Summary
يتم وصف الإجراءات التجريبية لاستخراج اللاحقة من الأنسجة اللمفاوية لاختبار تنشيط الخلايا الجذعية اللمفاوية بعد العلاج من نانوماتيريال إيمونوستيمولاتينج.
Abstract
تحليل لتنشيط الخلايا المناعية في الأنسجة اللمفاوية ضروري لتقييم عامل علاجي جديد للعلاج المناعي أو التطعيم،. هنا، نحن التحقيق في الآثار المناعية لمنبه المناعة الحمض الدهني الرواية في شكل نانوحبيبات من طرق الإدارة المختلفة في الماوس: عن طريق الفم، وداخل الآنف، وتحت الجلد، قاطع، داخل، وعن طريق الحقن الوريدي. هذه الحقن سوف تؤثر بصورة مباشرة الاستجابة المناعية، وحصاد الأنسجة اللمفاوية والتحليل لتنشيط الخلايا الجذعية (DC) في الأنسجة أجزاء مهمة من هذه التقييمات. استخراج العقد الليمفاوية الشعاعي (mLNs) هامة ولكن معقدة جداً بسبب حجم وموقع هذا الجهاز. ويرد إجراء التدرجي لحصاد العقدة الليمفاوية الاربية (إيلن)، ومعرض، والطحال وتحليل التنشيط DC بالتدفق الخلوي.
Introduction
التقدم في علم المناعة والمواد النانوية أدت إلى وفرة استراتيجيات العلاجية الجديدة المحتملة للتطبيقات في الطب الحيوي، بما في ذلك إيصال الأدوية و immunostimulation. الأمثل لمسار الإدارة أحد جوانب حيوية التي تؤثر على كفاءة وكلاء immunostimulatory. Immunostimulatory نانوحبيبات (البرنامج النووي العراقي) تتكون من الحمض النووي هو adjuvant نانو-المناعي المطورة حديثا تجميعها ذاتيا بفصل ميكروفاسي بسبب هيكل amphiphilic الحمض الدهني1. لذلك، بروتوكولات لمواده المتعلقة بالإدارة للمواد1 في فيفو عبر طرق مختلفة، وثلاثة إجراءات لقطع الأنسجة مناسبة مثل العقدة الليمفاوية الاربية (إيلن) والشعاعي LN (مليون)، والطحال، ووصف. أخيرا، تم تحليل هذه الأنسجة لتنشيط الخلايا الجذعية (DC)، خلايا مستضد-عرض أقوى في الجهاز المناعي. يمكن أيضا تطبيق هذا البروتوكول لتقييم المستضدات أو أجسام أخرى مأمونية المناعي2.
نحن اختبار صياغة البرنامج النووي العراقي لأنها عامل قد أظهرت الوعد العظيم. البرنامج النووي العراقي مستقبل مثل عدد القتلى 9 (TLR9) adjuvant المواد التي تحتوي على الأحماض النووية، أي تقييم ل immunostimulation كفاءة المطلوبة لاختبار طرق الحقن المختلفة3. وفي هذا السياق، الحث على وحدات تحكم المجال Dc نقطة قوية في فيفو التقييم. بعد أن يتم فاجوسيتوسيد جزيئات مستضد أو إيمونوستيمولاتوري بوحدات تحكم المجال Dc في الأنسجة المحيطية أو الدم، ترحيل هذه الخلايا إلى الأجهزة اللمفاوية مثل الطحال ولنس4،5. وهكذا، وقد تم تحليل التنشيط DC في الطحال وإيلن، ومعرض لحقن الحيوانات. حصاد هذه الأنسجة بشكل صحيح ذلك أيضا حاسمة لتقييم الاستجابة المناعية ل رواية أخرى الأعشاب أو مسببات الأمراض5. هذه الأنسجة حصاد مهم أيضا لوضع منهجية مناعية رواية كعلاج سرطان. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام هذا البروتوكول للتحقق من فعالية الأدوية الأخرى، مثل نقص المناعة البشرية المضادة الفيروسات المداواة6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأجريت جميع الإجراءات التجريبية بما في ذلك عزل الجهاز والتضحية والتعامل مع الحيوانات صارمة وفقا للقواعد "الدولية رعاية الحيوان" و "استخدام اللجنة" في مركز شانغهاي للصحة العامة السريرية والمركز الطبي أسان. وأقر البروتوكول دراسة اللجان المعنية في "أخلاقيات التجارب الحيوانية" في "مركز شانغهاي للصحة العامة السريرية" (رقم البروتوكول الماوس: سيكسك-2010-0098) واسان الطبي (2016-02-168).
1-إعداد المواد
ملاحظة: نانو-adjuvant، البرنامج النووي العراقي، تتألف من الناقل الحمض الدهن الذاتي تجميعها، إلا وهي U4T، وتحتوي على البد-عزر اليغنوكليوتيد، eCpG، كان يعمل في الدراسة الحالية لاختبار المسار الحقن المناسبة للعلاج المناعي والتطعيم في الفئران2 . الأهم من ذلك، يمكن أن تكون بديلاً للبرنامج النووي العراقي الجزيئات العلاجية الأخرى المحتملة مثل المستضدات والأجسام المضادة، ووكلاء adjuvant واختباره باستخدام نفس المنهجية المبينة أدناه.
- البرنامج النووي العراقي صياغة2،،من47
- يصلب U4T (160 ميكرون، والناقل) مع eCpG (80 ميكرومتر، التي تحتوي على تسلسل مؤثر TLR9) حضور 1 x مخزنة الفوسفات المالحة (برنامج تلفزيوني، ودرجة الحموضة 7.4) ومجكل2 (مم 2). حجم قياسي للصلب ما بين 50 و 110 ميليلتر في أنبوب PCR. تسخين المزيج إلى 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق وثم تبرد ببطء (1 درجة مئوية/16 دقيقة) إلى 25 درجة مئوية باستخدام ثيرموسيكلير. ويتطلب البروتوكول انلينغ حوالي 2 ح.
تنبيه: السائل الذي يحتوي على U4T هو مزبد جداً ويجب التعامل معها بعناية. - جعل 50 ميليلتر مختبرين لإعداد البرنامج النووي العراقي؛ استخدام 50 ميليلتر من المواد لكل حقن.
ملاحظة: في حالة 100 ميليلتر للحقنة، كرر الخطوة 1.1 مع الحساب الصحيح للمكونات.
- يصلب U4T (160 ميكرون، والناقل) مع eCpG (80 ميكرومتر، التي تحتوي على تسلسل مؤثر TLR9) حضور 1 x مخزنة الفوسفات المالحة (برنامج تلفزيوني، ودرجة الحموضة 7.4) ومجكل2 (مم 2). حجم قياسي للصلب ما بين 50 و 110 ميليلتر في أنبوب PCR. تسخين المزيج إلى 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق وثم تبرد ببطء (1 درجة مئوية/16 دقيقة) إلى 25 درجة مئوية باستخدام ثيرموسيكلير. ويتطلب البروتوكول انلينغ حوالي 2 ح.
2-العامة الحيوان الإجراءات
ملاحظة: يمكن استخدام طرق بديلة للتعامل مع الفئران تبعاً لمتطلبات المختبر والبروتوكولات الحيوانية المعتمدة8. هو نوع الفئران تستخدم الفئران C57BL/6 وأنثى عمرها 6 في الأسبوع.
- قائمة بالمواد
- تحضير مخدر السائل (إيسوفلوراني)، آلة مخدر، الدائرة استنشاق غاز ثاني أكسيد الكربون (CO2)، وشاش معقم، الملقط، ريسترينير الماوس، قفازات، الملقط مدمن مخدرات، ومقص تشريح 1 بوصة، مقص تشريح 2 بوصة، الكحول التعقيم، وحقنه الأنسولين.
- التخدير الاستنشاق
ملاحظة: التخدير إلزامي لقاطع داخل الآنف، وتحت الجلد، والحقن الوريدي للفئران9. يتم استخدام تشكيل دائرة التعريفي مع المبخر آلة والأكسجين خزان متصل لهذا الإجراء.- ضع الحيوان في قاعة توجيهي وتأكد من أحكام إغلاق الغطاء.
- تدفق الأكسجين في 1 لتر في الدقيقة، وقم بتعيين إعداد المبخر إلى مستوى توجيهي 4% ل isoflurane.
