Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zu entwickeln und tolerogene dendritischen Zellen (TolDCs) zu charakterisieren und deren immuntherapeutischen nutzen zu bewerten.
Abstract
Das Immunsystem arbeitet durch ein enge Verhältnis zwischen koordinierenden Antworten gegen fremde Antigene und Pflege einen nicht interaktiver Status gegen selbstantigenen sowie Antigene von Kommensalen Organismen abgeleitet. Die Störung dieser immun Homöostase kann zu chronischen Entzündungen und zur Entwicklung von Autoimmunität führen. Dendritische Zellen (DCs) sind die professionellen Antigen-präsentierenden Zellen des angeborenen Immunsystems beteiligt bei der Aktivierung von naiven T-Zellen um Immunantworten gegen fremde Antigene zu initiieren. DCs können jedoch auch in TolDCs unterschieden werden, die dienen zur Wahrung und Förderung der T-Zell Toleranz und Effektorzellen zur Entwicklung entweder Autoimmun- oder chronischen Entzündungen Bedingungen zu unterdrücken. Die jüngste Weiterentwicklung in unserem Verständnis des TolDCs legt nahe, dass DC Toleranz durch modulieren ihre Differenzierung Bedingungen erreicht werden kann. Dieses Phänomen führte zu enormen Wachstum in den Entwicklungsländern TolDC Therapien für zahlreiche Erkrankungen des Immunsystems verursacht durch Immuntoleranz zu brechen. Erfolgreiches Studium in präklinischen Autoimmunität murinen Modellen haben weiter die Immuntherapie Nützlichkeit des TolDCs bei der Behandlung von Autoimmun-Erkrankungen bestätigt. Heute haben TolDCs ein viel versprechendes Instrument der Immuntherapie in der Klinik für Wiederherstellung der Immuntoleranz in verschiedenen Erkrankungen des Immunsystems durch gezielte pathogene autoimmune Reaktionen, wobei schützende Immunität intakt bleiben. Obwohl eine Reihe von Strategien von mehreren Labs induzieren TolDCs vorgeschlagen wurde, gibt es keine Einheitlichkeit bei der Charakterisierung des zellulären und funktionale Phänotyps dieser Zellen. Dieses Protokoll enthält eine schrittweise Anleitung für die Entwicklung von Knochenmark stammenden DCs in großer Zahl, eine einzigartige Methode zur Unterscheidung in TolDCs mit einem synthetischen Triterpenoid 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic Säure-Difluoro-Propyl-Amid (CDDO-DFPA), und die Techniken verwendet, um deren Phänotyp, einschließlich Analyse der wesentlichen Molekulare Signaturen des TolDCs bestätigen. Zu guter Letzt zeigen wir eine Methode, um TolDC Funktion zu beurteilen, indem Sie testen ihre immunsuppressive Antwort in Vitro und in Vivo in einem präklinischen Modell der multiplen Sklerose.
Introduction
Dendritische Zellen (DCs) waren sind fester Bestandteil des angeborenen Immunsystems zuerst entdeckt und gekennzeichnet durch Ralph Steinman und Zanvil Cohn 1973 als primäre professionelle Antigen präsentierenden1 Zellen. DCs haben gezeigt, dass eine wichtige Rolle in Immunaktivierung spielen, verarbeitete Antigene an T-Zellen und B-Zellen über große Histocompatibility komplexe (MHC) in sekundären lymphatischen Organe verbinden die angeborenen und der adaptiven Immunsystem2präsentiert. In den Säugetieren Immunsystem gibt es mindestens zwei Kategorien von DCs die myeloische DCs und DCs (pDCs)3plasmazytoide beschrieben sind. Myeloische DCs, auch bekannt als konventionelle DCs (cDCs), zeichnen sich durch die Expression von CD11c und kann als unreif DCs (iDCs) in Vitro aus Vorläuferzellen des Knochenmarks oder peripherem Blut Monozyten mit unterschieden werden Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierende Faktor (GM-CSF) und IL-4 in murinen oder menschlichen Arten, bzw.4.
Aktivierung von "Gefahr" signalisiert, wie Pathogen-assoziierte molekulare Muster (PAMP) oder Schaden-assoziierte molekulare Muster (feucht), fahren iDCs Reifung in Richtung immunogen DCs als Reife DCs (mDCs) über verschiedene Muster Anerkennung Rezeptoren für verbindlich die DC Oberfläche5. Immunogen DCs weitere erstklassige naive T-Zell-Proliferation und Differenzierung durch Hochregulation der ARBEITSPLATZAUSSTATTUNG2, costimulatory Liganden (CD40, CD80 und CD86)6, Zytokine und andere lösliche Mittler-7. Eine Kaskade von Pro-inflammatorischen Mediator Produktion von immunogen DCs ist essentiell für Zytokin-vermittelte T-Zell-Differenzierung. IFN-γ und IL-12 sind notwendig für Th1 Differenzierung8 und IL-1, sind beispielsweise IL-6 und IL-23 für naive T-Zelle Polarisation Richtung Th17 Zellen9von entscheidender Bedeutung. Obwohl Reife DCs auf fremde Antigene reagieren, unkontrollierte DC-Aktivierung von selbstantigenen Toleranz Ablation verursachen und fördern die Entwicklung von Autoimmunerkrankungen durch die Generierung von autoreaktiven T-Zellen, deren Aktivierung zur Zerstörung des Gewebes10 führt .
Die jüngsten Berichte lieferten eindeutige Beweise für DC Plastizität, veranschaulicht durch ihre Fähigkeit zur Interaktion mit verschiedenen Queues innerhalb ihrer Mikroumgebung Gewebe und in verschiedenen Effektor/Suppressor DC Teilmengen zu unterscheiden. Die Anti-inflammatorische Mediatoren wie IL-10-11, TGF-β12und HO-113 haben gezeigt, eine wichtige Rolle bei Immunsuppression durch Induktion tolerogene DCs (TolDCs) zu spielen. Diese TolDCs regulatorische Funktionen erwerben und T-Zell-Proliferation-14zu unterdrücken. Darüber hinaus das Fehlen der Ko-Stimulation von DCs und die Produktion von Anti-inflammatorische Mediatoren aus TolDCs sowohl zur Induktion von regulatorischen T-Zellen (Tregs) beitragen und auch effektiv hemmen Th1 und Th17 Differenzierung und Erweiterung15. In vergangenen zwei Jahrzehnten wurde durch mehrere Untersucher das therapeutische Potenzial von TolDCs berichtet. In diesen Studien die Verwaltung der Ex-Vivo erzeugt nicht nur gelindert TolDCs pathologische Symptome in präklinischen Modellen von Autoimmunerkrankungen16 aber führte auch zur Entwicklung der Immuntoleranz bei Patienten17 ,18. Interessant ist, heute die TolDCs Therapie galt als alternative oder Zusatztherapie Ansatz für Autoimmunerkrankungen in mehreren klinischen Studien, einschließlich 1 Diabetes Mellitus19, rheumatoider Arthritis20, Typ 21, Multiple Sklerose (MS)22,23,24und Crohns Krankheit25.
Es gibt eine Vielzahl von Protokollen, die beschäftigt sind, TolDCs zu entwickeln und mehrere Labore haben Methoden zur Generierung und phänotypischen Charakterisierung des TolDCs berichtet. Diese Methoden können reproduzierbar TolDCs in Vitro aus hämatopoetischen Vorläuferzellen zu generieren und, sie in einem tolerogene Zustand in Vivo26,27,28,29stabil zu halten. Die iDCs kann durch die Einwirkung von verschiedenen immunmodulatorischen pharmakologische Wirkstoffe oder Anti-inflammatorische Zytokine TolDCs umgewandelt. Vitamin D3 ist beispielsweise eine bekannte pharmakologische Agenten bekannt erweitern Produktion von IL-10 und IL-12 Sekretion von DCs zu unterdrücken und damit ihre immunsuppressive Funktion30steigern. Darüber hinaus Wenn DCs starke entzündliche Reize wie Lipopolysacchariden (LPS), ausgesetzt sind mehrere pharmakologische Wirkstoffe wie Dexamethason31, Rapamycin32und Kortikosteroide33 haben gezeigt, dass induzieren die TolDC Phänotyp durch Verringerung der DC oberflächenexpression von CD40, CD80 und CD86 ARBEITSPLATZAUSSTATTUNG34. IL-10 und TGF-β sind die meisten studiert Anti-inflammatorische Zytokine, DC Toleranz35 und die gleichzeitige Exposition gegenüber beide dieser Zytokine induzieren nachweislich zu tolerogene Phänotyp in DCs36zu induzieren.
Seit der tolerogene DC von funktionellen Eigenschaften definiert ist, anstatt durch phenotypische Marker gibt es muss eine große eine einheitliche Methode zur zellulären und funktionelle Charakterisierung des TolDCs zu entwickeln. Darüber hinaus eine strenge und konsequente Protokoll muss für die einheitliche Bewertung und Charakterisierung von tolerogene DC-Phänotyp festgestellt werden, wenn wir effektiv und reproduzierbar die Möglichkeit neuer Wirkstoffe induzieren TolDC Phänotyp in vergleichen sollen die Labor. Hier bieten wir Ihnen ein detailliertes Protokoll mit schrittweisen Methoden iDCs von hämatopoetischen Vorläuferzellen von Mäusen isolieren und anschließend die Wirksamkeit neuer Wirkstoffe in der Bewertungsphase für ihre Fähigkeit zur TolDCs, iDCs umzuwandeln analysieren bietet eine robuste phänotypische und funktionelle Charakterisierung des TolDCs in Vitro und in Vivo. Diese Beschreibung umfasst eine aufwändige Methode zur Charakterisierung des TolDCs durch ihre Oberfläche Liganden, Cytokine Profil und immunsuppressive Funktionen in Vitro. Wir bieten auch ein Beispiel für eine Methode, um die mögliche therapeutische Anwendung dieser TolDCs in einem präklinischen Modell der MS, Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) zu erkunden. Dieses etablierte Protokoll hilft Ermittlern auszuwertende die Kapazität der neuen Agenten, die Induktion von TolDCs zu fördern und die Bemühungen um die Ausweitung der therapeutischen Entwicklung TolDC erleichtern.
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Protocol
Alle Studien wurden durchgeführt in Übereinstimmung mit den Verfahren, die von der Case Western Reserve University School of Medicine der institutionellen Animal Care und Use Committee genehmigt.
1. Vorbereiten des Knochenmarks-abgeleitete dendritischer Zellen (BMDCs)
- Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente durch Autoklavieren zu und führen Sie das Experiment in Klasse II biologischen Sicherheitsschrank mit entsprechenden Sicherheitsvorkehrungen.
- Einschläfern Sie C57BL/6 Mäusen 8-10 Wochen alt mit CO2 -Kammer. Platzieren Sie den Mauszeiger auf einen sezierenden Brett und spülen Sie mit 70 % Ethanol. Verbrauchsteuern Sie Tibia-Fibula und Femur-Knochen mit einer chirurgischen Schere und legen Sie sie mit 70 % Ethanol in der Kulturschale 10 cm.
- Chirurgische Messer und Zange verwenden, um Gewebe entfernt sezieren so weit wie möglich auf dem Deckel des 10 cm Kultur Gericht und Isolierung von Gebeinen und Oberschenkelknochen zu platzieren mit 70 % Ethanol in der Kulturschale 6 cm.
- Verwenden Sie chirurgische Sägeblätter, um beide Enden der Schienbeine und Oberschenkelknochen zu trimmen. Verwenden Sie 3 mL PBS in 3 ml Spritze mit einer Nadel 23G, um den Inhalt von Knochenmark von einem Ende der Knochen auf eine konische Rohr mit 12 ml PBS zu leeren. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 X für die beiden Enden der Knochen.
- Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 300 X g für 5 min.
- Entfernen Sie den überstand und Aufschwemmen der Zelle Pellet mit 1 ml ACK lysiereinrichtung Puffer für 5 Minuten, um rote Blutkörperchen zu entfernen.
- Fügen Sie 9 ml PBS verdünnen ACK lysiereinrichtung Puffer und Zentrifuge bei 300 X g für 5 Minuten.
- Den überstand zu entfernen und erneut mit 10 ml Kulturmedium (RPMI-1640 plus L-Glutamin, 10 % FBS, 1 % nicht-essentielle Aminosäure (100 X), 10 mM HEPES, 50 nM β-Mercaptoethanol und 5 % Penicillin/Streptomycin).
Hinweis: Endotoxin-Ebene muss weniger als 0,1 EU/ml in FBS. - Die Zellsuspension durch ein 40 μm Zelle Sieb passieren und nehmen 20 µl Zellsuspension und mischen mit 80 µl Trypan blau, um die Anzahl der lebenden Zellen mithilfe Cytometer.
- Passen Sie die Anzahl von Zellen, 1 x 106 Zellen/ml mit 15 ng/ml GM-CSF und 10 ng/ml IL-4.
- 3 ml 1 x 106 Zellen/ml in jede Vertiefung des 6-Well-Platte-Platte und die Zellen bei 37 ° C, 5 % CO2und 95 % Luftfeuchtigkeit in den CO2 Inkubator inkubieren.
Hinweis: Die Knochenmarkzellen von einer Maus ist um 3-5 x 107 Zellen, die darauf hinweist, dass es von 2 bis 3 6-Well-Platten platziert werden kann. - Am 3. Tag fügen Sie alle 3 ml Kulturmedium aus jedem Bohrloch entfernen 2 ml frische PBS in jede Vertiefung hinzu und dann schwenken Sie sanft die Platte, um sicherzustellen, entfernen alle nicht-anhaftende Zellen.
- 3 ml frisches Kulturmedium mit 15 ng/ml GM-CSF und 10 ng/ml IL-4 in jede Vertiefung zu ersetzen. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C, 5 % CO2und 95 % Luftfeuchtigkeit in den CO2 Inkubator.
- Am 5. Tag direkt hinzufügen einer anderen 3 ml frisches Kulturmedium mit 15 ng/ml GM-CSF und 10 ng/ml IL-4 in jede Vertiefung. Inkubieren Sie die Zellen bei 37° C, 5 % CO2, und 95 % Luftfeuchtigkeit im CO2 Inkubator.
Hinweis: Das Gesamtvolumen in jede Vertiefung ist jetzt 6 ml. - Am 7. Tag legte die gesamte Platte für 10 min auf Eis. Pipette vorsichtig das Kulturmedium in jede Vertiefung, die lose anhaftende BMDCs als iDCs in Suspension zu verdrängen.
Hinweis: Die anhaftenden Makrophagen sind noch an der Platte befestigt. Niedrige Temperatur und sanft Verfahren sind der Schlüssel zur Vermeidung von DC-Aktivierung um weitere Experimente zu beeinflussen. - Die Zellsuspension bei 300 X g für 5 Minuten zentrifugieren und Aufschwemmen mit frischem Nährmedium für weitere Experimente.
Hinweis: BMDCs durch Durchflusszytometrie mit Fluoreszenz-markierten CD11c Antikörper identifiziert werden können und wir haben unsere gating Strategie des BMDCs für weitere Experimente in Abbildung 1gezeigt.
(2) charakterisieren Sie TolDC gen und Protein-Profil
- Platte 2 ml 1 x 106 BMDCs/ml pro Bohrloch in 6 Well-Platte mit Kulturmedium in Anwesenheit oder Abwesenheit von 100-400 nM CDDO DFPA für die Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit im Inkubator CO2 1 h.
Hinweis: CDDO-DFPA, eine synthetische Triterpenoid ist ein nuklearer Faktor (2 erythroiden abgeleitet) - wie - 2 Faktor (Nrf2) Induktor und nuklearer Faktor κB (NF-κB)-Inhibitor. Gelten Sie andere Agenten für die Induktion von TolDCs von iDCs, wie IL-10, Vitamin D3, Dexamethason oder Bucht 11-7085, und ändern Sie diesen Schritt, um eine optimale Voraussetzung für jeden Agenten. - Fügen Sie 10 oder 100 ng/ml von LPS für die Inkubation 4-24 Std., induzieren mDCs (Inkubationszeit unterscheidet sich durch Messung von mRNA oder Protein).
- Sanft pipette das Kulturmedium in jede Vertiefung und ernten die Zellsuspension mit 1 ml-Pipette. Zentrifugieren Sie bei 300 X g für 5 Minuten, die Zellen und überstand, bzw. zu sammeln.
- Analysieren der Oberfläche Liganden aus der Zelle Pellets durch Durchflusszytometrie, wie stimulierende Liganden: CD40, CD80 und CD86, MHC-II, OX40L, ICOSL oder hemmenden Liganden: PD-L1, PD-L2, ILT3, ILT4.
- Isolierung der RNS aus der Zelle Pellets und analysieren die RNA und überstand Proben für die Cytokine Profil und gen und Protein Ebenen durch quantitative Echtzeit-PCR (qRT-PCR) und ELISA, beziehungsweise.
Hinweis: zum Beispiel, inflammatorische Zytokine: TNF-α, IFNγ, EDN-1, IL-6, IL-12 und IL-23 oder Anti-inflammatorische Zytokine: IL-4, IL-10, IL-15, TGF-β1 und HO-1.
3. Beurteilung die Funktion des TolDCs In Vitro und In Vivo
-
T-Zell-Phänomen Proliferation-Assay
- Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente durch Autoklavieren zu und führen Sie das Experiment in Klasse II biologischen Sicherheitsschrank mit entsprechenden Sicherheitsvorkehrungen.
- Bereiten Sie MACS-Puffer mit 0,5 % Rinderserumalbumin (BSA) und 2 mM EDTA in 500 ml PBS vor. Sterilisieren Sie den Puffer durch durch einen 0,2 µm-Filter filtern.
Hinweis: Halten Sie den Puffer auf dem Eis während das folgende Experiment. - CD4 zu+ T Zellen, einschläfern OT-II T-Zell-Rezeptor (TCR) Transgene Mäuse 8-10 Wochen alt mit CO2 -Kammer. Platzieren Sie den Mauszeiger auf einen sezierenden Brett und spülen Sie mit 70 % Ethanol. Isolieren der Milz von der linken Seite des Bauches mit chirurgische Scheren und Pinzetten.
- Legen Sie die Milz mit 2 ml PBS in einer Kulturschale 6 cm und mit der Rückseite der schiebestock 3 ml Spritze die Milz Zerkleinern, indem man ein Sieb 40 μm Zelle.
- Sammeln Sie die Zellsuspension und Zentrifuge bei 300 X g für 5 Minuten.
- Aufschwemmen der Zelle Pellet in 400 µl des MACS-Puffer.
- Fügen Sie 100 μl der CD4+ T-Zell-Biotin-Antikörper-Cocktail bei 4° C für 5 Minuten.
Hinweis: Der cocktail Antikörper bindet auf andere Zelltypen außer CD4+ T-Zellen, wie z. B. CD8a, CD11b, CD11c, CD19, CD25, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, Anti-MHC-Klasse II, Ter-119 und TCRγ/δ. - Fügen Sie 300 μl des MACS-Puffer und 200 μl des Anti-Biotin Perlen (Table of Materials) bei 4° C für 10 Minuten.
- Ort die Spalte aus der ferromagnetischen Sphären (Table of Materials) und Vorabscheidung Filter zusammen in dem magnetischen Feld und spülen Sie ihn mit 3 ml MACS-Puffer.
- Fügen Sie 9 ml MACS-Puffer in die Zellen und die Zentrifuge bei 300 X g für 5 Minuten.
- Aufschwemmen der Zelle Pellet in 3 ml MACS-Puffer und wenden Sie auf die Spalte. Sammeln Durchflussverfahren mit CD4+ T Zellen.
- Spalte mit einer anderen 3 ml MACS-Puffer waschen und auch die Durchströmung zu sammeln.
- Um Milz Pfanne DCs zu erhalten, einschläfern Sie C57BL/6 Mäusen mit CO2 Kammer ca. 8-10 Wochen alt. Platzieren Sie den Mauszeiger auf einen sezierenden Brett und spülen Sie mit 70 % Ethanol. Isolieren der Milz von der linken Seite des Bauches mit chirurgische Scheren und Pinzetten. Setzen die Milz in der 6cm Kulturschale mit 2 ml Kollagenase D-Lösung (2 mg/ml Kollagenase D aufgelöst in HBSS, enthält Kalzium, Magnesium).
- Spritzen Sie 1 ml der Kollagenase D Lösung zur Milz zwei Mal eine 1 ml Spritze mit einer Nadel 25G. Schneiden Sie die Milz mit einer kleinen Schere in kleine Stücke.
- Schütteln und Inkubation bei Raumtemperatur für 25 Minuten.
- Fügen Sie 500 µl 0,5 M EDTA bei Raumtemperatur für 5 Minuten.
Hinweis: Die Schritte von 3.1.13-3.1.14 sind entscheidend für die Erhöhung der Ausbeute von DCs. - Jetzt mithilfe der Rückseite der schiebestock 3 ml Spritze mince der Milz Brei durch ein Sieb 40 μm Zelle vorbei und sammeln die Zellsuspension durch Zentrifugieren bei 300 X g für 5 Minuten.
- Aufschwemmen der Zelle Pellet in 350 μl des MACS-Puffer, 50 μl der FcR Blocking Reagenz und 100 μl des Pan Dendritische Zelle Biotin-Antikörper Cocktail bei 4° C für 10 Minuten.
Hinweis: Der Antikörper gegen Antigene, die nicht von DCs ausgedrückt sind cocktail. - Waschen Sie die Zellen, indem 9 ml MACS-Puffer und Zentrifuge auf 300 X g für 5 Minuten.
- Aufschwemmen der Zelle Pellet in 800 µl des MACS-Puffer und fügen Sie 200 μl des Anti-Biotin Perlen bei 4 ° C für 10 Minuten.
- Wiederholen Sie die Schritte aus 3.1.9-3.1.11 DCs zu sammeln.
- Spalte mit einer anderen 3 ml MACS-Puffer zwei Mal waschen und auch die Durchströmung sammeln.
- 2 x 105 DCs/ml mit 1 μM CFSE bei 37 ° C für 15 Minuten in das Vorhandensein oder Fehlen von 100-400 nM CDDO DFPA bei 37 ° C für 1 Stunde separat, Beschriftung der CD4+ -T-Zellen (1 x 107/ml) zu behandeln, Waschen mit PBS , und passen Sie die Lautstärke um Endkonzentration bei 2 x 106 T Zellen/ml zu erhalten.
- Als nächstes in eine 96-Well-Platte Co Kultur 100 μl der behandelten dendritischen Zellen mit dem gleichen Volumen des CFSE--mit der Bezeichnung CD4+ T-Zellen, beide gesammelt aus den oben genannten Schritte, um 01:10 Verhältnis. Fügen Sie jetzt 100 ng/mL Ovalbumin (OVA) Peptid 323-329 pro Brunnen und messen die Intensität der CFSE-der T-Zellen durch Durchflusszytometrie nach 2-3 Tagen Inkubationszeit.
Hinweis: Die Zellzahlen und das Verhältnis von DCs und T Zellen aus unserer bisherigen Arbeit37optimiert worden.
-
Induzieren passiv EAE durch die Injektion von BMDCs gepulst mit Myelin Oligodendrozyt Glykoprotein (MOG) (35-55)
- Platte 2 ml 1 x 106 BMDCs/ml pro Bohrloch in 6 Well-Platte mit Kulturmedium in das Vorhandensein oder Fehlen von 100-400 nM CDDO DFPA für die Inkubation von 1 Stunde.
- Fügen Sie 10 ng/ml von LPS für Inkubation 24 hrs.
- Hinzufügen von 100 μg/ml MOG (35-55) für die Inkubation 4 Stunden.
- Ernte der Zellsuspension und Zentrifuge bei 300 X g für 5 Minuten.
- Aufschwemmen der Zelle Pellet mit PBS und die Zellen zu zählen.
- Subkutan Spritzen Sie 200 μl der 2 x 106 Zellen auf ca. 8-10 Wochen alten weiblichen C57BL/6 Mäusen (100 μl in jedem Hinterbein).
- Am Tag der Injektion BMDC und 48 Stunden. später, injizieren 200 ng Pertussis-Toxin (PTX) in jeder Maus.
- Wiederholen Sie Schritte 3.2.6-3.2.7 einmal pro Woche für 4 Wochen.
- Die klinischen Symptome der EAE täglich mithilfe von Standardkriterien37 (0,5-hinken Endstück, 1-hinken Rute, 2-mäßig Hind Gliedmaßen Schwäche, 3 schwere Hind Gliedmaßen Schwäche, 4 komplette Hind Extremität Lähmung, 5-Tetraplegie oder sterbenden Zustand, 6-Tod) zu bewerten.
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Representative Results
Die Differenzierung und die Auswahl von BMDCs:
Vorläuferzellen des Knochenmarks wurden komplette RPMI Medium im Beisein von GM-CSF und IL-4 in iDCs für 7 Tage (Abbildung 1A) differenzieren kultiviert. Am 1. Tag Zellen waren klein und zeigte sphärische Morphologie. Waschen mit PBS, bevor die Ersetzung der frisches Medium am Tag3 Zellen zur Form Cluster beigetragen und auch die Einwohnerzahl von CD11c stieg+ Zellen. Am 4. Tag BMDCs wurden in der Größe vergrößert und Clusterbildung eingeleitet. Eingehalten Makrophagen waren auch konvertiert und an der Unterseite der Platte mit einer länglichen Form beobachtet. Am 5. Tag werden große große Cluster von BMDCs gebildet. Am 6. Tag wurden eine große Anzahl von semi-Anhänger und schwimmenden BMDCs auch beobachtet. BMDCs wurden am 7. Tag geerntet und von Durchflusszytometrie für CD11c Ausdruck als spezifische Marker der murinen DCs analysiert. Wie eine repräsentative Flow Cytometry Grundstück in Abbildung 1 bzeigt, wurden ca. 83,6 % der BMDCs mit dem Ausdruck CD11c durch diese Methode erhalten.
Induktion und genetische Charakterisierung des TolDCs:
Einige der Agenten bekannt induzieren TolDCs, wie z. B. Vitamin D338 und Dexamethason39, bekannt, um Down-regulieren die Expression von DC Oberfläche Liganden, einschließlich MHC-II und costimulatory Moleküle, CD40, CD80 und CD86. Im Gegensatz dazu im Rahmen entweder LPs oder CD40L-induzierte Reifung der DCs zeigte Calcineurin-Hemmern Cyclosporin A und FK506 keinen Einfluss auf die Expression von MHC-II, CD83, CD80 und CD8633. Wie Flow-zytometrie-Analyse zeigt, hatte die Induktion von TolDC von CDDO DFPA keinen signifikanten Effekt auf die Oberfläche Liganden LPS-induzierte Expression von DCs, einschließlich CD80, CD86, MHC-II, PD-L1 und CD40. (Abbildung 2).
Darüber hinaus die vergleichende Transkriptom und Zytokin-Analyse der BMDCs behandelt mit oder ohne CDDO-DFPA in Anwesenheit oder Abwesenheit von LPS dargestellt moduliert entzündliche gen Profil. CDDO-DFPA Behandlung deutlich reduziert LPS induzierte Pro-inflammatorische Zytokin-Gene wie IFN-γ, IL-12, EDN1, TNF, IL-6 und IL-23 (Abbildung 3A-3F). Diese sind für Th1 Zytokine bekannt (IFN-γ und IL-12) und Th17 (IL-6 und IL-23) Zell-Differenzierung. Darüber hinaus behandelt CDDO DFPA BMDCs zeigte verstärkte Expression von Genen der Anti-inflammatorische Zytokine wie IL-4, IL-10 und TGF-β HO-1 (Abbildung 4A-4D). Diese entzündungshemmende Gene sind Autoimmunität Modulator bekannt, durch die Förderung von Th2 (IL-4) und Treg (IL-10 und TGF-β)-Zell-Differenzierung. 40 hier ist es wichtig zu beachten, dass die unverwechselbare IL-12−; IL-10+ Cytokine Produktion36, die Induktion von HO-1 Ausdruck13und die Hemmung der EDN-141 induziert durch CDDO DFPA Behandlung, sind alle bekannte zu tolerogene Funktion DCs zu authentifizieren.
Zelluläre und funktionelle Charakterisierung des TolDCs in vitro
DC-vermittelten T-Zell-Proliferation ist bekannt durch das Engagement der costimulatory Oberfläche Liganden sowie die Sekretion von Zytokinen und löslichen Mediatoren7ausgelöst werden. Allerdings hemmen TolDCs T-Zell-Reaktionen durch verschiedene Mechanismen: durch Induktion von T-Zell-Anergie, indem die Streichung von autoreaktiven Zellen aktiv zu fördern und die Polarisation des naiven T-Zellen auf Tregs42. Wir haben bereits berichtet, dass die funktionelle Charakterisierung von CDDO DFPA TolDCs37induziert. T-Zell-Anergie und Löschung von autoreaktiven T-Zellen können unabhängig voneinander analysiert werden, indem oberflächenmarker oder Annexin V/7-AAD Färbung. Allerdings haben wir indirekt bestätigt diesen Phänotyp durch Messung der T-Zell-Proliferation-Index. Dafür wir Transgene Mäuse C57BL/6 OTII T-Zellen genutzt und sie Phänomen DCs C57BL/6 Mäusen entnommen und behandelt mit oder ohne CDDO-DFPA ausgesetzt. Diese DCs wurden gewaschen und Co mit CFSE gebeizt T-Zellen mit OVA Peptid kultiviert. Wir beobachteten einen erheblichen Rückgang der T-Zell-Proliferation von CDDO DFPA vorbehandelt DCs, was auf ihre tolerogene Phänotyp (Abbildung 5).
In vivo funktionelle Charakterisierung des TolDCs in einem präklinischen Modell von Autoimmunität
Schließlich kann die Funktionalität der DFPA-induzierte TolDCs in einer Reihe von präklinischen in Vivo Modellen gekennzeichnet Autoimmun- oder entzündlichen Funktionen getestet werden. Da EAE ist eine weithin akzeptierte präklinischen Mausmodell der klinischen immunvermittelte ZNS Erkrankung, MS43, wir dies in unserer aktuellen Studie genutzt. Um weiter zu prüfen, die in Vivo Funktionalität des CDDO DFPA induziert TolDCs, wir sie in einer präklinischen Mausmodell der passiven EAE herausgefordert. Dazu wurden BMDCs mit oder ohne CDDO-DFPA in Anwesenheit von LPS und MOG (35-55) kultiviert. Diese Zellen wurden wiederholt als geplante Protokoll dargestellt in Abbildung 6A eingespritzt und Mäuse wurden routinemäßig für die Manifestation der klinischen Symptome beobachtet. Wie erwartet, gepulst LPS und MOG (35-55) BMDCs zeigten klinische Symptome der EAE, jedoch; CDDO-DFPA grundiert BMDCs behandelt Gruppe zeigte verzögert auftretende Erkrankung mit deutlich reduziertem klinischen Symptomen (Abb. 6 b). Diese Ergebnisse bestätigen die immunsuppressiven Phänotyp des TolDCs induziert durch CDDO DFPA Behandlung.
Abbildung 1: Entwicklung und phänotypische Charakterisierung von BMDCs: (A) Knochenmarkzellen wurden von Tibia und Femur-Knochen von C57BL/6 Mäusen ausgespült und weiter differenziert, BMDCs. Eine entsprechende Zelle Clusterbildung wurde von Lichtmikroskopie während der gesamten Dauer der Differenzierung (Maßstabsbalken, 100µm) verfolgt. (B) die BMDCs Differenzierung wurde durch die CD11c oberflächenexpression bestätigt, wie durch FACS analysiert. Grafiken zeigen den Anteil der erweiterten CD11c+ Zelle Bevölkerung. (C) Herbeirufung Strategie der Zellen BMDCs. waren zunächst gated, um Schutt (FSC vs. SSC) auszuschließen. Ein Wams-Ausschluss-Gate wurde eingesetzt, um auf Unterhemden Zellen (FL2-W vs. FL2-A) Tor. Innerhalb der Singulett-Zellen wurden lebende Zellen auf 7-AAD Grundstück (7-AAD vs. FSC) bewachte. Die Zellen wurden dann weiter analysiert und gated CD11c Ausdruck. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: DC Zelle Oberfläche Liganden Ausdruck ist unverändert von CDDO DFPA. Zellen wurden in entweder das Vorhandensein oder Fehlen von CDDO DFPA vorbehandelt (200 nM) für 1 Stunde vor der Stimulation mit LPS (100 ng/ml) für 24 Stunden. Zelle oberflächenexpression von CD80, CD86, MHC-II, PD-L1 und CD40 wurde Durchflusszytometrie analysiert. Diese Zahl verändert wurde, vom Wissenschaftlichen Berichte 7, Artikel-Nr.: 9886 (2017), Doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. Urheberrechtliche Genehmigung reproduziert und mit neu veröffentlicht. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: CDDO-DFPA verändert die genetischen und Protein Phänotyp der Immunogenen DCs. BMDCs wurden in der Anwesenheit oder Abwesenheit von CDDO-DFPA (50-400 nM) für 1 Stunde vor der Zugabe von LPS vorbehandelt (100 ng/ml), und entweder für RNA-Extraktion (4 geerntet HRS.) oder durfte Zustand Kulturmedium für 24 Stunden. vor der Entnahme für Zytokin-Analysen. Die Werte von IL-12 (B), TNF (D), IL-6 (E) und IL-23 (F) wurden durch qRT-PCR und ELISA gemessen. Während das Niveau der IFN-γ (A) durch qRT-PCR und EDN-1 (C) von ELISA allein gemessen wurde. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± S.D. von drei Experimenten ausgedrückt. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001 im Vergleich mit den LPS behandelten Gruppen. Ungepaarte Student t-Test. Diese Zahl verändert wurde, vom Wissenschaftlichen Berichte 7, Artikel-Nr.: 9886 (2017), Doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. Reproduziert und neu aufgelegt mit urheberrechtliche Genehmigung." Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: CDDO-DFPA induzierte TolDCs Phänotyp durch Gene und Proteine Ausdruck bestätigt. BMDCs wurden in das Vorhandensein oder Fehlen des CDDO-DFPA (10-400 nM) vorbehandelt für 1 Stunde vor der Zugabe von LPS (100 ng/ml) und Zellen geerntet wurden, für die RNA-Extraktion nach 24 Stunden. Die IL-4 (A), IL-10 (B) und TGF-β (C) wurden durch qRT-PCR gemessen. (D) Cell Protein Lysates wurden gesammelt, um 12 Uhr. für Analysen und die Ebenen der HO-1 und β-Aktin war Ausdruck von Western blotting bestimmt. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± S.D. von drei Experimenten ausgedrückt. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001 im Vergleich mit den LPS behandelten Gruppen. Ungepaarte Student t-Test. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: CDDO-DFPA ausgesetzt DCs unterdrücken T-Zell-Proliferation. DCs waren nur 1 Stunde mit CDDO-DFPA (100-400 nM) vorbehandelt, dann gewaschen und Co mit kultivierten CFSE gebeizt T-Zellen bei einer 01:10 Verhältnis. (A) Milz T-Zellen und DCs waren von transgenen Mäusen C57BL/6 OTII und C57BL/6 Mäusen isoliert. CDDO-DFPA vorbehandelte DCs wurden Co kultiviert mit CFSE gefärbt (w /) T-Zellen mit oder ohne (OVA Ergänzung während der Inkubation w/o). T-Zell-Proliferation wurde am 2. Tag durch Durchflusszytometrie bestimmt. Grafiken zeigen den Anteil der Division T-Zellen im Vergleich zu zahlen T Zellteilung. Die Daten sind eine Darstellung von 3 unabhängigen Experimenten. Diese Zahl verändert wurde, vom Wissenschaftlichen Berichte 7, Artikel-Nr.: 9886 (2017), Doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. Urheberrechtliche Genehmigung reproduziert und mit neu veröffentlicht. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6: MOG grundiert DC-induzierte Passive EAE ist durch TolDCs geabschafft. (A) EAE Induktion von MOG (35-55)-gepulste BMDCs. Reife BMDCs wurden in das Vorhandensein oder Fehlen von CDDO DFPA behandelt (400 nM) und anschließend gepulst mit MOG (35-55) für 4 Stunden. Insgesamt 200 μl der 2 × 106 Zellen wurde durch subkutane Injektion in die Flanke Region von C57BL/6 Mäusen einmal wöchentlich für insgesamt vier Injektionen verabreicht. Jedes Mal war PTX durch i.p. Injektion sofort und wieder 2 Tage später (Tag 0 4. Zyklus) verabreicht. (B) Klinische Resultate wurden aufgezeichnete immerhin vier Injektionen, nach einheitlichen Kriterien. Alle Daten wurden als Mittelwert ± S.E.M präsentiert * P < 0,05. Mehrere t-Tests mit Holm-Sidak Analyse (n = 7 Mäuse in jeder Gruppe). Diese Zahl verändert wurde, vom Wissenschaftlichen Berichte 7, Artikel-Nr.: 9886 (2017), Doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. Urheberrechtliche Genehmigung reproduziert und mit neu veröffentlicht. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Dieses Paper beschreibt ein effizientes Protokoll, das die reproduzierbar iDCs generieren und anschließend Unterscheidung in TolDCs verwendet werden kann, und wir schlagen vor, dies angewendet werden, kann um die Kapazität der neuen molekularen Ziel Agenten induzieren die TolDC bewerten Phänotyp. Wie in diesem Bericht beschrieben, folgten wir eine Sequenz, in der ersten TolDC Ausdruck der Oberfläche Liganden durch Durchflusszytometrie, gefolgt von einer Bewertung der DC Cytokine Profil qRT-PCR und ELISA gemessen analysiert. Schließlich wurde die immunregulatorische Funktion des TolDCs bestätigt, durch den Nachweis ihrer Fähigkeit, T Cell Proliferation in Vitro und ihre Wirksamkeit in vivo mit der präklinischen EAE-Mausmodell der MS Autoimmunität zu unterdrücken zu reduzieren.
In unserem Protokoll wurden iDCs generiert und differenziert aus murinen Knochenmark Vorstufen mit der Kombination von GM-CSF und IL-4. Andere Protokolle sind Formen wie Tyrosin-Kinase 3 Liganden (Flt3L) in das Kulturmedium verwendet, um iDCs44zu generieren. Obwohl der Einsatz von Flt3L die Ausbeute des iDCs erhöht, diese iDCs in der Regel 2 weitere Tage dauern (9 Tage) zu ernten, im Vergleich zu GM-CSF/IL-4 Zusatz (7 Tage)44. Noch wichtiger ist, iDC, die oft aus Flt3L generiert differenzieren in beiden cDCs (CD8– und CD8+) und pDCs45 , die funktional und phänotypisch stationären DCs in-vivo-äquivalente. GM-CSF/IL-4 induziert jedoch ausnahmslos die Differenzierung der iDC in Richtung cDCs (CD8–) nur44 und während der Reifung, demonstriert sie ähnliche Zeichen von entzündlichen DCs46. Es ist bemerkenswert, zu wissen, dass GM-CSF/IL-4 wegen der Vorteil des DCs von Monozyten oder CD34 unterscheiden häufig in klinischen Studien und die Grundlagenforschung verwendet wird+ Stammväter44. Es hat sich gezeigt, dass iDCs generiert aus diesen beiden Methoden morphologisch unterschiedliche Zellen produzieren, die auch andere Zelle oberflächenmarker besitzen und weisen unterschiedliche Cytokine profile bei ihrer Aktivierung. Darüber hinaus variieren TolDCs induziert durch diese Methoden in ihrer Fähigkeit, in Reaktion auf chemotaktische Faktoren zu migrieren und Antigen-spezifischen T-Zell-Antworten44,45zu induzieren. Wir verstehen, dass CD8+ DCs mehr Potenzial in TolDC Induktion durch ihre einzigartige Fähigkeit der querlaufende47aufweisen kann. Jedoch ist es dann notwendig, weitere Zelle Sortierung von BMDCs durch Flt3L zu untersuchen, die spezifische CD8 abgeleitet+ DC Teilmenge. Darüber hinaus da GM-CSF/IL-4 induziert BMDCs bei T-Zell-Stimulation und die Produktion von Entzündungsmediatoren nach LPS Behandlung44,45überlegen sind, fanden wir diese Strategie gab mehr reproduzierbare Ergebnisse unserer Experimente.
BMDCs abgeleitet von GM-CSF/IL-4 Anfang CD11c um 4.Tag zum Ausdruck zu bringen und den Ausdruck nach Tag 648bereichern. Diese Kultur-Prozedur kann aufrechterhalten werden, bis Tag 10-12 mit einer niedrigeren Beschichtung Dichte von Knochenmarkzellen und eine niedrige von GMC-SF am Tag 8-1049 Dosis. In diesem Protokoll wurden CDDO-DFPA (synthetische Triterpenoid) und LPS im Tandem als Agenten bzw. induzieren DC Toleranz und Reifung, hinzugefügt. Wir berichteten kürzlich, dass iDCs geerntet aus Kulturen, die unter Verwendung dieser Methode der BMDC Generation einen funktionalen TolDC Phänotyp weisen bei mit CDDO DFPA37vorbehandelt. Es ist bemerkenswert, dass CDDO-DFPA, die nur hinzugefügt wurde Kulturen nach iDC ernten (Tag 7)37, im Gegensatz zu Mitteln wie Vitamin D3 die Kulturen muss mehrere Male während iDC Differenzierung (Tag 2, 4, 6)50hinzugefügt werden. Darüber hinaus kann diese Induktion des TolDCs durch Vitamin D3 diverse Mechanismen hängt, die sowohl während als auch nach iDC Differenzierung51initiiert werden muss. Unsere Daten zeigen, dass hinzufügen CDDO DFPA während iDC Differenzierung keinen Einfluss auf die Reinheit des CD11c + DCs hatte aber Dosis-Abhängigkeit zu die Ausbeute des iDCs am 7. Tag (Daten nicht gezeigt senken). Unsere Analysen schlagen auch vor, dass die höhere Konzentration des CDDO-DFPA in diesen Experimenten verwendeten Vorläuferzellen des Knochenmarks, giftig sein kann, obwohl iDC normale Rentabilität mit dieser Konzentration von CDDO DFPA37zeigte. Es wird erwartet, dass TolDC Induktion durch sorgfältige Analysen der Auswirkungen des zeitlichen Verlaufs und Dauer der Exposition gegenüber Stoffen wie CDDO DFPA optimiert werden kann.
Es ist wichtig zu überlegen, die alternative Methoden und Mechanismen, die durch die von anderen als LPS, wie CD40L, TNF-α und IFN-γ52iDCs zu mDCs induziert werden kann. DC-Reifung von LPS durch Toll-Like-Rezeptoren 4(TLR4) führt die Aktivierung der verschiedenen Transkriptionsfaktoren, einschließlich nuklearer Faktor κB (NF-κB), p38 Mitogen-activated Proteinkinase (p38 MAPK), c-Jun N-Terminal Kinase (JNK) und extrazellulären Signal-regulierte Proteinkinase (ERK1/2). Die Reifung der DCs durch CD40L und TNF-α durch CD40 und TNF-Rezeptoren induziert bzw. der NF-κB-Signalweg. Im Gegensatz dazu IFN-γ regt einen anderen Weg einschließlich der Aktivierung von Janus-Kinase (JAK), Tyrosin-Kinase (TYK), und die Signalwandler und Aktivator der Transkription Proteine (Statistik), und diese nachgelagerte Effekte werden auch durch Aktivierung ergänzt die NF-κB-Signalweg52. Darüber hinaus während des genexpressionsprofils CD40L/TNF-α-basierte DC Reifung legt nahe, dass diese DCs T-Zellen in Richtung einer Th2-Zelle Antwort53 polarisieren, DC Reifung von IFN-γ ist stark in Richtung einer Th1-Zelle Antwort54voreingenommen. Daher sind diese Induktoren der DC Reifung verbunden mit Differenzierung gegenüber bestimmten T Zelle Teilmengen nicht in diesem Protokoll eingesetzt.
Mehrere Berichte haben gezeigt, dass ex-Vivo-differenzierte DCs sind in der Lage, das gesamte Spektrum der EAE klinische Symptome und Pathologie in Mäusen55induzieren. Die Methode des passiven EAE-Induktion durch Ex Vivo aktiviert DCs wurde mit verschiedenen Modifikationen von verschiedenen Labors übernommen. Die Kombination von passiven und aktiven EAE-Induktion durch Gabe von MOG grundiert BMDCs, 7 Tage vor der Impfung mit MOG und komplette Freund des Adjuvans (CFA) führt zu höheren klinischen Symptom Partituren (peak klinische Bewertung: 3,5) im Vergleich zu passiven EAE Induktion durch die Gabe von MOG grundiert BMDCs allein (peak klinischen Ergebnis: 2)56. Ergebnisse mit dieser Methode kombiniert MOG grundiert BMDCs mit MOG Immunisierung deutet darauf hin, dass Krankheitsbeginn geschieht am Tag 9 nach der Immunisierung mit MOG und CFA56. Jedoch da es bekannt ist, dass CFA erhebliche Entzündungen am Ort der Verwaltung57führt, haben wir passive EAE Induktion durch Gabe von DCs allein in unserem Protokoll genutzt, um effektiv die Wirkung des TolDCs während EAE analysieren. Um die funktionale Phänotyp des TolDCs weiter zu bestätigen, sollte man auch erproben klinische Symptome einer aktiven EAE Mäusen zu unterdrücken. Die Verwaltung-Route der DCs ist auch entscheidend für die Induktion von EAE Symptome58. Wie von unserem Labor und von anderen berichtet, subkutane Injektion von BMDCs in die Flanke Region von C57BL/6 Mäusen einmal wöchentlich für insgesamt ca. 3-4 Injektionen induziert eine Spitze klinische Bewertung von EAE rund um 2-2,5 mit reproduzierbaren Krankheitsbeginn auf Tag 11-1237 ,58. Wir stellten einen kurzen Clip demonstrieren die verschiedenen klinischen Symptome zwischen aktiven und passiven EAE Induktion (Video 1).
Die anerkannten Grenzen unseres Protokolls sind der Zeitaufwand durch die angewandten Methoden und die Abhängigkeit von einem nicht physiologisch relevanten Mikroumgebung für BMDC Differenzierung. Allerdings leidet während der Antikörper Spalte Trennmethoden Kollektion für DCs bereichert und T-Zellen aus murinen Milz können effizienter sein, eine geringe Ausbeute an die gewünschte DC Bevölkerung. So ergibt sich der Vorteil der Methode der Knochenmark-abgeleitete DC Entwicklung Log Skala höher DC Bevölkerung im Vergleich zu Antikörper Spalte Trennung aus der ganzen Milz. Wie bereits erwähnt, die DCs generiert erfordert in Vitro durch diese Methode eine hohe Konzentration von Zytokin-Supplementierung ist nicht physiologisch relevanten DCs in Vivo Mikroumgebung59 und auch garantiert nicht die langfristige Nachhaltigkeit von DC. Die GM-CSF in unserem Protokoll verwendet ist auch keine wesentliche Zytokin für normale DC Differenzierung in Vivo60. Dennoch, das vorgeschlagene BMDC Generation Protokoll reproduzierbar ergibt einen hohen Anteil an funktionell TolDCs und sollte als eine sehr zuverlässige und reproduzierbare Methode zur Erzeugung von funktionellen DCs mit tolerogene Eigenschaften angesehen werden.
Zusammenfassend kann die TolDCs aus dem hier beschriebenen Protokoll generiert effektiv durch die Bewertung ihrer Gene und Proteine expressionsprofile, durch die Bestimmung ihrer Fähigkeit zur T-Zell-abhängigen immune Antworten in Vitrozu modulieren und durch charakterisiert werden bewerten ihre Funktion als eine Adoptiv Zelltherapie, EAE Induktion in Vivozu unterdrücken. Unser Protokoll bietet einen Rahmen für die Bewertung der neuen Agenten gedacht, um die Kapazität haben induzieren TolDCs und weiteren therapeutischen Entwicklungsprozesses für TolDCs von Bank in Klinik zu beschleunigen.
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Disclosures
Keine
Acknowledgments
Wir danken für die Bereitstellung von CDDO DFPA Reata Pharma. Wir anerkennen auch die Unterstützung von Jane und Lee Seidman Lehrstuhl für Pädiatrie Krebs Innovation (John Letterio). Diese Arbeit wurde unterstützt vom Verteidigungsministerium [W81XWH-12-1-0452]; die Angie Fowler Jugendlichen und jungen Erwachsenen Krebs Forschungsinitiative an dem Fall Comprehensive Cancer Center; und dem Callahan Absolvent Scholar Award for Hsi-Ju Wei von f.j. Callahan-Stiftung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CDDO-DFPA (RTA-408) | Reata Pharmaceuticals | in house synthesis | Cell culture |
| Mouse GM-CSF | Peprotech Inc. | 315-03 | BMDC differentiation |
| Mouse IL-4 | Peprotech Inc. | 214-14 | BMDC differentiation |
| Lipopolysaccharides (LPS) | Sigma Aldrich Inc. | L2880 | Cell culture |
| β-mercaptoethanol | Sigma Aldrich Inc. | 516732 | Cell culture |
| Pertussis toxin (PTX) | R&D systems | 3097 | EAE induction |
| MOG (35–55) peptide | 21stCentury Biochemicals | in house synthesis | EAE induction |
| Trypan blue | Gibco, Life Technologies | 15250-061 | Cell culture |
| RPMI-1640 plus L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 11875-093 | Cell culture |
| Non-essential amino acid (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | Cell culture |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630080 | Cell culture |
| penicillin/streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140122 | Cell culture |
| 40 μm cell strainer | Corning | 352340 | Cell isolation |
| PE-conjugated CD80 | BD Biosciences | 557227 | Flow cytometry |
| PE-conjugated CD86 | BD Biosciences | 555665 | Flow cytometry |
| PE-conjugated PD-L1 | BioLegend | 124307 | Flow cytometry |
| APC-conjugated MHCII | Miltenyi Biotec Inc. | 130-112-388 | Flow cytometry |
| APC-conjugated CD11c | BD Biosciences | 340544 | Flow cytometry |
| Isotype matched PE | Miltenyi Biotec Inc. | 130-091-835 | Flow cytometry |
| Isotype matched APC | Miltenyi Biotec Inc. | 130-091-836 | Flow cytometry |
| CFSE | BioLegend | 423801 | T cell proliferation assay |
| Pan dendritic cell isolation kit | Miltenyi Biotec Inc. | 130-100-875 | T cell proliferation assay |
| FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotec Inc. | 130-100-875 | T cell proliferation assay |
| Pan Dendritic Cell Biotin-Antibody Cocktail | Miltenyi Biotec Inc. | 130-100-875 | T cell proliferation assay |
| Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec Inc. | 130-100-875 | T cell proliferation assay |
| CD4+ T cell isolation kit | Miltenyi Biotec Inc. | 130-104-454 | T cell proliferation assay |
| CD4+ T cell Biotin-Antibody Cocktail | Miltenyi Biotec Inc. | 130-104-454 | T cell proliferation assay |
| Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec Inc. | 130-104-454 | T cell proliferation assay |
| ACK lysing buffer | ThermoFisher Scientific | A1049201 | BMDC differentiation |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309626 | T cell proliferation assay |
| 3 ml syringe | BD Biosciences | 309588 | BMDC differentiation |
| 25G needle | BD Biosciences | 309626 | T cell proliferation assay |
| 23G needle | BD Biosciences | 309588 | BMDC differentiation |
| BSA | Sigma Aldrich Inc. | A2058 | T cell proliferation assay |
| EDTA | ThermoFisher Scientific | 15575020 | T cell proliferation assay |
| LS Column | Miltenyi Biotec Inc. | 130-042-401 | T cell proliferation assay |
| Pre-Separation Filter | Miltenyi Biotec Inc. | 130-095-823 | T cell proliferation assay |
| collagenase D | Sigma Aldrich Inc. | 11088858001 | T cell proliferation assay |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14025076 | T cell proliferation assay |
| ovalbumin (OVA) peptide 323–329 | Sigma Aldrich Inc. | O1641 | T cell proliferation assay |
| Mouse IFN-γ TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm01168134_m1 | qRT-PCR |
| Mouse IL-12a TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm00434165 | qRT-PCR |
| Mouse IL-12 p70 DuoSet ELISA | R&D systems | DY419-05 | ELISA |
| Mouse EDN-1 ELISA | RayBiotech | ELM-EDN1-1 | ELISA |
| TNF-α TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm00443258 | qRT-PCR |
| Mouse TNF-α Quantikine ELISA Kit | R&D systems | MTA00B | ELISA |
| IL-6 TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm00446190 | qRT-PCR |
| Mouse IL-6 Quantikine ELISA Kit | R&D systems | M6000B | ELISA |
| IL-23a TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm01160011 | qRT-PCR |
| Mouse IL-23 DuoSet ELISA | R&D systems | DY1887-05 | ELISA |
| IL-4 TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm99999154_m1 | qRT-PCR |
| IL-10 TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm01288386_m1 | qRT-PCR |
| TGF-β TaqMan probe | ThermoFisher Scientific | Mm01178820_m1 | qRT-PCR |
| Anti-Heme Oxygenase 1 antibody | Abcam | ab13248 | Western blotting |
| Anti-β-actin antibody | Abcam | ab8226 | Western blotting |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad Inc. | qRT-PCR | |
| BD FACSCalibur Cell Analyzer | BD Biosciences | Flow cytometry |
References
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