Summary
Procedimientos experimentales para la posterior extracción de los tejidos linfáticos para probar la activación de las células dendríticas linfoides se describen después del tratamiento de un nanomaterial inmunoestimulante.
Abstract
Para la evaluación de un nuevo agente terapéutico para la inmunoterapia o vacunación, análisis de la activación inmune celular en tejidos linfáticos es esencial. Aquí, hemos investigado los efectos inmunológicos de un inmunoestimulante novela lípido-ADN en forma de nanopartículas de vías de administración diferentes en el ratón: oral, intranasal, subcutánea, bandolero, intraperitoneal e intravenosa. Estas inyecciones directamente influirá en la respuesta inmune y recolección de tejidos linfáticos y análisis de la activación de células dendríticas (DC) en los tejidos son partes cruciales de estas evaluaciones. La extracción de los ganglios linfáticos mediastínicos (mLNs) es importante pero bastante complejo debido al tamaño y la ubicación de este órgano. Se describe un procedimiento paso a paso para la cosecha del bazo, nodo de linfa inguinal (iLN) y mLN y análisis de activación de DC por citometría de flujo.
Introduction
Avances en Inmunología y nanomateriales han conducido a una gran cantidad de posibles nuevas estrategias terapéuticas para aplicaciones en biomedicina, incluyendo immunostimulation y entrega de la droga. Optimización de la vía de administración es un aspecto fundamental que afecta a la eficacia de agentes inmunoestimulantes. Una nanopartícula de inmunoestimulantes (INP) que consta de ADN es un coadyuvante de nano-inmune desarrollado recientemente uno montado por la separación del microphase debido a la estructura anfifílicas de lípidos-ADN1. Por lo tanto, los protocolos de INP que implica administración del material1 en vivo a través de diferentes vías y tres procedimientos para la recolección de tejidos apropiados como el nodo de linfa inguinal (iLN), mediastínica LN (mLN) y el bazo, son se describe. Por último, estos tejidos se analizaron para la activación de células dendríticas (DC), las células presentadoras de antígenos más poderosas en el sistema inmune. Este protocolo también puede ser aplicado para evaluar antígenos, anticuerpos y otros adyuvantes inmunes2.
Probamos la formulación INP porque es un agente que ha demostrado gran promesa. INP es un receptor de tipo Toll 9 (TLR9) material coadyuvante que contiene ácidos nucleicos, para que evaluación del immunostimulation eficacia se requiere prueba de inyección diferentes métodos3. En este contexto, la estimulación de la DCs es un potente extremo para evaluación en vivo . Después de que las moléculas de antígeno o inmunoestimulantes son fagocitadas por DCs en tejidos periféricos o en sangre, estas células migran a los órganos linfoides como el bazo y el LNs4,5. Así, se analizó la activación de DC en el bazo, iLN y el mLN de los animales inyectados. Adecuadamente la cosecha de estos tejidos, por tanto, también es crucial para la evaluación de la respuesta inmune a un nuevo adyuvante o patógenos5. Tal cosecha de tejido también es importante para el desarrollo de una nueva metodología inmunológica como una terapia del cáncer. Además, este protocolo puede utilizarse para verificar la eficacia de otros fármacos, como el virus de inmunodeficiencia humana terapéutica6.
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Protocol
Se realizaron todos los procedimientos experimentales incluyendo aislamiento manipulación, sacrificio y órgano animal en estricta conformidad con las normas del Comité de uso en el centro clínico de salud pública de Shanghai y centro médico de Asan e internacional Animal Care. El protocolo de estudio fue aprobado por los respectivos Comités sobre la ética de los experimentos animales en el centro clínico de salud pública de Shanghai (número de protocolo del ratón: SYXK-2010-0098) y el centro médico de Asan (2016-02-168).
1. preparación del Material
Nota: Un nano-adyuvante, INP, conformada por un portador uno mismo-montado lípido-ADN, es decir, U4T, y oligonucleótidos que contienen motivos CpG, candidaturas, fue empleado en el presente estudio para probar la ruta apropiada inyección de inmunoterapia y vacunación en ratones2 . Importante, otras moléculas terapéuticas potenciales como antígenos, anticuerpos y agentes adyuvantes pueden sustituirse por el INP y probaron utilizando la misma metodología que se describe a continuación.
- INP formulación2,4,7
- Recocido U4T (160 μm, portador) con candidaturas (80 μm, que contienen una secuencia de TLR9 agonista) en presencia de 1 x solución salina con tampón fosfato (PBS, pH 7,4) y MgCl2 (2 mM). El volumen estándar para recocido es entre 50 y 110 μl en un tubo PCR. La mezcla a 95 ° C durante 10 minutos y luego enfriar lentamente (1 ° C/16 min) a 25 ° C utilizando un termociclador. El protocolo de recocido requiere aproximadamente 2 h.
PRECAUCIÓN: El líquido que contiene U4T es muy espumoso y debe manejarse con cuidado. - Hacer 50 alícuotas de μl de la preparación del INP; utilizar 50 μl del material para cada inyección.
Nota: En el caso de 100 μl por inyección, repita el paso 1.1 con el correcto cálculo de ingredientes.
- Recocido U4T (160 μm, portador) con candidaturas (80 μm, que contienen una secuencia de TLR9 agonista) en presencia de 1 x solución salina con tampón fosfato (PBS, pH 7,4) y MgCl2 (2 mM). El volumen estándar para recocido es entre 50 y 110 μl en un tubo PCR. La mezcla a 95 ° C durante 10 minutos y luego enfriar lentamente (1 ° C/16 min) a 25 ° C utilizando un termociclador. El protocolo de recocido requiere aproximadamente 2 h.
2. general Animal procedimientos
Nota: Los métodos alternativos para el manejo de los ratones se pueden utilizar dependiendo de los requisitos de laboratorio y aprobados los protocolos animales8. El tipo de ratones utilizada es ratones C57BL/6 y las 6 semanas de edad.
- Lista de materiales
- Preparar el líquido anestésico (isoflurano), máquina anestésica, cámara de inhalación de dióxido de carbono (CO2), gasa esterilizada, fórceps, limitador de ratón, guantes, pinzas gancho, 1 pulgada tijeras disección, tijeras disección de 2 pulgadas, alcohol para esterilización y jeringa de insulina.
- Anestesia inhalante
Nota: La anestesia es obligatoria intranasal, subcutánea, bandolero y las inyecciones intravenosas de ratones9. Una cámara de inducción con un tanque de la máquina y el oxígeno de vaporizador conectado se utiliza para este procedimiento.- Colocar el animal en la cámara de inducción y asegúrese de cerrar bien la tapa.
- Flujo de oxígeno en 1 L/min y ajustar el vaporizador a un nivel de inducción de 4% de isoflurano.
- Variar el tiempo de exposición de animales en la cámara dependiendo del peso de los animales; sin embargo, más de 10 s de exposición y monitoreo cada 5 min es necesario anestesia10.
Nota: No hay reflejo pedal indica anestesia exitosa. - Apague el inductor de isoflurano y flujo de 1 L/min de oxígeno para evitar la exposición personal a gas isoflurano.
- Sacrificio
- Preparar una cámara CO2 inhalación sacrificio según el NIH "directrices para la eutanasia de roedores utilizando dióxido de carbono"11.
- Respuesta de gag de prueba para confirmar que el animal es sacrificado totalmente.
- Compruebe que el ratón correctamente se sacrifica por la punta de su pie se atore y no confirmar ninguna respuesta de la mordaza. Si hay una respuesta, repita el paso 2.2.
- Desinfección
- Desinfectar todas las áreas de la superficie utilizadas para inyecciones o disecciones con rociado de alcohol y una gasa esterilizada.
- Almacenamiento del órgano
- Utilizar pinzas para quitar toda grasa y la sangre que rodea los órganos cosechados. Almacenar estos tejidos cosechados individualmente en una caja de Petri con 3 mL de PBS. Los contenedores y medios de comunicación pueden diferir dependiendo de los requisitos de procedimiento posterior.
3. inyección rutas
- Utilizar los métodos de seis inyección para investigar las respuestas inmunes dependientes de inyección: oral, intranasal, subcutánea, bandolero, intraperitoneal y intravenosa8,12,13.
4. aislamiento de los ganglios linfáticos y el bazo
Nota: Utilice ratones magros jóvenes y sanos (6 semanas) para estos procedimientos porque las grasas que se acumulan normalmente alrededor de los nodos de linfa en los ratones más viejos son difíciles de eliminar y puede impedir la correcta visualización del órgano.
- Pasos de pre cosecha
Nota: Esta sección describe la cosecha después de la inyección del iLN, el bazo y el mLN de los ratones para el análisis de estimulación inmune. Consulte los pasos 2.3-2.5 para el sacrificio, mordaza de respuesta y métodos de desinfección.- Prender las extremidades del ratón para el tablero de la espuma quirúrgica y esterilizar el lado ventral del ratón con etanol al 70%.
- Escoger una ubicación 2 cm por encima de la zona genital y uso enganchada pinzas para tirar de la cubierta externa de la piel como una tienda de campaña. Hacer un corte de aproximadamente 1 cm en este lugar y deslice las tijeras (2 pulgadas) por debajo de la piel, haciendo más cortes de disección.
- El tegumento, cortar verticalmente a través de la piel externa de ambos brazos de las tijeras (2 pulgadas). Exponer los órganos internos cubiertos con peritoneo.
- Prender la capa externa de la piel.
-
Aislamiento del nodo de linfa inguinal (iLN)
- Localice el iLN en el lado izquierdo de la pierna después de la conjunción de los vasos sanguíneos bajando la pierna izquierda, que aparece como una letra inclinada 'Y'.
Nota: Para los ratones inyectados por vía subcutánea, elija un iLN en el mismo lado de la localización de la inyección. - Descubrir la capa con dos pinzas para extraer la capa de cubierta lipídica y cosechar el iLN amarillo pálido (forma de frijol, 2 mm). Para el tratamiento subsecuente y el almacenaje del tejido, ver paso 2.6.
- Localice el iLN en el lado izquierdo de la pierna después de la conjunción de los vasos sanguíneos bajando la pierna izquierda, que aparece como una letra inclinada 'Y'.
-
Aislamiento del bazo 14
- Hacer una tienda en el centro del peritoneo utilizando engancha pinzas en una mano y usar pequeño fino tijeras (1 pulgada) en la otra mano para cortar el peritoneo.
- Pinzas de uso enganchado en la mano izquierda para sujetar el intestino y voltee para localizar el bazo de haba-como rojo (longitud de aproximadamente 14 mm) conectado a la parte superior izquierda del abdomen de ratón.
- Extraiga con cuidado el bazo con otro juego de pinzas en la mano derecha mientras que la extracción de otros órganos con el fórceps enganchado. Siga el paso 2.6 para almacenar el bazo.
Nota: Cuidado es necesario cuando se cosecha el bazo, ya que es un órgano suave fácilmente dañado.
-
Aislamiento de los ganglios linfáticos mediastínicos (mLN)
Nota: El mLN está situado aproximadamente a 1 cm por debajo de las costillas y está recubierta por otros órganos como el corazón y los pulmones. Por su ubicación y pequeño tamaño, es importante exponer cuidadosamente los alrededores utilizando pinzas y tijeras (1 pulgada).- Cortar el diafragma y separarlo de las costillas. Mantener el cuerpo de las costillas con unas pinzas y luego corte el lado izquierdo y derecho de las costillas con unas tijeras (1 pulgada). Prender las costillas corte sobre el hombro del ratón a la derecha para exponer el corazón y los pulmones.
Nota: Procure no para cortar ninguno de los vasos sanguíneos alrededor del corazón y los pulmones, como goteando sangre dificulta localizar el pequeña mLN translúcido. Si se cortan cualquier vasos, absorber suavemente la sangre en la zona con una gasa. - Usando pinzas de gancho en la mano derecha, voltear el corazón y los pulmones ligeramente a la derecha hasta la columna vertebral está expuesta. Use un par de pinzas para regulares en la mano izquierda para quitar el iLN con el fórceps enganchado en la mano derecha para ayudar con esta cosecha.
- Agarra los pulmones y les tapa hasta que la columna vertebral está ampliamente expuesta. El mLN (transparente en forma de frijol estructura de aproximadamente 2 mm de tamaño) se encuentra entre los pulmones y la columna vertebral.
- Utilizar las pinzas gancho para exponer el área alrededor de lo mLN y otros fórceps para extraer el tejido.
Nota: El mLN está rodeado por numerosos otros tejidos que deben eliminarse cuidadosamente con pinzas antes de la cosecha. - Consulte el paso 2.7 para las instrucciones en el almacenamiento del cosechado mLN.
- Cortar el diafragma y separarlo de las costillas. Mantener el cuerpo de las costillas con unas pinzas y luego corte el lado izquierdo y derecho de las costillas con unas tijeras (1 pulgada). Prender las costillas corte sobre el hombro del ratón a la derecha para exponer el corazón y los pulmones.
5. preparación de muestras para citometría de flujo
Nota: Para la activación de DCs en el iLN cosechado, el bazo y el mLN de ensayo, suspensiones de la sola célula de estos tejidos se tiñen con anticuerpos conjugados con fluorescencia como marcadores de C.C.-específicos, moléculas coestimuladoras y de histocompatibilidad complejo moléculas y analizadas por citometría de flujo.
-
Preparación de suspensiones celulares solo: bazo
- Añadir 5 mL de medio fresco de cultivo (CM) en la placa de cultivo de 6 mm y coloque las muestras en hielo.
- Retire los tejidos circundantes de la sangre y la grasa y el tejido en la tapa de la placa de cultivo.
- Cortar los tejidos en pequeños fragmentos (< 1 mm) con unas tijeras curvas. Suspender los fragmentos en PBS seguido por girar hacia abajo el tejido utilizando una centrífuga en 646 × g por 5 min y retirar el sobrenadante.
- Suspender las muestras otra vez en 3 mL de CM y digerir los fragmentos con 200 μL de solución de 2% suero bovino fetal (FBS) complementado con colagenasa IV durante 20 min.
- Homogeneizar e incubar la muestra a 37 ° C por 1 h. filtrar los tejidos digeridos a través de la malla de nylon (100 nm) y los hace girar hacia abajo. Lavar las células en 5 mL de PBS y eliminar el sobrenadante por centrifugación.
- Resuspenda las células en 5 mL de solución de aislamiento de la célula. Volver a cargar otra capa de 5 mL de solución de aislamiento claro de la célula para formar una pila de capa por capa acuosa.
- La preparación de la célula en 2012 × g durante 10 minutos obtener el sobrenadante, que es la fracción de densidad más ligera de la centrífuga (< 1,077 g/cm3), para el análisis de citometría de flujo posterior.
- Contar el número de células con un hemocitómetro.
-
Preparación de suspensiones celulares solo: ganglio linfático
- Siga el paso 5.1.1-5.1.2.
- Añadir 5 mL de CM utilizando una pipeta de 10 mL para suspender las células transfiriendo 3 ó 4 veces. Después de suspender completamente las células, uso de malla de nylon estéril para filtrar las células para la colección en un tubo cónico de 15 mL.
- Girar las celdas abajo de 646 ×g por 7 min a 4 ° C y eliminar el sobrenadante.
- Añadir 5 mL adicional de CM en pipeta de 10 mL mejor suspender las células mediante pipeteo.
- Lavar con PBS y cuente el número de células.
-
Análisis de citometría de flujo
- Alícuota de 0.5-1 × 106 células en cada celular activado por fluorescencia clasificación tubo (FACS).
- Centrifugue a 646 × g a 4 ° C por 5 min y aspirar el sobrenadante.
- Añadir 5 μl de cada diluidos conjugado fluorescencia preparación de anticuerpos a las células para Resuspender el pellet celular y vortex.
Nota: Es importante proteger el precipitado de células de exposición a la luz tanto como sea posible porque los anticuerpos fluorescente etiquetados son sensibles a la luz. Generar una mezcla maestra de anticuerpo y siempre agregar bloque de Fc. - Preparar el tampón FACS utilizando 100 μl de PBS, 1% de FBS regular inactivado con calor y 0.1% de azida sódica.
- Coloque la muestra en el tubo a 4 ° C durante 30 minutos enjuague las células con 2-4 mL de FACS del almacenador intermediario y Centrifugue la muestra a 1700 rpm por 7 minutos a 4 ° C.
- Resuspenda las células en 500 μl de tampón FACS en la oscuridad. Analizar las células mediante citometría de flujo.
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Representative Results
Para evaluar rutas de inyección apropiado del INP para la activación del tejido linfático DC, la población de DC como linaje fue definida como –CD11c+ de las células en el bazo, iLN y mLN y analizó los niveles de expresión de moléculas coestimuladoras. Tratamiento de INP por inyección intravenosa (i.v.) y subcutánea (s.c.) promovió aumentos sustanciales en la expresión de CD40, CD80 y CD86 en el bazo y iLN DCs (figura 2B y 2C). Bandolero y la inyección intraperitoneal (i.p.) de INP también considerablemente para arriba-regular que compararon con los niveles de expresión de CD40, CD80 y CD86 en el bazo y iLN DCs en el control tratados con PBS (figura 2B y 2C). En mLN estimulado DCs, inyección intranasal (i.n.) de INP promueve el más alto para arriba-regulación de moléculas coestimuladoras en comparación con el control tratados con PBS (Figura 2D). inyección i.p. y i.v. del INP también indujo aumentos marcados en la expresión de la molécula coestimuladoras en el mLN, mientras que la oral, s.c., e inyección de bandolero del INP no indujo la activación del mLN DCs (Figura 2D).
Figura 1 : Ubicación del punto de inyección intraperitoneal de Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Localización exacta de la inyección intravenosa de Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Activación de DC en órganos linfáticos analizados por citometría de flujo. Ratones C57BL/6 fueron inyectados con INP por seis rutas diferentes de inyección y 24 horas después de que fueron cosechadas inyección, bazo, iLN y mLN. (A) la población de DC en las células del tejido linfático se definió como linaje –CD11c+ de las células en vivo leucocitos. (B-D) Los niveles de expresión de CD40, CD80 y CD86 fueron analizados por citometría de flujo en el bazo (B) iLN (C) y (D) el mLN. Los datos son promedios de los análisis de seis muestras independientes. Resultados se expresan como el medio ± error estándar de la media (SEM). La significación estadística de las diferencias entre los grupos experimentales se calculó mediante análisis de varianza del estudiante t-test. los valores de p < 0.05 eran considerados significativos. * < 0.05, ** < 0,01. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Se han logrado muchos avances en nanotecnología y de la inmunología a través de la investigación terapéutica del fármaco y el immunostimulation. Cuidadosa selección del método de inyección se sabe para ser importante para el immunostimulation, que era el objetivo del presente estudio.
Rutas de inyección diferentes fueron evaluadas por un natural no tóxico y biodegradable basado en el ADN material, INP (inmunoestimulantes nanopartículas), para determinar el camino que rindieron los mejores resultados. Este enfoque también es relevante para la entrega de otros agentes terapéuticos incluyendo anticuerpos, antígenos y otros adyuvantes.
Para analizar la respuesta inmune a esas inyecciones, cosecha de tejido linfático (bazo, iLN y millones) se requiere. Aislamiento de tejidos linfáticos es el aspecto más importante de este protocolo y requiere el uso de una técnica que no se ha descrito previamente en detalle. Además, preparación de la suspensión unicelular para analizar aún más las células inmunes no ha sido bien descrito. Este estudio se centró en la extracción de los tejidos linfáticos, particularmente el iLN, mLN y el bazo, para el análisis de activación de DC. Activación sistémica de la respuesta inmune se produjo principalmente a través de las células inmunes en el bazo. Además, la respuesta inmune en el tejido específico fueron controlado por los ganglios linfáticos cercanos. Se realizará evaluación de moléculas moduladores inmunes desarrolladas recientemente para determinar si las moléculas pueden inducir estimulación inmune en los tejidos. Por lo tanto, puede utilizarse el método de aislamiento de tejido linfático y análisis de activación de DC en los tejidos de nuevas moléculas estimulantes inmunes.
Para evaluar el efecto estimulante inmune del INP, se cosecharon el iLN, el mLN y el bazo y INP fue demostrado para promover la activación linfática de DC. Determinado previamente, INP efectivamente objetivos de estimulación de TLR9 en DCs en ratones2. Los macrófagos expresan también citosólica TLR9 en ratones. Por lo tanto, la inyección INP puede inducir activación DC y macrófagos. Sin embargo, los macrófagos residen en tejido periférico que contribuyen a la fagocitosis de microbios en el tejido. Además, la capacidad de presentación del antígeno y efecto migratorio al tejido linfático de los macrófagos están comparable más débiles que en DCs. Por lo tanto, evaluar la ruta de la inyección del INPs para el efecto estimulante inmune era adecuado para examinar la DCs en el tejido linfático.
Por lo tanto, el modo de administración de adyuvante inmune debe considerarse muy cuidadosamente para lograr éxito inmunoterapia y vacunación utilizando materiales blandos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por el programa de descubrimiento creativo de materiales a través de la nacional investigación Fundación de Corea (NRF) financiado por el Ministerio de ciencia, TIC y planeación de futuro (NRF-2017M3D1A1039421) y por el programa de biotecnología marina, financiado por el Ministerio de océanos y pesca, República de Corea y una subvención (20150220).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| phosphate buffer saline | Corning | 21-040-CVR | Washing organs |
| (PBS, pH 7.4) | |||
| isoflurane solution | Aesica Queenborough limited | 26675-46-7 | Anesthesia process |
| Tuberculin 1mL syringe - | Junglim | N/A | Injection |
| 50 mL conical tube | S.P.L | 50050 | Anesthesia process |
| 1mL Insulin Syringe | (BD Ultra-FineTMII)_short needle | 324826 | Intramuscular Injection |
| DMEM High Glucose | Hyclone | SH30081.01 | Storing organs |
| Histopaque | Sigma-Aldrich | 10771 | FACS analysis |
| Ethyl alcohol anhydrous 99.5 % | Daejung | 4022-4110 | Disinfectant |
| Equipments | |||
| FineCycler C100 (Thermocycler) | Ssufine | - | Anealing |
| Centrifuge | Centrifuge | ||
| FACS tube | FALCON | 2052 | FACS analysis |
| Automated High-performance Flow Cytometer | BD (USA), FACSVerse | - | FACS analysis |
References
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