- يختلف وقت التعرض للحيوانات في الدائرة تبعاً لوزن الحيوان؛ ومع ذلك، أكثر من 10 ثانية من التعرض، ورصد كل 5 دقائق ضروري للتخدير10.
ملاحظة: يشير لا منعكس دواسة التخدير الناجح. - إيقاف محث isoflurane وتدفق 1 لتر في الدقيقة للأكسجين لمنع تعرض الأفراد للغاز إيسوفلوراني.
- تضحية
- إعداد غرفة لشركة2 استنشاق تضحية وفقا للمعاهد الوطنية للصحة "المبادئ التوجيهية للقتل الرحيم للقوارض باستخدام ثاني أكسيد الكربون"11.
- اختبار هفوة استجابة للتأكد من أن الحيوان هو التضحية بالكامل.
- تحقق من أن الماوس بشكل صحيح التضحية معسر تلميح الأقدام وتأكيد أي رد اسكت. إذا لم يكن هناك استجابة، كرر الخطوة 2، 2.
- تطهير
- تطهير جميع المناطق السطحية المستخدمة للحقن أو تشريح مع رذاذ الكحول وشاش معقم.
- جهاز التخزين
- استخدام الملقط لإزالة جميع الدهون والدم المحيطة بأجهزة المقطوع. تخزين هذه الأنسجة المقطوع على حدة في طبق بتري مليئة 3 مل من برنامج تلفزيوني. حاوية ووسائل الإعلام قد تختلف تبعاً لمتطلبات الإجراءات اللاحقة.
3-حقن الطرق
- استخدام أساليب حقن الستة إلى التحقيق في الاستجابات المناعية تعتمد على حقن: عن طريق الفم، وداخل الآنف، وتحت الجلد، قاطع، داخل، و عن طريق الحقن الوريدي8،،من1213.
4-العزل من الغدد الليمفاوية والطحال
ملاحظة: استخدام الشباب وصحية العجاف الفئران (6 أسابيع من العمر) لهذه الإجراءات لأن الدهون التي عادة بناء حول العقد الليمفاوية في الفئران الأكبر سنا من الصعب إزالتها، ويمكن منع التصور السليم للجهاز.
- خطوات ما قبل الحصاد
ملاحظة: يصف هذا القسم حصاد ما بعد الحقن إيلن والطحال، ومليون من الفئران لتحليل التحفيز المناعي. الرجوع إلى الخطوات 2.3 2.5 للتضحية، وأسكت استجابة، وأساليب التعقيم.- دبوس أطرافه الماوس للمجلس رغوة الجراحية وتعقيم الجانب البطني للماوس مع الإيثانول 70%.
- اختيار موقع 2 سم فوق منطقة الأعضاء التناسلية ومدمن مخدرات استخدام الملقط لسحب ما يصل غطاء الجلد الخارجي مثل خيمة. جعل هو قطع 1 سم تقريبا في هذا الموقع والشريحة المقص (2 بوصة) تحت الجلد، وإجراء مزيد من التخفيضات في التشريح.
- لأهاب، قص عمودياً من خلال الجلد الخارجي مع كل الأسلحة من المقص (2 بوصة). كشف الأجهزة الداخلية مغطاة بالغشاء البريتوني.
- دبوس على الطبقة الخارجية للجلد.
-
عزل العقدة الليمفاوية الاربية (إيلن)
- حدد موقع في إيلن في الجانب الأيسر من الساق بعد اقتران الأوعية الدموية تسير أسفل الساق اليسرى، الذي يظهر كحرف مائل 'نعم'.
ملاحظة: للفئران حقن تحت الجلد، اختر iLN في نفس الجانب من مكان الحقن. - كشف الطبقة مع الملقط اثنين التمزق في طبقة الدهن مغطاة وحصاد iLN أصفر باهت (الشكل فول، 2 مم). للمعالجة اللاحقة وتخزين الأنسجة، راجع الخطوة 2.6.
- حدد موقع في إيلن في الجانب الأيسر من الساق بعد اقتران الأوعية الدموية تسير أسفل الساق اليسرى، الذي يظهر كحرف مائل 'نعم'.
-
عزل الطحال 14
- جعل خيمة في المركز من الغشاء البريتوني باستخدام التوصيل الملقط في يد واحدة واستخدام صغيرة رقيقة المقص (1 بوصة) في اليد الأخرى قطع الصفاق.
- مدمن مخدرات استخدام الملقط في اليد اليسرى لفهم الأمعاء واقلب لتحديد موقع الطحال مثل الفاصوليا الحمراء (طول ما يقرب من 14 مم) تعلق على الجانب الأيسر العلوي من البطن الماوس.
- بلطف سحب الطحال مع مجموعة أخرى من الملقط في يده اليمنى أثناء فصل الأجهزة الأخرى مع الملقط مدمن مخدرات. اتبع الخطوة 2.6 لتخزين الطحال.
ملاحظة: الرعاية مطلوب عند الحصاد الطحال، كما أنها هيئة لينة تالفة بسهولة.
-
عزل العقدة الليمفاوية الشعاعي (مليون)
ملاحظة: معرض يقع حوالي 1 سم تحت الأضلاع ومغطى بالأجهزة الأخرى مثل القلب والرئتين. بسبب موقعها وصغر حجمها، من المهم أن تعرض المنطقة المحيطة باستخدام الملقط، والمقص (1 بوصة) بدقة.- قطع الحجاب الحاجز ويفصله من أضلاعه. تعقد هيئة الأضلاع بالملقط وثم قطع الجانب الأيسر والأيمن من الأضلاع بالمقص (1 بوصة). دبوس الأضلاع استقطاع على الكتف الماوس على اليمين لكشف القلب والرئتين.
ملاحظة: رعاية لا قطع أي من الأوعية الدموية حول القلب والرئتين، كما تسرب الدم يجعل من الصعب جداً تحديد موقع معرض شفافة صغيرة. إذا كان يتم قطع أي الأوعية الدموية، بلطف استيعاب الدم في المنطقة بشاش. - استخدام الملقط مدمن مخدرات في اليد اليمنى، انعكاس القلب والرئتين بلطف إلى اليمين حتى يتم عرضها في العمود الفقري. استخدام زوج من الملقط العادية في اليد اليسرى لإزالة في إيلن مع الملقط مدمن مخدرات في اليد اليمنى لمساعدة مع هذا الحصاد.
- الاستيلاء على الرئتين وانعكاسها حتى العمود الفقري يتعرض لها على نطاق واسع. معرض (شفافة على شكل حبة بنية حوالي 2 مم في الحجم) يقع بين الرئتين والعمود الفقري.
- استخدام الملقط مدمن مخدرات لكشف المنطقة المحيطة مليون والملقط الأخرى لانتزاع الأنسجة.
ملاحظة: معرض محاط بالعديد من الأنسجة الأخرى التي يجب إزالتها بعناية مع الملقط قبل موسم الحصاد. - راجع الخطوة 2.7 للحصول على إرشادات حول تخزين مليون المقطوع.
- قطع الحجاب الحاجز ويفصله من أضلاعه. تعقد هيئة الأضلاع بالملقط وثم قطع الجانب الأيسر والأيمن من الأضلاع بالمقص (1 بوصة). دبوس الأضلاع استقطاع على الكتف الماوس على اليمين لكشف القلب والرئتين.
5-إعداد العينات للتدفق الخلوي
ملاحظة: للاعتداء تفعيل وحدات تحكم المجال Dc في iLN المقطوع والطحال، ومليون، تعليق خلية واحدة من هذه الأنسجة هي ملطخة بالأجسام المضادة مترافق الأسفار كعلامات خاصة بالعاصمة وجزيئات كوستيمولاتوري و histocompatibility الرئيسية المعقدة الجزيئات وتحليلها بواسطة التدفق الخلوي.
-
إعداد تعليق خلية واحدة: الطحال
- إضافة 5 مل من جديد الثقافة المتوسطة (سم) في الطبق الثقافة 6 ملم ووضع العينات في الجليد.
- إزالة الأنسجة المحيطة بها الدم والدهون والأنسجة في غطاء الطبق الثقافة.
- قطع الأنسجة إلى أجزاء صغيرة (< 1 مم) مع مقص منحنى. تعليق الشظايا في برنامج تلفزيوني تليها الغزل أسفل النسيج باستخدام أجهزة الطرد مركزي في 646 × ز لمدة 5 دقائق وإزالة المادة طافية.
- تعليق العينات مرة أخرى مل 3 سم وهضم الأجزاء مع 200 ميليلتر لإيجاد حل للمصل 2% البقري الجنين (FBS) وتستكمل مع كولاجيناز الرابع لمدة 20 دقيقة.
- تهز بلطف واحتضان العينة في 37 درجة مئوية لتصفية حاء 1 الأنسجة هضمها من خلال شبكة النايلون (100 nm) ومعين لهم باستمرار. تغسل الخلايا المفردة في 5 مل من برنامج تلفزيوني وإزالة المادة طافية بالطرد المركزي.
- إعادة تعليق الخلايا في 5 مل خلية عزل الحل. إعادة تحميل طبقة أخرى من 5 مل حل العزلة الخلية واضحة لشكل رصة طبقة بالطبقة مائية.
- الطرد المركزي إعداد الخلية في 2012 × ز 10 دقيقة الحصول على المادة طافية، الذي هو الكسر كثافة أخف (< 1.077 غرام/سم3)، للتحليل الخلوي تدفق اللاحقة.
- حساب عدد الخلايا التي تحتوي هيموسيتوميتير.
-
إعداد تعليق خلية واحدة: العقدة الليمفاوية
- اتبع الخطوة 5.1.1-5.1.2.
- إضافة مل 5 سم باستخدام بيبيت 10 مل تعليق الخلايا من بيبيتينج 3-4 مرات. بعد تعليق دقة استخدام الخلايا، شبكة النايلون العقيمة لتصفية الخلايا لجمع في أنبوب مخروطي 15 مل.
- تدور الخلايا لأسفل في 646 ×ز لمدة 7 دقائق في 4 درجات مئوية وإزالة المادة طافية.
- إضافة مل 5 إضافية من سم إلى 10 مل بيبيت أفضل تعليق الخلايا من بيبيتينج.
- تغسل ببرنامج تلفزيوني وحساب عدد الخلايا.
-
تحليل التدفق الخلوي
- الكوة 0.5-1 × 106 خلايا في كل خلية تنشيط fluorescence فرز أنابيب (نظام مراقبة الأصول الميدانية).
- الطرد المركزي في 646 × ز عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ونضح المادة طافية.
- إضافة إعداد جسم ميليلتر من كل المخفف مترافق الأسفار 5 في الخلايا لإعادة تعليق خلية بيليه ودوامه.
ملاحظة: من المهم درع بيليه الخلية من التعرض للضوء بقدر الإمكان لأن الأجسام المضادة المسماة فلوريسسينتلي حساسة للضوء. توليد مزيج رئيسي الأجسام المضادة ودائما إضافة كتلة Fc. - إعداد نظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن المؤقت باستخدام 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني، 1% من الحرارة إبطال FBS العادية، وأزيد الصوديوم 0.1%.
- ضع العينة في الأنبوب في 4 درجات مئوية عن 30 دقيقة شطف الخلايا مع 2-4 مل من نظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن المؤقت والطرد المركزي العينة 1700 لفة في الدقيقة لمدة 7 دقائق في 4 درجات مئوية.
- إعادة تعليق الخلايا في 500 ميليلتر من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية في الظلام. تحليل الخلايا بالتدفق الخلوي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
عرف سكان العاصمة كنسب أنه لتقييم طرق الحقن المناسبة للبرنامج النووي العراقي لتنشيط الأنسجة اللمفية DC، –CD11c+ الخلايا في الطحال وإيلن، ومعرض، وتحليل مستويات التعبير من الجزيئات كوستيمولاتوري. تعزيز العلاج للبرنامج النووي العراقي تحت الجلد (الليبي) والحقن في الوريد (رابعا) زيادات كبيرة في التعبير CD40، CD80، و CD86 في DCs الطحال وإيلن (الشكل 2 و 2 ج). قاطع والحقن داخل (القائمة) من البرنامج النووي العراقي إلى حد كبير يصل-ينظم أيضا مقارنة مستويات التعبير CD40، CD80، و CD86 في وحدات تحكم المجال Dc الطحال وإيلن في عنصر تحكم تعامل برنامج تلفزيوني (الشكل 2 (ب) و 2 (ج)). في حفز مليون وحدات تحكم المجال Dc، شجعت الحقن داخل الآنف (i.n.) للبرنامج النووي العراقي يصل أعلى-تنظيم جزيئات كوستيمولاتوري مقارنة بالتي في عنصر تحكم تعامل برنامج تلفزيوني (الشكل 2D). بفعل حقن القائمة و رابعا مواده أيضا زيادات ملحوظة في جزيء كوستيمولاتوري التعبير في مليون، بينما الفم، الليبي، وحقن قاطع مواده الحث على عدم تفعيل مليون وحدات تحكم المجال Dc (الشكل 2D).
الشكل 1 : موقع نقطة الحقن داخل الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : موقع دقيقة من الحقن الوريدي الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : تفعيل DC في أجهزة اللمفاوي تحليلها بواسطة التدفق الخلوي- تم حقن الفئران C57BL/6 مع البرنامج النووي العراقي بست طرق الحقن المختلفة و 24 ساعة بعد الحقن والطحال، إيلن ومليون تم حصادها. (أ) سكان العاصمة في خلايا الأنسجة اللمفية كان يعرف النسب –CD11c+ الخلايا في الكريات البيضاء حية. (ب-د) تم تحليل مستويات التعبير CD40، CD80، و CD86 بالتدفق الخلوي في الطحال (ب)، إيلن (ج) ومليون (د). البيانات متوسطات من تحليل العينات المستقلة الستة. يتم التعبير عن النتائج بوسائل ± الخطأ المعياري للوسط (SEM). تم حساب الدلالة الإحصائية للفروق بين المجموعات التجريبية باستخدام تحليل التباين مع الطالب مزاوج تي-اختبار. فقيم < 0.05 اعتبرت هامة. * < 0.05، * * < 0.01. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لقد تحققت العديد من أوجه التقدم في تكنولوجيا النانو وعلم المناعة من خلال الأبحاث العلاجية لإيصال الأدوية و immunostimulation. الاختيار الدقيق لأسلوب الحقن المعروف أن المهم بالنسبة immunostimulation، الذي كان محور هذه الدراسة.
تم تقييم طرق الحقن المختلفة بطبيعة الحال غير السامة والقابلة للتحلل الحيوي القائم على الحمض النووي مادة البرنامج النووي العراقي (immunostimulatory نانوحبيبات)، لتحديد الطريق التي تسفر عن نتائج أفضل. وهذا النهج أيضا ذات الصلة لإيصال العوامل العلاجية الأخرى بما في ذلك الأجسام المضادة أو مولدات المضادات، أو المواد المساعدة الأخرى.
لتحليل الاستجابة المناعية لهذه الحقن، مطلوب حصاد نسيج اللمفاوي (الطحال و iLN مليون). عزل الأنسجة اللمفية هو الجانب الأكثر أهمية في هذا البروتوكول والمطلوب باستخدام تقنية قد لا تم وصفها سابقا بالتفصيل. وعلاوة على ذلك، لم يكن جيدا وصف إعداد تعليق خلية واحدة لمواصلة تحليل الخلايا المناعية. وركزت هذه الدراسة على استخراج الأنسجة اللمفاوية، لا سيما iLN، مليون، والطحال، لتحليل التنشيط DC. منهجية تنشيط الاستجابة المناعية حدث أساسا من خلال خلايا المناعة في الطحال. بالإضافة إلى ذلك، تسيطر الاستجابات المناعية في أنسجة محددة في العقد الليمفاوية المجاورة. ينبغي إجراء تقييم لجزيئات مودولاتوري المناعي المطورة حديثا لتحديد ما إذا كانت الجزيئات يمكن أن يستحث التحفيز المناعي في الأنسجة. ولذلك، يمكن استخدام الأسلوب عزل الأنسجة اللمفية وتحليل للتنشيط DC في الأنسجة لجزيئات محفزة مأمن المطورة حديثا.
لتقييم تأثير تنشيطية محصنة من البرنامج النووي العراقي، iLN، مليون، والطحال تم حصادها وأبدى البرنامج النووي العراقي تعزيز اللمفاوية DC التنشيط. كما تقرر سابقا، يستهدف البرنامج النووي العراقي فعالية التحفيز TLR9 في وحدات تحكم المجال Dc في الفئران2. كما أعرب الضامة TLR9 سيتوسوليك في الفئران. ولذلك، قد حمل حقن مواده التنشيط DC وبلعم. ومع ذلك، الضامة الموجودة في الأنسجة المحيطية التي تسهم في البلعمه للميكروبات في الأنسجة. وعلاوة على ذلك، عرض مستضد قدرة وتأثير الهجرة على النسيج اللمفاوي من الضامة أضعف نسبيا من تلك الموجودة في وحدات تحكم المجال Dc. ولذلك، تقييم مسار حقن INPs لتأثير تنشيطية المناعي كان مناسبة لدراسة وحدات تحكم المجال Dc في النسيج اللمفاوي.
ولذلك، يجب النظر طريقة الإدارة adjuvant محصنة بعناية فائقة لتحقيق نجاح العلاج المناعي والتطعيم باستخدام مواد لينة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
هذا البحث كان يدعمها "البرنامج اكتشاف المواد الإبداعية" عن طريق الوطنية بحوث مؤسسة من كوريا (جبهة الخلاص الوطني) تمول وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات و "تخطيط المستقبل" (جبهة الخلاص الوطني-2017M3D1A1039421)، و "برنامج التكنولوجيا الحيوية البحرية" تموله وزارة من المحيطات ومصائد الأسماك، وجمهورية كوريا ومنحة (20150220).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| phosphate buffer saline | Corning | 21-040-CVR | Washing organs |
| (PBS, pH 7.4) | |||
| isoflurane solution | Aesica Queenborough limited | 26675-46-7 | Anesthesia process |
| Tuberculin 1mL syringe - | Junglim | N/A | Injection |
| 50 mL conical tube | S.P.L | 50050 | Anesthesia process |
| 1mL Insulin Syringe | (BD Ultra-FineTMII)_short needle | 324826 | Intramuscular Injection |
| DMEM High Glucose | Hyclone | SH30081.01 | Storing organs |
| Histopaque | Sigma-Aldrich | 10771 | FACS analysis |
| Ethyl alcohol anhydrous 99.5 % | Daejung | 4022-4110 | Disinfectant |
| Equipments | |||
| FineCycler C100 (Thermocycler) | Ssufine | - | Anealing |
| Centrifuge | Centrifuge | ||
| FACS tube | FALCON | 2052 | FACS analysis |
| Automated High-performance Flow Cytometer | BD (USA), FACSVerse | - | FACS analysis |
References
- Park, H. Preparation of dodecynyl modified DNA nanoparticles with unmethylated CpG adjuvant and ovalbumin for immunostimulation. , Department of Chemistry. Pukyong National University, Master Thesis. (2016).
- Jin, J. O., Park, H., Zhang, W., de Vries, J. W., Gruszka, A., Lee, M. W., Ahn, D. R., Herrmann, A., Kwak, M. Modular delivery of CpG-incorporated lipid-DNA nanoparticles for spleen DC activation. Biomaterials. 115, 81-89 (2017).
- Pal, I., Ramsey, J. D. The role of the lymphatic system in vaccine trafficking and immune response. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (10-11), 909-922 (2011).
- Jin, J. O., Kwak, M., Xu, L., Kim, H., Lee, T. H., Kim, J. O., Liu, Q., Herrmann, A., Lee, P. C. W. Administration of soft matter lipid-DNA nanoparticle as the immunostimulant via multiple routes of injection in vivo. ACS Biomaterial Science & Engineering. 3 (9), 2054-2058 (2017).
- Worbs, T., Hammerschmidt, S. I., Förster, R. Dendritic cell migration in health and disease. Nature Review Immunology. 17 (1), 30-48 (2017).
- Milling, S. W. F., Jenkins, C., MacPherson, G. Collection of lymph-borne dendritic cells in the rat. Nature Protocols. 1 (5), 2263-2270 (2006).
- Desormeaux, A., Bergeron, M. G. Lymphoid tissue targeting of anti-HIV drugs using liposomes. Methods in Enzymology. 391, 330-351 (2005).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).
- Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).
- General anesthesia of mice and rats. , Animal Care and Use Standards Committee. (2016).
- Guidelines for the Euthanasia of Animals. , Veterinary Record. (2013).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration I. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration III. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- Mebius, R. E., Kraal, G. Structure and function of the spleen. Nature Review Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).
