Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Udvikling og funktionel karakterisering af Murine Tolerogenic dendritiske celler

Published: May 18, 2018 doi: 10.3791/57637
Automatic Translation
1, 2,3, 2,3
1Department of Biochemistry, School of Medicine, Case Western Reserve University, 2Department of Pediatrics, Division of Pediatric Hematology/Oncology, Case Western Reserve University, 3Angie Fowler Cancer Institute, Rainbow Babies & Children's Hospital, University Hospitals, Cleveland

Summary

Vi præsenterer her, en protokol for at udvikle og karakterisere tolerogenic dendritiske celler (TolDCs) og evaluere deres immunterapeutisk nytte.

Abstract

Immunforsvaret fungerer ved at fastholde en stram balance mellem koordinerende svar mod udenlandske antigener og opretholde en tilstand af selv-antigener samt antigener stammer fra commensal organismer. Afbrydelse af denne immun homøostase kan føre til kronisk betændelse og udviklingen af autoimmunitet. Dendritiske celler (DCs) er de professionelle antigen-præsenterer celler af den medfødte immunsystem involveret i aktivering naive T-celler til at indlede en immunrespons mod fremmede antigener. DCs kan imidlertid også opdeles i TolDCs, der fungerer til at opretholde og fremme T-celle tolerance og til at undertrykke effektor celler bidrager til udviklingen af enten autoimmun eller kronisk inflammation betingelser. Den seneste avancement i forståelsen af TolDCs antyder, at DC tolerance kan opnås ved at modulere deres differentiering betingelser. Dette fænomen har ført til enorme vækst i udviklingen af TolDC terapier for talrige immune lidelser forårsaget grund til at bryde i immuntolerance. Vellykket undersøgelser i prækliniske autoimmunitet murine modeller har yderligere valideres den immunterapeutisk nytte af TolDCs i behandlingen af autoimmune sygdomme. I dag er blevet TolDCs en lovende immunterapeutisk værktøj i klinik for genindsætte immuntolerance i forskellige immune lidelser ved at målrette patogene autoimmune reaktioner mens beskyttende immunitet intakte. Selv om en bred vifte af strategier er blevet foreslået af flere laboratorier til at fremkalde TolDCs, er der ingen konsistens i kendetegner den cellulære og funktionelle Fænotypen af disse celler. Denne protokol indeholder en trinvis vejledning til udvikling af knoglemarv-afledte DCs i stort tal, en unik metode til at differentiere dem i TolDCs med et syntetisk triterpenoid 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic syre-difluoro-propyl-AMID (CDDO-DFPA), og de teknikker, der anvendes til at bekræfte deres fænotype, herunder analyser af væsentlige molekylære signaturer af TolDCs. Endelig viser vi en metode til at vurdere TolDC funktion ved at teste deres immunosuppressive svar i vitro og vivo i prækliniske model af multipel sklerose.

Introduction

Dendritiske celler (DCs) blev er en integreret del af det medfødte immunforsvar og først opdaget og præget af Ralph Steinman og Zanvil Cohn i 1973 som primære professionelle antigen præsentere celler1. DCs har vist sig at spille en vigtig rolle i immun aktivering ved at præsentere forarbejdede antigener til T-celler og B-celler via store histocompatibility komplekser (MHC) i den sekundære lymfoide organer til at sammenkæde de medfødte og adaptive immunforsvar2. I pattedyr immunsystemet findes der mindst to kategorier af DCs, som er blevet beskrevet som myeloid DCs og plasmacytoid DCs (fremdaterede)3. Myeloid DCs, også kendt som konventionel DCs (cDCs), er karakteriseret ved udtryk for CD11c og kan differentieres som umodne DCs (iDCs) in vitro fra knoglemarv stamceller eller perifert blod monocytter ved hjælp af granulocyt-makrofag-koloni-stimulerende faktor (GM-CSF) og IL-4 i murine eller menneskelige arter, henholdsvis4.

Aktivering 'fare' signaler, såsom patogen-associeret molekylære mønstre (PAMP) eller skade-associeret molekylære mønstre (FUGTIG), vil drive iDCs modning mod immunogen DCs som modne DCs (mDCs) via bindende forskellige mønster anerkendelse receptorer DC overflade5. Immunogen DCs yderligere prime naive T-celle spredning og differentiering gennem opregulering af MHCII2, costimulatory ligander (CD80, CD86 og CD40)6, cytokiner og andre opløselige mæglere7. En kaskade af pro-inflammatoriske mediator produktion fra immunogen DCs er afgørende for cytokin-medieret T-Celledifferentiering. For eksempel, både IFN-γ og IL-12 er nødvendige for Th1 differentiering8 og IL-1, IL-6 og IL-23 er kritisk for naive T-celle polarisering mod Th17 celler9. Selv om modne DCs reagere på udenlandske antigener, kan ukontrolleret DC aktivering af selv-antigener forårsage tolerance ablation og fremme udviklingen af autoimmune sygdomme ved at generere autoreactive T celler hvis aktivering fører til væv destruktion10 .

Nylige rapporter har fastsat klare beviser for DC plasticitet, eksemplificeret af deres evne til at interagere med forskellige signaler i deres væv mikromiljø og differentiere i særskilte effektor/suppressor DC undersæt. De anti-inflammatoriske mediatorer, IL-1011, TGF-β12og HO-113 har vist sig at spille en vigtig rolle i immunsuppression ved at inducere tolerogenic DCs (TolDCs). Disse TolDCs erhverve myndighedsopgaver og undertrykke T-celle spredning14. Desuden, manglen fælles stimulation af DCs og produktion af anti-inflammatoriske mediatorer fra TolDCs både bidrage til induktion af regulerende T-celler (Tregs) og også effektivt hæmmer både Th1 og Th17 differentiering og ekspansion15. I sidste to årtier, er den terapeutiske potentiale af TolDCs blevet rapporteret af flere efterforskere. I disse undersøgelser, administration af ex-vivo genereret TolDCs ikke kun forbedret patologiske symptomer i forskellige prækliniske modeller af autoimmune sygdomme16 men også ført til udviklingen af immuntolerance i patienter17 ,18. Interessant, i dag TolDCs terapi har været betragtet som et alternativ eller tillægsbehandling tilgang til autoimmune sygdomme i adskillige kliniske forsøg, herunder type 1 diabetes mellitus19, reumatoid arthritis20, 21, multipel sklerose (MS)22,23,24, og Crohns sygdom25.

Der er en række protokoller, der har været ansat til at udvikle TolDCs og flere laboratorier har rapporteret metoder til generation og fænotypiske karakterisering af TolDCs. Disse metoder kan anvendes, reproducerbar generere TolDCs i vitro fra hæmatopoietisk ophav og stabilt fastholde dem i en tolerogenic tilstand i vivo26,27,28,29. IDCs kan omregnes til TolDCs ved udsættelse for forskellige immunmodulerende farmakologiske midler eller anti-inflammatoriske cytokiner. For eksempel, er D3-Vitamin en velkendt farmakologiske agent kendt at forøge IL-10 produktion og undertrykke IL-12 sekretion fra DCs og dermed styrke deres immunosuppressive funktion30. Desuden, når DCs udsættes for potent inflammatoriske stimuli, såsom lipopolysaccharides (LPS), flere farmakologiske stoffer såsom dexamethason31, rapamycin32og kortikosteroider33 har vist sig at fremkalde den TolDC fænotype ved at nedsætte DC overflade udtryk for CD40, CD80, CD86 og MHCII34. IL-10 og TGF-β er de mest studerede anti-inflammatoriske cytokiner fremkalde DC tolerance35 og samtidig eksponering for begge disse cytokiner har vist sig at fremkalde en tolerogenic fænotype i DCs36.

Siden tolerogenic DC er defineret af funktionelle kendetegn, snarere end af fænotypiske markører, der er et stort behov at udvikle en konsekvent metode for cellulære og funktionel karakterisering af TolDCs. Desuden en streng og konsekvent protokol skal fastsættes for ensartet vurdering og karakterisering af tolerogenic DC fænotype, hvis vi skal effektivt og reproducerbar sammenligne nye agenser evne til at fremkalde TolDC fænotype i den laboratorium. Her give vi en detaljeret protokol med trinvise metoder til at isolere iDCs fra hæmatopoietisk stamfaderen til mus og efterfølgende analysere effekten af nye agenter under evaluering for deres evne til at konvertere iDCs i TolDCs, giver en robust funktionel og fænotypiske karakterisering af TolDCs både in vitro- og in vivo. Denne beskrivelse indeholder en omfattende metode til at karakterisere TolDCs af deres overflade ligander, cytokin-profil og immunosuppressive funktioner i vitro. Vi tilbyder også et eksempel på en metode til at udforske den potentielle terapeutiske anvendelse af disse TolDCs i en præ-klinisk model af MS, eksperimentelle autoimmune encephalomyelitis (EAE). Denne etableret protokol vil hjælpe efterforskere at evaluere nye agenser evne til at fremme induktion af TolDCs og vil lette indsatsen for at udvide anvendelsesområdet for TolDC terapeutiske udvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle undersøgelser blev udført i overensstemmelse med procedurer, der er godkendt af den Case Western Reserve University School of Medicines institutionelle Animal Care og brug udvalget.

1. Forbered knoglemarv-afledte dendritiske celler (BMDCs)

  1. Sterilisere alle kirurgiske instrumenter via autoklavering og udføre eksperimentet i klasse II biologiske sikkerhed kabinet med bevilgede sikkerhedsprocedurer.
  2. Aflive C57BL/6 mus 8-10 uger gammel ved hjælp af CO2 kammer. Placer musen på en dissekere bord og skyl med 70% ethanol. Punktafgifter tibia-fibula og lårben ben ved hjælp af en kirurgisk saks og placere dem med 70% ethanol i en 10 cm kultur parabol.
  3. Bruge kirurgiske knive og pincet til at dissekere væv væk så meget som muligt på låget af 10 cm kultur parabol og isolere forbenede og lårben at placere dem med 70% ethanol i en 6 cm kultur parabol.
  4. Bruge kirurgiske knive til at trimme begge ender af skinneben og lårben. Bruge 3 mL PBS i 3 ml sprøjten med en 23G nål til at skylle indholdet af knoglemarv fra den ene ende af knogler til en konisk tube indeholder 12 ml PBS. Gentag dette trin 3 x for hver ende af knogler.
  5. Der centrifugeres cellesuspension ved 300 x g i 5 min.
  6. Fjern supernatanten og resuspenderes celle med 1 ml ACK lysing buffer for 5 minutter til at fjerne røde blodlegemer.
  7. Tilføje 9 ml PBS til at fortynde ACK lysing buffer, og der centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter.
  8. Fjern supernatanten og resuspend med 10 ml næringssubstratet (RPMI-1640 plus L-glutamin, 10% FBS, 1% ikke-essentiel aminosyre (100 x), 10 mM HEPES, 50 nM β-mercaptoethanol og 5% penicillin/streptomycin).
    Bemærk: Endotoxin niveau må være mindre end 0.1 EU/ml i FBS.
  9. Passere en 40 μm celle si cellesuspension og tage 20 µl af cellesuspension og bland med 80 µl af trypan blå til at tælle antallet af levende celler ved hjælp af forskellige.
  10. Justere celle nummer til 1 x 106 celler/ml med 15 ng/ml GM-CSF og 10 ng/ml IL-4.
  11. Plade 3 ml 1 x 106 celler/ml i hver brønd af 6-godt plade og inkuberes celler ved 37 ° C, 5% CO2og 95% luftfugtighed i CO2 inkubator.
    Bemærk: Knoglemarv celler fra en mus er omkring 3-5 x 107 celler, der angiver, at det kan ligge fra 2 til 3 6-godt plader.
  12. På dag 3, fjerne alle 3 ml kultur medium fra hver brønd, tilføje 2 ml frisk PBS i hvert hul, og derefter forsigtigt swirl plade for at sikre, at fjerne alle de ikke-tilhænger celler.
  13. Erstatte 3 ml frisk næringssubstratet med 15 ng/ml GM-CSF og 10 ng/ml IL-4 i hver brønd. Inkuber celler ved 37 ° C, 5% CO2og 95% luftfugtighed i CO2 inkubator.
  14. På dag 5, direkte tilføje en anden 3 ml frisk næringssubstratet med 15 ng/ml GM-CSF og 10 ng/ml IL-4 i hver brønd. Inkuber celler ved 37° C, 5% CO2, og 95% luftfugtighed i CO2 inkubator.
    Bemærk: Det samlede volumen i hver brønd er nu 6 ml.
  15. På dag 7, skal du sætte hele pladen i isbad i 10 min. Forsigtigt afpipetteres næringssubstratet i hver brønd til at løsne løst tilhænger BMDCs som iDCs i suspension.
    Bemærk: De vedhængende makrofager er stadig knyttet til pladen. Lav temperatur og forsigtigt procedurer er nøglen til at undgå DC aktivering for at påvirke yderligere eksperimenter.
  16. Centrifugeres cellesuspension ved 300 x g i 5 minutter og resuspend med friske næringssubstrat for yderligere eksperimenter.
    Bemærk: BMDCs kan identificeres med fluorescens-mærket CD11c antistof ved flowcytometri og vi viste vores gating strategi af BMDCs for yderligere eksperimenter i figur 1.

2. karakterisere TolDC gen- og Protein profil

  1. Plade 2 ml 1 x 106 BMDCs/ml pr. brønd i 6 godt-plade med næringssubstratet i tilstedeværelse eller fravær af 100-400 nM CDDO-DFPA for inkubere 1 h ved 37 ° C, 5% CO2 og 95% luftfugtighed i CO2 inkubator.
    Bemærk: CDDO-DFPA, en syntetisk triterpenoid, er en nuklear factor (erythroid-afledte 2) - som - 2 faktor (Nrf2) inducer og nuklear factor-κB (NF-κB)-hæmmer. Anvende andre agenter for induktion af TolDCs fra iDCs, IL-10, vitamin D3, dexamethason eller BAY 11-7085, og ændre dette trin til en optimal tilstand for hver agent.
  2. Tilføje 10 eller 100 ng/ml af LP'ER til inkubere 4-24 timer for at fremkalde mDCs (Inkubationstiden er anderledes på grund af mRNA eller protein måling).
  3. Forsigtigt afpipetteres næringssubstratet i hver brønd og høste cellesuspension ved hjælp af 1 ml pipette. Der centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter til at indsamle de celler og supernatanten, henholdsvis.
  4. Analysere de overflade ligander fra celle pellets ved flowcytometri, såsom stimulerende ligander: CD40, CD80, CD86, MHC-II, OX40L, ICOSL eller hæmmende ligander: PD-L1, PD-L2, ILT3, ILT4.
  5. Isolere RNA fra celle pellets og analysere RNA og supernatanten prøver til cytokin profilen og gen og protein niveauer af kvantitative real-time PCR (qRT-PCR) og ELISA, henholdsvis.
    Bemærk: For eksempel, inflammatoriske cytokiner: TNF-α, IFNγ, udg.-1, IL-6, IL-12, og IL-23 eller anti-inflammatoriske cytokiner: IL-4, IL-10, IL-15, TGF-B1 og HO-1.

3. vurdere funktionen af TolDCs In Vitro og In Vivo

  1. T-celle Syngeneic spredning analyse
    1. Sterilisere alle kirurgiske instrumenter via autoklavering og udføre eksperimentet i klasse II biologiske sikkerhed kabinet med bevilgede sikkerhedsprocedurer.
    2. Forberede MACS buffer ved hjælp af 0,5% bovint serumalbumin (BSA) og 2 mM EDTA i 500 ml PBS. Sterilisere bufferen ved filtrering gennem et 0,2 µm filter.
      Bemærk: Hold buffer på isen under de følgende eksperiment.
    3. At opnå CD4+ T celler, aflive OT-II T-celle receptoren (TCR) Transgene mus 8-10 uger gammel ved hjælp af CO2 kammer. Placer musen på en dissekere bord og skyl med 70% ethanol. Isolere milt fra venstre side af maven ved hjælp af kirurgiske saks og pincet.
    4. Læg milt med 2 ml PBS i en 6 cm kultur fad og bruge bagsiden af push-stick i 3 ml sprøjten til hakkekød milten ved at passere en 40 μm celle si.
    5. Indsamle cellesuspension og centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter.
    6. Resuspenderes celle i 400 μl MACS buffer.
    7. Tilsæt 100 μl af CD4+ T-celle Biotin-antistof Cocktail ved 4° C i 5 minutter.
      Bemærk: Den cocktail antistof binder på andre celletyper undtagen CD4+ T-celler, såsom CD8a, CD11b, CD11c, CD19, CD25, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, Anti-MHC klasse II, Ter-119 og TCRγ/δ.
    8. Tilsæt 300 μl af MACS buffer og 200 µl anti-Biotin perler (Table of Materials) ved 4° C i 10 minutter.
    9. Sted kolonnen sammensat af ferromagnetisk sfærer (Tabel af materialer) og før adskillelse Filter sammen i det magnetiske felt og skyl det med 3 ml af MACS buffer.
    10. Tilføje 9 ml MACS buffer i celler og centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter.
    11. Resuspenderes celle i 3 ml af MACS buffer og Anvend på kolonnen. Indsamle gennemstrømnings-indeholdende CD4+ T celler.
    12. Vaske kolonne med en anden 3 ml af MACS buffer og også indsamle gennemstrømnings.
    13. For at opnå milt pan DCs, aflive C57BL/6 mus 8-10 uger gammel ved hjælp af CO2 kammer. Placer musen på en dissekere bord og skyl med 70% ethanol. Isolere milt fra venstre side af maven ved hjælp af kirurgiske saks og pincet. Læg milten i en 6cm kultur fad indeholdende 2 ml af collagenase D løsning (2 mg/ml collagenase D opløst i HBSS der indeholder calcium, magnesium).
    14. Indsprøjte 1 ml af collagenase D løsning til milten to gange med en 1 ml sprøjte og en 25G kanyle. Skær milten i små stykker med en lille saks.
    15. Ryst og inkuberes ved stuetemperatur i 25 minutter.
    16. Tilsæt 500 μl af 0,5 M EDTA ved stuetemperatur i 5 minutter.
      Bemærk: Trin fra 3.1.13-3.1.14 er afgørende for at øge udbyttet af DCs.
    17. Nu bruge bagsiden af push-stick i 3 ml sprøjten til hakkekød milt gylle ved at passere en 40 μm celle si og indsamle cellesuspension ved centrifugering ved 300 x g i 5 minutter.
    18. Resuspenderes celle i 350 µl MACS buffer, 50 μl af FcR blokering reagens og 100 μl af Pan dendritiske celle Biotin-antistof Cocktail ved 4° C i 10 minutter.
      Bemærk: Det antistof cocktail mod antigener, der ikke er udtrykt af DCs.
    19. Cellerne vaskes ved at tilføje 9 ml MACS buffer, og der centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter.
    20. Resuspenderes celle i 800 μl MACS buffer og tilføje 200 µl anti-Biotin perler ved 4 ° C i 10 minutter.
    21. Gentag trin fra 3.1.9-3.1.11 at indsamle DCs.
    22. Vask kolonne med en anden 3 ml af MACS bufferen to gange og også indsamle gennemstrømnings.
    23. Behandle 2 x 105 DCs/ml i tilstedeværelse eller fravær af 100-400 nM CDDO-DFPA ved 37 ° C i 1 time seperat, etiket CD4+ T-celler (1 x 107/ml) med 1 μM CFSE ved 37 ° C i 15 minutter, vask med PBS , og justere volumen for at få slutkoncentration på 2 x 106 T celler/ml.
    24. Næste, i en 96-brønd plade, co kultur 100 μl af de behandlede dendritiske celler med den samme mængde af CFSE-mærket CD4+ T celler, både indsamlet fra ovenstående trin til at få 1:10 ratio. Nu tilsættes 100 ng/mL ægalbumin (æg) peptid 323-329 pr. brønd og foranstaltning CFSE intensiteten af T-celler ved flowcytometri efter 2-3 dages inkubation.
      Bemærk: Den celle numre og forholdet af DCs og T celler er blevet optimeret fra vores tidligere arbejde37.
  2. Fremkalde passiv EAE ved at indsprøjte BMDCs pulserende med Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG) (35-55)
    1. Plade 2 ml 1 x 106 BMDCs/ml pr. brønd i 6 godt-plade med næringssubstratet i tilstedeværelse eller fravær af 100-400 nM CDDO-DFPA for inkubere 1 hr.
    2. Tilføje 10 ng/ml af LPS for kvægbruget 24 timer.
    3. Tilsættes 100 μg/ml af MOG (35-55) for kvægbruget 4 timer.
    4. Høste cellesuspension og centrifugeres ved 300 x g i 5 minutter.
    5. Resuspenderes celle med PBS og tælle cellerne.
    6. Subkutant injicere 200 µl af 2 x 106 celler til 8-10 uger gamle C57BL/6-hunmus (100 μl i hvert bagben).
    7. På dagen for BMDC injektion og 48 timer. senere, injicere 200 ng af kighoste toksin (PTX) i hvert mus.
    8. Gentag trin 3.2.6-3.2.7 én gang hver uge i 4 uger i træk.
    9. Vurdere de kliniske symptomer på EAE dagligt ved hjælp af standard kriterier37 (0,5-halte enden, 1-halte hale, 2-moderat hind lemmer svaghed, 3-svær hind lemmer svaghed, 4-komplet hind lemmer lammelse, 5-quadriplegia eller døende stat, 6-død).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den differentiering og udvælgelse af BMDCs:

Knoglemarv stamceller var kulturperler i komplet RPMI medium tilstedeværelse af GM-CSF og IL-4 til at differentiere i iDCs i 7 dage (figur 1A). På dag 1, celler var små i størrelse og viste sfæriske morfologi. Vask med PBS, før udskiftning af frisk medium på dag 3 hjalp celler til form klynger og også øget befolkningen i CD11c+ celler. Dag 4, BMDCs blev udvidet i størrelse og indledt klynge dannelse. Overholdt makrofager blev også ombygget og observeret i bunden af pladen med en aflang form. På dag 5, er store mellemstore klynger af BMDCs dannet. Dag 6, blev et stort antal semi-tilhænger og flydende BMDCs også observeret. BMDCs blev høstet på dag 7 og analyseret ved flowcytometri for CD11c udtryk som en specifik markør for murine DCs. Som vist i en repræsentativ flow flowcytometri plottet i figur 1B, ca 83.6% af BMDCs udtryk for CD11c blev opnået ved denne metode.

Induktion og genetisk karakterisering af TolDCs:

Nogle af agenter kendt for at inducere TolDCs, såsom vitamin D338 og dexamethason39, er kendt for at ned-regulere udtrykket af DC overflade ligander, herunder MHC II og costimulatory molekyler, CD40, CD80 og CD86. Derimod i forbindelse med enten LP'ER eller CD40L-induceret modning af DCs viste calcineurin hæmmere ciclosporin A og FK506 ingen effekt på udtryk for CD83, CD80, CD86 og MHC II33. Som det fremgår af analysen af handelsstrømmen flowcytometri, havde induktion af TolDC af CDDO-DFPA ingen signifikant effekt på LPS-induceret overflade ligand udtryk for DCs, herunder CD80, CD86, MHC II, PD-L1 og CD40. (Figur 2).

Desuden, den sammenlignende transkriptom og cytokin analyse af BMDCs behandles med eller uden CDDO-DFPA i tilstedeværelse eller fravær af LP'ER afbildet moduleret inflammatoriske gen profil. CDDO-DFPA behandling betydeligt reduceret LPS induceret pro-inflammatoriske cytokine gener såsom IFN-γ, IL-12, EDN1, TNFα, IL-6 og IL-23 (figur 3A-3F). Disse er kendt cytokiner for Th1 (IFN-γ og IL-12) og Th17 (IL-6 og IL-23) celle differentiering. Endvidere CDDO-DFPA behandles BMDCs viste øget udtryk for anti-inflammatorisk cytokin gener som IL-4, IL-10, TGF-β og HO-1 (figur 4A-4D). Disse anti-inflammatoriske gener kendt autoimmunitet modulator ved at fremme Th2 (IL-4) og langsomme (IL-10 og TGF-β) Celledifferentiering. 40 her er det vigtigt at bemærke, at den særprægede IL-12−; IL-10+ cytokin produktion36, induktion af HO-1 udtryk13, og hæmning af EDN-141 induceret af CDDO-DFPA behandling, er alle kendt til at godkende DCs tolerogenic funktion.

Cellulære og funktionel karakterisering af TolDCs in vitro

DC-medieret T celledelingen er kendt for at være udløst af engagement af costimulatory overflade ligand samt udskillelsen af cytokiner og opløselige mæglere7. Dog TolDCs hæmmer T-celle svar gennem flere mekanismer: ved at inducere T-celle anergy, ved aktivt at fremme fjernelsen af autoreactive celler og ved at fremme polariseringen af naive T celler til Tregs42. Vi har allerede rapporteret den funktionelle karakterisering af CDDO-DFPA induceret TolDCs37. T-celle anergy og sletning af autoreactive T celler kan analyseres uafhængigt af kontrol overflade markører eller Annexin V/7-ald farvning. Men vi indirekte bekræftet denne fænotype ved måling af T celle spredning indeks. For dette, vi udnyttet C57BL/6 OTII Transgene mus T-celler og udsat dem for syngeneic DCs udvundet fra C57BL/6 mus og behandlet med eller uden CDDO-DFPA. Disse DCs blev vasket og co kulturperler med CFSE farves T celler med æg peptid. Vi observeret en betydelig reduktion i T-celle spredning af CDDO-DFPA forbehandlet DCs, hvilket tyder på deres tolerogenic fænotype (figur 5).

In vivo funktionelle karakterisering af TolDCs i en prækliniske model af autoimmunitet

Endelig kan funktionaliteten af DFPA-induceret TolDCs testes i nogen af en række prækliniske i vivo modeller karakteriseret autoimmune eller inflammatoriske funktioner. Siden, EAE er en bredt accepteret prækliniske murine model af kliniske immun-medieret centralnervesystemet sygdom, MS43, vi udnyttede dette i vores nuværende undersøgelse. For yderligere at undersøge i vivo funktionalitet af CDDO-DFPA induceret TolDCs, vi udfordret dem i en prækliniske murine model af passive EAE. For dette, var BMDCs kulturperler med eller uden CDDO-DFPA i tilstedeværelsen af LPS og MOG (35-55). Disse celler blev derefter indsprøjtes flere gange som planlagt protokol afbildet i figur 6A og mus blev rutinemæssigt observeret for manifestation af kliniske tegn. Som forventet, pulserende LP'ER og MOG (35-55) BMDCs viste kliniske symptomer på EAE, dog; CDDO-DFPA primet BMDCs behandlede gruppe viste forsinket udbrud af sygdom med betydeligt reduceret kliniske symptomer (fig. 6B). Disse resultater validere immunosuppressive Fænotypen af TolDCs induceret af CDDO-DFPA behandling.

Figure 1
Figur 1: udvikling og fænotypiske karakterisering af BMDCs: (A) knoglemarv celler blev skyllet fra skinnebenet og lårbenet knogler af C57BL/6 mus og yderligere opdelte til BMDCs. En passende celle klynge dannelse blev sporet ved lysmikroskopi i hele den periode af differentiering (skala barer, 100µm). (B) BMDCs differentiering blev bekræftet af CD11c overflade udtryk, som analyseret af FACS. Grafer skildrer procentdelen af den udvidede CD11c+ celle befolkning. C Gating strategi BMDCs. celler blev først låge for at udelukke vragrester (FSC vs SSC). En doublet udstødelse gate blev udnyttet til at gate på slåbrokker celler (FL2-W vs FL2-A). Inden for singlet celler, var levende celler gated på 7-ald plot (7-ald vs FSC). Derefter blev cellerne yderligere analyseres og låge på CD11c udtryk. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: DC celle overflade ligand udtryk er uændret ved CDDO-DFPA. Celler var forbehandlet i tilstedeværelse eller fravær af CDDO-DFPA (200 nM) for 1 time før stimulation med LP'ER (100 ng/ml) for 24 timer. Celle overflade udtryk for CD80, CD86, MHC II, PD-L1 og CD40 blev analyseret ved flowcytometri. Dette tal er blevet ændret fra Videnskabelige rapporter 7, artikelnummer: 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. Gengivet og genudgives med ophavsret tilladelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: CDDO-DFPA ændret den genetiske og protein Fænotypen af immunogen DCs. BMDCs var forbehandlet i tilstedeværelse eller fravær af CDDO-DFPA (50-400 nM) for 1 time før tilsætning af LP'ER (100 ng/ml), og enten høstet for RNA udvinding (4 HRS.) eller tilladt at betingelse næringssubstrat for 24 timer. forud for indsamling til cytokin analyser. Niveauet af IL-12 (B), TNFα (D), IL-6 (E) og IL-23 (F) blev målt ved qRT-PCR og ELISA. Der henviser til, at IFN-γ (A) blev målt af qRT-PCR og EDN-1 (C) af ELISA alene. Resultaterne udtrykkes som gennemsnit ± SD tre forsøg. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001 sammenlignet med de LP'ER-behandlede grupper. Uparret student t-test. Dette tal er blevet ændret fra Videnskabelige rapporter 7, artikelnummer: 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. Gengivet og genudgives med ophavsret tilladelse." Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: CDDO-DFPA induceret TolDCs fænotype bekræftet ved gen- og protein ekspression. BMDCs var forbehandlet i tilstedeværelse eller fravær af CDDO-DFPA (10-400 nM) for 1 time før tilsætning af LP'ER (100 ng/ml), og celler blev høstet for RNA udvinding efter 24 timer. Niveauet af IL-4 (A), IL-10 (B), og TGF-β (C) blev målt ved qRT-PCR. (D) protein cellelysater blev indsamlet på 12 timer. for analyser og niveauer af HO-1 og β-actin var udtryk bestemt af Western blotting. Resultaterne udtrykkes som gennemsnit ± SD tre forsøg. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001 sammenlignet med de LP'ER-behandlede grupper. Uparret student t-test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: CDDO-DFPA udsat DCs undertrykke T celledelingen. DCs var forbehandlet med CDDO-DFPA (100-400 nM) i 1 time kun, så vasket og co kulturperler med CFSE farves T-celler på en 1:10 ratio. (A) milt T-celler og DCs blev isoleret fra C57BL/6 OTII Transgene mus og C57BL/6 mus, henholdsvis. CDDO-DFPA massiv DCs var Co kulturperler med CFSE farves T celler med (med) eller uden (w/o) aeg tilføjelse under inkubation. T-celle spredning blev bestemt ved flowcytometri på dag 2. Grafer skildrer procentdelen af dividere T celler i forhold til tal T celledeling. Dataene er en repræsentation af 3 uafhængige forsøg. Dette tal er blevet ændret fra Videnskabelige rapporter 7, artikelnummer: 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. Gengivet og genudgives med ophavsret tilladelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: MOG primet DC-induceret passiv EAE er ophævet ved TolDCs. (A) EAE induktion af MOG (35-55)-pulserende BMDCs. modne BMDCs blev behandlet i tilstedeværelse eller fravær af CDDO-DFPA (400 nM) og efterfølgende pulserende med MOG (35-55) til 4 timer. Ialt 200 µl af 2 × 106 celler blev administreret af subkutan injektion i regionen flanke af C57BL/6 mus én gang hver uge til i alt fire injektioner. Hver gang, blev PTX administreret af i.p. injektion straks og igen 2 dage senere (4th cyklus dag 0). (B) kliniske scoringer var indspillet efter alle fire injektioner, ved hjælp af standard kriterier. Alle data, der blev præsenteret som den gennemsnit ± S.E.M. * P < 0,05. Flere t-test med Holm-Sidak analyse (n = 7 mus i hver gruppe). Dette tal er blevet ændret fra Videnskabelige rapporter 7, artikelnummer: 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. Gengivet og genudgives med ophavsret tilladelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dette papir beskriver en effektiv protokol, der kan bruges til reproducerbar til at generere iDCs og senere differentiere dem i TolDCs, og vi foreslår, at dette kan anvendes til at vurdere nye molekylære mål agenter evne til at fremkalde TolDC fænotype. Som beskrevet i denne rapport, vi har fulgt en sekvens, hvor vi først analyseres TolDC udtryk af overflade ligander ved flowcytometri, efterfulgt af en vurdering af DC cytokin profilen som målt ved qRT-PCR og ELISA. Endelig blev funktionen immunregulerende af TolDCs bekræftet ved at demonstrere deres evne til at reducere T-celle spredning in vitro- og deres effektivitet til at undertrykke autoimmunitet in vivo, ved hjælp af prækliniske murine EAE model af MS.

I vores protokol, var iDCs genereret og differentieret fra murine knoglemarv prækursorer med kombinationen af GM-CSF og IL-4. Andre protokoller har brugt former-lignende tyrosin kinase 3 ligander (Flt3L) i dyrkningsmediet for at generere iDCs44. Selv om brugen af Flt3L øger udbyttet af iDCs, tage disse iDCs normalt 2 dage mere (9 dage) til at høste, i forhold til GM-CSF/IL-4 tilsætning (7 dage)44. Endnu vigtigere, iDC genereret fra Flt3L ofte differentiere i begge cDCs (CD8- og CD8+) og fremdaterede45 der var funktionelt og fænotype ækvivalenter til steady-state DCs in vivo. Dog GM-CSF/IL-4 uvægerligt inducerer differentiering af iDC mod cDCs (CD8-) kun44 og under modning, de viste lignende tegn af inflammatoriske DCs46. Det er bemærkelsesværdigt at vide, at GM-CSF/IL-4 er ofte brugt i kliniske forsøg og grundforskning på grund af fordelen af at differentiere DCs fra monocytter eller CD34+ progenitorceller44. Det har vist sig at iDCs genereret fra disse to metoder producerer morfologisk forskellige celler, som også besidder forskellige celle overflade markører og udstille særskilte cytokin profiler ved deres aktivering. Desuden varierer TolDCs induceret af disse metoder i deres evne til at overføre svar på kemotaktisk faktorer og fremkalde antigen-specifikke T-celle svar44,45. Vi forstår, at CD8+ DCs kan udvise mere potentiale i TolDC induktion på grund af deres unikke kapacitet af cross-tolerance47. Men det er derefter nødvendigt yderligere celle sortering fra BMDCs afledt af Flt3L til at undersøge de specifikke CD8+ DC undersæt. Derudover siden, GM-CSF/IL-4 induceret BMDCs er overlegen på T-celle stimulation og produktion af inflammatoriske mediatorer efter LPS behandling44,45, fandt vi denne strategi gav mere reproducerbare resultater vores eksperimenter.

BMDCs afledt af GM-CSF/IL-4 start at udtrykke CD11c omkring dag 4 og berige udtryk efter dag 648. Denne kultur procedure kan opretholdes, indtil dag 10-12 med en lavere plating tæthed af knoglemarv celler og en lav dosis af GMC-SF på dag 8-1049. I denne protokol, blev CDDO-DFPA (syntetisk triterpenoid) og LP'ER tilføjet i tandem som agenter for at fremkalde DC tolerance og modning, henholdsvis. Vi har for nylig rapporteret, at iDCs høstet fra kulturer udnytter denne metode af BMDC generation udviser en funktionel TolDC fænotype når forbehandlet med CDDO-DFPA37. Det er bemærkelsesværdigt, at CDDO-DFPA, som kun blev føjet til kulturer efter iDC høst (dag 7)37, i modsætning til agenter som vitamin D3, som skal føjes til kulturer flere gange under iDC differentiering (dag 2, 4, 6)50. Desuden, denne induktion af TolDCs af D3-vitamin kan afhænge af forskellige mekanismer, der skal iværksættes både under og efter iDC differentiering51. Vores data tyder på, at tilføje CDDO-DFPA under iDC differentiering havde ingen indflydelse på renheden af CD11c + DCs men dosis-afhængigt lavere udbytte af iDCs på dag 7 (data ikke vist). Vores analyser foreslår også, at den højere koncentration af CDDO-DFPA bruges i disse eksperimenter kan være giftige for knoglemarv stamceller, selv om iDC viste normale levedygtighed med denne koncentration af CDDO-DFPA37. Det forventes, at TolDC induktion kan optimeres ved omhyggelig analyser af virkningen af timingen og længden af eksponering for agenter som CDDO-DFPA.

Det er vigtigt at overveje alternative metoder og mekanismer gennem hvilke iDCs kan være fremkaldt til mDCs af andre end LP'ER, CD40L, TNF-α og IFN-γ52. DC modning af LP'ER gennem Toll-lignende receptorer 4(TLR4) fører til aktivering af flere transkriptionsfaktorer, herunder nuklear factor-κB (NF-κB), p38 mitogen-aktiveret protein kinase (p38 MAPK), c-Jun N-terminale kinase (JNK), og ekstracellulære signal-reguleret protein kinase (ERK1/2). Modning af DCs CD40L og TNF-α gennem CD40 og TNF-receptorer inducerer henholdsvis NF-κB vej. Derimod IFN-γ stimulerer en anden vej, herunder aktivering af Janus kinase (JAK), tyrosin kinase (TYK), og signal transducer og aktivator af transskription proteiner (statistik), og disse downstream effekter er også suppleret med aktivering NF-κB vej52. Derudover gen expression profil CD40L/TNF-α-baserede DC modningsproces antyder, at disse DCs polarisere T celler mod en Th2 celle respons53, er DC modning af IFN-γ stærkt forudindtaget mod en Th1 celle respons54. Derfor, disse andre induktorer af DC modning, som er knyttet til differentiering mod specifikke T celle subsets er ikke ansat i denne protokol.

Flere rapporter har vist, at ex vivo-differentieret DCs er i stand til at inducere det fulde spektrum af EAE kliniske symptomer og patologi i mus55. Metoden for passiv EAE induktion af ex vivo aktiveret DCs er blevet vedtaget med forskellige ændringer af forskellige laboratorier. En kombination af passive og aktive EAE induktion af administration af MOG primet BMDCs, 7 dage før vaccination med MOG og komplet Freund's adjuvans (CFA) resulterer i højere klinisk symptom score (peak kliniske score: 3.5) i forhold til den passive EAE Induktion af administrationen af MOG primet BMDCs alene (peak kliniske score: 2)56. Resultater med denne metode kombinerer MOG primet BMDCs med MOG immunisering tyder på, at sygdom indsættende sker på dag 9 efter vaccination med MOG og CFA56. Da det vides, at CFA forårsager betydelig inflammation i stedet for administration57, har vi imidlertid udnyttede passiv EAE induktion af administration af DCs alene i vores protokol for at effektivt analysere effekten af TolDCs under EAE. For at yderligere bekræfte den funktionelle Fænotypen af TolDCs, bør man også teste dem i undertrykke kliniske symptomer på aktiv EAE mus. Ruten administration af DCs er også afgørende for induktion af EAE symptomer58. Som rapporteret af vores lab og af andre, subkutan injektion af BMDCs i regionen flanke af C57BL/6 mus en gang om ugen for et samlet beløb på 3-4 injektioner inducerer en peak kliniske score på EAE omkring 2-2.5 med reproducerbare sygdom debut på dag 11-1237 ,58. Vi givet et kort klip for at demonstrere de forskellige kliniske symptomer mellem aktiv og passiv EAE induktion (Video 1).

De anerkendte begrænsninger af vores protokol omfatter den tid, der kræves af metoderne og afhængigheden af en ikke-fysiologisk relevante mikromiljø BMDC differentiering. Men mens antistoffet beriget kolonne adskillelse metoder til indsamling til DCs og T celler fra murine milten kan være mere tid effektiv, det lider af et lavt udbytte af den ønskede DC befolkning. Fordelen ved metoden af knoglemarv-afledte DC udvikling er således log skala højere udbytte af DC populationer i forhold til antistof kolonne adskillelse fra hele milten. Som nævnt ovenfor, DCs genereret kræver i vitro ved denne metode en høj koncentration af cytokin tilskud, som ikke er fysiologisk relevante for DCs i vivo mikromiljø59 og også sikrer ikke den langsigtede bæredygtighed af DC. GM-CSF bruges i vores protokol er heller ikke en afgørende cytokin for normale DC differentiering i vivo60. Ikke desto mindre, den foreslåede BMDC generation protokol reproducerbar giver en høj brøkdel af funktionelt TolDCs og skal ses som en meget pålidelig og reproducerbar metode til at generere funktionelle DCs med tolerogenic egenskaber.

Til sidst, kan en TolDCs, genereret fra protokollen beskrevet her karakteriseres effektivt ved at vurdere deres gen- og protein udtryk profiler, ved at bestemme deres evne til at modulere T-celle-afhængige immun svar i vitroog af vurdering af deres funktion som en adoptiv celleterapi at undertrykke EAE induktion i vivo. Vores protokol giver en ramme for evaluering af eventuelle nye agenser menes at have kapacitet til at fremkalde TolDCs og yderligere fremskynde den terapeutiske udviklingsprocessen for TolDCs fra bænken til klinikken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen

Acknowledgments

Vi takker Reata Pharmaceuticals for at give CDDO-DFPA. Vi anerkender også støtten fra Jane og Lee Seidman stol i Pediatric Cancer Innovation (John Letterio). Dette arbejde blev støttet af Department of Defense [W81XWH-12-1-0452]; Angie Fowler teenager og ung voksen kræft forskningsinitiativ på sag Comprehensive Cancer Center; og Callahan Graduate Scholar Award for Hsi-Ju Wei fra F.J. Callahan Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CDDO-DFPA (RTA-408) Reata Pharmaceuticals in house synthesis Cell culture
Mouse GM-CSF Peprotech Inc. 315-03 BMDC differentiation
Mouse IL-4 Peprotech Inc. 214-14 BMDC differentiation
Lipopolysaccharides (LPS) Sigma Aldrich Inc. L2880 Cell culture
β-mercaptoethanol Sigma Aldrich Inc. 516732 Cell culture
Pertussis toxin (PTX) R&D systems 3097 EAE induction
MOG (35–55) peptide 21stCentury Biochemicals in house synthesis EAE induction
Trypan blue Gibco, Life Technologies 15250-061 Cell culture
RPMI-1640 plus L-glutamine ThermoFisher Scientific 11875-093 Cell culture
Non-essential amino acid (100X) ThermoFisher Scientific 11140050 Cell culture
HEPES ThermoFisher Scientific 15630080 Cell culture
penicillin/streptomycin ThermoFisher Scientific 15140122 Cell culture
40 μm cell strainer Corning 352340 Cell isolation
PE-conjugated CD80 BD Biosciences 557227 Flow cytometry
PE-conjugated CD86 BD Biosciences 555665 Flow cytometry
PE-conjugated PD-L1 BioLegend 124307 Flow cytometry
APC-conjugated MHCII Miltenyi Biotec Inc. 130-112-388 Flow cytometry
APC-conjugated CD11c BD Biosciences 340544 Flow cytometry
Isotype matched PE Miltenyi Biotec Inc. 130-091-835 Flow cytometry
Isotype matched APC Miltenyi Biotec Inc. 130-091-836 Flow cytometry
CFSE BioLegend 423801 T cell proliferation assay
Pan dendritic cell isolation kit Miltenyi Biotec Inc. 130-100-875 T cell proliferation assay
FcR Blocking Reagent Miltenyi Biotec Inc. 130-100-875 T cell proliferation assay
Pan Dendritic Cell Biotin-Antibody Cocktail Miltenyi Biotec Inc. 130-100-875 T cell proliferation assay
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi Biotec Inc. 130-100-875 T cell proliferation assay
CD4+ T cell isolation kit Miltenyi Biotec Inc. 130-104-454 T cell proliferation assay
CD4+ T cell Biotin-Antibody Cocktail Miltenyi Biotec Inc. 130-104-454 T cell proliferation assay
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi Biotec Inc. 130-104-454 T cell proliferation assay
ACK lysing buffer ThermoFisher Scientific A1049201 BMDC differentiation
1 ml syringe BD Biosciences 309626 T cell proliferation assay
3 ml syringe BD Biosciences 309588 BMDC differentiation
25G needle BD Biosciences 309626 T cell proliferation assay
23G needle BD Biosciences 309588 BMDC differentiation
BSA Sigma Aldrich Inc. A2058 T cell proliferation assay
EDTA ThermoFisher Scientific 15575020 T cell proliferation assay
LS Column Miltenyi Biotec Inc. 130-042-401 T cell proliferation assay
Pre-Separation Filter Miltenyi Biotec Inc. 130-095-823 T cell proliferation assay
collagenase D Sigma Aldrich Inc. 11088858001 T cell proliferation assay
HBSS ThermoFisher Scientific 14025076 T cell proliferation assay
ovalbumin (OVA) peptide 323–329 Sigma Aldrich Inc. O1641 T cell proliferation assay
Mouse IFN-γ TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm01168134_m1 qRT-PCR
Mouse IL-12a TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm00434165 qRT-PCR
Mouse IL-12 p70 DuoSet ELISA R&D systems DY419-05 ELISA
Mouse EDN-1 ELISA RayBiotech ELM-EDN1-1 ELISA
TNF-α TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm00443258 qRT-PCR
Mouse TNF-α Quantikine ELISA Kit R&D systems MTA00B ELISA
IL-6 TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm00446190 qRT-PCR
Mouse IL-6 Quantikine ELISA Kit R&D systems M6000B ELISA
IL-23a TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm01160011 qRT-PCR
Mouse IL-23 DuoSet ELISA R&D systems DY1887-05 ELISA
IL-4 TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm99999154_m1 qRT-PCR
IL-10 TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm01288386_m1 qRT-PCR
TGF-β TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm01178820_m1 qRT-PCR
Anti-Heme Oxygenase 1 antibody Abcam ab13248 Western blotting
Anti-β-actin antibody Abcam ab8226 Western blotting
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System Bio-Rad Inc. qRT-PCR
BD FACSCalibur Cell Analyzer BD Biosciences Flow cytometry

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).
  2. Inaba, K., et al. Efficient presentation of phagocytosed cellular fragments on the major histocompatibility complex class II products of dendritic cells. J Exp Med. 188 (11), 2163-2173 (1998).
  3. Banchereau, J., et al. Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol. 18, 767-811 (2000).
  4. Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 179 (4), 1109-1118 (1994).
  5. Hemmi, H., Akira, S. TLR signalling and the function of dendritic cells. Chem Immunol Allergy. 86, 120-135 (2005).
  6. Caux, C., et al. B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells. J Exp Med. 180 (5), 1841-1847 (1994).
  7. Chastain, E. M., Duncan, D. S., Rodgers, J. M., Miller, S. D. The role of antigen presenting cells in multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 265-274 (2011).
  8. Smeltz, R. B., Chen, J., Ehrhardt, R., Shevach, E. M. Role of IFN-gamma in Th1 differentiation: IFN-gamma regulates IL-18R alpha expression by preventing the negative effects of IL-4 and by inducing/maintaining IL-12 receptor beta 2 expression. J Immunol. 168 (12), 6165-6172 (2002).
  9. Gyulveszi, G., Haak, S., Becher, B. IL-23-driven encephalo-tropism and Th17 polarization during CNS-inflammation in vivo. Eur J Immunol. 39 (7), 1864-1869 (2009).
  10. Kronenberg, M., Rudensky, A. Regulation of immunity by self-reactive T cells. Nature. 435 (7042), 598-604 (2005).
  11. Boks, M. A., et al. IL-10-generated tolerogenic dendritic cells are optimal for functional regulatory T cell induction--a comparative study of human clinical-applicable DC. Clin Immunol. 142 (3), 332-342 (2012).
  12. Anderson, A. E., et al. Tolerogenic dendritic cells generated with dexamethasone and vitamin D3 regulate rheumatoid arthritis CD4+ T cells partly via transforming growth factor-beta1. Clin Exp Immunol. 187 (1), 113-123 (2017).
  13. Chauveau, C., et al. Heme oxygenase-1 expression inhibits dendritic cell maturation and proinflammatory function but conserves IL-10 expression. Blood. 106 (5), 1694-1702 (2005).
  14. Maldonado, R. A., von Andrian, U. H. How tolerogenic dendritic cells induce regulatory T cells. Adv Immunol. 108, 111-165 (2010).
  15. Schmidt, S., Nino-Castro, A., Schultze, J. Regulatory dendritic cells: there is more than just immune activation. Frontiers in Immunology. 3 (274), (2012).
  16. Hilkens, C. M., Isaacs, J. D., Thomson, A. W. Development of dendritic cell-based immunotherapy for autoimmunity. Int Rev Immunol. 29 (2), 156-183 (2010).
  17. Dhodapkar, M. V., Steinman, R. M. Antigen-bearing immature dendritic cells induce peptide-specific CD8(+) regulatory T cells in vivo in humans. Blood. 100 (1), 174-177 (2002).
  18. Dhodapkar, M. V., Steinman, R. M., Krasovsky, J., Munz, C., Bhardwaj, N. Antigen-specific inhibition of effector T cell function in humans after injection of immature dendritic cells. J Exp Med. 193 (2), 233-238 (2001).
  19. Giannoukakis, N., Phillips, B., Finegold, D., Harnaha, J., Trucco, M. Phase I (safety) study of autologous tolerogenic dendritic cells in type 1 diabetic patients. Diabetes Care. 34 (9), 2026-2032 (2011).
  20. Benham, H., et al. Citrullinated peptide dendritic cell immunotherapy in HLA risk genotype-positive rheumatoid arthritis patients. Sci Transl Med. 7 (290), 290ra287 (2015).
  21. Bell, G. M., et al. Autologous tolerogenic dendritic cells for rheumatoid and inflammatory arthritis. Ann Rheum Dis. 76 (1), 227-234 (2017).
  22. University Hospital, A. A "Negative" Dendritic Cell-based Vaccine for the Treatment of Multiple Sclerosis: a First-in-human Clinical Trial (MS tolDC). ClinicalTrials.gov. , (2015).
  23. Pujol, F. I. G. T. i Tolerogenic Dendritic Cells as a Therapeutic Strategy for the Treatment of Multiple Sclerosis Patients (TOLERVIT-MS) (TOLERVIT-MS). ClinicalTrials.gov. , (2016).
  24. Varea, S. Treatment of Multiple Sclerosis and Neuromyelitis Optica With Regulatory Dendritic Cell: Clinical Trial Phase 1 B. ClinicalTrials.gov. , (2017).
  25. Jauregui-Amezaga, A., et al. Intraperitoneal Administration of Autologous Tolerogenic Dendritic Cells for Refractory Crohn's Disease: A Phase I Study. J Crohns Colitis. 9 (12), 1071-1078 (2015).
  26. Mahnke, K., Schmitt, E., Bonifaz, L., Enk, A. H., Jonuleit, H. Immature, but not inactive: the tolerogenic function of immature dendritic cells. Immunol Cell Biol. 80 (5), 477-483 (2002).
  27. Lutz, M. B., Schuler, G. Immature, semi-mature and fully mature dendritic cells: which signals induce tolerance or immunity? Trends Immunol. 23 (9), 445-449 (2002).
  28. Suciu-Foca, N., et al. Molecular characterization of allospecific T suppressor and tolerogenic dendritic cells: review. Int Immunopharmacol. 5 (1), 7-11 (2005).
  29. Wakkach, A., et al. Characterization of dendritic cells that induce tolerance and T regulatory 1 cell differentiation in vivo. Immunity. 18 (5), 605-617 (2003).
  30. Szeles, L., et al. 1,25-dihydroxyvitamin D3 is an autonomous regulator of the transcriptional changes leading to a tolerogenic dendritic cell phenotype. J Immunol. 182 (4), 2074-2083 (2009).
  31. Unger, W. W., Laban, S., Kleijwegt, F. S., vander Slik, A. R., Roep, B. O. Induction of Treg by monocyte-derived DC modulated by vitamin D3 or dexamethasone: differential role for PD-L1. Eur J Immunol. 39 (11), 3147-3159 (2009).
  32. Reichardt, W., et al. Impact of mammalian target of rapamycin inhibition on lymphoid homing and tolerogenic function of nanoparticle-labeled dendritic cells following allogeneic hematopoietic cell transplantation. J Immunol. 181 (7), 4770-4779 (2008).
  33. Woltman, A. M., et al. The effect of calcineurin inhibitors and corticosteroids on the differentiation of human dendritic cells. Eur J Immunol. 30 (7), 1807-1812 (2000).
  34. Hackstein, H., Thomson, A. W. Dendritic cells: emerging pharmacological targets of immunosuppressive drugs. Nat Rev Immunol. 4 (1), 24-34 (2004).
  35. Torres-Aguilar, H., Blank, M., Jara, L. J., Shoenfeld, Y. Tolerogenic dendritic cells in autoimmune diseases: crucial players in induction and prevention of autoimmunity. Autoimmun Rev. 10 (1), 8-17 (2010).
  36. Rutella, S., Danese, S., Leone, G. Tolerogenic dendritic cells: cytokine modulation comes of age. Blood. 108 (5), 1435-1440 (2006).
  37. Wei, H. J., Pareek, T. K., Liu, Q., Letterio, J. J. A unique tolerizing dendritic cell phenotype induced by the synthetic triterpenoid CDDO-DFPA (RTA-408) is protective against EAE. Sci Rep. 7 (1), 9886 (2017).
  38. van Etten, E., Mathieu, C. Immunoregulation by 1,25-dihydroxyvitamin D3: basic concepts. J Steroid Biochem Mol Biol. 97 (1-2), 93-101 (2005).
  39. Pan, J., et al. Dexamethasone inhibits the antigen presentation of dendritic cells in MHC class II pathway. Immunol Lett. 76 (3), 153-161 (2001).
  40. Zhu, J., Paul, W. E. Heterogeneity and plasticity of T helper cells. Cell Res. 20 (1), 4-12 (2010).
  41. Spirig, R., et al. TLR2 and TLR4 agonists induce production of the vasoactive peptide endothelin-1 by human dendritic cells. Mol Immunol. 46 (15), 3178-3182 (2009).
  42. Walton, E. L. Make immunological peace not war: Potential applications of tolerogenic dendritic cells. Biomed J. 40 (2), 77-79 (2017).
  43. Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). Br J Pharmacol. 164 (4), 1079-1106 (2011).
  44. Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking. J Immunol. 179 (11), 7577-7584 (2007).
  45. Angelov, G. S., Tomkowiak, M., Marcais, A., Leverrier, Y., Marvel, J. Flt3 ligand-generated murine plasmacytoid and conventional dendritic cells differ in their capacity to prime naive CD8 T cells and to generate memory cells in vivo. J Immunol. 175 (1), 189-195 (2005).
  46. Lowes, M. A., et al. Increase in TNF-alpha and inducible nitric oxide synthase-expressing dendritic cells in psoriasis and reduction with efalizumab (anti-CD11a). Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (52), 19057-19062 (2005).
  47. Schnorrer, P., et al. The dominant role of CD8+ dendritic cells in cross-presentation is not dictated by antigen capture. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (28), 10729-10734 (2006).
  48. Wang, W., Li, J., Wu, K., Azhati, B., Rexiati, M. Culture and Identification of Mouse Bone Marrow-Derived Dendritic Cells and Their Capability to Induce T Lymphocyte Proliferation. Med Sci Monit. 22, 244-250 (2016).
  49. Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J Immunol Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
  50. Griffin, M. D., et al. Dendritic cell modulation by 1alpha,25 dihydroxyvitamin D3 and its analogs: a vitamin D receptor-dependent pathway that promotes a persistent state of immaturity in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (12), 6800-6805 (2001).
  51. Bscheider, M., Butcher, E. C. Vitamin D immunoregulation through dendritic cells. Immunology. 148 (3), 227-236 (2016).
  52. Castiello, L., et al. Monocyte-derived DC maturation strategies and related pathways: a transcriptional view. Cancer Immunol Immunother. 60 (4), 457-466 (2011).
  53. Decker, W. K., et al. Deficient T(H)-1 responses from TNF-alpha-matured and alpha-CD40-matured dendritic cells. J Immunother. 31 (2), 157-165 (2008).
  54. Longhi, M. P., et al. Dendritic cells require a systemic type I interferon response to mature and induce CD4+ Th1 immunity with poly IC as adjuvant. J Exp Med. 206 (7), 1589-1602 (2009).
  55. Link, H., Huang, Y. M., Xiao, B. G. Dendritic cells in experimental allergic encephalomyelitis and multiple sclerosis. J Neuroimmunol. 100 (1-2), 102-110 (1999).
  56. Leech, M. D., et al. Cutting edge: IL-6-dependent autoimmune disease: dendritic cells as a sufficient, but transient, source. J Immunol. 190 (3), 881-885 (2013).
  57. Saul, L., Besusso, D., Mellanby, R. J. LPS-matured CD11c+ bone marrow-derived dendritic cells can initiate autoimmune pathology with minimal injection site inflammation. Lab Anim. 51 (3), 292-300 (2017).
  58. Aghdami, N., Gharibdoost, F., Moazzeni, S. M. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) induced by antigen pulsed dendritic cells in the C57BL/6 mouse: influence of injection route. Exp Anim. 57 (1), 45-55 (2008).
  59. Wilson, H. L. Limitations with in vitro production of dendritic cells using cytokines. J Leukoc Biol. 75 (4), 600-603 (2004).
  60. Ni, K., O'Neill, H. C. Development of dendritic cells from GM-CSF-/- mice in vitro : GM-CSF enhances production and survival of cells. Dev Immunol. 8 (2), 133-146 (2001).

Tags

Medicin spørgsmål 135 Tolerogenic dendritiske celler (TolDCs) knoglemarv-afledte dendritiske celler (BMDCs) eksperimentelle Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) immunsuppression cytokiner autoimmunitet
Udvikling og funktionel karakterisering af Murine Tolerogenic dendritiske celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wei, H. J., Letterio, J. J., Pareek, … More

Wei, H. J., Letterio, J. J., Pareek, T. K. Development and Functional Characterization of Murine Tolerogenic Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (135), e57637, doi:10.3791/57637 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter