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Medicine

Développement et caractérisation fonctionnelle des cellules dendritiques tolérogène murin

Published: May 18, 2018 doi: 10.3791/57637
Automatic Translation
1, 2,3, 2,3
1Department of Biochemistry, School of Medicine, Case Western Reserve University, 2Department of Pediatrics, Division of Pediatric Hematology/Oncology, Case Western Reserve University, 3Angie Fowler Cancer Institute, Rainbow Babies & Children's Hospital, University Hospitals, Cleveland

Summary

Nous présentons ici un protocole visant à développer et caractériser les cellules dendritiques tolérogène (TolDCs) et évaluer leur utilité immunothérapeutique.

Abstract

Le système immunitaire fonctionne en maintenant un équilibre serré entre la coordination des réponses contre les antigènes étrangers et maintenir un État ne répondant pas contre des auto-antigènes comme antigènes dérivés d’organismes commensaux. La perturbation de cette homéostasie immunitaire peut entraîner une inflammation chronique et le développement de l’auto-immunité. Les cellules dendritiques (CD) sont les cellules présentatrices d’antigène professionnelles du système immunitaire inné impliqué dans l’activation des cellules naïves T pour initier des réponses immunitaires contre les antigènes étrangers. Cependant, DCs peuvent également être différenciés dans les TolDCs qui agissent pour maintenir et promouvoir la tolérance des lymphocytes T et de supprimer les cellules effectrices qui contribuent au développement des deux conditions d’inflammation auto-immune ou chronique. Le récent progrès dans notre compréhension de TolDCs suggère que DC tolérance peut être réalisée en modulant leurs conditions de différenciation. Ce phénomène a entraîné une croissance considérable dans le développement de thérapies TolDC de nombreux désordres du système immunitaire causées à rompre dans la tolérance immunitaire. Des études dans les modèles murins auto-immunité précliniques ont validé davantage l’immunothérapie utilité de TolDCs dans le traitement des maladies auto-immunes. Aujourd'hui, les TolDCs sont devenus un outil prometteur immunothérapeutique dans la clinique de rétablissement tolérance immunitaire dans divers troubles immunitaires en ciblant les réponses auto-immunes pathogènes tout en conservant l’immunité protectrice intactes. Bien qu’un éventail de stratégies a été proposée par plusieurs laboratoires pour induire la TolDCs, il n’y a aucune cohérence pour caractériser le phénotype cellulaire et fonctionnel de ces cellules. Ce protocole fournit un guide étape par étape pour le développement de la moelle osseuse DCs en grand nombre, une méthode unique permettant de les différencier en TolDCs avec un 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic de triterpénoïdes synthétique difluoro-propyl-amide de l’acide (CDDO-Division) et les techniques utilisées pour confirmer leur phénotype, y compris les analyses des signatures moléculaires essentielles de TolDCs. Enfin, nous montrons une méthode pour évaluer la fonction TolDC en testant leur réponse immunosuppressive in vitro et in vivo dans un modèle préclinique de sclérose en plaques.

Introduction

Les cellules dendritiques (CD) font partie intégrante du système immunitaire inné et ont d’abord découvert et caractérisé par Ralph Steinman et Zanvil Cohn en 1973 comme cellules présentatrices d’antigène professionnelle primaire1. DCs ont été démontrés à jouer un rôle important dans l’activation immunitaire en présentant des antigènes transformés à cellules T et cellules B via des complexes majeurs d’histocompatibilité (MHC) dans les organes lymphoïdes secondaires pour relier le système immunitaire inné et adaptatif2. Dans le système immunitaire des mammifères, il y a au moins deux catégories de contrôleurs de domaine qui ont été décrits comme myéloïde DCs et plasmacytoides des contrôleurs de domaine (PDC)3. DCs myéloïdes, aussi connus comme le DCs classiques (CDC), sont caractérisées par l’expression de CD11c et peuvent être différenciées comme immatures DCs (iDCs) in vitro de cellules souches de moelle osseuse ou les monocytes du sang périphérique à l’aide granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor (GM-CSF) et IL-4 espèces murines ou humaines, respectivement4.

Activation de « danger » de signaux, tels que les profils moléculaires de micro-organismes pathogènes associés (PAMP) ou profils moléculaires associés aux dommages (DAMP), conduira la maturation iDCs vers DCs immunogènes comme matures DCs (CAM) via liaison différents récepteurs de reconnaissance de modèle la surface DC5. Immunogènes DCs plus amorcer la prolifération des lymphocytes T naïfs et la différenciation par le biais de l’augmentation de MHCII2, ligands costimulation (CD80, CD86, CD40 et)6, cytokines et autres médiateurs solubles7. Une cascade de production pro-inflammatoire médiateur de DCs immunogène est essentielle pour la différenciation des cellules de T médiée par les cytokines. Par exemple, tant IL-12 et IFN-γ sont nécessaires pour de différenciation Th18 et IL-1, IL-6 et IL-23 sont essentiels pour naïve des lymphocytes T polarisation vers de cellules Th179. Bien que matures DCs réagissent aux antigènes étrangers, activation incontrôlée de DC par auto-antigènes susceptible d’entraîner l’ablation de tolérance et favorisent le développement de maladies auto-immunes en générant des cellules autoréactives T dont l’activation mène à la destruction des tissus10 .

Des rapports récents ont fourni une preuve claire de la plasticité de DC, témoigne de leur capacité à interagir avec différents repères au sein de leur microenvironnement de tissu et à se différencier en sous-ensembles distincts effecteur/suppresseur DC. Les médiateurs anti-inflammatoires, comme l’IL-10,11, TGF-β12et13 de la HO-1 ont été démontrés à jouer un rôle important dans l’immunosuppression en induisant tolérogène DCs (TolDCs). Ces TolDCs acquérir des fonctions régulatrices et supprimer la prolifération de lymphocytes T14. En outre, l’absence de Co-stimulation par DCs la production de médiateurs anti-inflammatoires de TolDCs contribuent à l’induction des cellules T régulatrices (Tregs) et aussi efficacement inhibe la différenciation et l’expansion des Th1 et Th1715. Dans passé deux décennies, le potentiel thérapeutique des TolDCs a été rapporté par plusieurs chercheurs. Dans ces études, l’administration de l’ex-vivo généré TolDCs non seulement amélioré les symptômes pathologiques dans différents modèles précliniques de maladies auto-immunes16 mais aussi conduit au développement d’une tolérance immunitaire chez les patients17 ,,18. Fait intéressant, aujourd'hui la thérapie TolDCs a été considérée comme une approche alternative ou complémentaire pour des maladies auto-immunes dans plusieurs essais cliniques, y compris de type 1 diabète sucré19, polyarthrite rhumatoïde,20, 21, sclérose en plaques (MS)22,23,24et de la maladie de Crohn25.

Il existe une variété de protocoles qui ont été employés pour développer TolDCs et plusieurs laboratoires ont signalé des méthodes pour la production et la caractérisation phénotypique de TolDCs. Ces méthodes peuvent être utilisées de façon reproductible générer TolDCs in vitro de progéniteurs hématopoïétiques et de les maintenir stablement dans un état in vivode la tolérogène26,27,28,29. L’iDCs peut être converti en TolDCs par l’exposition à divers agents pharmacologiques immunomodulateurs ou cytokines anti-inflammatoires. Par exemple, la vitamine D3 est un agent pharmacologique bien connu connu pour augmenter la production d’IL-10 et de supprimer la sécrétion d’IL-12 de contrôleurs de domaine et d’accroître ainsi leur fonction immunosuppressive30. En outre, lorsque les contrôleurs de domaine sont exposés à des stimuli inflammatoires puissants, tels que les lipopolysaccharides (LPS), plusieurs agents pharmacologiques telles que dexaméthasone31et32de la rapamycine corticostéroïdes33 ont démontré qu’induisent les Phénotype TolDC en réduisant l’expression de CD40, CD80, CD86 et MHCII34DC en surface. IL-10 et TGF-β sont les cytokines anti-inflammatoires plus étudié pour induire la tolérance de DC35 et l’exposition simultanée à la fois de ces cytokines auraient dû être divulgués pour induire un phénotype tolérogène dans DCs36.

Depuis le tolérogène que DC est défini par des caractéristiques fonctionnelles plutôt que par des marqueurs phénotypiques, il y a un grand besoin d’élaborer une méthode cohérente pour la caractérisation fonctionnelle et cellulaire des TolDCs. En outre, un protocole rigoureux et cohérent doit être établi d’évaluation cohérents et de caractérisation du phénotype tolérogène DC si l'on veut efficacement et de façon reproductible comparer la capacité des nouveaux agents d’induire le phénotype TolDC dans la laboratoire. Ici, nous fournissons un protocole détaillé avec les méthodes étape par étape pour isoler les pays en développement insulaires de progéniteurs hématopoïétiques de souris et d’analyser par la suite l’efficacité d’un nouvel agent en cours d’évaluation pour leur capacité à convertir des pays en développement insulaires en TolDCs, fournissant une robuste caractérisation phénotypique et fonctionnelle des TolDCs in vitro et in vivo. Cette description inclut une méthode élaborée pour caractériser la TolDCs de leurs ligands surfaces, profil des cytokines et fonctions immunosuppressive in vitro. Nous fournissons également un exemple d’une méthode pour étudier l’application thérapeutique potentielle de ces TolDCs dans un modèle préclinique de MS, encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE). Ce protocole établi aide les chercheurs à évaluer la capacité des nouveaux agents pour promouvoir l’induction de TolDCs et facilitera les efforts visant à élargir le champ de développement thérapeutique TolDC.

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Protocol

Toutes les études ont été effectuées conformément aux procédures approuvées de la Case Western Reserve University School of Medicine animalier institutionnel et Comité d’urbanisme.

1. préparer la moelle osseuse des cellules dendritiques (BMDCs)

  1. Stériliser tous les instruments chirurgicaux par autoclavage et réaliser l’expérience en classe II hotte biologique de sécurité avec les procédures de sécurité appropriées.
  2. Euthanasier souris C57BL/6 8-10 semaines d’âge à l’aide de CO2 chambre. Placez votre souris sur une planche de dissection et rincer avec de l’éthanol à 70 %. L’accise OS fémur et du tibia-péroné à l’aide de ciseaux chirurgicaux et placez-les avec 70 % d’éthanol dans une boîte de Petri de 10 cm.
  3. Utiliser des lames chirurgicales et pinces à disséquer les tissus loin autant que possible sur le couvercle de la 10 cm culture plat et isoler les tibias et fémurs de les placer avec 70 % d’éthanol dans une boîte de Petri de 6 cm.
  4. Lames chirurgicales permet de couper les deux extrémités des tibias et des fémurs. Utiliser 3 mL de PBS en seringue de 3 ml avec une aiguille de 23G pour vider le contenu de la moelle osseuse d’un bout d’os dans un tube conique contenant 12 ml de PBS. Répétez cette opération 3 fois pour chaque extrémité des os.
  5. Centrifuger la suspension de cellules à 300 g pendant 5 min.
  6. Retirez le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire avec 1 ml de tampon lyse de ACK pendant 5 minutes éliminer les globules rouges.
  7. Ajouter 9 ml de PBS pour diluer le tampon de lyse ACK et centrifuger à 300 x g pendant 5 minutes.
  8. Retirez le surnageant et remettre en suspension avec 10 ml de milieu de culture (RPMI 1640 plus L-glutamine, 10 % FBS, 1 % des aminoacides non essentiels (100 x), 10 mM HEPES, 50 nM β-mercaptoéthanol et 5 % la pénicilline/streptomycine).
    NOTE : Niveau d’endotoxine doit être inférieure à 0,1 UE/ml en BF.
  9. Passer la suspension cellulaire à travers un tamis de cellule 40 μm et prendre 20 µl de suspension cellulaire et mélanger avec 80 µl du bleu pour compter le nombre de cellules vivantes en utilisant cytomètre trypan.
  10. Ajuster le nombre de cellules à 1 x 106 cellules/ml à 15 ng/ml GM-CSF et 10 ng/ml IL-4.
  11. Plaque de 3 ml de 1 x 106 cellules/ml dans chaque puits de la plaque 6 puits et incuber les cellules à 37 ° C, 5 % de CO2et 95 % d’humidité dans l’incubateur à CO2 .
    Remarque : Les cellules de la moelle osseuse de souris est d’environ 3-5 x 107 cellules, ce qui indique qu’il peut être placé entre 2 à 3 plaques 6 puits.
  12. Le jour 3, supprimer tous les 3 ml de milieu de culture de chaque puits, ajouter 2 ml de PBS frais dans chaque puits, et puis doucement agiter la plaque afin d’enlever toutes les cellules non adhérentes.
  13. Remplacer les 3 ml milieu de culture fraîche avec 15 ng/ml GM-CSF et 10 ng/ml IL-4 dans chaque puits. Incuber les cellules à 37 ° C, 5 % de CO2et 95 % d’humidité dans l’incubateur à CO2 .
  14. Le jour 5, ajouter directement un autre milieu de culture frais 3 ml avec 15 ng/ml GM-CSF et 10 ng/ml IL-4 dans chaque puits. Incuber les cellules à 37° C, 5 % de CO2 et 95 % d’humidité dans l’incubateur à CO2 .
    Remarque : Le volume total dans chaque puits est maintenant 6 ml.
  15. Jour 7, mettre la plaque entière sur la glace pendant 10 minutes. Pipetez doucement le milieu de culture dans chaque puits pour déloger le faiblement adhérentes BMDCs comme pays en développement insulaires en suspension.
    Remarque : Les macrophages adhérentes sont encore attachées à la plaque. Procédures et doucement à basse température sont la clé pour éviter l’activation de DC pour affecter davantage les expériences.
  16. Centrifuger la suspension de cellules à 300 g pendant 5 mn et remettre en suspension avec milieu de culture frais pour d’autres expériences.
    Remarque : BMDCs peuvent être identifiées avec l’anticorps CD11c marqués par fluorescence par cytométrie en flux et nous avons montré notre stratégie de blocage de BMDCs pour d’autres expériences dans la Figure 1.

2. caractériser les gènes TolDC et profil protéique

  1. Plaque de 2 ml de 1 x 106 BMDCs/ml par puits en puits-plaque 6 milieu de culture dans la présence ou l’absence de 100 à 400 nM CDDO-Division pour l’incubation de 1 h à 37 ° C, 5 % de CO2 et 95 % d’humidité dans l’incubateur à CO2 .
    NOTE : CDDO-Division, un synthétique triterpénoïdes, est un facteur nucléaire (2 dérivés érythroïdes) - like - 2 inducteur de facteur (Nrf2) et inhibiteur du facteur nucléaire-κB (NF-κB). Appliquer des autres agents d’induction de TolDCs de pays en développement insulaires, tels que l’IL-10, vitamine D3, dexaméthasone ou la baie 11-7085 et modifier cette étape pour une condition optimale pour chaque agent.
  2. Ajouter 10 ou 100 ng/ml de LPS pour incubation 4-24 heures pour induire la CAM (temps d’incubation est différent en raison de la mesure d’ARNm ou protéines).
  3. Doucement le milieu de culture dans chaque puits, déposer et récolter la suspension cellulaire à l’aide de la pipette 1 ml. Centrifuger à 300 x g pendant 5 mn recueillir les cellules et le surnageant, respectivement.
  4. Analyser les ligands surfaces des granulés de cellules par cytométrie en flux, tels que les stimulateurs ligands : CD40, CD80, CD86, MHC-II, OX40L, ICOSL ou ligands inhibitrices : PD-L1, L2-PD, ILT3 ILT4.
  5. Isoler l’ARN à partir des granulés de cellule et d’analyser les ARN et les échantillons surnageants pour les niveaux de profil et des gènes et des protéines de cytokine par PCR en temps réel quantitative (qRT-PCR) et ELISA, respectivement.
    NOTE : par exemple, des cytokines inflammatoires : TNF-α, IFNγ, EDN-1, IL-6, IL-12 et IL-23 ou anti-inflammatoires cytokines : IL-4, IL-10, IL-15, TGF-β1 et HO-1.

3. évaluer la fonction de TolDCs In Vitro et In Vivo

  1. Analyse de syngénique prolifération de lymphocytes T
    1. Stériliser tous les instruments chirurgicaux par autoclavage et réaliser l’expérience en classe II hotte biologique de sécurité avec les procédures de sécurité appropriées.
    2. Préparer le tampon Mac à l’aide de 0,5 % d’albumine sérique bovine (BSA) et 2 mM EDTA dans 500 ml de PBS. Stériliser le tampon en le filtrant à travers un filtre de 0,2 µm.
      Remarque : Conservez le tampon sur la glace au cours de l’expérience suivante.
    3. Pour obtenir des CD4+ T cellules, euthanasier des souris transgéniques de OT-II T-cell receptor (TCR) âgés de 8 à 10 semaines à l’aide de CO2 chambre. Placez votre souris sur une planche de dissection et rincer avec de l’éthanol à 70 %. Isoler la rate du côté gauche de l’abdomen à l’aide de pinces et ciseaux chirurgicaux.
    4. Mettre la rate avec 2 ml de PBS dans une boîte de Petri de 6 cm et utiliser l’arrière du poussoir de la seringue de 3 ml à mâcher la rate en passant une passoire de cellule 40 μm.
    5. Recueillir la suspension cellulaire et centrifuger à 300 x g pendant 5 minutes.
    6. Resuspendre le culot dans 400 μl de tampon de MACS.
    7. Ajouter 100 μl de CD4+ T Cell biotine-anticorps Cocktail à 4° C pendant 5 minutes.
      Remarque : Le cocktail d’anticorps se lie sur les autres types de cellules sauf CD4 des cellules+ T, tels que CD8a, CD11b, CD11c, CD19, CD25, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, Anti-MHC classe II, Ter-119 et TCRγ/δ.
    8. Ajouter 300 μl de tampon de MACS et 200 µL de perles anti-biotine (Table des matières) à 4° C pendant 10 minutes.
    9. Place la colonne composée de sphères ferromagnétiques (Table des matières) et filtre de pré-séparation ensemble dans le magnétique sur le terrain et le rincer avec 3 ml de tampon de MACS.
    10. Ajouter 9 ml de tampon de MACS dans les cellules et centrifuger à 300 x g pendant 5 minutes.
    11. Resuspendre le culot dans 3 ml de tampon de MACS et appliquez sur la colonne. Collect intermédiaires contenant CD4+ T des cellules.
    12. Laver la colonne avec un autre 3 ml de tampon de MACS et également recueillir l’accréditif.
    13. Pour obtenir DCs pan splénique, euthanasier souris C57BL/6, 8-10 semaines d’âge à l’aide de CO2 chambre. Placez votre souris sur une planche de dissection et rincer avec de l’éthanol à 70 %. Isoler la rate du côté gauche de l’abdomen à l’aide de pinces et ciseaux chirurgicaux. Mettre la rate dans une boîte de Petri de 6cm contenant 2 ml de solution de collagènase D (collagénase de 2 mg/ml D dissous dans HBSS contenant du calcium, magnésium).
    14. Injecter 1 ml de solution de collagènase D à la rate deux fois avec une seringue de 1 ml et une aiguille 25G. Couper la rate en petits morceaux avec des petits ciseaux.
    15. Agiter et laisser incuber à température ambiante pendant 25 minutes.
    16. Ajouter 500 μl d’EDTA 0,5 M à température ambiante pendant 5 minutes.
      Remarque : Les étapes de 3.1.13-3.1.14 sont essentiels pour accroître le rendement des contrôleurs de domaine.
    17. Maintenant utiliser l’arrière du poussoir de la seringue de 3 ml à émincer la boue rate en passant une passoire de cellule 40 μm et recueillir la suspension cellulaire par centrifugation à 300 g pendant 5 mn.
    18. Resuspendre le culot dans 350 μl de tampon MACS, 50 µl de réactif de blocage de FcR et de 100 μl de Pan biotine-anticorps cellules dendritiques Cocktail à 4° C pendant 10 minutes.
      Remarque : L’anticorps cocktail contre les antigènes qui ne sont pas exprimées par les contrôleurs de domaine.
    19. Laver les cellules en ajoutant 9 ml de tampon de MACS et centrifuger à 300 x g pendant 5 minutes.
    20. Resuspendre le culot dans 800 μl de tampon de MACS et ajouter 200 µL de anti-biotine perles à 4 ° C pendant 10 minutes.
    21. Répétez les étapes de 3.1.9-3.1.11 de recueillir des contrôleurs de domaine.
    22. Laver la colonne avec un autre 3 ml de tampon de MACS deux fois et aussi recueillir l’accréditif.
    23. Traiter les 2 x 105 DCs/ml en présence ou en absence de lymphocytes T de 100 à 400 nM CDDO-Division à 37 ° C pendant 1 h séparément, étiquette le CD4+ (1 x 107/ml) avec 1 μM CFSE à 37 ° C pendant 15 minutes, laver avec du PBS et réajuster le volume pour obtenir la concentration finale de 2 x 106 T cellules/ml.
    24. Ensuite, dans une plaque à 96 puits, co-culture 100 μl des cellules dendritiques traitées avec le même volume de CD4 marqué CFSE+ T cells, tous deux prélevés dans les étapes ci-dessus pour obtenir 01:10 ratio. Maintenant ajoutez 100 ng/mL le peptide d’ovalbumine (OVA) 323-329 par puits et mesure l’intensité CFSE des cellules T par cytométrie en flux après 2-3 jours d’incubation.
      Remarque : Le nombre de cellules et le rapport des contrôleurs de domaine et T ont été optimisés en cellules de nos précédents travaux37.
  2. Induire le passif EAE en injectant BMDCs pulsé avec la myéline Oligodendrocyte glycoprotéine (MOG) (35-55)
    1. Plaque de 2 ml de 1 x 106 BMDCs/ml par puits de 6 puits-plaque avec milieu de culture en présence ou en absence de 100 à 400 nM CDDO-Division pour incubation 1hr.
    2. Ajouter 10 ng/ml de LPS pour incubation 24 hrs.
    3. Ajouter 100 μg/ml de MOG (35-55) pour incubation 4 hrs.
    4. Récolter la suspension cellulaire et centrifuger à 300 x g pendant 5 minutes.
    5. Resuspendre le culot cellulaire avec du PBS et compter les cellules.
    6. Injecter par voie sous-cutanée de 200 μl de 2 x 106 cellules à des souris C57BL/6 femelles âgés de 8 à 10 semaines (100 μl dans chaque patte arrière).
    7. Le jour de l’injection de BMDC et 48 heures. plus tard, injecter 200 ng de la toxine coquelucheuse (PTX) dans chacune des souris.
    8. Répétez les étapes 3.2.6-3.2.7 une fois par semaine pendant 4 semaines consécutives.
    9. Évaluer les symptômes cliniques de l’EAE quotidiennement en utilisant les critères standard37 (0,5 limp queue, queue 1-boites, faiblesse modérée 2 patte, patte 3 grave faiblesse, paralysie de la patte 4-complet, état 5-quadriplégie ou moribond, 6-mort).

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Representative Results

La différenciation et la sélection de BMDCs :

Cellules souches de la moelle osseuse ont été cultivés en milieu RPMI complet en présence de GM-CSF et d’IL-4 à se différencier en pays en développement insulaires pendant 7 jours (Figure 1 a). Jour 1, les cellules ont de petite taille et morphologie sphérique. Laver avec du PBS avant le remplacement du milieu frais le jour 3 aidé des cellules pour former des grappes et également augmenté la population de CD11c+ cellules. Jour 4, BMDCs ont été agrandies à la taille et initié la formation de cluster. Macrophages collés étaient également convertis et observées au bas de la plaque avec une forme allongée. Le jour 5, grosses grappes de tailles des BMDCs sont forment. Jour 6, un grand nombre de BMDCs semi adhérentes et flottantes ont été également observé. BMDCs ont été récoltés le jour 7 et analysés par cytométrie de flux pour l’expression CD11c un marqueur spécifique de DCs murines. Comme sur un terrain de cytométrie de flux représentatif dans la Figure 1 b, environ 83,6 % des BMDCs exprimant CD11c ont été obtenues par cette méthode.

Induction et caractérisation génétique de TolDCs :

Certains des agents connus pour provoquer des TolDCs, tels que de la vitamine D338 et la dexaméthasone39, sont connus pour bas-réguler l’expression des ligands surfaces DC, y compris le CMH II et des molécules de costimulation CD40, CD80 et CD86. En revanche, dans le cadre du LPS soit ou induite par le CD40L maturation de DCs, inhibiteurs de la calcineurine A de cyclosporine et FK506 ont montré aucun effet sur l’expression du CD83, CD80, CD86 et CMH II33. Tel que démontré par l’analyse en cytométrie en flux, l’induction de la TolDC de CDDO-division eut aucun effet significatif sur l’expression du ligand surface induite par LPS de contrôleurs de domaine, y compris CD80, CD86, CMH II, PD-L1 et CD40. (Figure 2).

En outre, l’analyse comparative de transcriptome et cytokines de BMDCs traités avec ou sans CDDO-Division en présence ou absence de LPS dépeint le profil génétique inflammatoire modulé. CDDO-Division traitement a considérablement réduit les gènes de cytokine pro-inflammatoire LPS induits tels que de IFN-γ, IL-12, EDN1 déclarations, TNFα, IL-6 et IL-23 (Figure 3 a-3F). Ce qu’on appelle cytokines pour Th1 (IFN-γ et IL-12) et Th17 (IL-6 et IL-23) la différenciation des cellules. En outre, CDDO-Division traités BMDCs a montré la surexpression des gènes de cytokines anti-inflammatoires telles que IL-4, IL-10, TGF-β et HO-1 (Figure 4 a-4D). Ces gènes anti-inflammatoires sont connus modulateur de l’auto-immunité en promouvant des Th2 (IL-4) et la différenciation des cellules Treg (IL-10 et TGF-β). 40 ici, il est important de noter que le distinctif de l’IL-12−; IL-10+ cytokine production36, l’induction de l' expression de HO-113et l’inhibition de l’EDN-141 induite par le traitement CDDO-Division, sont tous connu pour authentifier les DCs tolérogène fonction.

Caractérisation fonctionnelle et cellulaire de TolDCs in vitro

Prolifération cellulaire T DC est connue pour être déclenché par l’engagement de costimulation ligand de surface ainsi que la sécrétion de cytokines et de médiateurs solubles7. Cependant, TolDCs inhibent les réponses des cellules T par le biais de plusieurs mécanismes : en induisant l’anergie des lymphocytes T, en promouvant activement la suppression des cellules autoréactives et en promouvant la polarisation des cellules naïves T Tregs42. Nous l’avons déjà signalé que la caractérisation fonctionnelle de CDDO-Division induit TolDCs37. L’anergie des lymphocytes t et la suppression des cellules autoréactives T peuvent être analysées indépendamment en vérifiant les marqueurs de surface ou annexine V/7-AAD coloration. Cependant, nous avons confirmé indirectement ce phénotype en mesurant l’indice de prolifération des lymphocytes T. Pour ce faire, nous utilisé des souris transgéniques OTII C57BL/6 cellules T et exposée à des DCs syngéniques extraite de souris C57BL/6 et traités avec ou sans CDDO-Division. Ces contrôleurs de domaine ont été lavés et cultivées conjointement avec CFSE teinté de cellules T avec peptide d’ovules. Nous avons observé une réduction significative de la prolifération des cellules T par DCs pré-traité CDDO-Division, suggérant leur phénotype tolérogène (Figure 5).

In vivo caractérisation fonctionnelle de TolDCs dans un modèle préclinique de l’auto-immunité

Enfin, la fonctionnalité de TolDCs induite par la division peut être testée dans un certain nombre de modèles caractérisés précliniques in vivo auto-immune ou inflammatoires caractéristiques. Depuis, EAE est un modèle murin préclinique largement accepté de la maladie clinique auto-immune du système nerveux central, MS43, nous avons utilisé cela dans notre étude. Afin d’approfondir l' in vivo des fonctionnalités de CDDO-Division induit TolDCs, nous le défia dans un modèle murin préclinique de l’EAE passive. Pour ce faire, les BMDCs ont été cultivées avec ou sans CDDO-Division en présence de LPS et MOG (35-55). Ces cellules ont été injectées puis à plusieurs reprises en tant que protocole régulier représenté dans la Figure 6 a et souris ont été systématiquement observés pour la manifestation de signes cliniques. Comme prévu, LPS et MOG (35-55) pulsée BMDCs ont montré des symptômes cliniques de l’EAE, cependant ; CDDO-Division apprêté BMDCs traités groupe a montré apparition retardée de la maladie avec des symptômes cliniques significativement réduites (Figure 6 b). Ces résultats valident le phénotype immunosuppresseur de TolDCs induite par le traitement CDDO-Division.

Figure 1
Figure 1 : développement et caractérisation phénotypique de BMDCs : (A) cellules de la moelle épinière ont été éliminées de l’os du tibia et du fémur de souris C57BL/6 et plus différenciés à BMDCs. Une formation de cluster cellule appropriée a été suivie par microscopie optique pendant toute la période de différenciation (barres d’échelle, 100 µm). (B) la différenciation BMDCs a été confirmée par l’expression en surface CD11c, telle qu’analysée par FACS. Graphes représentent le pourcentage de l’expansé CD11c+ population de cellules. (C) Gating stratégie de cellules BMDCs. ont été tout d’abord gated pour exclure les débris (FSC vs SSC). Une porte d’exclusion doublet a été utilisée pour porte sur les maillots de corps de cellules (FL2-W vs FL2-A). Dans les cellules de singulet, des cellules vivantes ont été bloqués sur la parcelle 7-AAD (7-AAD vs FSC). Puis les cellules ont été également analysés et gated sur CD11c expression. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : DC cell surface ligand expression est inchangée par CDDO-Division. Les cellules ont été traités au préalable en présence ou en absence de CDDO-Division (200 nM) pendant 1 heure avant la stimulation par le LPS (100 ng/ml) pendant 24 heures. Expression à la surface cellulaire de CD80, CD86, CMH II, PD-L1 et CD40 a été analysée par cytométrie en flux. Ce chiffre a été modifié par Rapports scientifiques 7, numéro d’Article : 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. Reproduit et republiée avec autorisation du droit d’auteur. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : CDDO-Division altéré le phénotype génétique et protéines des immunogènes DCs. BMDCs ont été préalablement traités en présence ou en absence de CDDO-Division (50-400 nM) pendant 1 heure avant l’addition de LPS (100 ng/ml), et soit récoltée pour l’extraction de l’ARN (4 hrs.) ou le droit de milieu de culture de condition pour 24 heures. ayant précédé le prélèvement pour les analyses de cytokine. Les niveaux d’IL-12 (B), D TNFα, IL-6 (E) et IL-23 (F) ont été mesurés par qRT-PCR et ELISA. Considérant que le niveau d’IFN-γ (A) a été mesuré par qRT-PCR et EDN-1 (C) par ELISA seule. Les résultats sont exprimés en moyenne ± S.D. de trois expériences. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001 comparativement aux groupes LPS-traités. Test t de student non appariés. Ce chiffre a été modifié par Rapports scientifiques 7, numéro d’Article : 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. Reproduit et republié avec l’autorisation du droit d’auteur. » S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : CDDO-Division induit phénotype TolDCs confirmée par l’expression génique et protéique. BMDCs ont été traités au préalable en présence ou en absence de CDDO-Division (10-400 nM) pendant 1 heure avant l’addition de LPS (100 ng/ml), et les cellules ont été récoltées pour l’extraction de l’ARN après 24 heures. Les niveaux d’IL-4 (A), IL-10 (B) et TGF-β (C) ont été mesurés par qRT-PCR. (D) les lysats de protéines ont été recueillis à 12 heures. pour les analyses et les niveaux de HO-1 et β-actine expression a été déterminée par Western Blot. Les résultats sont exprimés en moyenne ± S.D. de trois expériences. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001 comparativement aux groupes LPS-traités. Test t de student non appariés. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : CDDO-Division exposés DCs supprimer la prolifération des cellules de T. Contrôleurs de domaine ont été pré-traitées avec CDDO-Division (100-400 nM) pendant 1 heure seulement, puis CFSE lavé et co cultivée avec teinté de lymphocytes T à un 01:10 ratio. (A) spléniques des lymphocytes T et des contrôleurs de domaine ont été isolées à partir des souris transgéniques OTII C57BL/6 et les souris C57BL/6, respectivement. CDDO-Division DCs prétraitées sont cultivés conjointement avec CFSE colorées avec des cellules de T (w /) ou sans (w/o) ajout d’ovules pendant l’incubation. La prolifération des cellules t a été déterminée par cytométrie de flux à jour 2. Graphes représentent le pourcentage de cellules de T par rapport aux nombres T cell division en division. Les données sont une représentation sous forme de 3 expériences indépendantes. Ce chiffre a été modifié par Rapports scientifiques 7, numéro d’Article : 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. Reproduit et republiée avec autorisation du droit d’auteur. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : MOG amorcée passive induite par le DC EAE est abrogé par le TolDCs. (A) induction de l’EAE par MOG (35-55)-pulsé BMDCs. BMDCs matures ont été traités en présence ou en absence de CDDO-Division (400 nM) et impulsé par la suite avec MOG (35-55) pour 4 heures. Un total de 200 μl de 2 × 106 cellules était administré par injection sous-cutanée dans la région du flanc de souris C57BL/6 fois par semaine pour un total de quatre injections. Chaque fois, PTX était administré par injection intrapéritonéale, immédiatement et à nouveau 2 jours plus tard (0 sur le 4e cycle). B cliniques scores ont été enregistrées après tout quatre injections, à l’aide de critères standards. Toutes les données ont été présentées comme la moyenne ± S.E.M. * P < 0,05. Plusieurs tests t Holm-Sidak analyse (n = 7 souris dans chaque groupe). Ce chiffre a été modifié par Rapports scientifiques 7, numéro d’Article : 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. Reproduit et republiée avec autorisation du droit d’auteur. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Cet article décrit un protocole efficace qui peut être utilisé pour reproductible pour générer des pays en développement insulaires et à les différencier par la suite dans TolDCs, et nous proposons que cela peut servir à évaluer la capacité des nouveaux agents de la cible moléculaire pour induire la TolDC phénotype. Comme décrit dans le présent rapport, nous avons suivi une séquence dans laquelle nous avons tout d’abord analysé TolDC expression de ligands surfaces par cytométrie en flux, suivie d’une évaluation du profil DC cytokine mesurée par qRT-PCR et ELISA. Enfin, la fonction immunorégulatrices de TolDCs a été confirmée en démontrant leur capacité à réduire la prolifération des lymphocytes T in vitro et leur efficacité pour supprimer l’auto-immunité in vivo, en utilisant le modèle préclinique de EAE murin de MS.

Dans notre protocole, iDCs ont été générés et différenciées des précurseurs de la murine moelle osseuse avec la combinaison de GM-CSF et d’IL-4. D’autres protocoles ont utilisés des ligands formes-like tyrosine kinase 3 (Flt3L) dans le milieu de culture pour générer des pays en développement insulaires44. Bien que l’utilisation de Flt3L augmente le rendement de ces pays, ces pays en développement insulaires prennent généralement 2 jours (9 jours) à la récolte, par rapport à l' addition (7 jours) de GM-CSF/IL-444. Plus important encore, iDC, provenant souvent de Flt3L se différencient en deux CDC (CD8– et CD8+) et PDC45 qui étaient fonctionnellement et phénotypiquement équivalents aux contrôleurs de domaine stationnaire in vivo. Toutefois, GM-CSF/IL-4 invariablement induit la différenciation des iDC vers CDC (CD8–) seulement44 et au cours de la maturation, ils ont fait preuve de caractères similaires d’inflammatoire DCs46. Il convient de savoir que GM-CSF/IL-4 est souvent utilisé dans les essais cliniques et la recherche fondamentale en raison de l’avantage de différencier les contrôleurs de domaine de monocytes ou CD34+ progéniteurs44. Il a été démontré qu’iDCs générés par ces deux méthodes produisent des cellules morphologiquement différents, qui aussi possèdent des marqueurs de surface de différentes cellules et présentent des profils distincts de cytokines lors de leur activation. En outre, TolDCs induites par ces méthodes varient dans leur capacité à migrer en réponse à des facteurs chimiotactiques et d’induire des lymphocytes T antigène-spécifiques réponses44,45. Nous comprenons que CD8+ DCs peuvent présenter plus de potentiel dans l’induction de la TolDC en raison de leur capacité unique de tolérance croisée47. Cependant, il faut alors davantage de cellules tri de BMDCs dérivé de Flt3L pour enquêter sur le CD8 spécifiques+ DC sous-ensemble. En outre, depuis, GM-CSF/IL-4 induite par BMDCs sont supérieures à la stimulation des cellules T et la production de médiateurs inflammatoires suite LPS traitement44,45, nous avons constaté que cette stratégie a donné des résultats plus reproductibles notre expériences.

BMDCs dérivé de GM-CSF/IL-4 début pour exprimer CD11c autour du jour 4 et enrichir l’expression après jour 648. Cette mise en culture peut être maintenue jusqu'à ce jour 10-12 avec une plus faible densité de placage des cellules de moelle osseuse et une faible dose de GMC-SF jour 8-1049. Dans ce protocole, CDDO-Division (triterpénoïdes synthétiques) et LPS ont été ajoutés en tandem en tant qu’agents pour induire la tolérance de DC et de la maturation, respectivement. Nous avons récemment rapporté qu’iDCs récoltées sur les cultures utilisant cette méthode de génération de BMDC présentent un phénotype TolDC fonctionnel lorsque prétraités avec CDDO-Division37. Il convient de noter que CDDO-Division, qui a été seulement ajouté aux cultures après iDC récolte (jour 7)37, à la différence des agents comme la vitamine D3, auxquels il faut ajouter aux cultures plusieurs fois au cours de l’iDC différenciation (jour 2, 4, 6)50. En outre, cette induction de TolDCs de vitamine D3 peut dépendre de divers mécanismes qui doivent être lancées pendant et après les iDC différenciation51. Nos résultats suggèrent que l’ajout de CDDO-Division durant la différenciation de l’iDC n’avait aucune incidence sur la pureté de CD11c + DCs mais n’ont baissé manière dose-dépendante du rendement de ces pays au jour 7 (données non présentées). Nos analyses indiquent également que la plus forte concentration de CDDO-Division utilisé dans ces expériences peut être toxique pour les cellules souches de la moelle osseuse, même si l’iDC a démontré la viabilité normale avec cette concentration de CDDO-Division37. Il est prévu que TolDC induction peut être optimisée par l’analyse attentive de l’impact du choix des dates et durée de l’exposition à des agents comme CDDO-Division.

Il est important de considérer les méthodes alternatives et les mécanismes par lesquels iDCs peut être induite à Cam par d’autres que LPS, tels que le CD40L et TNF-α, IFN-γ52. Maturation de DC par LPS par l’intermédiaire de récepteurs Toll-like 4(TLR4) entraîne l’activation de plusieurs facteurs de transcription, y compris le facteur nucléaire-κB (NF-κB), kinase de protéine mitogène-p38 (p38 MAPK), c-Jun N-terminal kinase (JNK) et extracellulaires signal-réglées de protéine kinase (ERK1/2). La maturation des DCs de CD40L et TNF-α par l’intermédiaire de récepteurs CD40 et TNF induit respectivement la voie NF-κB. En revanche, IFN-γ stimule une voie différente, y compris l’activation de la kinase Janus (JAK), kinase de tyrosine (TYK) et le transducteur de signal et activateur des protéines transcription (STATs), et ces effets en aval sont également accompagnées d’activation de la voie de NF-κB52. En outre, tandis que le profil d’expression de gène de maturation CD40L/TNF-α-based DC suggère que ces contrôleurs de domaine polarisent les lymphocytes T vers un Th2 cellule réponse53, maturation des DC de l’IFN-γ est fortement biaisée vers un Th1 cellule réponse54. Par conséquent, ces autres inducteurs de la maturation des DC qui sont liés à la différenciation vers des sous-ensembles spécifiques de cellules T ne sont pas employés dans le présent protocole.

Plusieurs rapports ont montré ex vivo-DCs différenciés sont capables d’induire l’éventail complet des symptômes cliniques EAE et pathologie chez les souris55. La méthode d’induction de EAE passive par ex vivo activé DCs a été adoptée avec diverses modifications par différents laboratoires. La combinaison de l’induction de EAE passive et active par l’administration de MOG amorcée BMDCs, 7 jours avant la vaccination avec MOG et adjuvant complet de Freund (ACF) se traduit par des scores plus élevés de symptôme clinique (score clinique de pointe : 3,5) par rapport à l’EAE passive induction par l’administration de MOG apprêté BMDCs seuls (score clinique de pointe : 2)56. Résultats avec cette méthode combinant MOG apprêté BMDCs avec MOG vaccination suggère cette apparition de la maladie se produit au jour 9 après la vaccination avec MOG et CFA56. Toutefois, comme il est connu que le CFA provoque une inflammation importante au site d’administration57, nous avons utilisé passive induction EAE par administration de DCs seuls dans notre protocole afin d’analyser l’effet de TolDCs au cours de l’EAE. Afin de confirmer le phénotype fonctionnel de TolDCs, un devrait également les tester dans la suppression des symptômes cliniques d’actives souris EAE. La voie d’administration de DCs est également essentielle pour l’induction de l’EAE symptômes58. Tel que rapporté par notre laboratoire et d’autres, l’injection sous-cutanée de BMDCs dans la région du flanc de souris C57BL/6 une fois par semaine pour un total de 3-4 injections induit un score clinique de pointe de l’EAE autour de 2 à 2,5 avec apparition de la maladie reproductible sur jour 11-1237 ,58. Nous avons fourni un petit clip pour illustrer les différents symptômes cliniques entre active et passive induction de EAE (vidéo 1).

Les limites reconnues de notre protocole comprennent le temps requis par les méthodes employées et la dépendance sur un micro-environnement physiologiquement non pertinente pour la différenciation BMDC. Cependant, alors que l’anticorps enrichi des méthodes de séparation de colonne de la collection pour les contrôleurs de domaine et les cellules de T de murin rate peuvent être plus efficace de temps, il souffre d’un rendement faible de la population souhaitée de la DC. Ainsi, l’avantage de la méthode de développement de DC dérivés de la moelle osseuse est le rendement supérieur de journal échelle des populations de DC par rapport aux anticorps colonne séparer la rate toute. Tel que noté ci-dessus, les contrôleurs de domaine générées in vitro par cette méthode exige une forte concentration de supplémentation de cytokine qui n’est pas physiologiquement pertinents pour DCs en vivo microenvironnement59 et aussi n’assure pas le long terme durabilité des DC. Le GM-CSF utilisé dans notre protocole n’est également pas une cytokine essentielle pour normal DC différenciation en vivo60. Néanmoins, le protocole de génération BMDC proposé donne une fraction élevée de fonctionnellement TolDCs façon reproductible et devrait être considéré comme une méthode fiable et reproductible pour générer DCs fonctionnelles avec des propriétés tolérogène.

En conclusion, le TolDCs généré à partir du protocole décrit ici peut être effectivement caractérisé en évaluant leurs profils d’expression génique et protéique, en déterminant leur capacité à moduler les réponses immunitaires dépendant des lymphocytes T in vitroet en évaluer leur fonction comme une thérapie cellulaire adoptive pour supprimer l’EAE induction in vivo. Notre protocole fournit un cadre pour l’évaluation de tout nouveaux agents considérés comme ayant la capacité de TolDCs et d’accélérer le processus de développement thérapeutique pour TolDCs de banc à la clinique.

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Disclosures

Aucun

Acknowledgments

Nous remercions Reata Pharmaceuticals pour la fourniture de CDDO-Division. Nous reconnaissons également l’appui de la Jane et Lee Seidman Chaire Innovation de Cancer pédiatrique (John Letterio). Ce travail a été soutenu par le ministère de la défense [W81XWH-12-1-0452] ; l’Initiative de recherche Cancer adultes Angie Fowler adolescents et les jeunes au cas Comprehensive Cancer Center ; et le diplômé Callahan Scholar Award pour Wei Hsi-Ju de F.J. Callahan Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CDDO-DFPA (RTA-408) Reata Pharmaceuticals in house synthesis Cell culture
Mouse GM-CSF Peprotech Inc. 315-03 BMDC differentiation
Mouse IL-4 Peprotech Inc. 214-14 BMDC differentiation
Lipopolysaccharides (LPS) Sigma Aldrich Inc. L2880 Cell culture
β-mercaptoethanol Sigma Aldrich Inc. 516732 Cell culture
Pertussis toxin (PTX) R&D systems 3097 EAE induction
MOG (35–55) peptide 21stCentury Biochemicals in house synthesis EAE induction
Trypan blue Gibco, Life Technologies 15250-061 Cell culture
RPMI-1640 plus L-glutamine ThermoFisher Scientific 11875-093 Cell culture
Non-essential amino acid (100X) ThermoFisher Scientific 11140050 Cell culture
HEPES ThermoFisher Scientific 15630080 Cell culture
penicillin/streptomycin ThermoFisher Scientific 15140122 Cell culture
40 μm cell strainer Corning 352340 Cell isolation
PE-conjugated CD80 BD Biosciences 557227 Flow cytometry
PE-conjugated CD86 BD Biosciences 555665 Flow cytometry
PE-conjugated PD-L1 BioLegend 124307 Flow cytometry
APC-conjugated MHCII Miltenyi Biotec Inc. 130-112-388 Flow cytometry
APC-conjugated CD11c BD Biosciences 340544 Flow cytometry
Isotype matched PE Miltenyi Biotec Inc. 130-091-835 Flow cytometry
Isotype matched APC Miltenyi Biotec Inc. 130-091-836 Flow cytometry
CFSE BioLegend 423801 T cell proliferation assay
Pan dendritic cell isolation kit Miltenyi Biotec Inc. 130-100-875 T cell proliferation assay
FcR Blocking Reagent Miltenyi Biotec Inc. 130-100-875 T cell proliferation assay
Pan Dendritic Cell Biotin-Antibody Cocktail Miltenyi Biotec Inc. 130-100-875 T cell proliferation assay
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi Biotec Inc. 130-100-875 T cell proliferation assay
CD4+ T cell isolation kit Miltenyi Biotec Inc. 130-104-454 T cell proliferation assay
CD4+ T cell Biotin-Antibody Cocktail Miltenyi Biotec Inc. 130-104-454 T cell proliferation assay
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi Biotec Inc. 130-104-454 T cell proliferation assay
ACK lysing buffer ThermoFisher Scientific A1049201 BMDC differentiation
1 ml syringe BD Biosciences 309626 T cell proliferation assay
3 ml syringe BD Biosciences 309588 BMDC differentiation
25G needle BD Biosciences 309626 T cell proliferation assay
23G needle BD Biosciences 309588 BMDC differentiation
BSA Sigma Aldrich Inc. A2058 T cell proliferation assay
EDTA ThermoFisher Scientific 15575020 T cell proliferation assay
LS Column Miltenyi Biotec Inc. 130-042-401 T cell proliferation assay
Pre-Separation Filter Miltenyi Biotec Inc. 130-095-823 T cell proliferation assay
collagenase D Sigma Aldrich Inc. 11088858001 T cell proliferation assay
HBSS ThermoFisher Scientific 14025076 T cell proliferation assay
ovalbumin (OVA) peptide 323–329 Sigma Aldrich Inc. O1641 T cell proliferation assay
Mouse IFN-γ TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm01168134_m1 qRT-PCR
Mouse IL-12a TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm00434165 qRT-PCR
Mouse IL-12 p70 DuoSet ELISA R&D systems DY419-05 ELISA
Mouse EDN-1 ELISA RayBiotech ELM-EDN1-1 ELISA
TNF-α TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm00443258 qRT-PCR
Mouse TNF-α Quantikine ELISA Kit R&D systems MTA00B ELISA
IL-6 TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm00446190 qRT-PCR
Mouse IL-6 Quantikine ELISA Kit R&D systems M6000B ELISA
IL-23a TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm01160011 qRT-PCR
Mouse IL-23 DuoSet ELISA R&D systems DY1887-05 ELISA
IL-4 TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm99999154_m1 qRT-PCR
IL-10 TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm01288386_m1 qRT-PCR
TGF-β TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm01178820_m1 qRT-PCR
Anti-Heme Oxygenase 1 antibody Abcam ab13248 Western blotting
Anti-β-actin antibody Abcam ab8226 Western blotting
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System Bio-Rad Inc. qRT-PCR
BD FACSCalibur Cell Analyzer BD Biosciences Flow cytometry

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References

  1. Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).
  2. Inaba, K., et al. Efficient presentation of phagocytosed cellular fragments on the major histocompatibility complex class II products of dendritic cells. J Exp Med. 188 (11), 2163-2173 (1998).
  3. Banchereau, J., et al. Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol. 18, 767-811 (2000).
  4. Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 179 (4), 1109-1118 (1994).
  5. Hemmi, H., Akira, S. TLR signalling and the function of dendritic cells. Chem Immunol Allergy. 86, 120-135 (2005).
  6. Caux, C., et al. B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells. J Exp Med. 180 (5), 1841-1847 (1994).
  7. Chastain, E. M., Duncan, D. S., Rodgers, J. M., Miller, S. D. The role of antigen presenting cells in multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 265-274 (2011).
  8. Smeltz, R. B., Chen, J., Ehrhardt, R., Shevach, E. M. Role of IFN-gamma in Th1 differentiation: IFN-gamma regulates IL-18R alpha expression by preventing the negative effects of IL-4 and by inducing/maintaining IL-12 receptor beta 2 expression. J Immunol. 168 (12), 6165-6172 (2002).
  9. Gyulveszi, G., Haak, S., Becher, B. IL-23-driven encephalo-tropism and Th17 polarization during CNS-inflammation in vivo. Eur J Immunol. 39 (7), 1864-1869 (2009).
  10. Kronenberg, M., Rudensky, A. Regulation of immunity by self-reactive T cells. Nature. 435 (7042), 598-604 (2005).
  11. Boks, M. A., et al. IL-10-generated tolerogenic dendritic cells are optimal for functional regulatory T cell induction--a comparative study of human clinical-applicable DC. Clin Immunol. 142 (3), 332-342 (2012).
  12. Anderson, A. E., et al. Tolerogenic dendritic cells generated with dexamethasone and vitamin D3 regulate rheumatoid arthritis CD4+ T cells partly via transforming growth factor-beta1. Clin Exp Immunol. 187 (1), 113-123 (2017).
  13. Chauveau, C., et al. Heme oxygenase-1 expression inhibits dendritic cell maturation and proinflammatory function but conserves IL-10 expression. Blood. 106 (5), 1694-1702 (2005).
  14. Maldonado, R. A., von Andrian, U. H. How tolerogenic dendritic cells induce regulatory T cells. Adv Immunol. 108, 111-165 (2010).
  15. Schmidt, S., Nino-Castro, A., Schultze, J. Regulatory dendritic cells: there is more than just immune activation. Frontiers in Immunology. 3 (274), (2012).
  16. Hilkens, C. M., Isaacs, J. D., Thomson, A. W. Development of dendritic cell-based immunotherapy for autoimmunity. Int Rev Immunol. 29 (2), 156-183 (2010).
  17. Dhodapkar, M. V., Steinman, R. M. Antigen-bearing immature dendritic cells induce peptide-specific CD8(+) regulatory T cells in vivo in humans. Blood. 100 (1), 174-177 (2002).
  18. Dhodapkar, M. V., Steinman, R. M., Krasovsky, J., Munz, C., Bhardwaj, N. Antigen-specific inhibition of effector T cell function in humans after injection of immature dendritic cells. J Exp Med. 193 (2), 233-238 (2001).
  19. Giannoukakis, N., Phillips, B., Finegold, D., Harnaha, J., Trucco, M. Phase I (safety) study of autologous tolerogenic dendritic cells in type 1 diabetic patients. Diabetes Care. 34 (9), 2026-2032 (2011).
  20. Benham, H., et al. Citrullinated peptide dendritic cell immunotherapy in HLA risk genotype-positive rheumatoid arthritis patients. Sci Transl Med. 7 (290), 290ra287 (2015).
  21. Bell, G. M., et al. Autologous tolerogenic dendritic cells for rheumatoid and inflammatory arthritis. Ann Rheum Dis. 76 (1), 227-234 (2017).
  22. University Hospital, A. A "Negative" Dendritic Cell-based Vaccine for the Treatment of Multiple Sclerosis: a First-in-human Clinical Trial (MS tolDC). ClinicalTrials.gov. , (2015).
  23. Pujol, F. I. G. T. i Tolerogenic Dendritic Cells as a Therapeutic Strategy for the Treatment of Multiple Sclerosis Patients (TOLERVIT-MS) (TOLERVIT-MS). ClinicalTrials.gov. , (2016).
  24. Varea, S. Treatment of Multiple Sclerosis and Neuromyelitis Optica With Regulatory Dendritic Cell: Clinical Trial Phase 1 B. ClinicalTrials.gov. , (2017).
  25. Jauregui-Amezaga, A., et al. Intraperitoneal Administration of Autologous Tolerogenic Dendritic Cells for Refractory Crohn's Disease: A Phase I Study. J Crohns Colitis. 9 (12), 1071-1078 (2015).
  26. Mahnke, K., Schmitt, E., Bonifaz, L., Enk, A. H., Jonuleit, H. Immature, but not inactive: the tolerogenic function of immature dendritic cells. Immunol Cell Biol. 80 (5), 477-483 (2002).
  27. Lutz, M. B., Schuler, G. Immature, semi-mature and fully mature dendritic cells: which signals induce tolerance or immunity? Trends Immunol. 23 (9), 445-449 (2002).
  28. Suciu-Foca, N., et al. Molecular characterization of allospecific T suppressor and tolerogenic dendritic cells: review. Int Immunopharmacol. 5 (1), 7-11 (2005).
  29. Wakkach, A., et al. Characterization of dendritic cells that induce tolerance and T regulatory 1 cell differentiation in vivo. Immunity. 18 (5), 605-617 (2003).
  30. Szeles, L., et al. 1,25-dihydroxyvitamin D3 is an autonomous regulator of the transcriptional changes leading to a tolerogenic dendritic cell phenotype. J Immunol. 182 (4), 2074-2083 (2009).
  31. Unger, W. W., Laban, S., Kleijwegt, F. S., vander Slik, A. R., Roep, B. O. Induction of Treg by monocyte-derived DC modulated by vitamin D3 or dexamethasone: differential role for PD-L1. Eur J Immunol. 39 (11), 3147-3159 (2009).
  32. Reichardt, W., et al. Impact of mammalian target of rapamycin inhibition on lymphoid homing and tolerogenic function of nanoparticle-labeled dendritic cells following allogeneic hematopoietic cell transplantation. J Immunol. 181 (7), 4770-4779 (2008).
  33. Woltman, A. M., et al. The effect of calcineurin inhibitors and corticosteroids on the differentiation of human dendritic cells. Eur J Immunol. 30 (7), 1807-1812 (2000).
  34. Hackstein, H., Thomson, A. W. Dendritic cells: emerging pharmacological targets of immunosuppressive drugs. Nat Rev Immunol. 4 (1), 24-34 (2004).
  35. Torres-Aguilar, H., Blank, M., Jara, L. J., Shoenfeld, Y. Tolerogenic dendritic cells in autoimmune diseases: crucial players in induction and prevention of autoimmunity. Autoimmun Rev. 10 (1), 8-17 (2010).
  36. Rutella, S., Danese, S., Leone, G. Tolerogenic dendritic cells: cytokine modulation comes of age. Blood. 108 (5), 1435-1440 (2006).
  37. Wei, H. J., Pareek, T. K., Liu, Q., Letterio, J. J. A unique tolerizing dendritic cell phenotype induced by the synthetic triterpenoid CDDO-DFPA (RTA-408) is protective against EAE. Sci Rep. 7 (1), 9886 (2017).
  38. van Etten, E., Mathieu, C. Immunoregulation by 1,25-dihydroxyvitamin D3: basic concepts. J Steroid Biochem Mol Biol. 97 (1-2), 93-101 (2005).
  39. Pan, J., et al. Dexamethasone inhibits the antigen presentation of dendritic cells in MHC class II pathway. Immunol Lett. 76 (3), 153-161 (2001).
  40. Zhu, J., Paul, W. E. Heterogeneity and plasticity of T helper cells. Cell Res. 20 (1), 4-12 (2010).
  41. Spirig, R., et al. TLR2 and TLR4 agonists induce production of the vasoactive peptide endothelin-1 by human dendritic cells. Mol Immunol. 46 (15), 3178-3182 (2009).
  42. Walton, E. L. Make immunological peace not war: Potential applications of tolerogenic dendritic cells. Biomed J. 40 (2), 77-79 (2017).
  43. Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). Br J Pharmacol. 164 (4), 1079-1106 (2011).
  44. Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking. J Immunol. 179 (11), 7577-7584 (2007).
  45. Angelov, G. S., Tomkowiak, M., Marcais, A., Leverrier, Y., Marvel, J. Flt3 ligand-generated murine plasmacytoid and conventional dendritic cells differ in their capacity to prime naive CD8 T cells and to generate memory cells in vivo. J Immunol. 175 (1), 189-195 (2005).
  46. Lowes, M. A., et al. Increase in TNF-alpha and inducible nitric oxide synthase-expressing dendritic cells in psoriasis and reduction with efalizumab (anti-CD11a). Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (52), 19057-19062 (2005).
  47. Schnorrer, P., et al. The dominant role of CD8+ dendritic cells in cross-presentation is not dictated by antigen capture. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (28), 10729-10734 (2006).
  48. Wang, W., Li, J., Wu, K., Azhati, B., Rexiati, M. Culture and Identification of Mouse Bone Marrow-Derived Dendritic Cells and Their Capability to Induce T Lymphocyte Proliferation. Med Sci Monit. 22, 244-250 (2016).
  49. Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J Immunol Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
  50. Griffin, M. D., et al. Dendritic cell modulation by 1alpha,25 dihydroxyvitamin D3 and its analogs: a vitamin D receptor-dependent pathway that promotes a persistent state of immaturity in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (12), 6800-6805 (2001).
  51. Bscheider, M., Butcher, E. C. Vitamin D immunoregulation through dendritic cells. Immunology. 148 (3), 227-236 (2016).
  52. Castiello, L., et al. Monocyte-derived DC maturation strategies and related pathways: a transcriptional view. Cancer Immunol Immunother. 60 (4), 457-466 (2011).
  53. Decker, W. K., et al. Deficient T(H)-1 responses from TNF-alpha-matured and alpha-CD40-matured dendritic cells. J Immunother. 31 (2), 157-165 (2008).
  54. Longhi, M. P., et al. Dendritic cells require a systemic type I interferon response to mature and induce CD4+ Th1 immunity with poly IC as adjuvant. J Exp Med. 206 (7), 1589-1602 (2009).
  55. Link, H., Huang, Y. M., Xiao, B. G. Dendritic cells in experimental allergic encephalomyelitis and multiple sclerosis. J Neuroimmunol. 100 (1-2), 102-110 (1999).
  56. Leech, M. D., et al. Cutting edge: IL-6-dependent autoimmune disease: dendritic cells as a sufficient, but transient, source. J Immunol. 190 (3), 881-885 (2013).
  57. Saul, L., Besusso, D., Mellanby, R. J. LPS-matured CD11c+ bone marrow-derived dendritic cells can initiate autoimmune pathology with minimal injection site inflammation. Lab Anim. 51 (3), 292-300 (2017).
  58. Aghdami, N., Gharibdoost, F., Moazzeni, S. M. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) induced by antigen pulsed dendritic cells in the C57BL/6 mouse: influence of injection route. Exp Anim. 57 (1), 45-55 (2008).
  59. Wilson, H. L. Limitations with in vitro production of dendritic cells using cytokines. J Leukoc Biol. 75 (4), 600-603 (2004).
  60. Ni, K., O'Neill, H. C. Development of dendritic cells from GM-CSF-/- mice in vitro : GM-CSF enhances production and survival of cells. Dev Immunol. 8 (2), 133-146 (2001).

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Médecine question 135 tolérogène des cellules dendritiques (TolDCs) dérivé de la moelle osseuse des cellules dendritiques (BMDCs) encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE) immunodépression Cytokines auto-immunité
Développement et caractérisation fonctionnelle des cellules dendritiques tolérogène murin
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Wei, H. J., Letterio, J. J., Pareek, … More

Wei, H. J., Letterio, J. J., Pareek, T. K. Development and Functional Characterization of Murine Tolerogenic Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (135), e57637, doi:10.3791/57637 (2018).

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