Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Ontwikkeling en functionele karakterisering van lymfkliertest Tolerogenic dendritische cellen

Published: May 18, 2018 doi: 10.3791/57637

Summary

Hier presenteren we een protocol te ontwikkelen en karakteriseren van tolerogenic dendritische cellen (TolDCs) en evalueren van hun immunotherapeutische nut.

Abstract

Het immuunsysteem werkt door een strakke evenwicht tussen coördinerende reacties tegen buitenlandse antigenen en handhaven van een niet-reagerende staat tegen zelf-antigenen en antigenen afkomstig van commensale organismen. De verstoring van deze immuun homeostase kan leiden tot chronische ontsteking en voor de ontwikkeling van auto-immuniteit. Dendritische cellen (DC's) zijn de professionele presentatie van antigeen cellen van het aangeboren immuunsysteem betrokken bij het activeren van de naïeve T cellen om te starten van de immuunrespons tegen vreemde antigenen. DCs kunnen echter ook worden onderscheiden in TolDCs die handelen te handhaven en T cel tolerantie te bevorderen en te onderdrukken effector cellen bij te dragen tot de ontwikkeling van beide voorwaarden van auto-immuunziekten of chronische ontsteking. De recente vooruitgang in ons begrip van TolDCs suggereert dat DC tolerantie kan worden bereikt door het moduleren van de voorwaarden van hun differentiatie. Dit verschijnsel heeft geleid tot een enorme groei in TolDC therapieën voor talrijke immuun aandoeningen veroorzaakt door te breken in immuun tolerantie te ontwikkelen. Succesvolle studies in preklinische autoimmuniteit lymfkliertest modellen hebben verder de immunotherapeutische nut van TolDCs in de behandeling van auto-immune aandoeningen gevalideerd. TolDCs hebben tegenwoordig een veelbelovende immunotherapeutische hulpmiddel in de kliniek voor herstel van immuun tolerantie in verschillende immuun aandoeningen door pathogene auto-immune reacties zich te richten terwijl protectieve immuniteit intact blijven. Hoewel een array van strategieën heeft voorgesteld door meerdere labs voor het opwekken van TolDCs, is er geen consistentie in het karakteriseren van de cellulaire en functionele fenotype van deze cellen. Dit protocol biedt een stapsgewijze handleiding voor de ontwikkeling van beenmerg-afgeleide DCs in grote aantallen, een unieke methode die wordt gebruikt om hen te onderscheiden in TolDCs met een synthetische triterpenoid 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic zuur-difluoro-propyl-amide (CDDO-DFPA), en de technieken gebruikt om te bevestigen hun fenotype, met inbegrip van analyses van essentiële moleculaire signaturen van TolDCs. Tot slot laten we zien een methode om te beoordelen van de TolDC functie door het testen van hun immunosuppressieve reactie in vitro en in vivo in een preklinische model van multiple sclerose.

Introduction

Dendritische cellen (DC's) werden zijn een integraal onderdeel van het aangeboren immuunsysteem en eerst ontdekt en gekenmerkt door Ralph Steinman en Zanvil Cohn in 1973 als primaire professionele antigeen presentatie1 cellen. DCs is aangetoond dat een belangrijke rol spelen in de immuunactivatie door de presentatie van verwerkte antigeen aan T-cellen en B cellen via grote comptabiliteit complexen (MHC) in secundaire lymfoïde organen te koppelen van de aangeboren en adaptieve immuunsysteem2. In de zoogdieren immuunsysteem zijn er ten minste twee categorieën van DCs die worden omschreven als myeloïde DCs en plasmacytoid DCs (PDC's)3. Myeloïde DCs, ook bekend als conventionele DCs (cDCs), worden gekenmerkt door de uitdrukking van CD11c en kan worden gedifferentieerd als onvolwassen DCs (iDCs) in vitro van voorlopercellen van het beenmerg of perifere bloed monocyten gebruiken granulocyt-macrofaag-kolonie-stimulerende factor (GM-CSF) en IL-4 bij lymfkliertest of menselijke diersoorten, respectievelijk4.

Activeren 'gevaar' signalen, zoals pathogen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMP) of schade-geassocieerde moleculaire patronen (VOCHTIGE), rijdt iDCs rijping richting immunogene DCs als volwassen DCs (mDCs) via verschillende patroon erkenning receptoren bindt de DC-oppervlakte5. Immunogene DCs verder prime naïef T-celproliferatie en differentiatie via opregulatie van MHCII2, costimulatory liganden (CD80, CD86 en interactie CD40)6, cytokines en andere oplosbare bemiddelaars7. Een cascade van pro-inflammatoire mediator productie van immunogene DCs is essentieel voor de cytokine gemedieerde T celdifferentiatie. Bijvoorbeeld, zowel IFN-γ en IL-12 zijn nodig voor de Th1 differentiatie8 en IL-1, IL-6, en IL-23 zijn kritisch voor de naïeve T cel polarisatie naar Th17 cellen9. Hoewel volwassen DCs op vreemde antigenen reageren, kan ongecontroleerde DC activering door zelf-antigenen leiden tot tolerantie ablatie en bevordering van de ontwikkeling van auto-immune ziekten door het genereren van autoreactieve T cellen waarvan Activering tot weefselvernietiging10 leidt .

Recente rapporten hebben verstrekt duidelijk bewijs van DC plasticiteit, wordt geïllustreerd door hun vermogen om te communiceren met verschillende aanwijzingen binnen hun communicatie weefsel en te onderscheiden in verschillende effector/suppressorgenen DC subsets. De anti-inflammatoire mediatoren, zoals IL-10,11, TGF-β12en HO-113 hebben aangetoond dat een belangrijke rol spelen bij immuun onderdrukking door inducerende tolerogenic DCs (TolDCs). Deze TolDCs verwerven van de regelgevende taken en onderdrukken van T-cel proliferatie14. Bovendien, het gebrek aan co-stimulatie door DCs en de productie van anti-inflammatoire mediatoren van TolDCs zowel bijdragen tot de inductie van regulatoire T-cellen (Tregs) en ook effectief remmen zowel Th1 en Th17 differentiatie en uitbreiding15. In afgelopen twee decennia, is de therapeutische mogelijkheden van TolDCs gemeld door verschillende onderzoekers. In deze studies, het beheer van ex-vivo TolDCs niet alleen verbeterd pathologische symptomen gegenereerd in verschillende preklinische modellen van auto-immune ziekten16 , maar ook geleid tot de ontwikkeling van immune tolerantie bij patiënten17 ,18. Interessant is dat vandaag de TolDCs therapie heeft beschouwd als een alternatieve of adjuvante aanpak voor auto-immune ziekten in verschillende klinische proeven, met inbegrip van type 1 diabetes mellitus19, reumatoïde artritis20, 21, multiple sclerose (MS)22,23,24, en de ziekte van Crohn ziekte25.

Er zijn een verscheidenheid van protocollen die hebben gewerkt aan het ontwikkelen van TolDCs en verschillende laboratoria methoden hebben gemeld voor generatie en fenotypische karakterisering van TolDCs. Deze methoden kunnen worden gebruikt voor het genereren van reproducibly TolDCs in vitro van hematopoietische progenitorcellen en stabiel om ze te bewaren in een tolerogenic staat in vivo26,27,28,29. De iDCs kan worden omgezet in TolDCs door blootstelling aan verschillende immunomodulerende farmacologische agenten of anti-inflammatoire cytokines. Vitamine D3 is bijvoorbeeld een bekende farmacologische agent bekend te vergroten van de productie van de IL-10 en onderdrukken van IL-12 secretie van DCs en te stimuleren waardoor hun immunosuppressieve functie30. Bovendien, wanneer DCs worden blootgesteld aan krachtige inflammatoire stimuli, zoals lipopolysacchariden (LPS), verschillende farmacologische stoffen zoals dexamethason31, rapamycin32en33 van de corticosteroïden is gebleken voor het opwekken van de TolDC fenotype doordat DC oppervlakte expressie van CD40, CD80, CD86 en MHCII34. IL-10 en TGF-β zijn de meest bestudeerde anti-inflammatoire cytokines voor het opwekken van DC tolerantie35 en de daarmee gepaard gaande blootstelling aan beide van deze cytokines voor het opwekken van het fenotype van een tolerogenic in DCs36is gebleken.

Sinds de tolerogenic die DC wordt bepaald door functionele eigenschappen in plaats van door fenotypische markers, er is behoefte een grote een consistente methode voor cellulaire en functionele karakterisering van TolDCs te ontwikkelen. Bovendien een strenge en consequente protocol moet worden vastgesteld voor de consistente beoordeling en de karakterisering van het tolerogenic DC fenotype als wij gaan effectief en reproducibly vergelijken het vermogen van de nieuwe agenten voor het opwekken van het fenotype van de TolDC in de laboratorium. Hier voorzien wij een gedetailleerd protocol met stapsgewijze methoden beschreven om te isoleren iDCs van hematopoietische progenitorcellen van muizen en vervolgens analyseren van de werkzaamheid van nieuwe agenten onder evaluatie voor hun capaciteit iDCs omzetten in TolDCs, die bieden een robuuste functionele en fenotypische karakterisatie van TolDCs zowel in vitro als in vivo. Deze beschrijving bevat een uitgebreide methode karakteriseren de TolDCs door hun oppervlakte liganden, cytokine profiel en immunosuppressieve functies in vitro. We bieden ook een voorbeeld van een methode om te verkennen van de mogelijke therapeutische toepassing van deze TolDCs in een preklinische model van MS, experimentele autoimmune encefalomyelitis (EAE). Deze gangbaar protocol helpt onderzoekers om de capaciteit van de nieuwe agenten ter bevordering van de inductie van TolDCs en vergemakkelijkt de inspanning uit te breiden het bereik van TolDC therapeutische ontwikkeling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle studies werden uitgevoerd met inachtneming van de procedures door de Case Western Reserve University School of Medicine van institutionele Animal Care en gebruik Comité goedgekeurd.

1. Prepareer het beenmerg-afgeleide dendritische cellen (BMDCs)

  1. Alle chirurgische instrumenten via autoclaaf steriliseren en het uitvoeren van het experiment in klasse II biologische veiligheidskast met geëigende veiligheidsprocedures.
  2. C57BL/6 muizen 8-10 weken oud met behulp van CO2 kamer euthanaseren. Plaats de muis op een ontleden bord en spoel met 70% ethanol. Accijnzen tibia kuitbeen en dijbeen botten met behulp van een chirurgische scissor en plaats ze met 70% ethanol in een 10 cm cultuur schotel.
  3. Chirurgische messen en pincet gebruiken om te ontleden weefsel weg zoveel mogelijk op het deksel van de 10 cm schotel cultuur en isoleren zijn verbeend en dijbeen te plaatsen met 70% ethanol in een 6 cm cultuur schotel.
  4. Hiermee kunt u dat chirurgische messen trim beide uiteinden van zijn verbeend en dijbeen. Gebruik 3 mL PBS in 3 ml injectiespuit met een naald 23G voor het spoelen van de inhoud van het merg van het ene eind van botten aan een conische buis met 12 ml PBS. Herhaal deze stap 3 x voor beide uiteinden van de botten.
  5. Centrifugeer de celsuspensie bij 300 x g gedurende 5 min.
  6. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet cel met 1 ml ACK lysing buffer voor 5 mins aan het verwijderen van rode bloedcellen.
  7. Voeg 9 ml PBS om te verdunnen ACK lysing buffer en centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten.
  8. Verwijder het supernatant en resuspendeer met 10 ml gestolde voedingsbodem (RPMI-1640 plus L-glutamine, 10% FBS, 1% niet-essentiële aminozuur (100 x), 10 mM HEPES, 50 nM β-mercaptoethanol en 5% penicilline/streptomycine).
    Opmerking: Endotoxine niveau moet minder dan 0.1 EU/ml in FBS.
  9. De celsuspensie passeren door een zeef van de cel 40 μm en nemen 20 µl celsuspensie en meng met 80 µl van trypan blauw aan tellen het aantal levende cellen met behulp van cytometer.
  10. Aanpassen van de cel nummer 1 x 106 cellen/ml met 15 ng/ml GM-CSF en 10 ng/ml IL-4.
  11. 3 ml 1 x 106 cellen/ml in elk putje van 6-well plaat plaat en Incubeer de cellen bij 37 ° C, 5% CO2, en 95% vochtigheid in de CO2 incubator.
    Opmerking: De beenmergcellen van één muis is ongeveer 3-5 x 107 cellen, die aangeeft dat het kan worden geplaatst van 2 naar 3 6-Wells-platen.
  12. Op dag 3, verwijder alle 3 ml gestolde voedingsbodem uit elk putje, voeg 2 ml verse PBS in elk putje en vervolgens voorzichtig swirl de plaat om ervoor te zorgen dat alle niet-aanhanger cellen verwijderen.
  13. 3 ml verse kweekmedium vervangen door 15 ng/ml GM-CSF en 10 ng/ml IL-4 in elk putje. Incubeer de cellen bij 37 ° C, 5% CO2, en 95% vochtigheid in de CO2 incubator.
  14. Op dag 5, direct een andere 3 ml verse kweekmedium met 15 ng/ml GM-CSF en 10 ng/ml IL-4 in elk putje toevoegen. Incubeer de cellen bij 37° C en 5% CO2, 95% vochtigheid in de CO2 incubator.
    Opmerking: Het totale volume in elk putje is nu 6 ml.
  15. Op dag 7, kunt u de hele plaat gezet door ijs voor 10 minuten. Pipetteer zachtjes het kweekmedium in elk putje te verjagen van de losjes-aanhanger BMDCs als iDCs in suspensie.
    Opmerking: Het aanhangend macrofagen zijn nog steeds gekoppeld aan de plaat. Lage temperatuur en zachtjes procedures zijn de sleutel tot het voorkomen van DC activering om invloed op verdere experimenten.
  16. Centrifugeer de celsuspensie bij 300 x g gedurende 5 minuten en resuspendeer met verse voedingsbodem voor verdere experimenten.
    Opmerking: BMDCs kan worden geïdentificeerd met fluorescentie-label CD11c antilichaam aan stroom cytometry en toonden we onze gating strategie van BMDCs voor verdere experimenten in Figuur 1.

2. het karakteriseren van TolDC gen- en eiwit profiel

  1. Plaat 2 ml 1 x 106 BMDCs/ml per putje in 6 goed-plaat met gestolde voedingsbodem in de aanwezigheid of afwezigheid van 100-400 nM, CDDO-DFPA voor 1 uur bij 37 ° C, 5% CO2 en 95% vochtigheid in de CO2 incubator aan het broeden.
    Opmerking: CDDO-DFPA, een synthetische triterpenoid, is een nucleaire factor (erythroid afkomstige 2) - zoals - 2 factor (Nrf2) inductor en nucleaire factor-recombination (NF-recombination) remmer. Andere agenten voor inductie van TolDCs uit iDCs, zoals IL-10, vitamine D3, dexamethason of BAY 11-7085, toepassen en wijzigen van deze stap naar een optimale voorwaarde voor elke agent.
  2. Het toevoegen van 10 of 100 ng/ml van LPS voor 4-24 uur om te induceren mDCs (incubatietijd verschilt als gevolg van de meting van mRNA of eiwitten) aan het broeden.
  3. Zachtjes Pipetteer het kweekmedium in elk putje en oogst van de celsuspensie met behulp van 1 ml pipet. Centrifugeer bij 300 x g voor 5 mins aan het verzamelen van de cellen en het supernatant, respectievelijk.
  4. Analyseren van de oppervlakte liganden van de cel pellets door stroom cytometry, zoals stimulerend liganden: interactie CD40 CD80, CD86, MHC-II, OX40L, ICOSL of remmende liganden: PD-L1 PD-L2, ILT3, ILT4.
  5. Isoleren van RNA van de cel pellets en analyseren van het RNA en supernatant monsters voor de cytokine profiel en gen- en eiwit niveaus door kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR) en ELISA, respectievelijk.
    Opmerking: als u bijvoorbeeld inflammatoire cytokines: TNF-α, IFNγ, EDN-1, IL-6, IL-12, en IL-23 of anti-inflammatoire cytokines: IL-4, IL-10, IL-15, TGF-β1 en HO-1.

3. de functie van TolDCs wordt geëvalueerd In Vitro en In Vivo

  1. T-cel Syngeneic proliferatie Assay
    1. Alle chirurgische instrumenten via autoclaaf steriliseren en het uitvoeren van het experiment in klasse II biologische veiligheidskast met geëigende veiligheidsprocedures.
    2. Bereiden MACS buffer met behulp van 0,5% bovien serumalbumine (BSA) en 2 mM EDTA in 500 ml PBS. Het steriliseren van de buffer door het filteren door middel van een 0,2 µm filter.
      Opmerking: Houd de buffer op het ijs tijdens het volgende experiment.
    3. Verkrijgen van CD4+ T cellen, euthanaseren OT-II T-cel receptor (TCR) transgene muizen met behulp van CO2 kamer 8-10 weken oud. Plaats de muis op een ontleden bord en spoel met 70% ethanol. Het isoleren van de milt vanaf de linkerkant van de buik met behulp van chirurgische schaar en pincet.
    4. Zet de milt met 2 ml PBS in een 6 cm cultuur schotel en gebruik de achterkant van de push-stick van 3 ml spuit mild met de milt door het passeren van een 40 μm cel zeef.
    5. Het verzamelen van de celsuspensie en centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten.
    6. Resuspendeer de pellet cel in 400 μl van MACS buffer.
    7. Voeg 100 µl van CD4+ T cel Biotine-antilichaam Cocktail bij 4° C gedurende 5 minuten.
      Opmerking: Het antilichaam cocktail bindt op andere celtypes behalve CD4+ T cellen, zoals CD8a, CD11b, CD11c, CD19, CD25, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, Anti-MHC klasse II, Ter-119, en TCRγ/δ.
    8. Voeg 300 μl van MACS buffer en 200 μl van anti-Biotine kralen (Tabel of Materials) bij 4° C gedurende 10 minuten.
    9. Plaats de kolom samengesteld van Ferromagnetische bollen (Tabel van materialen) en Filter van de pre scheiding samen in het magnetische veld en spoel het met 3 ml MACS buffer.
    10. Voeg 9 ml MACS buffer in de cellen en centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten.
    11. Resuspendeer de pellet cel in 3 ml MACS buffer en toepassen op de kolom. Verzamel doorstroomtest met CD4+ T cellen.
    12. Was de kolom met een andere 3 ml MACS buffer en verzamelen ook de doorstroming.
    13. Voor het verkrijgen van milt pan DCs, euthanaseren C57BL/6 muizen 8-10 weken oud met behulp van CO2 kamer. Plaats de muis op een ontleden bord en spoel met 70% ethanol. Het isoleren van de milt vanaf de linkerkant van de buik met behulp van chirurgische schaar en pincet. Zet de milt in een 6cm cultuur schotel met collagenase D oplossing 2 ml (2 mg/ml collagenase D opgelost in HBSS met calcium, magnesium).
    14. 1 ml van collagenase D oplossing tot de milt twee keer met een spuit van 1 ml en een 25G naald injecteert. De milt in kleine stukjes gesneden met een kleine schaar.
    15. Schudden en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 25 minuten.
    16. Voeg toe 500 μl van EDTA 0.5 M bij kamertemperatuur voor 5 minuten.
      Opmerking: De stappen van 3.1.13-3.1.14 zijn essentieel voor het verhogen van het rendement van DCs.
    17. Gebruik nu de achterkant van de push-stick van 3 ml spuit mince de milt drijfmest door het passeren van een 40 μm cel zeef te verzamelen van de celsuspensie door centrifugatie bij 300 x g gedurende 5 minuten.
    18. Resuspendeer de pellet cel in 350 μl van MACS buffer 50 µl van FcR blokkeren reagens en 100 µl van Pan dendritische cel Biotine-antilichaam Cocktail bij 4° C gedurende 10 minuten.
      Opmerking: Het antilichaam tegen antigenen die niet worden uitgedrukt door DCs cocktail.
    19. De cellen door toevoeging van 9 ml van MACS buffer en centrifuge bij 300 x g gedurende 5 minuten wassen.
    20. Resuspendeer de pellet cel in 800 μl van MACS buffer en voeg 200 μl van anti-Biotine kralen bij 4 ° C gedurende 10 minuten.
    21. Herhaal de stappen van de 3.1.9-3.1.11 voor het verzamelen van DCs.
    22. Was de kolom met een andere 3 ml MACS buffer tweemaal en verzamelen ook de doorstroming.
    23. Behandelen van de 2 x 10-5 DCs/ml in de aanwezigheid of afwezigheid van 100-400 nM CDDO-DFPA bij 37 ° C gedurende 1 hr. apart, label CD4+ T-cellen (1 x 107/ml) met 1 μM CFSE bij 37 ° C gedurende 15 minuten, wassen met PBS , en passen het volume om de definitieve concentratie van 2 x 106 T cellen/ml.
    24. Vervolgens in een 96-wells-plaat, cultuur samen 100 µl van de behandelde dendritische cellen met hetzelfde volume van CFSE-label CD4+ T cellen, beide verzameld uit de bovenstaande stappen om 1:10 verhouding. Voeg nu 100 ng/mL ovoalbumine (OVA) peptide 323-329 per goed en meet de intensiteit van de CFSE van de T-cellen door stroom cytometry na 2-3 dagen incubatie.
      Opmerking: De cel nummers en verhouding van DCs en T cellen uit onze eerdere werk37zijn geoptimaliseerd.
  2. Induceren van passief EAE door het injecteren van de BMDCs Pulsed met myeline Oligodendrocyt glycoproteïne (MOG) (35-55)
    1. Plaat 2 ml 1 x 106 BMDCs/ml per putje in 6 goed-plaat met gestolde voedingsbodem in de aanwezigheid of afwezigheid van 100-400 nM CDDO-DFPA voor 1 uur aan het broeden.
    2. Voeg 10 ng/ml LPS voor drachtige 24 uur.
    3. Voeg 100 μg/ml MOG (35-55) voor drachtige 4 uur.
    4. Oogst de celsuspensie en centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten.
    5. Resuspendeer de pellet cel met PBS en cellen tellen.
    6. Subcutaan injecteren 200 μl van 2 x 106 cellen met 8-10 weken oude vrouwelijke C57BL/6 muizen (100 µl in elke achterpoot).
    7. Op de dag van BMDC injectie en de 48 uur. later, injecteren 200 ng pertussis toxine (PTX) in elke muis.
    8. Herhaal stappen 3.2.6-3.2.7 eenmaal per week voor 4 opeenvolgende weken.
    9. De klinische symptomen van EAE dagelijks evalueren met behulp van de criteria van de kwaliteitsnorm37 (0.5-limp staart, staart 1-limp, 2-matig hind-limb zwakte, 3-ernstige hind-limb zwakte, hind-limb 4-volledige verlamming, 5-tetraplegie of stervende state, 6-dood).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De differentiatie en de selectie van BMDCs:

Het beenmerg voorlopercellen werden gekweekt in volledige RPMI medium in het bijzijn van GM-CSF en IL-4 te onderscheiden in iDCs gedurende 7 dagen (figuur 1A). Op dag 1, cellen waren klein in omvang en toonde sferische morfologie. Wassen met PBS voordat de vervanging van verse medium op dag 3 cellen hielp vorm clusters en ook steeg de bevolking van CD11c+ cellen. Op dag 4, BMDCs werden uitgebreid in omvang en clustervorming gestart. Zelfklevend macrofagen waren ook omgezet en waargenomen aan de onderkant van de plaat met een langwerpige vorm. Op dag 5, worden grote formaat clusters van BMDCs gevormd. Op dag 6, werden ook een groot aantal semi-aanhangend en zwevende BMDCs waargenomen. BMDCs werden geoogst op dag 7 en geanalyseerd door stroom cytometry voor CD11c expressie als een specifieke marker voor lymfkliertest DCs. Zoals blijkt uit een representatieve stroom cytometry grondstuk in figuur 1B, werden rond 83.6% van BMDCs uiten van CD11c verkregen door deze methode.

Inductie en genetische karakterisering van TolDCs:

Sommige van de agenten bekend voor het opwekken van TolDCs, zoals vitamine D338 en dexamethason39, is bekend dat de expressie van DC oppervlakte liganden, met inbegrip van MHC II en costimulatory moleculen, interactie CD40 CD80 en CD86 naar beneden-regelen. Daarentegen, in het kader van hetzij LPS of CD40L-geïnduceerde rijping van DCs toonden calcineurin-remmers cyclosporin A en FK506 geen effect op de expressie van CD83, CD80, CD86 en MHC II33. Zoals blijkt uit de stroom cytometry analyse, hadden de inductie van TolDC door CDDO-DFPA geen significant effect op de oppervlakte ligand LPS-geïnduceerde expressie van DCs, met inbegrip van CD80, CD86, MHC II, PD-L1 en interactie CD40. (Figuur 2).

Bovendien, de vergelijkende analyse van BMDCs transcriptome en cytokine behandeld met of zonder CDDO-DFPA in aanwezigheid of afwezigheid van LPS afgebeeld gemoduleerde inflammatoire gene profiel. CDDO-DFPA behandeling aanzienlijk verminderd LPS geïnduceerde pro-inflammatoire cytokine genen zoals IFN-γ, IL-12, EDN1 en TNFα, IL-6, IL-23 (figuur 3A-3F). Deze cytokines staan bekend om Th1 (IFN-γ en IL-12) en Th17 (IL-6 en IL-23) cel differentiatie. Bovendien behandeld CDDO-DFPA BMDCs toonde verbeterde expressie van genen die anti-inflammatoire cytokine zoals IL-4, IL-10, TGF-β en HO-1 (figuur 4A-4D). Deze anti-inflammatoire genen autoimmuniteit modulator zijn bekend door het bevorderen van Th2 (IL-4) en Walter (IL-10 en TGF-β) celdifferentiatie. 40 hier is het belangrijk op te merken dat de onderscheidende IL-12; IL-10+ cytokine productie36, de inductie van HO-1 expressie13, en de remming van de EDN-141 geïnduceerd door CDDO-DFPA behandeling, zijn alle bekend voor het verifiëren van DCs tolerogenic functie.

Cellulaire en functionele karakterisering van TolDCs in vitro

DC-gemedieerde T-celproliferatie is bekend om te worden geactiveerd door de betrokkenheid van costimulatory oppervlakte ligand evenals de secretie van cytokines en oplosbare bemiddelaars7. Echter TolDCs remmen T cel reacties via verschillende mechanismen: door inducerende T cel anergie, door het actief bevorderen van het schrappen van autoreactieve cellen en het bevorderen van de polarisatie van naïeve T cellen tot en met Tregs42. We hebben al gerapporteerd dat de functionele karakterisering van CDDO-DFPA geïnduceerde TolDCs37. T cel anergie en schrapping van autoreactieve T cellen kunnen onafhankelijk worden geanalyseerd door te controleren oppervlakte markeringen of Annexine V/7-AAD kleuring. Echter, wij niet indirect bevestigd dit fenotype door het meten van T-cel proliferatie index. Hiervoor, we gebruikt C57BL/6 th transgene muizen T-cellen en hen blootgesteld aan syngeneic DCs gewonnen uit C57BL/6 muizen en behandeld met of zonder CDDO-DFPA. Deze DCs werden gewassen en co gekweekt met CFSE T cellen met eicellen peptide gekleurd. We hebben vastgesteld dat een aanzienlijke vermindering van T-celproliferatie door CDDO-DFPA vooraf behandelde DCs, suggereren hun tolerogenic fenotype (Figuur 5).

In vivo functionele karakterisering van TolDCs in een preklinische model van autoimmuniteit

Tot slot kan de functionaliteit van DFPA-geïnduceerde TolDCs in om het even welk van een aantal preklinische in-vivo modellen gekenmerkt auto-immune inflammatoire functies of worden getest. Aangezien EAE is een algemeen aanvaarde preklinische lymfkliertest model van de klinische immuun-gemedieerde centrale zenuwstelsel ziekte, MS43, we dit in onze huidige studie gebruikt. Om verder te onderzoeken de in vivo functionaliteit van CDDO-DFPA geïnduceerde TolDCs, wij hen in een preklinische lymfkliertest model van passieve EAE uitgedaagd. Hiervoor werden BMDCs met of zonder CDDO-DFPA gekweekt in aanwezigheid van LP's en MOG (35-55). Deze cellen vervolgens herhaaldelijk als geplande protocol afgebeeld in figuur 6A werden ingespoten en muizen werden routinematig waargenomen voor de manifestatie van klinische symptomen. Zoals verwacht, gepulseerde LP's en MOG (35-55) BMDCs toonde van klinische symptomen van EAE, echter; CDDO-DFPA primer BMDCs behandeld groep toonde vertraagde begin van de ziekte met aanzienlijk lagere klinische symptomen (figuur 6B). Deze resultaten bevestigen de immunosuppressieve fenotype van TolDCs die zijn geïnduceerd door CDDO-DFPA behandeling.

