Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Geliştirme ve işlevsel fare Tolerogenic dendritik hücrelerin karakterizasyonu

Published: May 18, 2018 doi: 10.3791/57637

Summary

Burada, geliştirmek ve tolerogenic dendritik hücreler (TolDCs) karakterize ve onların immunotherapeutic yardımcı programı değerlendirmek için bir protokol mevcut.

Abstract

Bağışıklık sisteminin yabancı antijenlere karşı denetleyici yanıt arasında sıkı bir denge tutarak çalışır ve öz-antijenleri yanı sıra antijenlere karşı tepkisiz bir durum komensal organizmalar türetilmiş. Bu bağışıklık homeostazı bozulma kronik inflamasyon ve otoimmünite gelişmesine yol açabilir. Dendritik hücreler (DC) doğuştan gelen bağışıklık sisteminin yabancı antijenlere karşı bağışıklık yanıtı başlatmak için saf T hücreleri aktive dahil profesyonel antijen sunan hücreler vardır. Ancak, DCs da korumak ve T hücre tolerans teşvik ve efektör hücreleri ya da otoimmün veya kronik inflamasyon koşulları gelişimine katkıda bastırmak için hareket TolDCs içine farklı. TolDCs son ilerlemesi anlayışımız içinde DC tolerans ayırt etme durumları oransal tarafından elde edilebilir öneriyor. Bu olay TolDC tedaviler çok sayıda bağışıklık bozuklukları nedeniyle neden olduğu bağışıklık toleransı kırmak için gelişmekte olan muazzam büyüme yol açmıştır. Preklinik otoimmünite fare modelleri başarılı çalışmalar daha da TolDCs immunotherapeutic yardımcı programı otoimmün hastalıklar tedavi doğrulanmış var. Bugün, TolDCs kliniğinde çeşitli bağışıklık hastalıkları bağışıklık toleransı koruyucu bağışıklık olduğu gibi bırakarak patojenik otoimmün yanıtları hedefleyerek geri getirmemesi için umut verici bir immunotherapeutic aracı haline gelmiştir. Stratejilerinin bir dizi TolDCs ikna etmek için birden fazla labs tarafından önerilen, orada olsa da hiçbir tutarlılık bu hücrelerinin hücresel ve fonksiyonel fenotip karakterize. Bu iletişim kuralı kemik iliği türevi DCs çok sayıda, onları bir sentetik triterpenoid 2-cyano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oic TolDCs ayırt etmek için kullanılan benzersiz bir yöntem geliştirilmesi için adım adım yönergeler sağlar asit-difluoro-propil-Amid (CDDO-DFPA) ve TolDCs temel moleküler imza analizleri de dahil olmak üzere kendi fenotip onaylamak için kullanılan teknikler. Son olarak, biz onların immünsüpresif yanıt vitro ve in vivo preklinik manken multipl skleroz test ederek TolDC işlevini değerlendirmek için bir yöntem gösterir.

Introduction

Dendritik hücreler (DC) doğuştan gelen bağışıklık sisteminin ayrılmaz bir parçası olan ilk keşfetti ve Ralph Steinman ve Zanvil Cohn birincil profesyonel antijen sunan hücreler1olarak 1973 yılında ile karakterizedir. DCs T hücreleri ve B hücreleri MHC kompleksi (MHC) ile işlenmiş antijen ikincil lenfoid organlara içinde doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık sistemleri2bağlantı sunarak bağışıklık harekete geçirmek içinde önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. Memeli bağışıklık sisteminde miyeloid DCs ve plazmasitoid DCs (PDC)3açıklanan DC'lerin en az iki kategorisi vardır. Myeloid DCs, geleneksel DCs (KGK), CD11c ifade tarafından karakterize ve olgunlaşmamış DCs (iDCs) içinde vitro kemik iliği progenitör hücre veya kullanarak periferik kan monosit olarak farklı olarak da bilinir granülosit-makrofaj-koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) ve Il-4 fare veya insan türler, sırasıyla4.

Sürücü moleküler desenleri (PAMP) patojen ilişkili veya moleküler desenleri (nem), hasar ilişkili öyle aynı derecede immunojenik DCs doğru iDCs olgunlaşma olgun DCs (mDCs) olarak çeşitli desen tanıma reseptörleri bağlama via 'tehlike' aktive, sinyalleri DC yüzey5. İmmunojenik DCs daha da prime saf T hücre çoğalması ve MHCII2, costimulatory ligandlar (CD80, CD86 ve CD40)6, sitokinler ve diğer çözünür arabulucu7upregulation aracılığıyla farklılaşma. Pro-inflamatuar arabulucu üretim immünojenik DCs gelen bir çağlayan sitokin aracılıklı T hücre farklılaşması için esastır. Örneğin, IL-12 ve IFN γ Th1 farklılaşma8 ve Il-1, için gerekli olan Il-6 ve IL-23 saf T hücre polarizasyon Th17 hücreleri9doğru için önemlidir. Her ne kadar olgun DCs yabancı antijenleri için tepki, kontrolsüz DC etkinleştirme tarafından öz-antijenleri tolerans ablasyon neden olabilir ve autoreactive T hücreleri olan harekete geçirmek10 doku yıkıma yol oluşturarak otoimmün hastalıklar gelişimi teşvik .

Son raporlar DC plastisite, yeteneklerini kendi doku microenvironment içinde farklı ipuçları ile etkileşim ve farklı efektör/bastırıcı DC alt kümeleri ayırt etmek için tarafından örneği açık kanıtlar sağlamıştır. IL-1011, TGF-β12ve HO-113 gibi anti-inflamatuar arabulucu tolerogenic DCs (TolDCs) inducing tarafından bağışıklık suppression içinde önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. Bu TolDCs düzenleyici işlevleri elde etmek ve T hücre proliferasyonu14bastırmak. Ayrıca, DC'ler tarafından ortak uyarım eksikliği ve anti-inflamatuar arabulucu TolDCs gelen üretim hem düzenleyici T hücreleri (Tregs) indüksiyon katkı ve aynı zamanda etkili Th1 ve Th17 farklılaşma ve genişleme15inhibe. İki yıl, TolDCs tedavi edici potansiyelini birkaç müfettişler tarafından bildirilmiştir. Bu çalışmalarda ex vivo yönetim sadece iyileştirmiştir TolDCs patolojik belirtiler otoimmün hastalıklar16 farklı preklinik modellerin oluşturulan ama aynı zamanda17 hastalarda immün tolerans gelişmesine yol açtı ,18. Otoimmün hastalıklar da dahil olmak üzere çeşitli klinik çalışmalarda 1 diyabet19, romatoid artrit20, türü için ilginç bir şekilde, bugün TolDCs terapi alternatif veya ek bir yaklaşım kabul edilmiştir 21, multipl skleroz (MS)22,23,24ve Crohn hastalığı25.

Çeşitli TolDCs geliştirmek için kullanılan iletişim kuralları vardır ve birkaç laboratuar yöntemleri üretimi ve TolDCs fenotipik karakterizasyonu için bildirdin. Bu yöntemler tekrarlanarak TolDCs vitro hematopoetik ataları oluşturmak ve stabil bir tolerogenic devlet vivo içinde26,27,28,29onları korumak için kullanılabilir. İDCs-ebilmek var olmak değiştirmek TolDCs çeşitli immunomodulatory farmakolojik ajanlar veya anti-inflamatuar sitokinlerin maruz. Örneğin, D3 vitamini IL-10 üretimi artırmak ve DCs gelen IL-12 salgılanması bastırmak ve böylece onların immünsüpresif işlevi30artırmak için bilinen bir iyi bilinen farmakolojik ajandır. DCs lipopolisakkaritler (LPS), gibi güçlü inflamatuar uyarıcılara maruz kaldığında Ayrıca, deksametazon31, rapamycin32ve kortikosteroidler33 gibi çeşitli farmakolojik ajanlar ikna etmek için gösterilmiştir CD40, CD80, CD86 ve MHCII34DC yüzey ifade azaltarak TolDC fenotip. IL-10 ve TGF-β DC tolerans35 ve eşlik eden maruz kalma bu sitokinler her ikisi de ikna etmek için en okudu anti-inflamatuar sitokinlerin tolerogenic fenotip DCs36içinde ikna etmek için göstermiştir vardır.

Yerine fenotipik işaretleri tarafından orada DC fonksiyonel özelliklere göre tanımlanır tolerogenic beri büyük bir TolDCs hücresel ve fonksiyonel karakterizasyonu için tutarlı bir yöntem geliştirmek zorundayız. Eğer biz etkili ve tekrarlanarak TolDC fenotip ikna etmek için yetenek yeni ajanların karşılaştırmak için Ayrıca, titiz ve tutarlı iletişim kuralı tutarlı değerlendirme ve tolerogenic DC fenotip karakterizasyonu için oluşturulmalıdır Laboratuvar. Burada ayrıntılı bir protokol ile adım adım yöntemler iDCs farelerin hematopoetik ataları gelen izole etmek ve daha sonra değerlendirme kapasitelerini TolDCs iDCs dönüştürmek için altında yeni ajanların etkinliğini çözümlemek için sağlam sağlayan sağlamak TolDCs fenotipik ve fonksiyonel karakterizasyonu vitro ve içinde vivo. Bu açıklama TolDCs onların yüzey ligandlar, sitokin profil ve immünsupresif işlevleri vitrotarafından karakterize etmek için ayrıntılı bir yöntem içerir. Biz de bu TolDCs MS, deneysel otoimmun ensefalomiyelit (EAE), önceden klinik bir modeli potansiyel tedavi uygulanması keşfetmek için bir yöntem örneği sağlar. Bu oluşturulmuş protokol TolDCs indüksiyon teşvik için yeni acentalar kapasitesini değerlendirmek için Müfettişler yardımcı olacak ve TolDC terapötik geliştirme kapsamını genişletmek için çaba kolaylaştıracaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Case Western Reserve Üniversitesi Tıp Fakültesi'nın kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmış yordamlar ile uyumlu tüm çalışmaları yapıldı.

1. dendritik hücreler (BMDCs) kemik iliği türevi hazırlayın

  1. Isıyla üzerinden tüm cerrahi aletler sterilize ve sınıf II biyolojik Emanet yürüttüğü güvenlik prosedürleri ile kabine deneme gerçekleştirin.
  2. C57BL/6 fareler CO2 odası kullanarak 8-10 hafta-in yaş ötenazi. Parçalanmış bir tahta üzerine fareyi getirin ve % 70 etanol ile durulayın. Cerrahi makas kullanarak Tibia-fibula ve uyluk kemikleri tüketim ve ile % 70 etanol 10 cm kültür tabağına koyun.
  3. Cerrahi bıçaklar ve forseps uzak doku incelemek için kullanın 10 cm kapağındaki mümkün olduğunca kültür çanak ve izole yırtılmalarıteşhis ve uyluk ile % 70 etanol 6 cm kültür tabağına koyun.
  4. Her iki ucunda da yırtılmalarıteşhis ve uyluk kırpmaya cerrahi bıçaklar kullanın. 3 mL PBS 3 ml şırınga 23 G iğne ile kemik iliği içeriğini kemik bir ucundan 12 ml PBS içeren bir konik tüp floş için kullanın. Bu adım 3 x her kemik için tekrarlamak.
  5. 300 x g 5 min için de hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi.
  6. Süpernatant kaldırmak ve hücre Pelet kırmızı kan hücreleri kaldırmak 5 dakika için 1 ml ACK lysing tampon ile resuspend.
  7. 9 ml ACK lysing tampon ve 5 dakika için 300 x g, santrifüj sulandırmak için PBS ekleyin.
  8. Süpernatant kaldırmak ve 10 ml kültür orta (RPMI-1640 artı L-glutamine, %10 FBS, % 1 esansiyel olmayan amino asit (100 x), 10 mM HEPES, 50 nM β-mercaptoethanol ve % 5 penisilin/streptomisin) ile resuspend.
    Not: Endotoksin düzeyi daha az 0.1 EU/ml FBS içinde olmak zorunda.
  9. Hücre süspansiyon 40 mikron hücre süzgeç aracılığıyla geçmek ve hücre süspansiyon, 20 µl alıp trypan canlı hücreleri sitometresi kullanarak saymak için mavi 80 µl ile karıştırın.
  10. 1 x 106 hücre/ml 15 ng/ml GM-CSF ve 10 ng/ml Il-4 ile cep numarasını ayarlayın.
  11. 3 ml 1 x 106 hücre/ml her iyi 6-şey plaka plaka ve 37 ° C, % 5 CO2ve % 95 nem CO2 kuluçka hücreleri kuluçkaya.
    Not: Bir fare kemik iliği hücrelerinden olduğunu çevresinde 3-5 x 107 hücreleri, bu 2 ila 3 6-şey plakaları için yerleştirilebilir gösteren.
  12. Günde 3, tüm 3 ml kültür orta her kuyudan çıkarmak her kuyuda 2 ml taze PBS ekleyin ve sonra yavaşça yapışık olmayan hücreleri kaldırma sağlamak için plaka girdap.
  13. 15 ng/ml GM-CSF ve 10 ng/ml Il-4 her iyi 3 ml taze kültür orta yerine. 37 ° C, % 5 CO2ve % 95 nem CO2 kuluçka hücreleri kuluçkaya.
  14. 5 günde, doğrudan başka bir 3 ml taze kültür ortamına 15 ng/ml GM-CSF ve 10 ng/ml Il-4 ile her kuyuya ekleyin. 37 ° C, % 5 CO2, ve % 95 nem CO2 kuluçka hücreleri kuluçkaya.
    Not: Toplam her iyi şimdi 6 ml birimdir.
  15. 7 günde 10 dakika için buz üzerinde tüm plaka koymak. Hafifçe gevşek-yapışık BMDCs iDCs süspansiyon çıkarmak için her şey kültür ortamında pipette.
    Not: Yapisan makrofajlar hala plakasına eklenir. Düşük sıcaklık ve yavaşça yordamlar deneyler daha da etkilemeye DC etkinleştirme önlemek için anahtarıdır.
  16. 300 x g 5 dakika için de hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi ve daha fazla deneyler için taze kültür orta ile resuspend.
    Not: BMDCs floresan etiketli CD11c antikor ile akış sitometresi tarafından tespit edilebilir ve Şekil 1' de BMDCs bizim perdeleme strateji daha fazla deneyler için gösterdi.

2. TolDC gen ve Protein profil karakterize

  1. 2 ml 1 x 106 BMDCs/ml 6 iyi-plaka bir kuyu başına 1 h 37 ° C, % 5 CO2 ve % 95 nem CO2 Kuluçka kuluçka için 100-400 nM CDDO-DFPA içinde kültür orta ile plaka.
    Not: CDDO-DFPA, sentetik bir triterpenoid 2 faktör (Nrf2) uyarıcı ve nükleer faktör-κB (NF-κB) inhibitörü - gibi - nükleer faktör (2 erythroid elde edilen) değil. İDCs IL-10, D3 vitamini, deksametazon veya BAY 11-7085, gibi diğer maddeleri TolDCs indüksiyon için uygulamak ve bu adımı her aracısının en uygun bir durumuna değiştirebilirsiniz.
  2. 10 veya 100 ng/ml LPS (kuluçka süresi nedeniyle mRNA veya protein ölçümü farklıdır) mDCs ikna etmek için 4-24 gönderilen kuluçka için ekleyin.
  3. Yavaşça her şey kültür ortamında pipette ve 1 ml pipet kullanarak hücre süspansiyon hasat. 300 x g hücreleri ve süpernatant, sırasıyla toplamak 5 dakika için de santrifüj kapasitesi.
  4. Uyarıcı ligandlar gibi akış sitometresi tarafından yüzey ligandlar hücre topakları üzerinden analiz: CD40, CD80, CD86, MHC-II, OX40L, ICOSL veya inhibitör ligandlar: PD-L1, PD-L2, ILT3, ILT4.
  5. RNA hücre topakları üzerinden yalıtmak ve RNA ve süpernatant örnekleri için nicel gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) ve ELISA, sitokin profil ve gen ve protein düzeyleri sırasıyla çözümleyebilirsiniz.
    Not: için örnek, inflamatuar sitokinlerin: TNF-α, IFNγ, EDN-1, IL-6, IL-12 ve IL-23 veya anti-inflamatuar sitokinlerin: Il-4, IL-10, IL-15, TGF-β1 ve HO-1.

3. TolDCs fonksiyonun değerlendirildiği Vitro ve In Vivo

  1. T-hücre Syngeneic yayılması tahlil
    1. Isıyla üzerinden tüm cerrahi aletler sterilize ve sınıf II biyolojik Emanet yürüttüğü güvenlik prosedürleri ile kabine deneme gerçekleştirin.
    2. MAC'ler arabellek % 0.5 Sığır serum albumin (BSA) ve 2 mM EDTA 500 ml PBS kullanarak hazırlayın. Arabellek 0.2 µm filtreden süzerek sterilize.
      Not: aşağıdaki deneme sırasında arabellek buz üzerinde tutun.
    3. CD4 elde etmek için+ T hücreleri, CO2 odası kullanarak 8-10 hafta-in yaş OT-II T-hücre reseptör (TCR) transgenik fareler ötenazi. Parçalanmış bir tahta üzerine fareyi getirin ve % 70 etanol ile durulayın. Karın sol tarafındaki dalak cerrahi makas ve forseps kullanarak yalıtmak.
    4. 2 ml PBS ile dalak bir 6 cm kültür tabak koyun ve bir 40 mikron hücre süzgeç geçirerek dalak bin dereden su getirmek için bas-3 ml şırınga parça arka kullanın.
    5. Hücre süspansiyon ve 5 dakika için 300 x g, santrifüj toplamak.
    6. Hücre Pelet MAC'ler arabellek 400 μl içinde resuspend.
    7. CD4 100 μl eklemek+ T hücre Biotin-antikor kokteyl 4° c 5 dakika için.
      Not: Antikor kokteyl CD4 dışındaki diğer hücre türleri üzerinde bağlar+ T hücreleri, CD8a, CD11b, CD11c, CD19, CD25, CD45R gibi (B220), CD49b (DX5), CD105, Anti-MHC sınıf II, Ter-119 ve TCRγ/δ.
    8. MAC'ler arabelleği 300 μl ve anti-Biotin boncuk (Tablo reçetesi) 200 μl 4 ° C'de 10 dakika için ekleyin.
    9. Sütun oluşan yer ferromanyetik küre (Malzemeler tablo) ve ön ayırma alanını seçin ve MAC'ler arabellek 3 ml ile durulayın filtrede birlikte manyetik.
    10. MAC'ler arabelleği 9 ml hücreleri ve 300 x g, santrifüj 5 dakika için ekleyin.
    11. Hücre Pelet 3 ml MAC'ler arabellek resuspend ve sütun uygulayın. Toplamak akışı içeren CD4 aracılığıyla+ T hücreleri.
    12. Başka bir 3 ml MAC'ler arabelleği sütun yıkama ve aynı zamanda akış aracılığıyla toplamak.
    13. Dalak pan DCs elde etmek için CO2 odası kullanarak C57BL/6 fareler 8-10 hafta-in yaş ötenazi. Parçalanmış bir tahta üzerine fareyi getirin ve % 70 etanol ile durulayın. Karın sol tarafındaki dalak cerrahi makas ve forseps kullanarak yalıtmak. Dalak 2 ml collagenase D çözeltisi içeren bir 6 cm kültür tabak koyun (2 mg/ml collagenase D çözünmüş kalsiyum, magnezyum içeren HBSS).
    14. 1 ml collagenase D çözeltisi dalak için iki kez 1 ml şırınga ve bir 25 G iğne ile enjekte. Dalak küçük parçalar halinde küçük makasla kesilmiş.
    15. Salla ve 25 dakika için oda sıcaklığında kuluçkaya.
    16. 0, 5 M EDTA 500 μl, oda sıcaklığında 5 dakika için ekleyin.
      Not: 3.1.13-3.1.14 adımlardan DCs verimini artırmak için kritik öneme sahiptir.
    17. Şimdi itmek-3 ml şırınga parça arka tarafından geçen 40 mikron hücre süzgeç dalak Bulamaç kıyma ve 300 x g 5 dakika için de centrifuging tarafından hücre süspansiyon toplamak için kullanın.
    18. Hücre Pelet MAC'ler arabellek, 50 μl FcR engelleme reaktif ve Pan dendritik hücre Biotin-antikor kokteyl, 100 μl 4 ° C'de 10 dakika için 350 μl resuspend.
      Not: Antikor DC'ler tarafından ifade değil antijenlere karşı kokteyl.
    19. Hücreleri 300 x g 5 dakika için de 9 ml MAC'ler arabellek ve santrifüj ekleyerek yıkayın.
    20. Hücre Pelet MAC'ler arabellek 800 μl içinde resuspend ve anti-Biotin boncuk 200 μl 4° C'de 10 dakika için ekleyin.
    21. DCs toplamak için 3.1.9-3.1.11 gelen adımları yineleyin.
    22. Başka bir 3 ml MAC'ler arabelleği sütun iki kez yıkama ve aynı zamanda akış aracılığıyla toplamak.
    23. 2 x 105 DCs/ml 100-400 nM CDDO DFPA 37 ° c+ için 1 saatlik ayrı, etiket CD4 T hücreleri (1 x 107/ml) içinde cihaz 15 dakika süreyle 37 ° C'de 1 mikron CFSE ile tedavi, PBS ile yıkayın ve son konsantrasyonu 2 x 106 T hücre/ml almak için birimin yeniden ayarlayabilirsiniz.
    24. Daha sonra bir 96-şey tabak içinde tedavi dendritik hücreler 100 μl CFSE etiketli CD4 aynı hacmi ile ortak kültür+ T hücreleri,--dan belgili tanımlık yukarıda merdiven-1:10 almak için toplanan her ikisi de oranı. Şimdi 100 ng/mL ovalbumin (OVA) peptid 323-329 iyi ve ölçü CFSE yoğunluk akış sitometresi tarafından T hücrelerinin başına 2-3 gün sonra kuluçka ekleyin.
      Not: Hücre sayıları ve oranı DCs ve T hücreleri bizim önceki iş37optimize edilmiştir.
  2. Pasif neden BMDCs enjekte edilerek EAE Geniş puls miyelin Oligodendrocyte glikoprotein (MOG) (35-55)
    1. 2 ml 1 x 106 BMDCs/ml 6 iyi-plaka bir kuyu başına 1 saat kuluçka için 100-400 nM CDDO-DFPA içinde kültür orta ile plaka.
    2. 10 ng/ml LPS 24 kuluçka için ekleyin gönderilen.
    3. 100 μg/ml MOG (35-55) 4 kuluçka için ekleyin gönderilen.
    4. Hücre süspansiyon ve 5 dakika için 300 x g, santrifüj hasat.
    5. Hücre Pelet PBS ile resuspend ve hücreleri saymak.
    6. Subkutan 200 μl 8-10 hafta yaşlı kadın C57BL/6 farelere (her arka bacak içine 100 μl) 2 x 106 hücrelerinin enjekte et.
    7. BMDC enjeksiyon ve 48 gün gönderilen. daha sonra 200 enjekte ng boğmaca toksin (PTX) her fare.
    8. Adımları 3.2.6-3.2.7, 4 hafta boyunca haftada bir kez yineleyin.
    9. EAE klinik belirtileri günlük standart ölçütleri37 (0,5-topal kuyruk sonunda, 1-topal kuyruk, 2-orta arka bacak zayıflık, 3 şiddetli hind uzuv zayıflık, 4-tam hind felç, 5-kesici veya can çekişen devlet, 6-ölüm) kullanarak değerlendirmek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Farklılaşma ve BMDCs seçimi:

Kemik iliği progenitör hücre GM-CSF ve Il-4 iDCs 7 gün (Şekil 1A) ayırt etmek için tam RPMI ortamda kültürlü. Gün 1, hücreleri küçük içinde büyüklük ve küresel morfoloji gösterdi. Önce gün 3 taze orta yerine hücreleri form kümeleri için yardımcı oldu ve aynı zamanda CD11c nüfusu arttı PBS ile yıkama+ hücreleri. Günde 4, BMDCs boyutunda büyütülmüş ve küme formasyonu başlattık. Yapıştırılan makrofajlar Ayrıca dönüştürülür ve uzun bir şekil ile tabak dibinde görülmektedir. 5 günde BMDCs büyük ölçekli kümeleri oluşturulur. Gün 6, çok sayıda yarı yapışık ve kayan BMDCs de tespit edildi. BMDCs 7 gün hasat ve CD11c ifade belirli bir işaret olarak fare DCs için akış sitometresi tarafından analiz edildi. Şekil 1Btemsilcisi akış sitometresi mezarlığına gösterildiği gibi yaklaşık CD11c ifade BMDCs yüzde 83.6 Bu yöntemle elde edilmiştir.

İndüksiyon ve TolDCs genetik karakterizasyonu:

Bazı TolDCs, D3 vitamini38 ve deksametazon39gibi ikna etmek için bilinen ajanların aşağı düzenleyen-DC yüzey ligandlar MHC II ve costimulatory molekülleri, CD40, CD80 ve CD86 de dahil olmak üzere, ifade için bilinen. Buna karşılık, ya LPS bağlamında veya CD40L kaynaklı olgunlaşma DCs, kalsinörin inhibitörü cyclosporin A ve FK506 CD83, CD80, CD86 ve MHC II33ifade üzerinde hiçbir etkisi gösterdi. Akış Sitometresi Analizi tarafından gösterildiği gibi TolDC CDDO-DFPA tarafından indüksiyon yüzey ligand LPS kaynaklı ifade DC'lerin CD80, CD86, MHC II, PD-L1 ve CD40 dahil olmak üzere, üzerinde önemli bir etkisi vardı. (Şekil 2).

Ayrıca, karşılaştırmalı transcriptome ve sitokin analiz için BMDCs veya CDDO-DFPA olmadan huzurunda tedavi veya LPS yokluğu modüle inflamatuvar gen profil tasvir. CDDO-DFPA tedavi azaltılacağını indüklenen LPS pro-inflamatuar sitokin genleri gibi IFN γ, IL-12, EDN1, TNFα, IL-6 ve IL-23 (Şekil 3A-3F). Bunlar Th1 için sitokinler bilinir (IFN γ ve IL-12) ve Th17 hücre farklılaşması (IL-6 ve IL-23). Ayrıca, CDDO-DFPA anti-inflamatuar sitokin gen Il-4 gibi gelişmiş ifade gösterdi BMDCs tedavi IL-10, TGF-β ve HO-1 (Şekil 4A-4D). Bu anti-enflamatuar genlerin Th2 teşvik ederek otoimmünite modülatör bilinmektedir (IL-4) ve Treg (IL-10 ve TGF-β) hücre farklılaşma. 40 burada ayırt edici IL-12; IL-10+ sitokin üretim36, HO-1 ifade13indüksiyon ve EDN-141 inhibisyonu indüklenen tarafından CDDO-DFPA tedavi, tüm unutmamak önemlidir DCs tolerogenic işlev kimliğini doğrulamak için bilinir.

TolDCs hücresel ve fonksiyonel karakterizasyonu içinde vitro

DC-aracılı T hücre çoğalması sitokinler ve çözünür arabulucu7salgılanmasını yanı sıra costimulatory yüzey ligand nişan tarafından tetiklenen olduğu bilinmektedir. Ancak, TolDCs T hücre yanıt-e doğru çeşitli mekanizmalar aracılığıyla inhibe: T hücre anerji, silme işlemini autoreactive hücrelerin aktif olarak teşvik ve polarizasyon saf T hücre Tregs42teşvik inducing tarafından. Biz zaten CDDO-DFPA fonksiyonel karakterizasyonu TolDCs37indüklenen bildirdin. T hücre anerji ve silme autoreactive T hücrelerinin bağımsız olarak yüzey işaretleyicileri veya Annexin V/7-AAD boyama kontrol ederek çözümlenebilir. Ancak, dolaylı olarak bu fenotip T hücre proliferasyonu Dizin ölçerek doğruladık. Bunun için C57BL/6 OTII transgenik fareler T hücreleri kullanılmaktadır ve onları C57BL/6 fare--dan hulâsa ve veya CDDO-DFPA olmadan tedavi syngeneic DCs maruz. Bu DCs yıkanmış ve T hücreleri ile OVA peptid lekeli CFSE ile birlikte kültürlü. T hücre çoğalması tarafından CDDO-DFPA önceden tedavi DCs, onların tolerogenic fenotip (Şekil 5) düşündüren önemli bir azalma görülmektedir.

Vivo fonksiyonel TolDCs otoimmünite, preklinik modeli karakterizasyonu

Son olarak, DFPA kaynaklı TolDCs işlevselliğini herhangi preklinik vivo içinde modelleri ile karakterize otoimmün veya inflamatuar özellikleri test edilebilir. Beri EAE klinik immün aracılı merkezi sinir sistemi hastalığı, MS43yaygın olarak kabul edilen preklinik fare modeli, bu bizim çalışmada kullanılan. Daha fazla vivo içinde incelemek için CDDO-DFPA işlevselliğini indüklenen TolDCs, biz onları pasif EAE bir preklinik fare modelinde meydan. Bunun için BMDCs veya CDDO-DFPA olmadan LPS ve MOG (35-55) varlığında kültürlü. Bu hücreler daha sonra zamanlanmış Protokolü Şekil 6A içinde tasvir olarak tekrar tekrar enjekte edildi ve fareler rutin klinik belirtiler tezahürü için gözlendi. Beklendiği gibi LPS ve MOG (35-55) BMDCs EAE, klinik belirtileri gösterdi ancak geniş puls; CDDO-DFPA BMDCs tedavi gösterdi grup gecikmeli başlangıçlı hastalığı önemli ölçüde azaltılmış klinik belirtiler (Şekil 6B) ile astarlanmalıdır. Bu sonuçlar TolDCs CDDO-DFPA tedavi tarafından indüklenen immünsüpresif fenotip doğrulayın.

Figure 1
Şekil 1: geliştirme ve BMDCs fenotipik karakterizasyonu: (A) kemik iliği hücreleri C57BL/6 fareler tibia ve uyluk kemiklerinden fışkırma ve daha fazla BMDCs için Ayrıştırılan. Bir uygun hücre kümesi oluşum tarafından ışık mikroskobu farklılaşma (ölçek çubukları, 100µm) tüm dönem takip edildi. (B) BMDCs farklılaşma FACS tarafından analiz gibi CD11c yüzey ifade tarafından doğrulandı. Grafikler tasvir genişletilmiş CD11c yüzdesi+ hücre nüfus. (C) Gating strateji BMDCs. hücre ilk enkaz (FSC vs SSC) dışlamak için kapı. Bir gelir dışlama kapı üzerinde gömlek hücreleri (FL2-A vs. FL2-W) kapı için kullanılmıştır. Singlet hücrelerde canlı hücreleri 7-AAD Arsa (FSC vs 7-AAD) üzerinde kapı. Sonra hücreleri daha fazla analiz ve CD11c ifade üzerinde kapı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: DC hücre yüzey ligand ifade CDDO-DFPA tarafından değiştirilmemiş. Hücreleri varlığı veya yokluğu CDDO-DFPA önceden tedavi (200 nM) stimülasyon LPS ile önce 1 saat (100 ng/ml) 24 için gönderilen. Hücre yüzey ifade CD80, CD86, MHC II, PD-L1 ve CD40 akış sitometresi tarafından analiz edildi. Bu rakam Bilimsel raporları 7, makale numarasını değiştirildi: 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. Telif hakkı izni çoğaltılamaz ve ile yayımlanamaz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: CDDO-DFPA değişmiş immünojenik DCs. BMDCs genetik ve protein fenotip varlığı veya yokluğu CDDO-DFPA (50-400 nM) yanı sıra LPS önce 1 saat önceden tedavi edildi (100 ng/ml), ve de RNA çıkarma (4 için hasat HRS.) veya koşul kültür ortamına 24 için izin gönderilen. sitokin analizleri için koleksiyon önce. IL-12 (B), TNFα (D), IL-6 (E) ve IL-23 (F) düzeyde qRT-PCR ve ELISA tarafından ölçüldü. Oysa IFN-γ (A) düzeyini qRT-PCR ve ELISA yalnız tarafından EDN-1 (C) tarafından ölçüldü. Sonuçları Ortalama ± SD üç deney ifade edilir. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001 LPS tedavi grupları ile karşılaştırıldığında. Unpaired öğrenci t-testi. Bu rakam Bilimsel raporları 7, makale numarasını değiştirildi: 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. Yeniden oluşturulmalı ve telif hakkı izni ile yayınlanacaktır." Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: CDDO-DFPA indüklenen TolDCs fenotip gen ve protein ifade tarafından doğruladı. BMDCs CDDO-DFPA (10-400 nM) içinde önceden tedavi LPS eklenmesi önce 1 saat (100 ng/ml), ve hücrelerin RNA çıkarma sonra 24 için hasat gönderilen. Il-4 (A), IL-10 (B) ve TGF-β (C) düzeyde qRT-PCR tarafından ölçüldü. (D) hücre proteini lysates 12, toplanan gönderilen. analizleri ve HO-1 ve β-aktin düzeyleri için ifade Western blot tarafından tespit edilmiştir. Sonuçları Ortalama ± SD üç deney ifade edilir. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001 LPS tedavi grupları ile karşılaştırıldığında. Unpaired öğrenci t-testi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: CDDO-DFPA maruz DCs T hücre çoğalması bastırmak. DCs 1 saattir CDDO-DFPA (100-400 nM) ile önceden tedavi olsaydı, o zaman yıkanmış ve işbirliği ile kültürlü CFSE lekeli T hücreleri bir 1:10 at oranı. (A) dalak T hücreleri ve DCs sırasıyla C57BL/6 OTII transgenik fareler ve C57BL/6 fare, izole edildi. CDDO-DFPA CFSE ile ön işleme DCs Co kültürlü lekeli T hücreleri (w) ile veya olmadan (w) OVA ek kuluçka sırasında. T hücre çoğalması akış sitometresi tarafından 2 gün tespit edilmiştir. Grafikler yüzde sayı T hücre bölünmesi göre T hücre bölünmesi olarak tasvir. Verileri 3 bağımsız deneyler, bir gösterimidir. Bu rakam Bilimsel raporları 7, makale numarasını değiştirildi: 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. Telif hakkı izni çoğaltılamaz ve ile yayımlanamaz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6: MOG astarlanmalıdır DC kaynaklı pasif EAE TolDCs tarafından kaldırıldı. (A) EAE indüksiyon MOG (35-55) tarafından-BMDCs. CDDO-DFPA içinde olgun BMDCs tedavi Geniş puls (400 nM) ve daha sonra MOG (35-55) ile 4 için Darbeli gönderilen. 2 × 106 hücre 200 μl toplam C57BL/6 farelerin Subkutan Enjeksiyon kanat bölge içine bir kez her hafta dört enjeksiyon toplam tarafından yönetiliyordu. Her zaman PTX hemen ve tekrar 2 gün sonra (gün 0 4 döngüsü) ı.p. enjeksiyon tarafından yönetiliyordu. (B) klinik puanları standart ölçütleri kullanarak kaydedilmiş tüm sonra dört iğneler vericiydi. Tüm veriler ortalama ± S.E.M. sunuldu * P < 0,05. Holm-Sidak analizi ile birden çok t-testi (n = 7 fareler her grup). Bu rakam Bilimsel raporları 7, makale numarasını değiştirildi: 9886 (2017), doi:10.1038 / s41598-017-06907-4. Telif hakkı izni çoğaltılamaz ve ile yayımlanamaz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu kağıt için tekrarlanarak iDCs oluşturmak ve daha sonra onları TolDCs ayırt etmek için kullanılabilir verimli bir iletişim kuralı tanımlar ve önerdiğimiz bu TolDC ikna etmek için yeni moleküler hedef aracıları kapasitesini değerlendirmek için uygulanabilir fenotip. Bu raporda açıklanan, hangi biz ilk yüzey ligandlar TolDC ifade tarafından qRT-PCR ve ELISA tarafından ölçülen DC sitokin profil bir değerlendirmesini ve ardından akış sitometresi analiz bir sıra takip ettik. Son olarak, TolDCs immunoregulatory fonksiyonu T hücre proliferasyonu vitro ve otoimmünite içinde vivo, MS preklinik fare EAE modelini kullanma bastırmak için onların etkinliğini azaltmak için kapasitelerini göstererek teyit edildi.

Bizim iletişim kuralında, iDCs oluşturulan ve fare kemik iliği öncüleri, GM-CSF ve Il-4 kombinasyonu ile gelen farklı. Diğer iletişim kuralları form benzeri Tirozin kinaz 3 ligandlar (Flt3L) iDCs44oluşturmak için kültür ortamında kullanılan. Flt3L kullanımını iDCs verimini artırır, ancak bu iDCs genellikle 2 gün (3 gün) hasat için GM-CSF/Il-4 ek (7 gün)44için karşılaştırıldığında alır. Daha da önemlisi, Flt3L sıklıkla oluşturulacağını IDC ayırt etmek her iki KGK (CD8- ve CD8+) ve işlevsel olduğunu PDC'ler45 ve phenotypically kararlı durum DCs içinde vivo eşdeğerlerine. Ancak, GM-CSF/Il-4 kaçınılmaz IDC KGK doğru farklılaşma neden olmaktadır (CD8-) sadece44 ve olgunlaşma sırasında onlar inflamatuar DCs46benzer karakter gösterdi. GM-CSF/Il-4 kez klinik çalışmalarda ve temel araştırma monosit veya CD34 DCs ayırt avantajı nedeniyle kullanılır biliyorum çekicidir+ ataları44. Bu iki yöntem oluşturulan iDCs Ayrıca farklı hücre yüzey işaretleyicileri sahip ve farklı sitokin profilleri onların harekete geçirmek üzerine sergi morfolojik farklı hücreleri üretmek gösterilmiştir. Ayrıca, bu yöntemler tarafından indüklenen TolDCs kemotaktik faktörler cevaben geçirmek ve antijen spesifik T hücre yanıt44,45ikna etmek için yeteneklerini değişir. Bunu anlayışla CD8+ DCs cross-tolerance47TolDC indüksiyon kendi benzersiz kapasitesi nedeniyle daha fazla potansiyel sergilemek. Ancak, o zaman daha fazla hücre tabi BMDCs sıralama elde edilen belirli CD8 araştırmak için Flt3L tarafından+ DC alt küme küme küme. Buna ek olarak, beri GM-CSF/Il-4 indüklenen BMDCs T hücre stimülasyon ve LPS tedavi44,45takip inflamatuar aracılar üretimi üstün, bu strateji daha fazla tekrarlanabilir sonuçlar verdi bulundu bizim deneyler.

BMDCs GM-CSF/Il-4 başlangıç CD11c 4 gün hızlı ve ifadeden sonra 6 gün48zenginleştirmek için türetilmiş. Gün 10-12 alt kaplama yoğunluklu kemik iliği hücreleri ve düşük GMC-SF günde 8-1049doz kadar bu kültür yordamı sürekli olabilir. Bu protokol için CDDO-DFPA (sentetik triterpenoid) ve LPS tandem DC hoşgörü ve olgunlaşma, sırasıyla ikna etmek için aracıları olarak eklenmiştir. Biz son zamanlarda BMDC üretimi bu yöntemi kullanan kültürler hasat iDCs CDDO-DFPA37ile ön işleme zaman işlevsel bir TolDC fenotip sergi bildirdi. Bu IDC hasat sonra (7 gün)37, kültürler için birden çok kez IDC farklılaşma (gün 2, 4, 6)50sırasında eklenmelidir D3 vitamini gibi ajanlar aksine yalnızca eklenmiş olan CDDO-DFPA, kültürlerin dikkat çekicidir. Ayrıca, TolDCs bu indüksiyon D3 vitamini tarafından sırasında ve sonrasında IDC farklılaşma51başlatılması gerekir çeşitli mekanizmaları bağlı olabilir. Bizim veri CDDO-DFPA IDC farklılaşma sırasında ekleme CD11c + DCs saflık üzerinde herhangi bir etkisi vardı ama doz bağımlı (veri gösterilmez) gün 7 iDCs verimi düşük öneririz. Bizim analizleri de bu konsantrasyon CDDO-DFPA37ile normal canlılığı IDC gösterdi rağmen CDDO-DFPA bu deneylerde kullanılan yüksek konsantrasyonu kemik iliği progenitör hücreler için toksik olabilir öneririz. TolDC indüksiyon zamanlama etkisini ve pozlama gibi CDDO-DFPA acentelere uzunluğu dikkatli analizler tarafından optimize edilebilir öngörülmektedir.

Alternatif Yöntemler ve mekanizmalar üzerinden iDCs mDCs için diğerlerinden daha CD40L, TNF-α ve IFN γ52gibi LPS tarafından indüklenen dikkate almak önemlidir. DC olgunlaşma nükleer faktör-κB (NF-κB), p38 mitojenle aktive protein kinaz (p38 MAPK), c-Jun N-terminal kinaz (JNK), dahil olmak üzere çeşitli transkripsiyon faktörleri aktivasyonu 4(TLR4) Toll benzeri reseptörler aracılığıyla LPS tarafından yol açar ve ekstrasellüler sinyal düzenlenir protein kinaz (ERK1/2). DC'ler tarafından CD40L ve TNF-α olgunlaşma CD40 ve TNF reseptörleri üzerinden sırasıyla NF-κB yolu neden olmaktadır. Buna ek olarak, Janus kinaz (JAK), Tirozin kinaz (TYK) ve sinyal dönüştürücü aktivasyonu ve aktivatör (istatistikler) transkripsiyon proteinlerin de dahil olmak üzere farklı bir yol IFN γ uyarır ve aşağı akım bu etkiler de etkinleştirme tarafından tamamlanmaktadır NF-κB yolu52. Buna ek olarak, bu DCs T hücreleri Th2 hücre yanıt53doğru kutuplaştırmak gen ifade profil CD40L/TNF-α-tabanlı DC olgunlaşma öneriyor iken, DC olgunlaşma IFN γ tarafından güçlü bir Th1 hücre yanıt54doğru önyargılı. Bu nedenle, farklılaşma doğru belirli T hücre alt kümeleri için bağlı bu indükleyicileri DC olgunlaşma bu protokol için istihdam değil.

Çeşitli raporlar bu ex vivogöstermiştir-farklılaştırılmış DCs EAE klinik belirtiler ve patoloji fareler55yılında tam spektrum inducing yeteneğine sahip. Aktif ex vivo DC'ler tarafından pasif EAE indüksiyon yöntemi farklı laboratuvarlar tarafından çeşitli değişiklikler ile kabul edilmiştir. Pasif ve aktif EAE indüksiyon MOG İdaresi tarafından kombinasyonu BMDCs, 7 gün öncesine bağışıklama MOG ile astarlanmalıdır ve tam Freund's adjuvan (CFA) sonuç daha yüksek klinik belirti skorları (klinik skoru zirve: 3.5) pasif EAE karşılaştırıldığında İndüksiyon MOG yönetimi tarafından kullanıma hazır BMDCs yalnız (klinik skoru zirve: 2)56. Sonuçları MOG birleştiren bu yöntemle astarlanmalıdır BMDCs bu hastalık başlangıcı olur gün 9'den sonra MOG ve CFA56ile bağışıklama bağışıklama MOG ile göstermektedir. Beri bilindiği CFA Yönetim57yerinde önemli iltihabı neden olur, ancak, biz pasif EAE indüksiyon DCs bizim iletişim kuralında yalnız İdaresi tarafından etkili bir şekilde EAE sırasında TolDCs etkisini analiz için kullanılan. Daha fazla TolDCs fonksiyonel fenotip onaylamak için bir de onları etkin EAE farelerin klinik belirtiler bastırmak sınamanız gerekir. DCs yönetim rotanın da EAE belirtiler58indüksiyon için önemlidir. Bizim laboratuvar tarafından ve diğerleri tarafından bildirildiği gibi Subkutan Enjeksiyon haftada 3-4 iğne olmak üzere toplam BMDCs C57BL/6 farelerin kanat bölgeye EAE bir tepe klinik skoru neden olmaktadır 2-2,5 gün 11-1237 tekrarlanabilir hastalığı başlangıcı ile ,58. Biz aktif ve pasif EAE İndüksiyon (Video 1) arasında farklı klinik belirtileri göstermek için kısa bir klip sağladı.

Bizim iletişim kuralı tanınan sınırlamaları istihdam yöntemleri tarafından gereken süreyi ve fizyolojik olarak sigara ilgili bir microenvironment için BMDC farklılaşma bağımlılığını içerir. Ancak, antikor toplama DCs için sütun ayırma yöntemleri zenginleştirilmiş ve fare dalak T hücrelerden daha fazla zaman verimli olabilir iken, istenilen DC nüfus bir düşük verim--dan bu yaşanıyor. Böylece, kemik iliği türevi DC geliştirme yöntemi bütün dalak antikor sütun ayrılık karşılaştırıldığında DC nüfus günlük ölçek daha yüksek verim avantajdır. Oluşturulan DCs yukarıda da belirtildiği gibi vitro bu yöntem tarafından DCs vivo içinde microenvironment59 için fizyolojik olarak ilgili olmayan ve aynı zamanda uzun vadeli garantilemez sitokin takviyesi yüksek konsantrasyon gerektirir DC sürdürülebilirliği. Bizim iletişim kuralında kullanılan GM-CSF da normal DC farklılaşma vivo içinde60için temel bir sitokin değil. Bununla birlikte, önerilen BMDC üretimi iletişim kuralını tekrarlanarak işlevsel olarak TolDCs yüksek bir kısmını verir ve tolerogenic özellikleri ile işlevsel DCs üretmek için son derece güvenilir ve tekrarlanabilir bir yöntem olarak görülmelidir.

Sonuç olarak, burada açıklanan protokolü oluşturulan TolDCs etkili bir şekilde gen ve protein ifade profillerini değerlendirirken, T hücre bağımlı bağışık yanıt vitromodüle kapasitelerini malzemelerini ve tarafından karakterize edilebilir işlevlerine EAE indüksiyon vivobastırmak için bir evlat edinen hücre tedavisi değerlendiriliyor. Bizim iletişim kuralı kapasitesine sahip düşünülen yeni herhangi bir ajan TolDCs ikna etmek için ve daha fazla terapötik geliştirme sürecini TolDCs için kliniğe Bank hızlandırmak için değerlendirilmesi için bir çerçeve sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Hiçbiri

Acknowledgments

Tekrar ilaç CDDO DFPA verdiğiniz için teşekkür ederiz. Ayrıca Jane ve Lee Seidman sandalye Pediatrik kanser yenilik (John Letterio) desteğiyle anıyoruz. Bu eser Savunma Bakanlığı tarafından [W81XWH-12-1-0452]; desteklenmiştir Angie Fowler ergen ve Genç Yetişkin kanser araştırma girişimiyle durumda kapsamlı Kanser Merkezi; ve FJ Callahan temelden Hsi-Ju Wei Callahan mezunu Scholar Ödülü.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CDDO-DFPA (RTA-408) Reata Pharmaceuticals in house synthesis Cell culture
Mouse GM-CSF Peprotech Inc. 315-03 BMDC differentiation
Mouse IL-4 Peprotech Inc. 214-14 BMDC differentiation
Lipopolysaccharides (LPS) Sigma Aldrich Inc. L2880 Cell culture
β-mercaptoethanol Sigma Aldrich Inc. 516732 Cell culture
Pertussis toxin (PTX) R&D systems 3097 EAE induction
MOG (35–55) peptide 21stCentury Biochemicals in house synthesis EAE induction
Trypan blue Gibco, Life Technologies 15250-061 Cell culture
RPMI-1640 plus L-glutamine ThermoFisher Scientific 11875-093 Cell culture
Non-essential amino acid (100X) ThermoFisher Scientific 11140050 Cell culture
HEPES ThermoFisher Scientific 15630080 Cell culture
penicillin/streptomycin ThermoFisher Scientific 15140122 Cell culture
40 μm cell strainer Corning 352340 Cell isolation
PE-conjugated CD80 BD Biosciences 557227 Flow cytometry
PE-conjugated CD86 BD Biosciences 555665 Flow cytometry
PE-conjugated PD-L1 BioLegend 124307 Flow cytometry
APC-conjugated MHCII Miltenyi Biotec Inc. 130-112-388 Flow cytometry
APC-conjugated CD11c BD Biosciences 340544 Flow cytometry
Isotype matched PE Miltenyi Biotec Inc. 130-091-835 Flow cytometry
Isotype matched APC Miltenyi Biotec Inc. 130-091-836 Flow cytometry
CFSE BioLegend 423801 T cell proliferation assay
Pan dendritic cell isolation kit Miltenyi Biotec Inc. 130-100-875 T cell proliferation assay
FcR Blocking Reagent Miltenyi Biotec Inc. 130-100-875 T cell proliferation assay
Pan Dendritic Cell Biotin-Antibody Cocktail Miltenyi Biotec Inc. 130-100-875 T cell proliferation assay
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi Biotec Inc. 130-100-875 T cell proliferation assay
CD4+ T cell isolation kit Miltenyi Biotec Inc. 130-104-454 T cell proliferation assay
CD4+ T cell Biotin-Antibody Cocktail Miltenyi Biotec Inc. 130-104-454 T cell proliferation assay
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi Biotec Inc. 130-104-454 T cell proliferation assay
ACK lysing buffer ThermoFisher Scientific A1049201 BMDC differentiation
1 ml syringe BD Biosciences 309626 T cell proliferation assay
3 ml syringe BD Biosciences 309588 BMDC differentiation
25G needle BD Biosciences 309626 T cell proliferation assay
23G needle BD Biosciences 309588 BMDC differentiation
BSA Sigma Aldrich Inc. A2058 T cell proliferation assay
EDTA ThermoFisher Scientific 15575020 T cell proliferation assay
LS Column Miltenyi Biotec Inc. 130-042-401 T cell proliferation assay
Pre-Separation Filter Miltenyi Biotec Inc. 130-095-823 T cell proliferation assay
collagenase D Sigma Aldrich Inc. 11088858001 T cell proliferation assay
HBSS ThermoFisher Scientific 14025076 T cell proliferation assay
ovalbumin (OVA) peptide 323–329 Sigma Aldrich Inc. O1641 T cell proliferation assay
Mouse IFN-γ TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm01168134_m1 qRT-PCR
Mouse IL-12a TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm00434165 qRT-PCR
Mouse IL-12 p70 DuoSet ELISA R&D systems DY419-05 ELISA
Mouse EDN-1 ELISA RayBiotech ELM-EDN1-1 ELISA
TNF-α TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm00443258 qRT-PCR
Mouse TNF-α Quantikine ELISA Kit R&D systems MTA00B ELISA
IL-6 TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm00446190 qRT-PCR
Mouse IL-6 Quantikine ELISA Kit R&D systems M6000B ELISA
IL-23a TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm01160011 qRT-PCR
Mouse IL-23 DuoSet ELISA R&D systems DY1887-05 ELISA
IL-4 TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm99999154_m1 qRT-PCR
IL-10 TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm01288386_m1 qRT-PCR
TGF-β TaqMan probe ThermoFisher Scientific Mm01178820_m1 qRT-PCR
Anti-Heme Oxygenase 1 antibody Abcam ab13248 Western blotting
Anti-β-actin antibody Abcam ab8226 Western blotting
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System Bio-Rad Inc. qRT-PCR
BD FACSCalibur Cell Analyzer BD Biosciences Flow cytometry

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).
  2. Inaba, K., et al. Efficient presentation of phagocytosed cellular fragments on the major histocompatibility complex class II products of dendritic cells. J Exp Med. 188 (11), 2163-2173 (1998).
  3. Banchereau, J., et al. Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol. 18, 767-811 (2000).
  4. Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 179 (4), 1109-1118 (1994).
  5. Hemmi, H., Akira, S. TLR signalling and the function of dendritic cells. Chem Immunol Allergy. 86, 120-135 (2005).
  6. Caux, C., et al. B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells. J Exp Med. 180 (5), 1841-1847 (1994).
  7. Chastain, E. M., Duncan, D. S., Rodgers, J. M., Miller, S. D. The role of antigen presenting cells in multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 265-274 (2011).
  8. Smeltz, R. B., Chen, J., Ehrhardt, R., Shevach, E. M. Role of IFN-gamma in Th1 differentiation: IFN-gamma regulates IL-18R alpha expression by preventing the negative effects of IL-4 and by inducing/maintaining IL-12 receptor beta 2 expression. J Immunol. 168 (12), 6165-6172 (2002).
  9. Gyulveszi, G., Haak, S., Becher, B. IL-23-driven encephalo-tropism and Th17 polarization during CNS-inflammation in vivo. Eur J Immunol. 39 (7), 1864-1869 (2009).
  10. Kronenberg, M., Rudensky, A. Regulation of immunity by self-reactive T cells. Nature. 435 (7042), 598-604 (2005).
  11. Boks, M. A., et al. IL-10-generated tolerogenic dendritic cells are optimal for functional regulatory T cell induction--a comparative study of human clinical-applicable DC. Clin Immunol. 142 (3), 332-342 (2012).
  12. Anderson, A. E., et al. Tolerogenic dendritic cells generated with dexamethasone and vitamin D3 regulate rheumatoid arthritis CD4+ T cells partly via transforming growth factor-beta1. Clin Exp Immunol. 187 (1), 113-123 (2017).
  13. Chauveau, C., et al. Heme oxygenase-1 expression inhibits dendritic cell maturation and proinflammatory function but conserves IL-10 expression. Blood. 106 (5), 1694-1702 (2005).
  14. Maldonado, R. A., von Andrian, U. H. How tolerogenic dendritic cells induce regulatory T cells. Adv Immunol. 108, 111-165 (2010).
  15. Schmidt, S., Nino-Castro, A., Schultze, J. Regulatory dendritic cells: there is more than just immune activation. Frontiers in Immunology. 3 (274), (2012).
  16. Hilkens, C. M., Isaacs, J. D., Thomson, A. W. Development of dendritic cell-based immunotherapy for autoimmunity. Int Rev Immunol. 29 (2), 156-183 (2010).
  17. Dhodapkar, M. V., Steinman, R. M. Antigen-bearing immature dendritic cells induce peptide-specific CD8(+) regulatory T cells in vivo in humans. Blood. 100 (1), 174-177 (2002).
  18. Dhodapkar, M. V., Steinman, R. M., Krasovsky, J., Munz, C., Bhardwaj, N. Antigen-specific inhibition of effector T cell function in humans after injection of immature dendritic cells. J Exp Med. 193 (2), 233-238 (2001).
  19. Giannoukakis, N., Phillips, B., Finegold, D., Harnaha, J., Trucco, M. Phase I (safety) study of autologous tolerogenic dendritic cells in type 1 diabetic patients. Diabetes Care. 34 (9), 2026-2032 (2011).
  20. Benham, H., et al. Citrullinated peptide dendritic cell immunotherapy in HLA risk genotype-positive rheumatoid arthritis patients. Sci Transl Med. 7 (290), 290ra287 (2015).
  21. Bell, G. M., et al. Autologous tolerogenic dendritic cells for rheumatoid and inflammatory arthritis. Ann Rheum Dis. 76 (1), 227-234 (2017).
  22. University Hospital, A. A "Negative" Dendritic Cell-based Vaccine for the Treatment of Multiple Sclerosis: a First-in-human Clinical Trial (MS tolDC). ClinicalTrials.gov. , (2015).
  23. Pujol, F. I. G. T. i Tolerogenic Dendritic Cells as a Therapeutic Strategy for the Treatment of Multiple Sclerosis Patients (TOLERVIT-MS) (TOLERVIT-MS). ClinicalTrials.gov. , (2016).
  24. Varea, S. Treatment of Multiple Sclerosis and Neuromyelitis Optica With Regulatory Dendritic Cell: Clinical Trial Phase 1 B. ClinicalTrials.gov. , (2017).
  25. Jauregui-Amezaga, A., et al. Intraperitoneal Administration of Autologous Tolerogenic Dendritic Cells for Refractory Crohn's Disease: A Phase I Study. J Crohns Colitis. 9 (12), 1071-1078 (2015).
  26. Mahnke, K., Schmitt, E., Bonifaz, L., Enk, A. H., Jonuleit, H. Immature, but not inactive: the tolerogenic function of immature dendritic cells. Immunol Cell Biol. 80 (5), 477-483 (2002).
  27. Lutz, M. B., Schuler, G. Immature, semi-mature and fully mature dendritic cells: which signals induce tolerance or immunity? Trends Immunol. 23 (9), 445-449 (2002).
  28. Suciu-Foca, N., et al. Molecular characterization of allospecific T suppressor and tolerogenic dendritic cells: review. Int Immunopharmacol. 5 (1), 7-11 (2005).
  29. Wakkach, A., et al. Characterization of dendritic cells that induce tolerance and T regulatory 1 cell differentiation in vivo. Immunity. 18 (5), 605-617 (2003).
  30. Szeles, L., et al. 1,25-dihydroxyvitamin D3 is an autonomous regulator of the transcriptional changes leading to a tolerogenic dendritic cell phenotype. J Immunol. 182 (4), 2074-2083 (2009).
  31. Unger, W. W., Laban, S., Kleijwegt, F. S., vander Slik, A. R., Roep, B. O. Induction of Treg by monocyte-derived DC modulated by vitamin D3 or dexamethasone: differential role for PD-L1. Eur J Immunol. 39 (11), 3147-3159 (2009).
  32. Reichardt, W., et al. Impact of mammalian target of rapamycin inhibition on lymphoid homing and tolerogenic function of nanoparticle-labeled dendritic cells following allogeneic hematopoietic cell transplantation. J Immunol. 181 (7), 4770-4779 (2008).
  33. Woltman, A. M., et al. The effect of calcineurin inhibitors and corticosteroids on the differentiation of human dendritic cells. Eur J Immunol. 30 (7), 1807-1812 (2000).
  34. Hackstein, H., Thomson, A. W. Dendritic cells: emerging pharmacological targets of immunosuppressive drugs. Nat Rev Immunol. 4 (1), 24-34 (2004).
  35. Torres-Aguilar, H., Blank, M., Jara, L. J., Shoenfeld, Y. Tolerogenic dendritic cells in autoimmune diseases: crucial players in induction and prevention of autoimmunity. Autoimmun Rev. 10 (1), 8-17 (2010).
  36. Rutella, S., Danese, S., Leone, G. Tolerogenic dendritic cells: cytokine modulation comes of age. Blood. 108 (5), 1435-1440 (2006).
  37. Wei, H. J., Pareek, T. K., Liu, Q., Letterio, J. J. A unique tolerizing dendritic cell phenotype induced by the synthetic triterpenoid CDDO-DFPA (RTA-408) is protective against EAE. Sci Rep. 7 (1), 9886 (2017).
  38. van Etten, E., Mathieu, C. Immunoregulation by 1,25-dihydroxyvitamin D3: basic concepts. J Steroid Biochem Mol Biol. 97 (1-2), 93-101 (2005).
  39. Pan, J., et al. Dexamethasone inhibits the antigen presentation of dendritic cells in MHC class II pathway. Immunol Lett. 76 (3), 153-161 (2001).
  40. Zhu, J., Paul, W. E. Heterogeneity and plasticity of T helper cells. Cell Res. 20 (1), 4-12 (2010).
  41. Spirig, R., et al. TLR2 and TLR4 agonists induce production of the vasoactive peptide endothelin-1 by human dendritic cells. Mol Immunol. 46 (15), 3178-3182 (2009).
  42. Walton, E. L. Make immunological peace not war: Potential applications of tolerogenic dendritic cells. Biomed J. 40 (2), 77-79 (2017).
  43. Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). Br J Pharmacol. 164 (4), 1079-1106 (2011).
  44. Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking. J Immunol. 179 (11), 7577-7584 (2007).
  45. Angelov, G. S., Tomkowiak, M., Marcais, A., Leverrier, Y., Marvel, J. Flt3 ligand-generated murine plasmacytoid and conventional dendritic cells differ in their capacity to prime naive CD8 T cells and to generate memory cells in vivo. J Immunol. 175 (1), 189-195 (2005).
  46. Lowes, M. A., et al. Increase in TNF-alpha and inducible nitric oxide synthase-expressing dendritic cells in psoriasis and reduction with efalizumab (anti-CD11a). Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (52), 19057-19062 (2005).
  47. Schnorrer, P., et al. The dominant role of CD8+ dendritic cells in cross-presentation is not dictated by antigen capture. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (28), 10729-10734 (2006).
  48. Wang, W., Li, J., Wu, K., Azhati, B., Rexiati, M. Culture and Identification of Mouse Bone Marrow-Derived Dendritic Cells and Their Capability to Induce T Lymphocyte Proliferation. Med Sci Monit. 22, 244-250 (2016).
  49. Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. J Immunol Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
  50. Griffin, M. D., et al. Dendritic cell modulation by 1alpha,25 dihydroxyvitamin D3 and its analogs: a vitamin D receptor-dependent pathway that promotes a persistent state of immaturity in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (12), 6800-6805 (2001).
  51. Bscheider, M., Butcher, E. C. Vitamin D immunoregulation through dendritic cells. Immunology. 148 (3), 227-236 (2016).
  52. Castiello, L., et al. Monocyte-derived DC maturation strategies and related pathways: a transcriptional view. Cancer Immunol Immunother. 60 (4), 457-466 (2011).
  53. Decker, W. K., et al. Deficient T(H)-1 responses from TNF-alpha-matured and alpha-CD40-matured dendritic cells. J Immunother. 31 (2), 157-165 (2008).
  54. Longhi, M. P., et al. Dendritic cells require a systemic type I interferon response to mature and induce CD4+ Th1 immunity with poly IC as adjuvant. J Exp Med. 206 (7), 1589-1602 (2009).
  55. Link, H., Huang, Y. M., Xiao, B. G. Dendritic cells in experimental allergic encephalomyelitis and multiple sclerosis. J Neuroimmunol. 100 (1-2), 102-110 (1999).
  56. Leech, M. D., et al. Cutting edge: IL-6-dependent autoimmune disease: dendritic cells as a sufficient, but transient, source. J Immunol. 190 (3), 881-885 (2013).
  57. Saul, L., Besusso, D., Mellanby, R. J. LPS-matured CD11c+ bone marrow-derived dendritic cells can initiate autoimmune pathology with minimal injection site inflammation. Lab Anim. 51 (3), 292-300 (2017).
  58. Aghdami, N., Gharibdoost, F., Moazzeni, S. M. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) induced by antigen pulsed dendritic cells in the C57BL/6 mouse: influence of injection route. Exp Anim. 57 (1), 45-55 (2008).
  59. Wilson, H. L. Limitations with in vitro production of dendritic cells using cytokines. J Leukoc Biol. 75 (4), 600-603 (2004).
  60. Ni, K., O'Neill, H. C. Development of dendritic cells from GM-CSF-/- mice in vitro : GM-CSF enhances production and survival of cells. Dev Immunol. 8 (2), 133-146 (2001).

Tags

Tıp sorunu 135 Tolerogenic dendritik hücreler (TolDCs) dendritik hücreler kemik iliği türevi (BMDCs) deneysel otoimmun ensefalomiyelit (EAE) bağışıklık suppression sitokinler otoimmüniteye
Geliştirme ve işlevsel fare Tolerogenic dendritik hücrelerin karakterizasyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wei, H. J., Letterio, J. J., Pareek, More

Wei, H. J., Letterio, J. J., Pareek, T. K. Development and Functional Characterization of Murine Tolerogenic Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (135), e57637, doi:10.3791/57637 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter