237 ,58. Abbiamo fornito una breve clip per dimostrare i diversi sintomi clinici tra attivo e passivo induzione EAE (Video 1).
Le limitazioni riconosciute del nostro protocollo comprendono il tempo richiesto dai metodi impiegati e la dipendenza da un microambiente non fisiologicamente rilevante per il differenziamento di BMDC. Tuttavia, mentre l'anticorpo arricchita metodi di separazione della colonna dell'insieme di controller di dominio e le cellule di T da murine della milza possono essere più tempo efficiente, soffre di una bassa resa della popolazione DC desiderata. Così, il vantaggio del metodo di sviluppo di DC derivate da midollo osseo è la più alta resa di registro scala di popolazioni DC rispetto alla separazione di colonna anticorpo dalla milza intera. Come notato sopra, il DCs generati in vitro da questo metodo richiede un'alta concentrazione di supplementazione di citochina che non è fisiologicamente rilevante per DCs in vivo microambiente59 e anche non garantisce a lungo termine sostenibilità della DC. Il GM-CSF utilizzato nel nostro protocollo, inoltre, non è una citochina essenziale per la normale differenziazione DC in vivo60. Tuttavia, il protocollo di generazione BMDC proposto riproducibile produce un'alta frazione di funzionalmente TolDCs e dovrebbe essere visto come un metodo altamente affidabile e riproducibile per la generazione di DCs funzionali con proprietà tollerogeniche.
In conclusione, il TolDCs generato dal protocollo descritto qui può essere efficacemente caratterizzato valutando i loro profili di espressione genica e proteica, determinando la loro capacità di modulare le risposte immunitarie T cellula-dipendente in vitroe di valutazione della loro funzione come terapia cellulare adottiva per sopprimere EAE induzione in vivo. Il nostro protocollo fornisce un framework per la valutazione di qualsiasi nuovi agenti pensato per avere la capacità di indurre TolDCs e di accelerare ulteriormente il processo di sviluppo terapeutico per TolDCs dalla panchina alla clinica.
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Disclosures
Nessuno
Acknowledgments
Ringraziamo Reata Pharmaceuticals per la fornitura di CDDO-DFPA. Riconosciamo anche il supporto del Jane e Lee Seidman Chair in innovazione di cancro pediatrico (John Letterio). Questo lavoro è stato sostenuto dal dipartimento della difesa [W81XWH-12-1-0452]; l'iniziativa di ricerca cancro adulti Angie Fowler adolescente e giovane al caso Comprehensive Cancer Center; e il premio di studioso di Callahan laureato per Hsi-Ju Wei da F.J. Callahan Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CDDO-DFPA (RTA-408) | Reata Pharmaceuticals | in house synthesis | Cell culture |
| Mouse GM-CSF | Peprotech Inc. | 315-03 | BMDC differentiation |
| Mouse IL-4 | Peprotech Inc. | 214-14 | BMDC differentiation |
| Lipopolysaccharides (LPS) | Sigma Aldrich Inc. | L2880 | Cell culture |
| β-mercaptoethanol | Sigma Aldrich Inc. | 516732 | Cell culture |
| Pertussis toxin (PTX) | R&D systems | 3097 | EAE induction |
| MOG (35–55) peptide | 21stCentury Biochemicals | in house synthesis | EAE induction |
| Trypan blue | Gibco, Life Technologies | 15250-061 | Cell culture |
| RPMI-1640 plus L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 11875-093 | Cell culture |
| Non-essential amino acid (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | Cell culture |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630080 | Cell culture |
| penicillin/streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | Cell culture |
| 40 μm cell strainer | Corning | 352340 | Cell isolation |
| PE-conjugated CD80 | BD Biosciences | 557227 | Flow cytometry |
| PE-conjugated CD86 | BD Biosciences | 555665 | Flow cytometry |
| PE-conjugated PD-L1 | BioLegend | 124307 | Flow cytometry |
| APC-conjugated MHCII | Miltenyi Biotec Inc. | 130-112-388 | Flow cytometry |
| APC-conjugated CD11c | BD Biosciences | 340544 | Flow cytometry |
| Isotype matched PE | Miltenyi Biotec Inc. | 130-091-835 | Flow cytometry |
| Isotype matched APC | Miltenyi Biotec Inc. | 130-091-836 | Flow cytometry |
| CFSE | BioLegend | 423801 | T cell proliferation assay |
| Pan dendritic cell isolation kit | Miltenyi Biotec Inc. | 130-100-875 | T cell proliferation assay |
| FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotec Inc. | 130-100-875 | T cell proliferation assay |
| Pan Dendritic Cell Biotin-Antibody Cocktail | Miltenyi Biotec Inc. | 130-100-875 | T cell proliferation assay |
| Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec Inc. | 130-100-875 | T cell proliferation assay |
| CD4+ T cell isolation kit | Miltenyi Biotec Inc. | 130-104-454 | T cell proliferation assay |
| CD4+ T cell Biotin-Antibody Cocktail | Miltenyi Biotec Inc. | 130-104-454 | T cell proliferation assay |
| Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec Inc. | 130-104-454 | T cell proliferation assay |
| ACK lysing buffer | ThermoFisher Scientific | A1049201 | BMDC differentiation |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309626 | T cell proliferation assay |
| 3 ml syringe | BD Biosciences | 309588 | BMDC differentiation |
| 25G needle | BD Biosciences | 309626 | T cell proliferation assay |
| 23G needle | BD Biosciences | 309588 | BMDC differentiation |
| BSA | Sigma Aldrich Inc. | A2058 | T cell proliferation assay |
| EDTA | ThermoFisher Scientific | 15575020 | T cell proliferation assay |
| LS Column | Miltenyi Biotec Inc. | 130-042-401 | T cell proliferation assay |
| Pre-Separation Filter | Miltenyi Biotec Inc. | 130-095-823 | T cell proliferation assay |
| collagenase D | Sigma Aldrich Inc. | 11088858001 | T cell proliferation assay |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14025076 | T cell proliferation assay |
| ovalbumin (OVA) peptide 323–329 | Sigma Aldrich Inc. | O1641 | T cell proliferation assay |
| Mouse IFN-γ TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm01168134_m1 | qRT-PCR |
| Mouse IL-12a TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm00434165 | qRT-PCR |
| Mouse IL-12 p70 DuoSet ELISA | R&D systems | DY419-05 | ELISA |
| Mouse EDN-1 ELISA | RayBiotech | ELM-EDN1-1 | ELISA |
| TNF-α TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm00443258 | qRT-PCR |
| Mouse TNF-α Quantikine ELISA Kit | R&D systems | MTA00B | ELISA |
| IL-6 TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm00446190 | qRT-PCR |
| Mouse IL-6 Quantikine ELISA Kit | R&D systems | M6000B | ELISA |
| IL-23a TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm01160011 | qRT-PCR |
| Mouse IL-23 DuoSet ELISA | R&D systems | DY1887-05 | ELISA |
| IL-4 TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm99999154_m1 | qRT-PCR |
| IL-10 TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm01288386_m1 | qRT-PCR |
| TGF-β TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm01178820_m1 | qRT-PCR |
| Anti-Heme Oxygenase 1 antibody | Abcam | ab13248 | Western blotting |
| Anti-β-actin antibody | Abcam | ab8226 | Western blotting |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad Inc. | qRT-PCR | |
| BD FACSCalibur Cell Analyzer | BD Biosciences | Flow cytometry |
References
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