Figure 1
Figuur 1: ontwikkeling en fenotypische karakterisering van BMDCs: (A) beenmergcellen werden gespoeld uit uit beenderen van het scheenbeen en het dijbeen van C57BL/6 muizen en verder gedifferentieerd naar BMDCs. Een passende cluster celvorming werd gevolgd door de lichte microscopie van gedurende de gehele periode van differentiatie (schaal balken, 100µm). (B) de differentiatie van de BMDCs werd bevestigd door de CD11c oppervlakte expressie, zoals geanalyseerd door FACS. Grafieken tonen het percentage van de uitgebreide CD11c+ cel bevolking. (C) Gating strategie BMDCs. cellen werden eerst omheinde om uit te sluiten van puin (FSC vs. SSC). Een doublet uitsluiting poort was utilized to gate op onderhemden cellen (FL2-W vs. FL2-A). Levende cellen werden binnen de singlet-cellen omheinde op 7-AAD perceel (7-AAD vs. FSC). De cellen werden vervolgens verder geanalyseerd en omheinde op CD11c expressie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: DC cel oppervlakte ligand expressie is ongewijzigd door CDDO-DFPA. Cellen waren vooraf behandeld in ofwel de aanwezigheid of de afwezigheid van CDDO-DFPA (200 nM) voor 1 uur vóór de stimulatie met LPS (100 ng/ml) voor 24 uur. Cel oppervlakte uitdrukking van CD80, CD86, MHC II, PD-L1 en interactie CD40 werd geanalyseerd door stroom cytometry. Dit cijfer is gewijzigd van Wetenschappelijke rapporten 7, artikelnummer: 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. Gereproduceerd en heruitgegeven met auteursrechtelijke toestemming. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: CDDO-DFPA veranderd de genetische en eiwit fenotype van immunogene DCs. BMDCs waren vooraf behandeld in ofwel de aanwezigheid of de afwezigheid van CDDO-DFPA (50-400 nM) voor 1 uur vóór toevoeging van LPS (100 ng/ml), en hetzij geoogst voor RNA extractie (4 HRS.) of mogen voorwaarde kweekmedium voor 24 uur. voorafgaand aan de collectie voor cytokine analyses. De niveaus van IL-12 (B), TNFα (D), IL-6 (E) en IL-23 (F) werden gemeten door qRT-PCR en ELISA. Overwegende dat het niveau van IFN-γ (A) werd gemeten door qRT-PCR en EDN-1 (C) door ELISA alleen. De resultaten worden uitgedrukt als gemiddelde ± S.D. van drie experimenten. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0.001 vergeleken met de LPS-behandelde groepen. Ongepaarde student t-test. Dit cijfer is gewijzigd van Wetenschappelijke rapporten 7, artikelnummer: 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. Gereproduceerd en gepubliceerd met toestemming van de auteursrecht." Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: CDDO-DFPA geïnduceerde TolDCs fenotype bevestigd door gen- en eiwit expressie. BMDCs waren vooraf behandeld in de aanwezigheid of afwezigheid van CDDO-DFPA (10-400 nM) voor 1 uur vóór toevoeging van LPS (100 ng/ml), en de cellen zijn geoogst voor RNA extractie na 24 uur. De niveaus van de IL-4 (A), IL-10 (B) en TGF-β (C) werden gemeten door qRT-PCR. (D) cel eiwitten lysates werden verzameld op 12 uur. voor analyses en de niveaus van HO-1 en β-actine werd expressie bepaald door het westelijke bevlekken. De resultaten worden uitgedrukt als gemiddelde ± S.D. van drie experimenten. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0.001 vergeleken met de LPS-behandelde groepen. Ongepaarde student t-test. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: CDDO-DFPA blootgesteld DCs onderdrukken van T-celproliferatie. DCs waren vooraf behandeld met CDDO-DFPA (100-400 nM) voor slechts 1 uur en vervolgens gewassen en co gekweekte met CFSE gekleurd T-cellen bij een 1:10 verhouding. (A) de milt T-cellen en DCs werden respectievelijk geïsoleerd uit C57BL/6 th transgene muizen en C57BL/6 muizen. CDDO-DFPA voorbehandeld DCs samen werden gekweekt met CFSE gekleurd T-cellen met (w /) of zonder (w/o) eicellen toevoeging tijdens de incubatie. T-celproliferatie was bepaald door stroom cytometry op dag 2. Grafieken tonen het percentage voor het verdelen van T-cellen ten opzichte van getallen T celdeling. De gegevens zijn een weergave van 3 onafhankelijke experimenten. Dit cijfer is gewijzigd van Wetenschappelijke rapporten 7, artikelnummer: 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. Gereproduceerd en heruitgegeven met auteursrechtelijke toestemming. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6: MOG primer DC-geïnduceerde passief EAE wordt ingetrokken door TolDCs. (A) EAE inductie door MOG (35-55)-gepulseerde BMDCs. rijpe BMDCs werden behandeld in de aanwezigheid of afwezigheid van CDDO-DFPA (400 nM) en vervolgens gepulseerde met MOG (35-55) voor 4 uur. Een totaal van 200 μl van 2 × 10-6 cellen werd toegediend door een subcutane injectie in de flank gebied van C57BL/6 muizen eenmaal per week voor een totaal van vier injecties. Telkens werd PTX bestuurd door i.p. injectie onmiddellijk en weer 2 dagen later (dag 0 op 4de cyclus). (B) klinische scores waren opgenomen na alle vier injecties, met behulp van de criteria van de kwaliteitsnorm. Alle gegevens werden gepresenteerd als de gemiddelde ± S.E.M. * P < 0.05. Meerdere t-tests met Holm-Sidak analyse (n = 7 muizen in elke groep). Dit cijfer is gewijzigd van Wetenschappelijke rapporten 7, artikelnummer: 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. Gereproduceerd en heruitgegeven met auteursrechtelijke toestemming. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit witboek beschrijft een efficiënt protocol dat kan worden gebruikt voor reproducibly voor het genereren van iDCs en vervolgens om hen te onderscheiden in TolDCs, en wij stellen voor dat dit kan worden toegepast om te evalueren van de capaciteit van de nieuwe moleculaire doel agenten voor het opwekken van de TolDC fenotype. Zoals beschreven in dit verslag, we hebben een reeks waarin we eerst geanalyseerd TolDC uitdrukking van oppervlakte liganden door stroom cytometry, gevolgd door een evaluatie van het DC cytokine profiel zoals gemeten door qRT-PCR en ELISA gevolgd. Tot slot werd de immunoregulerende functie van TolDCs bevestigd door het tonen van hun capaciteit om T-cel proliferatie in vitro en hun doeltreffendheid te onderdrukken autoimmunity in vivo, met behulp van de preklinische lymfkliertest EAE model van MS te verminderen.

In ons protocol, werden iDCs gegenereerd en onderscheiden van lymfkliertest beenmerg precursoren met de combinatie van GM-CSF en IL-4. Andere protocollen zijn gewend geraakt vormen-achtige tyrosine kinase 3 liganden (Flt3L) in het kweekmedium iDCs44genereren. Hoewel het gebruik van Flt3L het rendement van iDCs verhoogt, nemen deze iDCs meestal 2 dagen (9 dagen) om te oogsten, in vergelijking met GM-CSF/IL-4 toevoeging (7 dagen)44. Nog belangrijker, iDC gegenereerd op basis van Flt3L vaak onderscheiden in beide cDCs (CD8- en CD8+) en PDC's45 , die waren functioneel en fenotypische equivalent van stationaire DCs in vivo. Echter, GM-CSF/IL-4 steevast induceert de differentiatie van iDC richting cDCs (CD8-) alleen44 en tijdens de rijping, ze laten zien dat vergelijkbare tekens van inflammatoire DCs-46. Het is opmerkelijk om te weten dat GM-CSF/IL-4 vaak bij klinische proeven en het fundamenteel onderzoek vanwege het voordeel gebruikt wordt van DCs differentiëren van monocyten of CD34+ progenitoren44. Het is aangetoond dat iDCs gegenereerd op basis van deze twee methoden produceren morfologisch verschillende cellen, die ook beschikken over verschillende cel oppervlakte markeringen en vertonen verschillende cytokine profielen na hun activatie. Bovendien variëren TolDCs geïnduceerd door deze methoden in hun vermogen om te migreren naar aanleiding van Chemotactische factoren en voor het opwekken van antigeen-specifieke T cel reacties44,45. Wij begrijpen dat CD8+ DCs kan vertonen meer potentieel in TolDC inductie vanwege hun unieke capaciteit van cross-tolerance47. Echter is het dan nodig verdere cel sorteren van BMDCs afgeleid door Flt3L te onderzoeken van de specifieke CD8+ DC deelverzameling. Bovendien, aangezien GM-CSF/IL-4 geïnduceerde BMDCs zijn superieur op T cel stimulatie en de productie van inflammatoire mediatoren na LPS behandeling44,45, vonden we deze strategie gaf meer reproduceerbare resultaten onze experimenten.

BMDCs afgeleid van GM-CSF/IL-4 start CD11c rond dag 4 en verrijken de expressie na dag 648. Deze cultuur procedure kan worden volgehouden tot dag 10-12 met een lagere dichtheid van de beplating van beenmergcellen en een lage dosis van GMC-SF op dag 8-1049. In dit protocol, werden CDDO-DFPA (synthetisch triterpenoid) en LP's toegevoegd in tandem als gemachtigden voor het opwekken van DC tolerantie en rijping, respectievelijk. Onlangs meldden we dat iDCs geoogst uit culturen met behulp van deze methode van BMDC generatie een functionele TolDC fenotype vertonen als voorbehandeld met CDDO-DFPA-37. Het is opmerkelijk dat CDDO-DFPA, die was alleen toegevoegd aan culturen nadat iDC oogst (dag 7)37, in tegenstelling tot de agenten zoals vitamine D3 die moet worden toegevoegd aan culturen meerdere keren tijdens iDC differentiatie (dag 2, 4, 6)50. Bovendien, deze inductie van TolDCs door vitamine D3 kan afhangen van verschillende mechanismen die moeten worden gestart, zowel tijdens als na de iDC differentiatie51. Onze gegevens suggereren dat tijdens iDC differentiatie toe te voegen CDDO-DFPA had geen invloed op de zuiverheid van CD11c + DCs maar dosis-dependently het rendement van iDCs op dag 7 (gegevens niet worden weergegeven verlagen). Onze analyses suggereren ook dat de hogere concentratie van CDDO-DFPA gebruikt in deze experimenten mogelijk vergiftig voor in het beenmerg voorlopercellen, hoewel iDC normale levensvatbaarheid met deze concentratie van CDDO-DFPA-37 toonden. Verwacht wordt dat TolDC inductie kan worden geoptimaliseerd door zorgvuldige analyse van de impact van het tijdstip en duur van blootstelling aan agentia zoals CDDO-DFPA.

Het is belangrijk om te overwegen de alternatieve methoden en mechanismen via welke iDCs kan worden opgewekt om te mDCs door anderen dan LPS, zoals CD40L, TNF-α en IFN-γ52. DC rijping door LPS via Toll-like receptoren leidt 4(TLR4) de activering van verschillende transcriptiefactoren, met inbegrip van nucleaire factor-recombination (NF-recombination), p38 mitogeen-geactiveerd proteïne kinase (p38 MAPK), c-Jun N-terminal kinase (JNK), en extracellulaire signaal-gereglementeerde proteïne kinase (ERK1/2). De rijping van DCs door CD40L en TNF-α door middel van interactie CD40 en TNF receptoren induceert respectievelijk het NF-recombination traject. In tegenstelling, IFN-γ stimuleert een ander traject, met inbegrip van de activering van Janus kinase (JAK), tyrosine kinase (TYK), en het signaal transducer en activator van eiwitten van de transcriptie (STATs), en deze downstream effecten worden ook aangevuld door activering van de NF-recombination traject52. Bovendien, terwijl de genexpressie profiel van DC CD40L/TNF-α-gebaseerde rijping suggereert dat deze DCs T-cellen naar een Th2 cel antwoord53 polariseren, is DC rijping door IFN-γ sterk gericht op een Th1 cel antwoord54. Deze andere inductoren van DC rijping die zijn gekoppeld aan differentiatie naar specifieke T cel subsets zijn daarom niet werkzaam in dit protocol.

Verschillende rapporten is gebleken dat ex vivo-gedifferentieerde DCs staat het volledige spectrum van EAE klinische symptomen en pathologie in muizen55inducerende zijn. De methode van passieve EAE inductie door ex vivo geactiveerd DCs is goedgekeurd met verschillende wijzigingen door verschillende laboratoria. De combinatie van passieve en actieve EAE inductie door administratie van MOG gevuld BMDCs, 7 dagen voordat de immunisatie met MOG en compleet Freund van adjuvans (CFA) resulteert in hogere klinische symptoom scores (piek klinische score: 3.5) vergeleken met de passieve EAE inductie door de administratie van de MOG primer BMDCs alleen (piek klinische score: 2)56. Resultaten met deze methode combineren MOG BMDCs gevuld met MOG immunisatie suggereert dat ziekte gebeurt op dag 9 na de immunisatie met MOG en CFA-56. Echter, aangezien het is bekend dat CFA aanzienlijke ontsteking op de plaats van toediening57 veroorzaakt, we hebben gebruikt passieve EAE inductie door administratie van DCs alleen in ons protocol om effectief analyseren het effect van TolDCs tijdens de EAE. Om verder te bevestigen de functionele fenotype van TolDCs, dient men ook testen in het onderdrukken van klinische symptomen van actieve EAE muizen. De route van de administratie van DCs is ook cruciaal voor de inductie van EAE symptomen58. Zoals gemeld door ons lab en anderen, subcutane injectie van BMDCs in de regio van de flank van C57BL/6 muizen eenmaal per week voor een totaal van 3-4 injecties induceert een piek klinische score van EAE rond 2-2.5 met reproduceerbare ziekte op dag 11-1237 ,58. We voorzien een korte clip om aan te tonen van de verschillende klinische symptomen tussen actieve en passieve EAE inductie (Video 1).

De erkende beperkingen van ons protocol omvat de tijd die nodig is door de toegepaste methoden en de afhankelijkheid van een niet-fysiologisch relevante communicatie voor differentiatie van de BMDC. Echter, terwijl het antilichaam kolom scheidingsmethoden van collectie voor DCs verrijkt en T cellen van lymfkliertest milt kunnen meer tijd efficiënt zijn, hij lijdt aan een lage opbrengst van de gewenste DC bevolking. Het voordeel van de methode van het beenmerg-afgeleide DC ontwikkeling is dus het logboek schaal hoger rendement van DC populaties in vergelijking met antilichaam kolom scheiding van de hele milt. Zoals hierboven vermeld, de DCs gegenereerd vergt in vitro door deze methode een hoge concentratie van cytokine suppletie is niet fysiologisch relevant voor DCs in vivo communicatie59 en ook geen waarborgen voor de lange termijn duurzaamheid van DC. De GM-CSF gebruikt in ons protocol is ook niet een essentiële cytokine voor normale DC differentiatie in vivo60. Niettemin, het voorgestelde protocol voor het genereren van BMDC reproducibly levert een hoge Fractie van functioneel TolDCs en moet worden gezien als een zeer betrouwbare en reproduceerbare methode voor het genereren van functionele DCs met tolerogenic eigenschappen.

Kortom, kan de TolDCs gegenereerd op basis van het protocol beschreven hier effectief worden gekarakteriseerd, door beoordeling van hun gen- en eiwit expressie-profielen, aan de hand van hun vermogen te moduleren T-cel-afhankelijke immuun reacties in vitro, en beoordeling van hun functie als een adoptief celtherapie te onderdrukken EAE inductie in vivo. Onze protocol vormt een kader voor de evaluatie van eventuele nieuwe agenten te zijn gedacht te hebben van de capaciteit voor het opwekken van TolDCs en verder de therapeutische om ontwikkelingsproces te versnellen voor TolDCs van Bank naar kliniek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen

Acknowledgments

Wij danken Reata Pharmaceuticals voor het verstrekken van CDDO-DFPA. We erkennen ook de steun van de Jane en Lee Seidman stoel in Pediatric Cancer innovatie (John Letterio). Dit werk werd gesteund door het ministerie van defensie [W81XWH-12-1-0452]; de Angie Fowler Adolescent en jong volwassen kanker onderzoeksinitiatief op de zaak uitgebreid Cancer Center; en de Callahan Graduate geleerde Award voor Hsi-Ju Wei van F.J. Callahan Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CDDO-DFPA (RTA-408) Reata Pharmaceuticals in house synthesis Cell culture
Mouse GM-CSF Peprotech Inc. 315-03 BMDC differentiation
Mouse IL-4 Peprotech Inc. 214-14 BMDC differentiation
Lipopolysaccharides (LPS) Sigma Aldrich Inc. L2880 Cell culture
β-mercaptoethanol Sigma Aldrich Inc. 516732 Cell culture
Pertussis toxin (PTX) R&D systems 3097 EAE induction
MOG (35–55) peptide 21stCentury Biochemicals in house synthesis EAE induction
Trypan blue Gibco, Life Technologies 15250-061 Cell culture
RPMI-1640 plus L-glutamine ThermoFisher Scientific 11875-093 Cell culture
Non-essential amino acid (100X) ThermoFisher Scientific 11140050 Cell culture
HEPES ThermoFisher Scientific 15630080 Cell culture
penicillin/streptomycin ThermoFisher Scientific 15140122 Cell culture
40 μm cell strainer Corning 352340 Cell isolation
PE-conjugated CD80 BD Biosciences 557227 Flow cytometry
PE-conjugated CD86 BD Biosciences 555665 Flow cytometry
PE-conjugated PD-L1 BioLegend 124307 Flow cytometry
APC-conjugated MHCII Miltenyi Biotec Inc. 130-112-388 Flow cytometry
APC-conjugated CD11c BD Biosciences 340544 Flow cytometry
Isotype matched PE Miltenyi Biotec Inc. 130-091-835 Flow cytometry
Isotype matched APC Miltenyi Biotec Inc. 130-091-836 Flow cytometry
CFSE BioLegend 423801 T cell proliferation assay
Pan dendritic cell isolation kit Miltenyi Biotec Inc. 130-100-875 T cell proliferation assay
FcR Blocking Reagent Miltenyi Biotec Inc. 130-100-875 T cell proliferation assay
Pan Dendritic Cell Biotin-Antibody Cocktail Miltenyi Biotec Inc. 130-100-875 T cell proliferation assay
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi Biotec Inc. 130-100-875 T cell proliferation assay
CD4+ T cell isolation kit Miltenyi Biotec Inc. 130-104-454 T cell proliferation assay
CD4+ T cell Biotin-Antibody Cocktail Miltenyi Biotec Inc. 130-104-454 T cell proliferation assay
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi Biotec Inc. 130-104-454 T cell proliferation assay
ACK lysing buffer ThermoFisher Scientific A1049201 BMDC differentiation
1 ml syringe BD Biosciences 309626 T cell proliferation assay
3 ml syringe BD Biosciences 309588 BMDC differentiation
25G needle BD Biosciences 309626 T cell proliferation assay
23G needle BD Biosciences 309588 BMDC differentiation
BSA Sigma Aldrich Inc. A2058 T cell proliferation assay
EDTA ThermoFisher Scientific 15575020 T cell proliferation assay
LS Column Miltenyi Biotec Inc. 130-042-401 T cell proliferation assay
Pre-Separation Filter Miltenyi Biotec Inc. 130-095-823 T cell proliferation assay
collagenase D Sigma Aldrich Inc. 11088858001 T cell proliferation assay
HBSS ThermoFisher Scientific 14025076 T cell proliferation assay
ovalbumin (OVA) peptide 323–329 Sigma Aldrich Inc. O1641 T cell proliferation assay
Mouse IFN-γ TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm01168134_m1 qRT-PCR
Mouse IL-12a TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm00434165 qRT-PCR
Mouse IL-12 p70 DuoSet ELISA R&D systems DY419-05 ELISA
Mouse EDN-1 ELISA RayBiotech ELM-EDN1-1 ELISA
TNF-α TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm00443258 qRT-PCR
Mouse TNF-α Quantikine ELISA Kit R&D systems MTA00B ELISA
IL-6 TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm00446190 qRT-PCR
Mouse IL-6 Quantikine ELISA Kit R&D systems M6000B ELISA
IL-23a TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm01160011 qRT-PCR
Mouse IL-23 DuoSet ELISA R&D systems DY1887-05 ELISA
IL-4 TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm99999154_m1 qRT-PCR
IL-10 TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm01288386_m1 qRT-PCR
TGF-β TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm01178820_m1 qRT-PCR
Anti-Heme Oxygenase 1 antibody Abcam ab13248 Western blotting
Anti-β-actin antibody Abcam ab8226 Western blotting
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System Bio-Rad Inc. qRT-PCR
BD FACSCalibur Cell Analyzer BD Biosciences Flow cytometry

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).
  2. Inaba, K., et al. Efficient presentation of phagocytosed cellular fragments on the major histocompatibility complex class II products of dendritic cells. J Exp Med. 188 (11), 2163-2173 (1998).
  3. Banchereau, J., et al. Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol. 18, 767-811 (2000).
  4. Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 179 (4), 1109-1118 (1994).
  5. Hemmi, H., Akira, S. TLR signalling and the function of dendritic cells. Chem Immunol Allergy. 86, 120-135 (2005).
  6. Caux, C., et al. B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells. J Exp Med. 180 (5), 1841-1847 (1994).
  7. Chastain, E. M., Duncan, D. S., Rodgers, J. M., Miller, S. D. The role of antigen presenting cells in multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 265-274 (2011).
  8. Smeltz, R. B., Chen, J., Ehrhardt, R., Shevach, E. M. Role of IFN-gamma in Th1 differentiation: IFN-gamma regulates IL-18R alpha expression by preventing the negative effects of IL-4 and by inducing/maintaining IL-12 receptor beta 2 expression. J Immunol. 168 (12), 6165-6172 (2002).
  9. Gyulveszi, G., Haak, S., Becher, B. IL-23-driven encephalo-tropism and Th17 polarization during CNS-inflammation in vivo. Eur J Immunol. 39 (7), 1864-1869 (2009).
  10. Kronenberg, M., Rudensky, A. Regulation of immunity by self-reactive T cells. Nature. 435 (7042), 598-604 (2005).
  11. Boks, M. A., et al. IL-10-generated tolerogenic dendritic cells are optimal for functional regulatory T cell induction--a comparative study of human clinical-applicable DC. Clin Immunol. 142 (3), 332-342 (2012).
  12. Anderson, A. E., et al. Tolerogenic dendritic cells generated with dexamethasone and vitamin D3 regulate rheumatoid arthritis CD4+ T cells partly via transforming growth factor-beta1. Clin Exp Immunol. 187 (1), 113-123 (2017).
  13. Chauveau, C., et al. Heme oxygenase-1 expression inhibits dendritic cell maturation and proinflammatory function but conserves IL-10 expression. Blood. 106 (5), 1694-1702 (2005).
  14. Maldonado, R. A., von Andrian, U. H. How tolerogenic dendritic cells induce regulatory T cells. Adv Immunol. 108, 111-165 (2010).
  15. Schmidt, S., Nino-Castro, A., Schultze, J. Regulatory dendritic cells: there is more than just immune activation. Frontiers in Immunology. 3 (274), (2012).
  16. Hilkens, C. M., Isaacs, J. D., Thomson, A. W. Development of dendritic cell-based immunotherapy for autoimmunity. Int Rev Immunol. 29 (2), 156-183 (2010).
  17. Dhodapkar, M. V., Steinman, R. M. Antigen-bearing immature dendritic cells induce peptide-specific CD8(+) regulatory T cells in vivo in humans. Blood. 100 (1), 174-177 (2002).
  18. Dhodapkar, M. V., Steinman, R. M., Krasovsky, J., Munz, C., Bhardwaj, N. Antigen-specific inhibition of effector T cell function in humans after injection of immature dendritic cells. J Exp Med. 193 (2), 233-238 (2001).
  19. Giannoukakis, N., Phillips, B., Finegold, D., Harnaha, J., Trucco, M. Phase I (safety) study of autologous tolerogenic dendritic cells in type 1 diabetic patients. Diabetes Care. 34 (9), 2026-2032 (2011).
  20. Benham, H., et al. Citrullinated peptide dendritic cell immunotherapy in HLA risk genotype-positive rheumatoid arthritis patients. Sci Transl Med. 7 (290), 290ra287 (2015).
  21. Bell, G. M., et al. Autologous tolerogenic dendritic cells for rheumatoid and inflammatory arthritis. Ann Rheum Dis. 76 (1), 227-234 (2017).
  22. University Hospital, A. A "Negative" Dendritic Cell-based Vaccine for the Treatment of Multiple Sclerosis: a First-in-human Clinical Trial (MS tolDC). ClinicalTrials.gov. , (2015).
  23. Pujol, F. I. G. T. i Tolerogenic Dendritic Cells as a Therapeutic Strategy for the Treatment of Multiple Sclerosis Patients (TOLERVIT-MS) (TOLERVIT-MS). ClinicalTrials.gov. , (2016).
  24. Varea, S. Treatment of Multiple Sclerosis and Neuromyelitis Optica With Regulatory Dendritic Cell: Clinical Trial Phase 1 B. ClinicalTrials.gov. , (2017).
  25. Jauregui-Amezaga, A., et al. Intraperitoneal Administration of Autologous Tolerogenic Dendritic Cells for Refractory Crohn's Disease: A Phase I Study. J Crohns Colitis. 9 (12), 1071-1078 (2015).
  26. Mahnke, K., Schmitt, E., Bonifaz, L., Enk, A. H., Jonuleit, H. Immature, but not inactive: the tolerogenic function of immature dendritic cells. Immunol Cell Biol. 80 (5), 477-483 (2002).
  27. Lutz, M. B., Schuler, G. Immature, semi-mature and fully mature dendritic cells: which signals induce tolerance or immunity? Trends Immunol. 23 (9), 445-449 (2002).
  28. Suciu-Foca, N., et al. Molecular characterization of allospecific T suppressor and tolerogenic dendritic cells: review. Int Immunopharmacol. 5 (1), 7-11 (2005).
  29. Wakkach, A., et al. Characterization of dendritic cells that induce tolerance and T regulatory 1 cell differentiation in vivo. Immunity. 18 (5), 605-617 (2003).
  30. Szeles, L., et al. 1,25-dihydroxyvitamin D3 is an autonomous regulator of the transcriptional changes leading to a tolerogenic dendritic cell phenotype. J Immunol. 182 (4), 2074-2083 (2009).
  31. Unger, W. W., Laban, S., Kleijwegt, F. S., vander Slik, A. R., Roep, B. O. Induction of Treg by monocyte-derived DC modulated by vitamin D3 or dexamethasone: differential role for PD-L1. Eur J Immunol. 39 (11), 3147-3159 (2009).
  32. Reichardt, W., et al. Impact of mammalian target of rapamycin inhibition on lymphoid homing and tolerogenic function of nanoparticle-labeled dendritic cells following allogeneic hematopoietic cell transplantation. J Immunol. 181 (7), 4770-4779 (2008).
  33. Woltman, A. M., et al. The effect of calcineurin inhibitors and corticosteroids on the differentiation of human dendritic cells. Eur J Immunol. 30 (7), 1807-1812 (2000).
  34. Hackstein, H., Thomson, A. W. Dendritic cells: emerging pharmacological targets of immunosuppressive drugs. Nat Rev Immunol. 4 (1), 24-34 (2004).
  35. Torres-Aguilar, H., Blank, M., Jara, L. J., Shoenfeld, Y. Tolerogenic dendritic cells in autoimmune diseases: crucial players in induction and prevention of autoimmunity. Autoimmun Rev. 10 (1), 8-17 (2010).
  36. Rutella, S., Danese, S., Leone, G. Tolerogenic dendritic cells: cytokine modulation comes of age. Blood. 108 (5), 1435-1440 (2006).
  37. Wei, H. J., Pareek, T. K., Liu, Q., Letterio, J. J. A unique tolerizing dendritic cell phenotype induced by the synthetic triterpenoid CDDO-DFPA (RTA-408) is protective against EAE. Sci Rep. 7 (1), 9886 (2017).
  38. van Etten, E., Mathieu, C. Immunoregulation by 1,25-dihydroxyvitamin D3: basic concepts. J Steroid Biochem Mol Biol. 97 (1-2), 93-101 (2005).
  39. Pan, J., et al. Dexamethasone inhibits the antigen presentation of dendritic cells in MHC class II pathway. Immunol Lett. 76 (3), 153-161 (2001).
  40. Zhu, J., Paul, W. E. Heterogeneity and plasticity of T helper cells. Cell Res. 20 (1), 4-12 (2010).
  41. Spirig, R., et al. TLR2 and TLR4 agonists induce production of the vasoactive peptide endothelin-1 by human dendritic cells. Mol Immunol. 46 (15), 3178-3182 (2009).
  42. Walton, E. L. Make immunological peace not war: Potential applications of tolerogenic dendritic cells. Biomed J. 40 (2), 77-79 (2017).
  43. Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). Br J Pharmacol. 164 (4), 1079-1106 (2011).
  44. Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking. J Immunol. 179 (11), 7577-7584 (2007).
  45. Angelov, G. S., Tomkowiak, M., Marcais, A., Leverrier, Y., Marvel, J. Flt3 ligand-generated murine plasmacytoid and conventional dendritic cells differ in their capacity to prime naive CD8 T cells and to generate memory cells in vivo. J Immunol. 175 (1), 189-195 (2005).
  46. Lowes, M. A., et al. Increase in TNF-alpha and inducible nitric oxide synthase-expressing dendritic cells in psoriasis and reduction with efalizumab (anti-CD11a). Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (52), 19057-19062 (2005).
  47. Schnorrer, P., et al. The dominant role of CD8+ dendritic cells in cross-presentation is not dictated by antigen capture. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (28), 10729-10734 (2006).
  48. Wang, W., Li, J., Wu, K., Azhati, B., Rexiati, M. Culture and Identification of Mouse Bone Marrow-Derived Dendritic Cells and Their Capability to Induce T Lymphocyte Proliferation. Med Sci Monit. 22, 244-250 (2016).
  49. Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J Immunol Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
  50. Griffin, M. D., et al. Dendritic cell modulation by 1alpha,25 dihydroxyvitamin D3 and its analogs: a vitamin D receptor-dependent pathway that promotes a persistent state of immaturity in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (12), 6800-6805 (2001).
  51. Bscheider, M., Butcher, E. C. Vitamin D immunoregulation through dendritic cells. Immunology. 148 (3), 227-236 (2016).
  52. Castiello, L., et al. Monocyte-derived DC maturation strategies and related pathways: a transcriptional view. Cancer Immunol Immunother. 60 (4), 457-466 (2011).
  53. Decker, W. K., et al. Deficient T(H)-1 responses from TNF-alpha-matured and alpha-CD40-matured dendritic cells. J Immunother. 31 (2), 157-165 (2008).
  54. Longhi, M. P., et al. Dendritic cells require a systemic type I interferon response to mature and induce CD4+ Th1 immunity with poly IC as adjuvant. J Exp Med. 206 (7), 1589-1602 (2009).
  55. Link, H., Huang, Y. M., Xiao, B. G. Dendritic cells in experimental allergic encephalomyelitis and multiple sclerosis. J Neuroimmunol. 100 (1-2), 102-110 (1999).
  56. Leech, M. D., et al. Cutting edge: IL-6-dependent autoimmune disease: dendritic cells as a sufficient, but transient, source. J Immunol. 190 (3), 881-885 (2013).
  57. Saul, L., Besusso, D., Mellanby, R. J. LPS-matured CD11c+ bone marrow-derived dendritic cells can initiate autoimmune pathology with minimal injection site inflammation. Lab Anim. 51 (3), 292-300 (2017).
  58. Aghdami, N., Gharibdoost, F., Moazzeni, S. M. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) induced by antigen pulsed dendritic cells in the C57BL/6 mouse: influence of injection route. Exp Anim. 57 (1), 45-55 (2008).
  59. Wilson, H. L. Limitations with in vitro production of dendritic cells using cytokines. J Leukoc Biol. 75 (4), 600-603 (2004).
  60. Ni, K., O'Neill, H. C. Development of dendritic cells from GM-CSF-/- mice in vitro : GM-CSF enhances production and survival of cells. Dev Immunol. 8 (2), 133-146 (2001).

Tags

Geneeskunde 135 van de kwestie Tolerogenic dendritische cellen (TolDCs) beenmerg-afgeleide dendritische cellen (BMDCs) experimentele Autoimmune encefalomyelitis (EAE) immuun onderdrukking Cytokines autoimmuniteit
Ontwikkeling en functionele karakterisering van lymfkliertest Tolerogenic dendritische cellen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wei, H. J., Letterio, J. J., Pareek, More

Wei, H. J., Letterio, J. J., Pareek, T. K. Development and Functional Characterization of Murine Tolerogenic Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (135), e57637, doi:10.3791/57637 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter