Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Utvikling og funksjonell karakteristikk av Murine Tolerogenic dendrittiske celler

Published: May 18, 2018 doi: 10.3791/57637
Automatic Translation
1, 2,3, 2,3
1Department of Biochemistry, School of Medicine, Case Western Reserve University, 2Department of Pediatrics, Division of Pediatric Hematology/Oncology, Case Western Reserve University, 3Angie Fowler Cancer Institute, Rainbow Babies & Children's Hospital, University Hospitals, Cleveland

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å utvikle og karakteriserer tolerogenic dendrittiske celler (TolDCs) og vurdere deres immunterapeutisk nytte.

Abstract

Immunsystem opererer ved å opprettholde en stram balanse mellom koordinerende svar mot utenlandske antigener og opprettholde en unresponsive tilstand mot selv-antigener samt antigener avledet fra commensal organismer. Avbrudd i dette immun homeostase kan føre til kronisk betennelse og til utviklingen av autoimmunitet. Dendrittiske celler (DCs) er profesjonell antigen-presentasjon cellene av medfødte immunforsvaret involvert i aktivering naiv T celler for å starte immunreaksjoner mot utenlandske antigener. DCs kan imidlertid også differensieres til TolDCs som kan brukes til å opprettholde og fremme T celle toleranse og undertrykke Effektor celler bidrar til utvikling av enten autoimmune eller kronisk betennelse. Siste fremme i vår forståelse av TolDCs antyder at DC toleranse kan oppnås ved modulerende arbeidsvilkår differensiering. Dette fenomenet har ført til enorm vekst i utviklingen av TolDC terapi for mange immune sykdommer forårsaket på grunn av brudd i immun toleranse. Vellykket studier i preklinisk autoimmunitet murine modeller har ytterligere bekreftet immunterapeutisk nytten av TolDCs i behandlingen av autoimmune sykdommer. TolDCs har i dag blitt et lovende immunterapeutisk verktøy i klinikken for gjeninnføre immun toleranse i ulike immun uroer av målretting patogene autoimmune svar mens røres beskyttende immunitet. Selv om en rekke strategier har vært foreslått av flere labs å indusere TolDCs, er det ingen konsistens i karakteriserer mobilnettet og funksjonelle fenotypen av disse cellene. Denne protokollen gir trinnvise instruksjoner for utvikling av Ben margtransplantasjon-avledet DCs i store mengder, en unik metode som brukes til å skille seg ut TolDCs med en syntetisk triterpenoid 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic Acid-difluoro-propyl-amid (CDDO-DFPA), og teknikkene som brukes til å bekrefte deres fenotype, inkludert analyser av viktige molekylær signaturer av TolDCs. Endelig viser vi en metode for å vurdere TolDC funksjon ved å teste deres suppressive svar i vitro og vivo i preklinisk modell av multippel sklerose.

Introduction

Dendrittiske celler (DCs) ble er en integrert del av det medfødte immunsystemet og først oppdaget og preget av Ralph Steinman og Zanvil Cohn i 1973 som primære profesjonell antigen presentere celler1. DCs har vist seg å spille en viktig rolle i immunforsvaret aktivering ved å presentere behandlet antigener T celler og B celler via store histocompatibility komplekser (MHC) i sekundære lymfoide organer koble den medfødte og adaptive immunsystem2. I pattedyr immunsystemet er det to kategorier av DCs som har blitt beskrevet som myelogen DCs og presenterer antigener domenekontrollere (PDC)3. Myeloid DCs, også kjent som konvensjonelle DCs (cDCs), er preget av uttrykk for CD11c og kan være differensiert som umodne DCs (iDCs) i vitro fra benmargen progenitor celler eller perifert blod monocytter bruker granulocytt-macrophage-koloni-stimulerende faktor (GM-CSF) og IL-4 i murine eller menneskelige arter, henholdsvis4.

Aktivere 'fare' signaler, slik som patogen-forbundet molekylær mønster (PAMP) eller skade-forbundet molekylær mønster (DAMP), vil kjøre iDCs modning mot immunogenic DCs som modne DCs (mDCs) via bindende ulike mønster anerkjennelse reseptorer DC overflaten5. Immunogenic DCs ytterligere prime naiv T celle spredning og differensiering gjennom oppregulering av MHCII2, costimulatory ligander (CD80, CD86 og CD40)6, cytokiner og andre løselig meglere7. En kaskade av pro-inflammatorisk megler produksjon fra Immunogenic DCs er viktig for cytokin-mediert T celledifferensiering. For eksempel både IFN-γ og IL-12 er nødvendig for Th1 differensiering8 og IL-1, IL-6 og IL-23 er avgjørende for naiv T celle polarisering mot Th17 celler9. Selv om eldre DCs reagerer på utenlandske antigener, kan ukontrollert DC aktivering av selv-antigener medføre toleranse ablasjon og fremme utviklingen av autoimmune sykdommer ved å generere autoreactive T celler som aktivering fører til vev10 .

Nylige rapporter har gitt klare bevis for DC plastisitet, eksemplifisert ved deres evne til å samhandle med forskjellige signaler i deres vev microenvironment og å skille ut forskjellige effektor/suppressor DC delsett. Anti-inflammatorisk meglere, som IL-1011, TGF-β12og HO-113 har vist seg å spille en viktig rolle i uimottakelig undertrykkelse av inducing tolerogenic DCs (TolDCs). Disse TolDCs anskaffer regulatoriske funksjoner og undertrykke T celle spredning14. Videre mangel på co-stimulering av DCs og produksjon av anti-inflammatoriske mediatorer fra TolDCs både bidra til induksjon av regulatoriske T-celler (Tregs) og også effektivt hemmer både Th1 og Th17 differensiering og utvidelse15. I siste to tiårene, har terapeutiske potensialet i TolDCs blitt rapportert av flere etterforskere. I disse studiene, administrasjon av ex-vivo generert TolDCs ikke bare ameliorated patologisk symptomer i forskjellige prekliniske modeller autoimmune sykdommer16 , men førte også til utviklingen av immun toleranse i pasienter17 ,18. Interessant, i dag TolDCs terapi har vært ansett som en alternativ eller Tilleggsbehandling tilnærming for autoimmune sykdommer i flere kliniske forsøk, inkludert type 1 diabetes mellitus19, revmatoid artritt20, 21, multippel sklerose (MS)22,23,24og Crohns sykdom25.

Det er en rekke som har vært ansatt å utvikle TolDCs og flere laboratorier rapportert metoder for generasjon og fenotypiske karakterisering av TolDCs. Disse metodene kan brukes til å generere reproduserbar TolDCs i vitro fra blodkreft progenitors og stabilt beholde dem i en tolerogenic tilstand i vivo26,27,28,29. IDCs kan konverteres til TolDCs av eksponering for ulike immunmodulerende farmakologiske agenter eller anti-inflammatoriske cytokiner. For eksempel er Vitamin D3 en velkjent farmakologiske agent kjent å øke IL-10 produksjon og undertrykke IL-12 sekret fra DCs og dermed øke deres suppressive funksjonen30. Videre, når DCs er utsatt for potente inflammatorisk stimuli, som lipopolysaccharides (LPS), flere farmakologisk agenter som dexamethasone31, rapamycin32og kortikosteroider33 har vist å indusere den TolDC fenotypen ved å redusere DC overflaten uttrykk for CD40, CD80, CD86 og MHCII34. IL-10 og TGF-β er mest studert anti-inflammatoriske cytokiner å indusere DC toleranse35 og samtidig eksponering til begge disse cytokiner har vist seg å indusere en tolerogenic fenotypen i DCs36.

Siden tolerogenic DC defineres av funksjonelle egenskaper enn fenotypiske markører, det er må en stor utvikle en konsekvent metode for mobilnettet og funksjonell karakteristikk av TolDCs. Videre en streng og konsekvent protokoll må opprettes for konsekvent evaluering og karakterisering av tolerogenic DC fenotypen hvis vi effektivt og reproduserbar sammenligne evne til nye agenter å indusere TolDC fenotypen i den laboratoriet. Her gir vi en detaljert protokoll med trinnvise metoder å isolere iDCs fra blodkreft progenitors av mus og deretter analysere effekten av nye agenter under evaluering for deres evne til å konvertere iDCs i TolDCs, gir en robust funksjonelle og fenotypiske karakterisering av TolDCs både i vitro og i vivo. Denne beskrivelsen inneholder en forseggjort metode for å beskrive TolDCs av deres overflate ligander cytokin profil og suppressive funksjoner i vitro. Vi tilbyr også et eksempel på en metode for å utforske den potensielle terapeutiske bruken av disse TolDCs i en pre-klinisk modell av MS, eksperimentelle autoimmune immunsviktvirus (EAE). Dette etablerte vil hjelpe etterforskerne å vurdere kapasitet av nye agenter til å fremme induksjon av TolDCs og vil lette arbeidet med å utvide omfanget av TolDC terapeutiske utvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle studiene ble utført i henhold til prosedyrene som er godkjent av de Case Western Reserve University School of Medicines institusjonelle Animal Care og bruk komiteen.

1. klargjør Ben margtransplantasjon-avledet dendrittiske celler (BMDCs)

  1. Sterilisere alle kirurgiske instrumenter via autoklavering og utføre eksperimentet i klasse II biologiske sikkerhetskabinett kabinett med bevilget sikkerhetsrutiner.
  2. Euthanize C57BL/6 mus 8-10 ukens av alderen ved hjelp av CO2 kammer. Plasser musen på dissecting bordet og skyll med 70% etanol. Avgiftsdirektoratet tibia-fibula og femur Ben ved hjelp av en kirurgisk saks og plassere dem med 70% etanol i 10 cm kultur parabol.
  3. Bruke kirurgisk blad og tang for å dissekere vev unna som mulig på lokket på 10 cm kultur parabol og isolere tibias og femurs å plassere dem med 70% etanol i 6 cm kultur parabol.
  4. Bruk surgical blades trimme begge ender av tibias og femurs. Bruk 3 mL PBS i 3 ml sprøyte med en 23G nål for å tømme innholdet i margtransplantasjon fra den ene enden av bein slik konisk som inneholder 12 ml PBS. Gjenta dette trinnet 3 x i hver ende av bein.
  5. Sentrifuge celle suspensjon på 300 x g i 5 min.
  6. Fjern nedbryting og resuspend celle pellets med 1 ml ACK lysing buffer i 5 minutter å fjerne røde blodlegemer.
  7. Legge til 9 ml PBS å fortynne ACK lysing buffer og sentrifuger 300 x g i 5 minutter.
  8. Fjern nedbryting og resuspend med 10 ml kultur medium (RPMI-1640 pluss L-glutamin, 10% FBS, 1% ikke-essensielle aminosyren (100 x), 10 mM HEPES, 50 nM β-mercaptoethanol og 5% penicillin/streptomycin).
    Merk: Endotoxin nivå må være mindre enn 0,1 EU/ml i FBS.
  9. Cellen suspensjon passere en 40 μm celle sil og ta 20 µl av cellen suspensjon og bland med 80 µl av trypan blå for å telle antallet lever celler ved hjelp av cytometer.
  10. Juster hvor celle til 1 x 106 celler/ml med 15 ng/ml GM-CSF og 10 ng/ml IL-4.
  11. Plate 3 ml 1 x 106 celler/ml i hver brønn av 6-vel plate og ruge cellene på 37 ° C, 5% CO2og 95% fuktighet i CO2 inkubator.
    Merk: Den Ben margtransplantasjon celler fra ett museklikk er rundt 3-5 x 107 celler, som angir at det kan være plassert fra 2 til 3 6-og plater.
  12. Dag 3, fjerne alle 3 ml kultur medium fra hver brønn, legge 2 ml frisk PBS i hver brønn og deretter forsiktig virvel platen for å sikre fjerne alle ikke-tilhenger cellene.
  13. Erstatte 3 ml frisk kultur medium med 15 ng/ml GM-CSF og 10 ng/ml IL-4 i hver brønn. Inkuber cellene på 37 ° C, 5% CO2og 95% fuktighet i CO2 inkubator.
  14. På dag 5, direkte legge et annet 3 ml frisk kultur medium med 15 ng/ml GM-CSF og 10 ng/ml IL-4 i hver brønn. Inkuber cellene på 37° C, 5% CO2, og 95% fuktighet i CO2 inkubator.
    Merk: Det totale volumet i hver brønn er nå 6 ml.
  15. På dag 7, setter du hele platen på isen i 10 minutter. Pipetter forsiktig kultur medium i hver brønn å dislodge det løst-tilhenger BMDCs som iDCs i suspensjon.
    Merk: De tilhenger makrofagene er fortsatt knyttet til plate. Lav temperatur og prosedyrer er nøkkelen å unngå DC aktivisering å påvirke ytterligere eksperimenter.
  16. Sentrifuge celle suspensjon på 300 x g i 5 minutter og resuspend med ferske kultur medium for videre studier.
    Merk: BMDCs kan identifiseres med fluorescens-merket CD11c antistoffer av flowcytometri og vi viste våre gating strategi for BMDCs for ytterligere eksperimenter i figur 1.

2. karakterisere TolDC Gene og Protein profil

  1. Plate 2 ml 1 x 106 BMDCs/ml per brønn i 6 vel-plate med kultur medium i tilstedeværelse eller fravær av 100-400 nM CDDO-DFPA for rugende 1t på 37 ° C, 5% CO2 og 95% fuktighet i CO2 inkubator.
    Merk: CDDO-DFPA, en syntetisk triterpenoid, er en kjernefysiske faktor (erythroid-avledet 2) - som - 2 faktor (Nrf2) induser og kjernefysiske faktor-κB (NF-κB) inhibitor. Bruke andre midler for induksjon av TolDCs fra iDCs, som IL-10, vitamin D3, deksametason eller BAY 11-7085, og endre dette trinnet til en optimal tilstand for hver agent.
  2. Legge til 10 eller 100 ng/ml av LPS for rugende 4-24 timer å indusere mDCs (inkubasjonstiden er annerledes på grunn av mRNA eller protein måling).
  3. Pipetter kultur medium i hver brønn og høste celle suspensjon ved hjelp av 1 ml Pipetter forsiktig. Sentrifuge 300 x g i 5 minutter å samle celler og nedbryting, henholdsvis.
  4. Analysere de overflaten ligander fra cellen pellets av flowcytometri, for eksempel stimulerende ligander: CD40, CD80, CD86, MHC-II, OX40L, ICOSL eller hemmende ligander: PD-L1, PD-L2, ILT3, ILT4.
  5. Isolere RNA fra cellen pellets og analysere RNA og supernatant prøver for cytokin profil og gene og protein nivåer av kvantitative sanntid PCR (qRT-PCR) og ELISA, henholdsvis.
    Merk: For eksempel inflammatoriske cytokiner: TNF-α, IFNγ, EDN-1, IL-6, IL-12, og IL-23 eller anti-inflammatoriske cytokiner: IL-4, IL-10, IL-15, TGF-β1 og HO-1.

3. vurdere funksjon TolDCs In Vitro og i Vivo

  1. T-celle Syngeneic spredning analysen
    1. Sterilisere alle kirurgiske instrumenter via autoklavering og utføre eksperimentet i klasse II biologiske sikkerhetskabinett kabinett med bevilget sikkerhetsrutiner.
    2. Klargjør Mac buffer med 0,5% bovin serum albumin (BSA) og 2 mM EDTA i 500 ml PBS. Sterilisere bufferen ved å filtrere gjennom en 0,2 µm.
      Merk: Holde bufferen på isen under følgende eksperimentet.
    3. Å få CD4+ T celler, euthanize OT-II T-celle reseptor (TCR) transgene mus 8-10 ukens av alderen ved hjelp av CO2 kammer. Plasser musen på dissecting bordet og skyll med 70% etanol. Isolere milten fra venstre side av magen med kirurgisk saks og tang.
    4. Milten med 2 ml PBS innlegge en 6 cm kultur parabol og bruk baksiden av push-stokk med 3 ml sprøyte for å hakke milten ved å sende en 40 μm celle sil.
    5. Samle celle suspensjon og sentrifuger 300 x g i 5 minutter.
    6. Resuspend celle pellet i 400 µL Mac buffer.
    7. Tilsett 100 μl av CD4+ T celle Biotin-antistoff Cocktail ved 4° C i 5 minutter.
      Merk: Antistoffer cocktail binder på andre celletyper unntatt CD4+ T celler, som CD8a, CD11b, CD11c, CD19, CD25, CD45R (B220), CD49b (DX5), CD105, Anti-MHC, klasse II Ter-119 og TCRγ/ses.
    8. Legg 300 µL Mac buffer og 200 μl av anti-Biotin perler (Tabell for materiale) på 4° C i 10 minutter.
    9. Sted kolonnen består av ferromagnetisk sfærer (Tabell for materiale) og pre separasjon Filter sammen i den magnetiske feltet og skyll den med 3 ml Mac buffer.
    10. Legge til 9 ml Mac bufferen i cellene og sentrifuger 300 x g i 5 minutter.
    11. Resuspend celle pellet i 3 ml Mac buffer og bruk på kolonnen. Samle gjennomflytsenhet inneholder CD4+ T celler.
    12. Vask kolonne med en annen 3 ml Mac buffer og også samle gjennomflytsenhet.
    13. For å få splenic pan DCs, euthanize C57BL/6 mus 8-10 ukens av alderen ved hjelp av CO2 kammer. Plasser musen på dissecting bordet og skyll med 70% etanol. Isolere milten fra venstre side av magen med kirurgisk saks og tang. Milten innlegge en 6cm kultur parabol med 2 ml collagenase D løsning (2 mg/ml collagenase D oppløst i HBSS som inneholder kalsium, magnesium).
    14. Injisere 1 ml av collagenase D løsning milten to ganger med en 1 ml sprøyte og en 25G nål. Skjær milten i små biter med liten saks.
    15. Shake og ruge ved romtemperatur for 25 minutter.
    16. Legg til 500 µL 0,5 M EDTA ved romtemperatur i 5 minutter.
      Merk: Trinnene fra 3.1.13-3.1.14 er kritisk for å øke avkastningen av DCs.
    17. Nå bruke baksiden av push-stokk med 3 ml sprøyte hakke milt gjødsel ved å sende en 40 μm celle sil og samle celle suspensjon av sentrifugering 300 x g i 5 minutter.
    18. Resuspend celle pellet i 350 µL Mac buffer, 50 μl av FcR blokkerer reagensen og 100 μl av Pan dendrittiske celle Biotin-antistoff Cocktail ved 4° C i 10 minutter.
      Merk: Antistoffer cocktail mot antigener som ikke er uttrykt ved DCs.
    19. Vask cellene ved å legge 9 ml Mac buffer og sentrifuger på 300 x g i 5 minutter.
    20. Resuspend celle pellet i 800 µL Mac bufferen og legge 200 μl av anti-Biotin perler på 4 ° C i 10 minutter.
    21. Gjenta trinnene fra 3.1.9-3.1.11 å samle DCs.
    22. Vask kolonne med en annen 3 ml Mac buffer to ganger og også samle gjennomflytsenhet.
    23. Behandle 2 x 105 DCs/ml i tilstedeværelse eller fravær av 100-400 nM CDDO-DFPA på 37 ° C i 1 hr. separat, etikett CD4+ T-celler (1 x 107/ml) med 1 μM CFSE på 37 ° C i 15 minutter, vask med PBS , og justere volumet for å få siste konsentrasjon på 2 x 106 T celler/ml.
    24. Neste, i en 96-brønns plate, co kultur 100 μl av behandlet dendrittiske celler med samme volum av CFSE-merket CD4+ T celler, både fra det over skritt å få 1:10 forholdet. Nå legge 100 ng/mL ovalbumin (OVA) peptid 323-329 per godt og måle CFSE intensiteten av T-celler av flowcytometri etter 2-3 dager med inkubering.
      Merk: Cellen tallene og forholdet DCs og T celler har blitt optimalisert fra våre tidligere arbeid37.
  2. Indusere passiv EAE ved å injisere BMDCs pulserende med Myelin Oligodendrocyte glykoprotein (MOG) (35-55)
    1. Plate 2 ml 1 x 106 BMDCs/ml per brønn i 6 vel-plate med kultur medium i tilstedeværelse eller fravær av 100-400 nM CDDO-DFPA for rugende 1 time.
    2. Legge til 10 ng/ml av LPS rugende 24 timer.
    3. Legge til 100 μg/ml MOG (35-55) for rugende 4 timer.
    4. Høste celle suspensjon og sentrifuger 300 x g i 5 minutter.
    5. Resuspend celle pellets med PBS og telle celler.
    6. Subcutaneously injisere 200 μl av 2 x 106 celler til 8-10 uker gammel kvinnelig C57BL/6 mus (100 μl i hvert bakben ben).
    7. Ved BMDC injeksjon og 48 timer. senere, injisere 200 ng av kikhoste toxin (PTX) i hver mus.
    8. Gjenta trinn 3.2.6-3.2.7 en gang hver uke for 4 sammenhengende uker.
    9. Vurdere de kliniske symptomene på EAE daglig ved hjelp av standardkriteriene37 (0,5 halte halen slutten, 1 halte hale, 2-moderat hind lem svakhet, 3-alvorlige hind lem svakhet, 4-fullstendig hind lem lammelse, 5-quadriplegia eller døende tilstand, 6-døden).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Differensiering og utvalg av BMDCs:

Benmarg progenitor celler ble kultivert i fullstendig RPMI medium i nærvær av GM-CSF og IL-4 for å skille ut iDCs i 7 dager (figur 1A). På dag 1, celler var små i størrelse og viste sfærisk morfologi. Vask med PBS før utskifting av fersk medium på dag 3 hjalp celler skjemaet klynger og også økt befolkningen i CD11c+ celler. På dag 4, BMDCs ble utvidet i størrelse og startet klynge formasjon. Overholdt makrofager var også konvertert og observert på bunnen av platen med en avlang form. På dag 5, er stor størrelse klynger av BMDCs dannet. På dag 6, ble et stort antall semi tilhenger og flytende BMDCs også observert. BMDCs høstes på dag 7 og analysert av flowcytometri for CD11c uttrykk som en spesifikk markør for murine DCs. Som vist i en representant flyt cytometri plot i figur 1B, ble rundt 83.6% av BMDCs uttrykke CD11c innhentet av denne metoden.

Induksjon og genetisk karakterisering av TolDCs:

Noen av agentene kjent å indusere TolDCs, som vitamin D338 og deksametason39, er kjent for ned-regulere uttrykk for DC overflaten ligander, inkludert MHC-II og costimulatory molekyler, CD40, CD80 og CD86. Derimot i sammenheng med enten LPS eller CD40L-indusert modning av DCs viste calcineurin hemmere Ciklosporin A og FK506 ingen effekt på uttrykk for CD83, CD80, CD86 og MHC-II33. Som vist ved flyt cytometri analyse, hadde induksjon av TolDC av CDDO-DFPA ingen signifikant effekt på LPS-indusert overflaten ligand uttrykk for DCs, inkludert CD80, CD86, MHC-II, PD-L1 og CD40. (Figur 2).

Videre sammenlignende transcriptome og cytokin analyse av BMDCs behandlet med eller uten CDDO-DFPA på tilstedeværelse eller fravær av LPS avbildet modulert inflammatorisk genet profil. CDDO-DFPA behandling betydelig redusert LPS indusert pro-inflammatoriske cytokin gener som IFN-γ, IL-12, EDN1, TNFα, IL-6 og IL-23 (figur 3A-3F). Dette kalles cytokiner for Th1 (IFN-γ og IL-12) og Th17 (IL-6 og IL-23) celle differensiering. Videre, CDDO-DFPA behandlet BMDCs viste økt uttrykk av anti-inflammatorisk cytokin gener som IL-4, IL-10, TGF-β og HO-1 (figur 4A-4D). Disse anti-inflammatorisk genene er kjent autoimmunitet modulator ved å fremme Th2 (IL-4) og Treg (IL-10 og TGF-β) celledifferensiering. 40 her er det viktig å merke seg at den karakteristiske IL-12−, IL-10+ cytokin produksjon36induksjon av HO-1 uttrykk13og hemming av EDN-141 indusert av CDDO-DFPA behandling, alle kjent for å godkjenne DCs tolerogenic funksjon.

Cellulære og funksjonell karakteristikk av TolDCs i vitro

DC-mediert T celle spredning er kjent for å være utløst av engasjement costimulatory overflaten ligand samt utskillelsen av cytokiner og løselig meglere7. Men TolDCs hemmer T celle svar gjennom flere mekanismer: ved å fremkalle T celle anergy, ved aktivt å fremme sletting av autoreactive celler og fremme polarisering av naiv T celler Tregs42. Vi har allerede rapportert funksjonelle karakterisering av CDDO-DFPA indusert TolDCs37. T celle anergy og sletting av autoreactive T celler kan analyseres uavhengig av kontroll overflate markører eller Annexin V/7-AAD flekker. Men bekreftet vi indirekte denne fenotypen ved å måle T celle spredning indeks. For dette vi utnyttet C57BL/6 OTII transgene mus T celler og utsatt dem for syngeneic DCs utdraget fra C57BL/6 mus og behandlet med eller uten CDDO-DFPA. Disse DCs ble vasket og co kultivert med CFSE farget T-celler med OVA peptid. Observerte vi en betydelig reduksjon i T celle spredning av CDDO-DFPA pre-behandlet DCs, foreslå sine tolerogenic fenotypen (figur 5).

I vivo funksjonell karakteristikk av TolDCs i en prekliniske modell av autoimmunitet

Til slutt, kan funksjonaliteten til DFPA-indusert TolDCs testes i noen av en rekke prekliniske i vivo modeller preget autoimmune eller inflammatorisk egenskaper. Siden EAE er en allment akseptert prekliniske murine modell av klinisk immun-mediert sentralnervesystemet sykdommen, MS43, vi utnyttet dette i vår nåværende studien. Videre undersøke den i vivo funksjonaliteten til CDDO-DFPA indusert TolDCs, vi utfordret dem i en prekliniske murine modell av passiv EAE. For dette, ble BMDCs kultivert med eller uten CDDO-DFPA i tilstedeværelsen av LPS og MOG (35-55). Disse cellene ble deretter injisert gjentatte ganger som planlagt protokoll avbildet i figur 6A og mus ble rutinemessig observert for manifestasjon av klinisk underskriver. Som forventet, pulserende LP-plater og MOG (35-55) BMDCs viste kliniske symptomer på EAE, imidlertid; CDDO-DFPA primet BMDCs behandlet gruppen viste forsinket utbruddet av sykdommen med reduserte kliniske symptomer (figur 6B). Disse resultatene validere suppressive fenotypen av TolDCs av CDDO-DFPA behandling.

Figure 1
Figur 1: utvikling og fenotypiske karakterisering av BMDCs: (A) bein margtransplantasjon celler var spyles ut av tibia og femur Ben C57BL/6 mus og videre differensiert til BMDCs. En aktuelle cellen klynge formasjon ble sporet av * lys i hele perioden av differensiering (skala barer, 100µm). (B) BMDCs differensiering ble bekreftet av CD11c overflate uttrykket, som analyseres av FACS. Grafer viser prosentandelen av den utvidede CD11c+ celle befolkningen. (C) Gating strategi BMDCs. celler ble først gated for å utelate rusk (FSC vs SSC). En doublet utelukkelse gate ble anvende for å gate på singleter celler (FL2-W g. FL2-A). I singlet cellene, var lever celler gated på 7-AAD tomt (7-AAD vs FSC). Deretter var cellene videre analysert og gated på CD11c uttrykk. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: DC-cellen overflaten ligand uttrykk er uendret av CDDO-DFPA. Cellene ble pre-behandlet i tilstedeværelse eller fravær av CDDO-DFPA (200 nM) i 1 time før stimulering med LPS (100 ng/ml) for 24 timer. Cellen overflaten uttrykk for CD80, CD86, MHC-II, PD-L1 og CD40 ble analysert av flowcytometri. Dette tallet har blitt endret fra Vitenskapelige rapporter 7, artikkelnummer: 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. Gjengitt og publiseres med copyright tillatelsen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: CDDO-DFPA endret genetiske og protein fenotypen av immunogenic DCs. BMDCs var pre-behandlet i tilstedeværelse eller fravær av CDDO-DFPA (50-400 nM) i 1 time før tillegg av LPS (100 ng/ml), og enten høstet for RNA utvinning (4 timer) eller tilstand kultur medium for 24 timer. før samling for cytokin analyser. Nivåer av IL-12 (B), TNFα (D), IL-6 (E) og IL-23 (F) ble målt ved qRT PCR og ELISA. Mens nivået av IFN-γ (A) ble målt ved qRT PCR og EDN-1 (C) med ELISA alene. Resultatene uttrykkes som gjennomsnittlig ± SD tre eksperimenter. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001 sammenlignet med LPS-behandlet gruppene. Kort student t-test. Dette tallet har blitt endret fra Vitenskapelige rapporter 7, artikkelnummer: 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. Gjengitt og publiseres med copyright tillatelsen." Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: CDDO-DFPA indusert TolDCs fenotypen bekreftet av genet og protein uttrykk. BMDCs var pre-behandlet i tilstedeværelse eller fravær av CDDO-DFPA (10-400 nM) for en time før tillegg av LPS (100 ng/ml), og celler ble høstet for RNA utvinning etter 24 timer. Nivåer av IL-4 (A), IL-10 (B) og TGF-β (C) ble målt ved qRT PCR. (D) cellen protein lysates var samlet på 12 timer. analyser og nivåer av HO-1 og β-utgangen ble uttrykket bestemt av vestlige blotting. Resultatene uttrykkes som gjennomsnittlig ± SD tre eksperimenter. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001 sammenlignet med LPS-behandlet gruppene. Kort student t-test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: CDDO-DFPA utsatt DCs undertrykke T celle spredning. DCs var pre-behandlet med CDDO-DFPA (100-400 nM) i 1 time bare, deretter vasket og co kulturperler med CFSE farget T celler på en 1:10 forholdet. (A) splenic T celler og DCs var isolert fra C57BL/6 OTII transgene mus og C57BL/6 mus, henholdsvis. CDDO-DFPA forbehandlet DCs var co kultivert med CFSE farget T-celler med (med) eller uten (uten) OVA tillegg under inkubasjon. T celle spredning ble bestemt av flowcytometri på dag 2. Grafer viser prosentandelen av dele T celler i forhold til tallene T cellen divisjon. Dataene er en representasjon av 3 uavhengige eksperimenter. Dette tallet har blitt endret fra Vitenskapelige rapporter 7, artikkelnummer: 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. Gjengitt og publiseres med copyright tillatelsen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: MOG primet DC-indusert passiv EAE er avskaffet av TolDCs. (A) EAE induksjon av MOG (35-55)-pulserende BMDCs. eldre BMDCs ble behandlet i tilstedeværelse eller fravær av CDDO-DFPA (400 nM) og senere pulserende med MOG (35-55) for 4 timer. Totalt 200 μl av 2 × 106 celler ble administrert av subkutan injeksjon i regionen flanken av C57BL/6 mus en gang hver uke for totalt fire injeksjoner. Hver gang ble PTX administrert av IP injeksjon umiddelbart og igjen 2 dager senere (dag 0 på 4 syklus). (B) kliniske resultater ble innspilt etter alle fire injeksjoner, bruker standardkriteriene. Alle data blir presentert som den gjennomsnittlig ± S.E.M. * P < 0,05. Flere t-tester med Holm-Sidak analyse (n = 7 mus i hver gruppe). Dette tallet har blitt endret fra Vitenskapelige rapporter 7, artikkelnummer: 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. Gjengitt og publiseres med copyright tillatelsen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dette dokumentet beskriver en effektiv protokoll som kan brukes til reproduserbar generere iDCs og deretter skille dem i TolDCs, og foreslår vi at dette kan brukes til å evaluere kapasiteten til nye molekylære mål agenter å indusere TolDC fenotypen. Som beskrevet i denne rapporten, fulgte vi en sekvens hvor vi først analysert TolDC uttrykk for overflate ligander av flowcytometri, etterfulgt av en vurdering av DC cytokin profilen målt ved qRT PCR og ELISA. Endelig ble immunoregulatory funksjonen til TolDCs bekreftet av demonstrere evnen til å redusere T celle spredning i vitro og deres effekt å undertrykke autoimmunitet i vivo, ved hjelp av prekliniske murine EAE modellen av MS.

I vår protokollen, ble iDCs generert og differensiert fra murine benmarg forløpere med kombinasjonen av GM-CSF og IL-4. Andre protokoller har brukt skjemaer som tyrosin kinase 3 ligander (Flt3L) i kultur medium for å generere iDCs44. Selv om bruk av Flt3L øker avkastningen av iDCs, ta disse iDCs vanligvis 2 dager (9 dager) til å høste, sammenlignet med GM-CSF/IL-4 tillegg (7 dager)44. Enda viktigere, iDC generert fra Flt3L ofte skille ut både cDCs (CD8- og CD8+) og PDC-45 som var funksjonelt, og svært ekvivalenter for stabil domenekontrollere i vivo. Men GM-CSF/IL-4 alltid induserer differensiering av iDC mot cDCs (CD8-) bare44 under modning, de vist lignende tegn i inflammatorisk DCs46. Det er bemerkelsesverdig å vite at GM-CSF/IL-4 er ofte brukt i kliniske forsøk og grunnleggende forskning på grunn av fordelen av skille DCs monocytter eller CD34+ progenitors44. Det har vist at iDCs generert fra disse to metodene produsere morphologically forskjellige celler, som også har ulike celle overflate markører og viser tydelig cytokin profiler på aktivisering. Videre varierer TolDCs av disse metodene i deres evne til å overføre svar chemotactic faktorer og indusere antigen-spesifikke T celle svar44,45. Vi forstår at CD8+ DCs kan ha flere potensielle i TolDC induksjon på grunn av sin unike kapasitet av cross-tolerance47. Men det er så nødvendig ytterligere celle sortering fra BMDCs utledet av Flt3L å undersøke de spesifikke CD8+ DC delsett. I tillegg siden, GM-CSF/IL-4 indusert BMDCs er overlegen på T celle stimulering og produksjon av inflammatoriske mediatorer etter LPS behandling44,45, fant vi denne strategien ga flere reproduserbar resultater i våre eksperimenter.

BMDCs avledet fra GM-CSF/IL-4 start å uttrykke CD11c rundt dag 4 og å berike uttrykket etter dag 648. Denne kulturen prosedyren kan opprettholdes til dag 10-12 med lavere plating tetthet av bein margtransplantasjon celler og en lav dose av GMC-SF dag 8-1049. I denne protokollen, ble CDDO-DFPA (syntetisk triterpenoid) og LPS lagt sammen som agenter å indusere DC toleranse og modning, henholdsvis. Vi har nylig rapportert at iDCs høstet fra kulturer bruker denne metoden BMDC generasjon ha en funksjonell TolDC fenotypen når forbehandlet med CDDO-DFPA37. Det er bemerkelsesverdig at CDDO-DFPA, ble kun lagt til kulturer etter iDC høste (dag 7)37, i motsetning til agenter som vitamin D3 som må legges til kulturer flere ganger under iDC differensiering (dag 2, 4, 6)50. Dessuten, denne induksjon av TolDCs av vitamin D3 kan avhenge av ulike mekanismer som må startes både under og etter iDC differensiering51. Våre data tyder på at legge CDDO-DFPA under iDC differensiering ikke hadde noen innvirkning på renheten av CD11c + DCs men gjorde dose-dependently lavere avkastningen av iDCs dag 7 (data ikke vist). Våre analyser foreslår også at den høyere konsentrasjonen av CDDO-DFPA brukes i disse eksperimentene kan være giftig for benmarg progenitor celler, selv om iDC viste normal viability med denne konsentrasjonen av CDDO-DFPA37. Det er forventet at TolDC induksjon kan optimaliseres ved forsiktig analyser av virkningen av timing og lengden på eksponering for agenter som CDDO-DFPA.

Det er viktig å vurdere alternative metodene og mekanismene som iDCs kan bli overtalt til å mDCs av andre enn LPS, som CD40L, TNF-α og IFN-γ52. DC modning av LPS gjennom Toll-like reseptorer 4(TLR4) fører aktivering av flere transkripsjonsfaktorer, inkludert kjernefysiske faktor-κB (NF-κB), p38 mitogen-aktivert protein kinase (p38 MAPK), c-Jun N-terminal kinase (JNK), og ekstracellulære signal-regulert protein kinase (ERK1/2). Modningen av DCs ved CD40L og TNF-α gjennom CD40 og TNF reseptorer induserer henholdsvis NF-κB veien. Derimot IFN-γ stimulerer en annen sti inkludert aktivering av Janus kinase (JAK), tyrosin kinase (TYK), og signalet svinger og aktivator transkripsjon proteiner (statistikk), og disse nedstrøms effektene er også supplert av aktivisering av NF-κB veien52. Dessuten, mens gene expression profilen til CD40L/TNF-α-baserte DC modning antyder at disse DCs polarize T-celler mot en Th2 celle respons53, er DC modning av IFN-γ sterkt partisk mot en Th1 celle respons54. Derfor er disse andre indusere av DC modning som er knyttet til differensiering mot bestemte T-celle delsett ikke ansatt i denne protokollen.

Flere rapporter har vist at ex vivo-differensiert DCs kan indusere hele spekteret av EAE kliniske symptomer og patologi i mus55. Metoden for passiv EAE induksjon av ex vivo aktivert DCs har blitt tatt med forskjellige modifikasjoner av ulike laboratorier. Kombinasjonen av passive og aktive EAE induksjon av administrasjonen av MOG primet BMDCs, 7 dager før immunisering med MOG og komplett Freund's adjuvant (CFA) resulterer i høyere klinisk symptom score (topp klinisk resultat: 3,5) sammenlignet med den passive EAE induksjon av administrasjonen av MOG primet BMDCs alene (topp klinisk resultat: 2)56. Resultater med denne metoden forbinder MOG primet BMDCs med MOG immunisering antyder at sykdommen utbruddet skjer på dag 9 etter immunisering med MOG og CFA56. Men siden det er kjent at CFA forårsaker betydelig betennelse på stedet av administrasjonen57, har vi benyttet passiv EAE induksjon av administrasjonen av DCs alene i vår protokollen for å effektivt analysere effekten av TolDCs under EAE. Ytterligere bekreftelse funksjonelle fenotypen av TolDCs, bør man også teste dem i undertrykke kliniske symptomer av aktive EAE mus. Administrasjon ruten DCs er også avgjørende for induksjon av EAE symptomer58. Som rapportert av vår lab og av andre, subkutan injeksjon av BMDCs i regionen flanken av C57BL/6 mus ukentlig totalt 3-4 injeksjoner induserer en topp klinisk score på EAE rundt 2-2,5 med reproduserbar sykdommen utbruddet på dag 11-1237 ,58. Vi ga et kort klipp for å demonstrere de kliniske symptomene mellom aktive og passive EAE induksjon (Video 1).

Anerkjent begrensningene av våre protokollen inkluderer tiden metoder brukt og avhengigheten av en ikke-fysiologisk relevante microenvironment for BMDC differensiering. Men mens antistoffer beriket kolonnen separasjon metoder for samling for DCer og T celler fra murine milt kan være mer tid effektiv, lider den av en lav avkastning av ønsket DC befolkningen. Dermed er fordelen av metoden for Ben margtransplantasjon-avledet DC utvikling log skala høyere avkastning DC befolkninger sammenlignet med antistoff kolonnen separasjon fra hele milten. Som nevnt ovenfor, DCs generert krever i vitro av denne metoden en høy konsentrasjon av cytokin kosttilskudd som er ikke fysiologisk relevant DCs i vivo microenvironment59 og også sikrer ikke den langsiktige bærekraft FM. GM-CSF brukes i våre protokollen er heller ikke en viktig cytokin normal DC differensiering i vivo60. Likevel foreslåtte BMDC generasjon protokollen reproduserbar gir en høy andel av funksjonelt TolDCs og bør sees på som en svært pålitelig og reproduserbar metode for å generere funksjonelle DCs med tolerogenic egenskaper.

Avslutningsvis kan TolDCs generert fra protokollen beskrevet her karakteriseres effektivt ved å vurdere deres genet og protein uttrykk profiler ved å fastsette deres evne til å modulere T celle-avhengige immun svar i vitroog ved vurdere sin funksjon som en adopsjon cellen terapi å undertrykke EAE induksjon i vivo. Våre protokollen gir et rammeverk for vurdering av noen nye agenter syntes å ha evnen til å indusere TolDCs og ytterligere akselerere terapeutiske utviklingsprosessen for TolDCs fra benken til klinikken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen

Acknowledgments

Vi takker Reata legemidler for å gi CDDO-DFPA. Vi erkjenner også støtte av Jane og Lee Seidman leder i Pediatric Cancer innovasjon (John Letterio). Dette arbeidet ble støttet av Forsvarsdepartementet [W81XWH-12-1-0452]; Angie Fowler ungdom og unge voksne kreft forskning initiativ på saken Comprehensive Cancer Center; og Callahan Graduate Scholar Award for Hsi-Ju Wei fra FJ Callahan Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CDDO-DFPA (RTA-408) Reata Pharmaceuticals in house synthesis Cell culture
Mouse GM-CSF Peprotech Inc. 315-03 BMDC differentiation
Mouse IL-4 Peprotech Inc. 214-14 BMDC differentiation
Lipopolysaccharides (LPS) Sigma Aldrich Inc. L2880 Cell culture
β-mercaptoethanol Sigma Aldrich Inc. 516732 Cell culture
Pertussis toxin (PTX) R&D systems 3097 EAE induction
MOG (35–55) peptide 21stCentury Biochemicals in house synthesis EAE induction
Trypan blue Gibco, Life Technologies 15250-061 Cell culture
RPMI-1640 plus L-glutamine ThermoFisher Scientific 11875-093 Cell culture
Non-essential amino acid (100X) ThermoFisher Scientific 11140050 Cell culture
HEPES ThermoFisher Scientific 15630080 Cell culture
penicillin/streptomycin ThermoFisher Scientific 15140122 Cell culture
40 μm cell strainer Corning 352340 Cell isolation
PE-conjugated CD80 BD Biosciences 557227 Flow cytometry
PE-conjugated CD86 BD Biosciences 555665 Flow cytometry
PE-conjugated PD-L1 BioLegend 124307 Flow cytometry
APC-conjugated MHCII Miltenyi Biotec Inc. 130-112-388 Flow cytometry
APC-conjugated CD11c BD Biosciences 340544 Flow cytometry
Isotype matched PE Miltenyi Biotec Inc. 130-091-835 Flow cytometry
Isotype matched APC Miltenyi Biotec Inc. 130-091-836 Flow cytometry
CFSE BioLegend 423801 T cell proliferation assay
Pan dendritic cell isolation kit Miltenyi Biotec Inc. 130-100-875 T cell proliferation assay
FcR Blocking Reagent Miltenyi Biotec Inc. 130-100-875 T cell proliferation assay
Pan Dendritic Cell Biotin-Antibody Cocktail Miltenyi Biotec Inc. 130-100-875 T cell proliferation assay
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi Biotec Inc. 130-100-875 T cell proliferation assay
CD4+ T cell isolation kit Miltenyi Biotec Inc. 130-104-454 T cell proliferation assay
CD4+ T cell Biotin-Antibody Cocktail Miltenyi Biotec Inc. 130-104-454 T cell proliferation assay
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi Biotec Inc. 130-104-454 T cell proliferation assay
ACK lysing buffer ThermoFisher Scientific A1049201 BMDC differentiation
1 ml syringe BD Biosciences 309626 T cell proliferation assay
3 ml syringe BD Biosciences 309588 BMDC differentiation
25G needle BD Biosciences 309626 T cell proliferation assay
23G needle BD Biosciences 309588 BMDC differentiation
BSA Sigma Aldrich Inc. A2058 T cell proliferation assay
EDTA ThermoFisher Scientific 15575020 T cell proliferation assay
LS Column Miltenyi Biotec Inc. 130-042-401 T cell proliferation assay
Pre-Separation Filter Miltenyi Biotec Inc. 130-095-823 T cell proliferation assay
collagenase D Sigma Aldrich Inc. 11088858001 T cell proliferation assay
HBSS ThermoFisher Scientific 14025076 T cell proliferation assay
ovalbumin (OVA) peptide 323–329 Sigma Aldrich Inc. O1641 T cell proliferation assay
Mouse IFN-γ TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm01168134_m1 qRT-PCR
Mouse IL-12a TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm00434165 qRT-PCR
Mouse IL-12 p70 DuoSet ELISA R&D systems DY419-05 ELISA
Mouse EDN-1 ELISA RayBiotech ELM-EDN1-1 ELISA
TNF-α TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm00443258 qRT-PCR
Mouse TNF-α Quantikine ELISA Kit R&D systems MTA00B ELISA
IL-6 TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm00446190 qRT-PCR
Mouse IL-6 Quantikine ELISA Kit R&D systems M6000B ELISA
IL-23a TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm01160011 qRT-PCR
Mouse IL-23 DuoSet ELISA R&D systems DY1887-05 ELISA
IL-4 TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm99999154_m1 qRT-PCR
IL-10 TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm01288386_m1 qRT-PCR
TGF-β TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm01178820_m1 qRT-PCR
Anti-Heme Oxygenase 1 antibody Abcam ab13248 Western blotting
Anti-β-actin antibody Abcam ab8226 Western blotting
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System Bio-Rad Inc. qRT-PCR
BD FACSCalibur Cell Analyzer BD Biosciences Flow cytometry

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).
  2. Inaba, K., et al. Efficient presentation of phagocytosed cellular fragments on the major histocompatibility complex class II products of dendritic cells. J Exp Med. 188 (11), 2163-2173 (1998).
  3. Banchereau, J., et al. Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol. 18, 767-811 (2000).
  4. Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 179 (4), 1109-1118 (1994).
  5. Hemmi, H., Akira, S. TLR signalling and the function of dendritic cells. Chem Immunol Allergy. 86, 120-135 (2005).
  6. Caux, C., et al. B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells. J Exp Med. 180 (5), 1841-1847 (1994).
  7. Chastain, E. M., Duncan, D. S., Rodgers, J. M., Miller, S. D. The role of antigen presenting cells in multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 265-274 (2011).
  8. Smeltz, R. B., Chen, J., Ehrhardt, R., Shevach, E. M. Role of IFN-gamma in Th1 differentiation: IFN-gamma regulates IL-18R alpha expression by preventing the negative effects of IL-4 and by inducing/maintaining IL-12 receptor beta 2 expression. J Immunol. 168 (12), 6165-6172 (2002).
  9. Gyulveszi, G., Haak, S., Becher, B. IL-23-driven encephalo-tropism and Th17 polarization during CNS-inflammation in vivo. Eur J Immunol. 39 (7), 1864-1869 (2009).
  10. Kronenberg, M., Rudensky, A. Regulation of immunity by self-reactive T cells. Nature. 435 (7042), 598-604 (2005).
  11. Boks, M. A., et al. IL-10-generated tolerogenic dendritic cells are optimal for functional regulatory T cell induction--a comparative study of human clinical-applicable DC. Clin Immunol. 142 (3), 332-342 (2012).
  12. Anderson, A. E., et al. Tolerogenic dendritic cells generated with dexamethasone and vitamin D3 regulate rheumatoid arthritis CD4+ T cells partly via transforming growth factor-beta1. Clin Exp Immunol. 187 (1), 113-123 (2017).
  13. Chauveau, C., et al. Heme oxygenase-1 expression inhibits dendritic cell maturation and proinflammatory function but conserves IL-10 expression. Blood. 106 (5), 1694-1702 (2005).
  14. Maldonado, R. A., von Andrian, U. H. How tolerogenic dendritic cells induce regulatory T cells. Adv Immunol. 108, 111-165 (2010).
  15. Schmidt, S., Nino-Castro, A., Schultze, J. Regulatory dendritic cells: there is more than just immune activation. Frontiers in Immunology. 3 (274), (2012).
  16. Hilkens, C. M., Isaacs, J. D., Thomson, A. W. Development of dendritic cell-based immunotherapy for autoimmunity. Int Rev Immunol. 29 (2), 156-183 (2010).
  17. Dhodapkar, M. V., Steinman, R. M. Antigen-bearing immature dendritic cells induce peptide-specific CD8(+) regulatory T cells in vivo in humans. Blood. 100 (1), 174-177 (2002).
  18. Dhodapkar, M. V., Steinman, R. M., Krasovsky, J., Munz, C., Bhardwaj, N. Antigen-specific inhibition of effector T cell function in humans after injection of immature dendritic cells. J Exp Med. 193 (2), 233-238 (2001).
  19. Giannoukakis, N., Phillips, B., Finegold, D., Harnaha, J., Trucco, M. Phase I (safety) study of autologous tolerogenic dendritic cells in type 1 diabetic patients. Diabetes Care. 34 (9), 2026-2032 (2011).
  20. Benham, H., et al. Citrullinated peptide dendritic cell immunotherapy in HLA risk genotype-positive rheumatoid arthritis patients. Sci Transl Med. 7 (290), 290ra287 (2015).
  21. Bell, G. M., et al. Autologous tolerogenic dendritic cells for rheumatoid and inflammatory arthritis. Ann Rheum Dis. 76 (1), 227-234 (2017).
  22. University Hospital, A. A "Negative" Dendritic Cell-based Vaccine for the Treatment of Multiple Sclerosis: a First-in-human Clinical Trial (MS tolDC). ClinicalTrials.gov. , (2015).
  23. Pujol, F. I. G. T. i Tolerogenic Dendritic Cells as a Therapeutic Strategy for the Treatment of Multiple Sclerosis Patients (TOLERVIT-MS) (TOLERVIT-MS). ClinicalTrials.gov. , (2016).
  24. Varea, S. Treatment of Multiple Sclerosis and Neuromyelitis Optica With Regulatory Dendritic Cell: Clinical Trial Phase 1 B. ClinicalTrials.gov. , (2017).
  25. Jauregui-Amezaga, A., et al. Intraperitoneal Administration of Autologous Tolerogenic Dendritic Cells for Refractory Crohn's Disease: A Phase I Study. J Crohns Colitis. 9 (12), 1071-1078 (2015).
  26. Mahnke, K., Schmitt, E., Bonifaz, L., Enk, A. H., Jonuleit, H. Immature, but not inactive: the tolerogenic function of immature dendritic cells. Immunol Cell Biol. 80 (5), 477-483 (2002).
  27. Lutz, M. B., Schuler, G. Immature, semi-mature and fully mature dendritic cells: which signals induce tolerance or immunity? Trends Immunol. 23 (9), 445-449 (2002).
  28. Suciu-Foca, N., et al. Molecular characterization of allospecific T suppressor and tolerogenic dendritic cells: review. Int Immunopharmacol. 5 (1), 7-11 (2005).
  29. Wakkach, A., et al. Characterization of dendritic cells that induce tolerance and T regulatory 1 cell differentiation in vivo. Immunity. 18 (5), 605-617 (2003).
  30. Szeles, L., et al. 1,25-dihydroxyvitamin D3 is an autonomous regulator of the transcriptional changes leading to a tolerogenic dendritic cell phenotype. J Immunol. 182 (4), 2074-2083 (2009).
  31. Unger, W. W., Laban, S., Kleijwegt, F. S., vander Slik, A. R., Roep, B. O. Induction of Treg by monocyte-derived DC modulated by vitamin D3 or dexamethasone: differential role for PD-L1. Eur J Immunol. 39 (11), 3147-3159 (2009).
  32. Reichardt, W., et al. Impact of mammalian target of rapamycin inhibition on lymphoid homing and tolerogenic function of nanoparticle-labeled dendritic cells following allogeneic hematopoietic cell transplantation. J Immunol. 181 (7), 4770-4779 (2008).
  33. Woltman, A. M., et al. The effect of calcineurin inhibitors and corticosteroids on the differentiation of human dendritic cells. Eur J Immunol. 30 (7), 1807-1812 (2000).
  34. Hackstein, H., Thomson, A. W. Dendritic cells: emerging pharmacological targets of immunosuppressive drugs. Nat Rev Immunol. 4 (1), 24-34 (2004).
  35. Torres-Aguilar, H., Blank, M., Jara, L. J., Shoenfeld, Y. Tolerogenic dendritic cells in autoimmune diseases: crucial players in induction and prevention of autoimmunity. Autoimmun Rev. 10 (1), 8-17 (2010).
  36. Rutella, S., Danese, S., Leone, G. Tolerogenic dendritic cells: cytokine modulation comes of age. Blood. 108 (5), 1435-1440 (2006).
  37. Wei, H. J., Pareek, T. K., Liu, Q., Letterio, J. J. A unique tolerizing dendritic cell phenotype induced by the synthetic triterpenoid CDDO-DFPA (RTA-408) is protective against EAE. Sci Rep. 7 (1), 9886 (2017).
  38. van Etten, E., Mathieu, C. Immunoregulation by 1,25-dihydroxyvitamin D3: basic concepts. J Steroid Biochem Mol Biol. 97 (1-2), 93-101 (2005).
  39. Pan, J., et al. Dexamethasone inhibits the antigen presentation of dendritic cells in MHC class II pathway. Immunol Lett. 76 (3), 153-161 (2001).
  40. Zhu, J., Paul, W. E. Heterogeneity and plasticity of T helper cells. Cell Res. 20 (1), 4-12 (2010).
  41. Spirig, R., et al. TLR2 and TLR4 agonists induce production of the vasoactive peptide endothelin-1 by human dendritic cells. Mol Immunol. 46 (15), 3178-3182 (2009).
  42. Walton, E. L. Make immunological peace not war: Potential applications of tolerogenic dendritic cells. Biomed J. 40 (2), 77-79 (2017).
  43. Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). Br J Pharmacol. 164 (4), 1079-1106 (2011).
  44. Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking. J Immunol. 179 (11), 7577-7584 (2007).
  45. Angelov, G. S., Tomkowiak, M., Marcais, A., Leverrier, Y., Marvel, J. Flt3 ligand-generated murine plasmacytoid and conventional dendritic cells differ in their capacity to prime naive CD8 T cells and to generate memory cells in vivo. J Immunol. 175 (1), 189-195 (2005).
  46. Lowes, M. A., et al. Increase in TNF-alpha and inducible nitric oxide synthase-expressing dendritic cells in psoriasis and reduction with efalizumab (anti-CD11a). Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (52), 19057-19062 (2005).
  47. Schnorrer, P., et al. The dominant role of CD8+ dendritic cells in cross-presentation is not dictated by antigen capture. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (28), 10729-10734 (2006).
  48. Wang, W., Li, J., Wu, K., Azhati, B., Rexiati, M. Culture and Identification of Mouse Bone Marrow-Derived Dendritic Cells and Their Capability to Induce T Lymphocyte Proliferation. Med Sci Monit. 22, 244-250 (2016).
  49. Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J Immunol Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
  50. Griffin, M. D., et al. Dendritic cell modulation by 1alpha,25 dihydroxyvitamin D3 and its analogs: a vitamin D receptor-dependent pathway that promotes a persistent state of immaturity in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (12), 6800-6805 (2001).
  51. Bscheider, M., Butcher, E. C. Vitamin D immunoregulation through dendritic cells. Immunology. 148 (3), 227-236 (2016).
  52. Castiello, L., et al. Monocyte-derived DC maturation strategies and related pathways: a transcriptional view. Cancer Immunol Immunother. 60 (4), 457-466 (2011).
  53. Decker, W. K., et al. Deficient T(H)-1 responses from TNF-alpha-matured and alpha-CD40-matured dendritic cells. J Immunother. 31 (2), 157-165 (2008).
  54. Longhi, M. P., et al. Dendritic cells require a systemic type I interferon response to mature and induce CD4+ Th1 immunity with poly IC as adjuvant. J Exp Med. 206 (7), 1589-1602 (2009).
  55. Link, H., Huang, Y. M., Xiao, B. G. Dendritic cells in experimental allergic encephalomyelitis and multiple sclerosis. J Neuroimmunol. 100 (1-2), 102-110 (1999).
  56. Leech, M. D., et al. Cutting edge: IL-6-dependent autoimmune disease: dendritic cells as a sufficient, but transient, source. J Immunol. 190 (3), 881-885 (2013).
  57. Saul, L., Besusso, D., Mellanby, R. J. LPS-matured CD11c+ bone marrow-derived dendritic cells can initiate autoimmune pathology with minimal injection site inflammation. Lab Anim. 51 (3), 292-300 (2017).
  58. Aghdami, N., Gharibdoost, F., Moazzeni, S. M. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) induced by antigen pulsed dendritic cells in the C57BL/6 mouse: influence of injection route. Exp Anim. 57 (1), 45-55 (2008).
  59. Wilson, H. L. Limitations with in vitro production of dendritic cells using cytokines. J Leukoc Biol. 75 (4), 600-603 (2004).
  60. Ni, K., O'Neill, H. C. Development of dendritic cells from GM-CSF-/- mice in vitro : GM-CSF enhances production and survival of cells. Dev Immunol. 8 (2), 133-146 (2001).

Tags

Medisin problemet 135 Tolerogenic dendrittiske celler (TolDCs) Ben margtransplantasjon-avledet dendrittiske celler (BMDCs) eksperimentelle Autoimmune immunsviktvirus (EAE) Immune suppression cytokiner autoimmunitet
Utvikling og funksjonell karakteristikk av Murine Tolerogenic dendrittiske celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wei, H. J., Letterio, J. J., Pareek, … More

Wei, H. J., Letterio, J. J., Pareek, T. K. Development and Functional Characterization of Murine Tolerogenic Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (135), e57637, doi:10.3791/57637 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter