Summary
Experimentella rutiner för efterföljande utvinning av lymfatiska vävnader att testa lymfoida dendritiska cellen aktiveringen beskrivs efter behandling av en immunstimulerande nanomaterial.
Abstract
För utvärdering av en ny terapeutisk agent för immunterapi eller vaccination är analys av immunceller aktivering i lymfatiska vävnader viktigt. Här, vi undersökte immunologiska effekter av en roman lipid-DNA immunostimulant i nanopartiklar form från olika administreringsvägar i musen: oral, intranasalt, subkutan, footpad, intraperitoneal och intravenös. Dessa injektioner kommer att direkt påverka immunsvaret och skörd lymfatiska vävnader och analys av dendritiska cellen (DC) aktivering i vävnaderna är avgörande delar av dessa utvärderingar. Utvinning av mediastinala lymfkörtlar (mLNs) är viktigt men ganska komplicerat på grund av storlek och läge av detta organ. Ett stegvis förfarande för skörd av inguinal lymfkörtel (iLN), mLN och mjälte och analysera DC aktivering av flödescytometri beskrivs.
Introduction
Framsteg inom immunologi och nanomaterial har lett till ett överflöd av potentiella nya terapeutiska strategier för applikationer inom biomedicin, inklusive drogen leverans och immunostimulering. Optimering av sträckan administration är en viktig aspekt som påverkar effekten av immunstimulerande medel. En immunstimulerande nanopartiklar (INP) som består av DNA är en nyutvecklad nano-immun adjuvant själv monteras av microphase separation på grund av lipid-DNA1amfifila struktur. Därför, protokoll för INP som omfattar administrering av den materiella1 i vivo via olika vägar och tre förfaranden för skörd lämpliga vävnader såsom den inguinal lymfkörtel (iLN), mediastinum LN (MUSD) och mjälte, är beskrivs. Slutligen, dessa vävnader analyserades för dendritiska cellen (DC) aktiveringen, de mest kraftfulla antigen-presenterande cellerna i immunsystemet. Detta protokoll kan också användas för att utvärdera antigener, antikroppar eller andra immun adjuvans2.
Vi testade INP formulering eftersom det är en agent som har visat stort löfte. INP är en Toll-like receptor 9 (TLR9) adjuvant material som innehåller nukleinsyror, för vilken bedömningen av immunostimulering effekt krävs att testa olika injektion metoder3. I detta sammanhang är stimulering av DCs en potent slutpunkt för i vivo utvärdering. Efter antigen eller immunstimulerande molekyler är fagocyteras av DCs i perifera vävnader eller blod, migrerar dessa celler till lymfoida organ som mjälte och LNs4,5. Därför analyserades DC aktivering i mjälte, iLN och mLN injicerade djuren. Korrekt skörd av dessa vävnader är därför också viktigt för att utvärdera immunsvaret mot en roman för adjuvant eller patogener5. Sådan vävnad skörd är också viktigt för att utveckla en ny immunologisk metodik som en cancerbehandling. Detta protokoll kan dessutom användas för att kontrollera effektiviteten av andra läkemedel, såsom anti-humant immunbrist virus therapeutics6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella rutiner inklusive djurens hantering, offer och orgel isolering utfördes i strikt överensstämmelse med reglerna för den internationella djur vård och användning kommittén på Shanghai folkhälsa kliniska Center och Asan Medical Center. Studieprotokollet godkändes av de respektive utskotten på etik av djur experimenten på Shanghai folkhälsa kliniska Center (mus protokollnummer: SYXK-2010-0098) och Asan Medical Center (2016-02-168).
1. beredning av Material
Obs: En nano-adjuvans, INP, består av en själv monterade lipid-DNA bärare, nämligen U4T, och CpG-motiv innehållande oligonukleotiden, eCpG, var anställd i den aktuella studien att testa lämpliga injektion rutten för immunterapi och vaccination i möss2 . Ännu viktigare, andra potentiella terapeutiska molekyler som antigener och antikroppar adjuvant agenter kan ersätta INP och testats med hjälp av samma metod som beskrivs nedan.
- INP formulering2,4,7
- Glödga U4T (160 µM, bärare) med eCpG (80 µM, innehållande en TLR9 agonist sekvens) i närvaro av 1 x fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS, pH 7,4) och MgCl2 (2 mM). Den standard volymen för glödgning är mellan 50 och 110 µL i en PCR-röret. Värm blandningen till 95 ° C i 10 min och sedan långsamt svalna (1 ° C/16 min) till 25 ° C med en termocykler. Glödgning protokollet kräver ca 2 h.
FÖRSIKTIGHET: U4T-innehållande vätskan är mycket skummande och måste hanteras försiktigt. - Gör 50 µL alikvoter av INP förberedelsen. Använd 50 µL av material för varje injektion.
Obs: När det gäller 100 µL per injektion, upprepa steg 1,1 med korrekt beräkning av ingredienser.
- Glödga U4T (160 µM, bärare) med eCpG (80 µM, innehållande en TLR9 agonist sekvens) i närvaro av 1 x fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS, pH 7,4) och MgCl2 (2 mM). Den standard volymen för glödgning är mellan 50 och 110 µL i en PCR-röret. Värm blandningen till 95 ° C i 10 min och sedan långsamt svalna (1 ° C/16 min) till 25 ° C med en termocykler. Glödgning protokollet kräver ca 2 h.
2. allmänna djur förfaranden
Obs: Alternativa metoder för hantering av möss kan användas beroende på laboratoriet krav och godkända djur protokoll8. Typen av möss som används är 6 veckor gamla C57BL/6 och kvinnliga möss.
- Lista över material
- Förbereda den flytande bedövningsmedel (isofluran) bedövningsmedel maskin, koldioxid (CO2) inandning kammare, steriliserad gasväv, pincett, mus fasthållning, handskar, hooked pincett, 1-tums dissekera sax, 2-tums dissekera saxen, alkohol för sterilisering och insulinspruta.
- Inhalationsmedel anestesi
Obs: Anestesi är obligatoriskt för intranasal, subkutan, footpad och intravenösa injektioner av möss9. En induktion kammare med spridare maskin och syre tank ansluten används för detta förfarande.- Placera djuret i induktion kammaren och se till att tätt Stäng locket.
- Flöde syre vid 1 L/min och ange inställningen spridare till en induktion nivå på 4% för isofluran.
- Variera exponeringstiden av djur i kammaren beroende på djurens vikt; dock fler än 10 s exponering och övervaka varje 5 min är nödvändigt för anestesi10.
Obs: Ingen pedal reflexen indikerar framgångsrika anestesi. - Stäng av isofluran induktorn och flöde 1 L/min syre att förhindra personal exponering för isofluran gas.
- Uppoffring
- Förbereda en kammare för CO2 inandning offer enligt NIH ”riktlinjer för eutanasi av gnagare med koldioxid”11.
- Test gag svar att bekräfta att djuret offras helt.
- Kontrollera att musen offras ordentligt genom att nypa spetsen på dess fot och bekräfta något gag svar. Om det finns ett svar, upprepa steg 2.2.
- Desinfektion
- Desinficera alla ytor används för injektioner eller dissektioner med alkohol spray och steriliserad gasväv.
- Orgel lagring
- Använd tången för att avlägsna alla fett och blod kring de skördade organ. Lagra dessa skördade vävnader individuellt i en petriskål fylld med 3 mL PBS. Behållaren och media kan variera beroende på krav som efterföljande förfarande.
3. injektion rutter
- Använda sex injektion metoder för att undersöka injektion-beroende immunsvar: oral, intranasalt, subkutan, footpad, intraperitoneal, och intravenös8,12,13.
4. isolering av lymfkörtlar och mjälte
Obs: Använd unga och friska lean möss (6 veckor gamla) för dessa procedurer eftersom de fetter som normalt byggs upp runt lymfkörtlarna i äldre möss är svåra att ta bort och kan förhindra korrekt visualisering av orgeln.
- Före skörd steg
Obs: Det här avsnittet beskrivs efter injektion skörd av iLN, mjälte och mLN från möss för att analysera immun stimulering. Se steg 2,3-2,5 för offer, gag svar och desinfektion metoder.- Fästa musen till den kirurgiska skumgummiplattan lemmar och sterilisera den ventrala sidan av musen med 70% etanol.
- Välj en plats 2 cm ovanför underlivet och användning hooked pincett att dra upp locket yttre huden som ett tält. Göra en cirka 1 cm snitt på denna plats och skjut saxen (2 tum) under huden, nedskärningar ytterligare dissektion.
- För integument, skär vertikalt genom yttre huden med båda armarna på saxen (2 tum). Exponera de inre organen som täckt med bukhinnan.
- Fäst det yttre lagret av huden.
-
Isolering av inguinal lymfkörteln (iLN)
- Leta upp iLN på vänster sida av benet efter konjunktionen av de blodkärl som går ner vänster ben, som visas som en lutande bokstaven 'Y'.
Obs: För subkutant injicerat möss, välja en iLN på samma sida av platsen för injektionen. - Avslöja lagret med två pincett att rippa täckt lipidskiktet och skörda den blek gul iLN (böna form, 2 mm). För efterföljande behandling och lagring av vävnad, se steg 2,6.
- Leta upp iLN på vänster sida av benet efter konjunktionen av de blodkärl som går ner vänster ben, som visas som en lutande bokstaven 'Y'.
-
Isolering av mjälte 14
- Gör ett tält i mitten av peritoneum med hooked tång i ena handen och använda små tunna sax (1 tum) i andra hand att skära bukhinnan.
- Användning fast tången i vänster hand att förstå tarmen och vänd på den för att hitta röda bönor-liknande mjälte (längd ca 14 mm) bifogas övre vänsterkant mus buken.
- Dra försiktigt ut mjälten med en annan uppsättning tången i höger hand medan du lossar andra organ med hooked tången. Följ steg 2,6 att lagra mjälte.
Obs: Vård krävs när skörden mjälte, eftersom det är ett enkelt skadade mjuka organ.
-
Isolering av mediastinum lymfkörteln (MUSD)
Obs: MLN är beläget ca 1 cm under revbenen och täcks av andra organ som hjärta och lungor. På grund av sitt läge och liten storlek är det viktigt att noggrant exponera området kring med hjälp av pincett och sax (1 tum).- Skär membranet och lossa det från revbenen. Håll kroppen av revbenen med pincett och sedan klippa vänster och höger sida av revbenen med sax (1 tum). Fästa cutoff revbenen över musens axel till höger att exponera hjärta och lungor.
Obs: ta hand inte för att skära något av blodkärlen runt hjärtat och lungorna, som läcker blod gör det mycket svårt att lokalisera den lilla genomskinliga mLN. Om alla blodkärl skärs, försiktigt absorbera blodet i området med gasväv. - Flip använder hooked tången i höger hand, hjärta och lungor försiktigt till höger tills ryggraden utsätts. Använda ett par vanlig pincett i vänster hand för att ta bort iLN med hooked tången i höger hand att hjälpa till med denna skörd.
- Greppa lungorna och vända dem tills ryggraden utsätts allmänt. MLN (en genomskinlig bönformade struktur av cirka 2 mm storlek) ligger mellan lungorna och ryggraden.
- Utnyttja hooked tången att exponera området runt mLN och andra tången att extrahera vävnaden.
Obs: MLN omges av många andra vävnader som måste tas bort försiktigt med pincett innan skörd. - Se steg 2,7 anvisningar om förvaring av den skördade mLN.
- Skär membranet och lossa det från revbenen. Håll kroppen av revbenen med pincett och sedan klippa vänster och höger sida av revbenen med sax (1 tum). Fästa cutoff revbenen över musens axel till höger att exponera hjärta och lungor.
5. beredning av prover för flödescytometri
Obs: För att assay aktivering av DCs i skördade iLN, mjälte och mLN, encelliga suspensioner av dessa vävnader färgas med fluorescens-konjugerade antikroppar som DC-specifika markörer, co-stimulatory molekyler och stora histocompatibility komplex molekyler och analyseras med flödescytometri.
-
Beredning av encelliga suspensioner: mjälte
- Tillsätt 5 mL av färska odlingsmedium (CM) i 6-mm kultur skål och placera proverna på is.
- Ta bort omgivande blod och fett vävnader och placera vävnaden i locket på kultur skålen.
- Skär vävnader i små fragment (< 1 mm) med böjd sax. Avbryta fragment i PBS följt av spinning ner vävnaden med hjälp av en centrifug på 646 × g i 5 min och ta bort supernatanten.
- Avbryta proverna igen 3 ml CM och smälta fragment med 200 µL lösning 2% fetalt bovint serum (FBS) kompletteras med kollagenas IV i 20 min.
- Försiktigt skaka och inkubera provet vid 37 ° C för 1 h. filtrera smält vävnader genom nylon mesh (100 nm) och snurra dem ned. Tvätta de enda cellerna i 5 mL PBS och avlägsna supernatanten genom centrifugering.
- Slamma upp cellerna i 5 mL cell isolera lösning. Re-load ytterligare ett lager av 5 mL klarcellig isolering lösning att bilda en vattenlösning lager-för-lager stack.
- Centrifugera cell förberedelserna på 2012 × g för 10 min. Erhåll supernatanten, som är den ljusa densitet fraktionen (< 1.077 g/cm3), för efterföljande Flödesanalys flödescytometri.
- Räkna antalet celler med en hemocytometer.
-
Beredning av encelliga suspensioner: lymfkörtel
- Följ steg 5.1.1-5.1.2.
- Tillsätt 5 mL av CM med en 10 mL Pipettera för att avbryta cellerna genom pipettering 3 - 4 gånger. Efter grundligt tillfälligt använda cellerna, sterila nylon mesh för att filtrera cellerna för samling i en 15 mL koniska rör.
- Snurra cellerna ner vid 646 ×g i 7 minuter vid 4 ° C och ta bort supernatanten.
- Lägga till en ytterligare 5 mL CM till 10 mL Pipettera bättre avbryta cellerna genom pipettering.
- Tvätta med PBS och räkna antalet celler.
-
Flödescytometri Flödesanalys
- Alikvotens 0,5-1 × 106 celler i varje fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS) tube.
- Centrifugera 646 × g vid 4 ° C i 5 min och Aspirera supernatanten.
- Lägg till 5 µL av varje utspätt fluorescens-konjugerad antikropp förberedelse till cellerna att åter upphäva de cellpelleten och vortex.
Obs: Det är viktigt att skydda cellpelleten från ljus exponering som möjligt eftersom fluorescently märkt antikroppar är ljuskänsliga. Generera en antikropp master mix och alltid lägga till Fc block. - Förbereda FACS buffert med 100 µL av PBS, 1% av Värmeinaktiverade regelbundna FBS och 0,1% natriumazid.
- Placera provet i röret vid 4 ° C i 30 min. Skölj cellerna med 2-4 mL FACS buffert och centrifugera provet vid 1700 rpm för 7 min vid 4 ° C.
- Slamma upp cellerna i 500 µL FACS buffert i mörkret. Analysera cellerna genom flödescytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utvärdera lämpliga injektion exponeringsvägar INP för aktivering av lymfatisk vävnad DC, DC befolkningen som härstamning definierades som –CD11c+ celler i mjälte, iLN och mLN och analyseras uttrycksnivåerna av co-stimulatory molekyler. Behandling av INP genom subkutana (s.c.) och intravenös (i.v.) injektion främjat betydande ökningar av CD40, CD80 och CD86 uttryck i mjälte och iLN DCs (figur 2B och 2 C). Footpad och intraperitoneal (IP) injektion av INP också avsevärt uppreglerat uttrycksnivåerna av CD40, CD80 och CD86 i mjälte och iLN DCs jämfört med i PBS-behandlade kontrollen (figur 2B och 2 C). I stimulerad mLN DCs främjas intranasalt (i.n.) injektion av INP högsta Uppregleringen av co-stimulatory molekyler jämfört med kontrollen PBS-behandlade (figur 2D). i.p. och i.v. injektion av INP inducerad också markanta ökningar i co-stimulatory molekyl uttryck i mLN, medan oral, s.c., och footpad injektion av INP inducerade inte aktivering av mLN DCs (figur 2D).
Figur 1 : Platsen för intraperitoneal injektion punkt Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Exakt plats för intravenös injektion Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : DC aktivering i lymfatiska organ analyseras med flödescytometri. C57BL/6 möss injicerades med INP av sex olika injektion rutter och 24 h efter injektion, mjälte, iLN och mLN skördades. (A) befolkningens DC i lymfatisk vävnadsceller definierades som härstamning –CD11c+ celler i levande leukocyter. (B-D) Uttrycksnivåerna av CD40, CD80 och CD86 analyserades av flödescytometri i mjälte (B), iLN (C) och mLN (D). Data är medelvärden från analyser av sex oberoende prover. Resultaten uttrycks som medel ± standardavvikelsen för medelvärdet (SEM). Den statistisk signifikans för skillnader mellan experimentella grupper har beräknats med variansanalys med oparade Student's t-test. p-värden < 0,05 ansågs betydande. * < 0,05, ** < 0,01. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Många framsteg inom nanoteknik och immunologi har uppnåtts genom terapeutisk forskning av drogen leverans och immunostimulering. Noggrant urval av metoden injektion är kända för att vara viktigt för immunostimulering, som var i fokus för föreliggande studie.
Olika injektion rutter utvärderades ett naturligt giftfria och biologiskt nedbrytbara DNA-baserade material, INP (immunstimulerande nanopartiklar), att bestämma vilken väg gav det bästa resultatet. Detta tillvägagångssätt är också relevant för att leverera andra terapeutiska medel inklusive antikroppar, antigener eller andra tillsatser.
För att analysera immunsvaret mot sådana injektioner, krävs skörd av lymfatisk vävnad (mjälte, iLN och MUSD). Isolering av lymfatiska vävnader är den mest avgörande aspekten av detta protokoll och krävs användning av en teknik som inte har beskrivits tidigare i detalj. Beredning av encelliga suspensionen för att ytterligare analysera immunceller har dessutom inte varit väl beskrivna. Denna studie fokuserar på utvinning av lymfvävnad, särskilt den iLN mLN och mjälte, för att analysera DC aktivering. Systemisk aktivering av immunförsvaret skett främst genom immunceller i mjälten. Dessutom kontrollerades immunsvaret i specifika vävnaden av närliggande lymfkörtlar. Utvärdering av nyutvecklade immun immunmodulerande molekyler bör utföras för att avgöra huruvida molekylerna kan framkalla immuna stimulering i vävnaderna. Metoden för lymfatisk vävnad isolering och analys av DC aktivering i vävnaderna kan därför användas för nyutvecklade immun stimulerande molekyler.
Utvärdera immun stimulerande effekten av INP, den iLN, mLN och mjälte skördades och INP visades att främja lymfatiska DC aktivering. Enligt tidigare, riktar INP effektivt TLR9 stimulering i DCs i möss2. Makrofager uttrycker också cytosoliska TLR9 hos möss. Därför kan INP injektion inducera både DC och makrofag aktivering. Dock bosatta makrofager i perifer vävnad som bidrar till fagocytos av mikrober i vävnaden. Dessutom, antigen-presentation kapacitet och flyttande effekt att den lymfatiska vävnaden i makrofager är comparably svagare än i DCs. Därför var utvärdera injektion rutten av INPs för immun stimulerande effekten lämplig för att undersöka DCs i lymfatisk vävnad.
Därför, funktionsläget av immun adjuvant administration beaktas mycket noga att uppnå framgångsrika immunterapi och vaccination med mjuka material.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av kreativt material Discovery Program genom den nationella forskning stiftelsen av Korea (NRF) finansieras av ministeriet för vetenskap, IKT och framtida planering (NRF-2017M3D1A1039421) och marin bioteknik Program finansieras av den Departement av hav och fiske, Republiken Korea och bidrag (20150220).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| phosphate buffer saline | Corning | 21-040-CVR | Washing organs |
| (PBS, pH 7.4) | |||
| isoflurane solution | Aesica Queenborough limited | 26675-46-7 | Anesthesia process |
| Tuberculin 1mL syringe - | Junglim | N/A | Injection |
| 50 mL conical tube | S.P.L | 50050 | Anesthesia process |
| 1mL Insulin Syringe | (BD Ultra-FineTMII)_short needle | 324826 | Intramuscular Injection |
| DMEM High Glucose | Hyclone | SH30081.01 | Storing organs |
| Histopaque | Sigma-Aldrich | 10771 | FACS analysis |
| Ethyl alcohol anhydrous 99.5 % | Daejung | 4022-4110 | Disinfectant |
| Equipments | |||
| FineCycler C100 (Thermocycler) | Ssufine | - | Anealing |
| Centrifuge | Centrifuge | ||
| FACS tube | FALCON | 2052 | FACS analysis |
| Automated High-performance Flow Cytometer | BD (USA), FACSVerse | - | FACS analysis |
References
- Park, H. Preparation of dodecynyl modified DNA nanoparticles with unmethylated CpG adjuvant and ovalbumin for immunostimulation. , Department of Chemistry. Pukyong National University, Master Thesis. (2016).
- Jin, J. O., Park, H., Zhang, W., de Vries, J. W., Gruszka, A., Lee, M. W., Ahn, D. R., Herrmann, A., Kwak, M. Modular delivery of CpG-incorporated lipid-DNA nanoparticles for spleen DC activation. Biomaterials. 115, 81-89 (2017).
- Pal, I., Ramsey, J. D. The role of the lymphatic system in vaccine trafficking and immune response. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (10-11), 909-922 (2011).
- Jin, J. O., Kwak, M., Xu, L., Kim, H., Lee, T. H., Kim, J. O., Liu, Q., Herrmann, A., Lee, P. C. W. Administration of soft matter lipid-DNA nanoparticle as the immunostimulant via multiple routes of injection in vivo. ACS Biomaterial Science & Engineering. 3 (9), 2054-2058 (2017).
- Worbs, T., Hammerschmidt, S. I., Förster, R. Dendritic cell migration in health and disease. Nature Review Immunology. 17 (1), 30-48 (2017).
- Milling, S. W. F., Jenkins, C., MacPherson, G. Collection of lymph-borne dendritic cells in the rat. Nature Protocols. 1 (5), 2263-2270 (2006).
- Desormeaux, A., Bergeron, M. G. Lymphoid tissue targeting of anti-HIV drugs using liposomes. Methods in Enzymology. 391, 330-351 (2005).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).
- Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).
- General anesthesia of mice and rats. , Animal Care and Use Standards Committee. (2016).
- Guidelines for the Euthanasia of Animals. , Veterinary Record. (2013).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration I. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration III. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- Mebius, R. E., Kraal, G. Structure and function of the spleen. Nature Review Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).
