Immunstimulerende middel evaluering: Lymfoide væv udvinding og injektion rute-afhængige dendritiske celle aktivering

Summary

Eksperimentelle procedurer for efterfølgende udvinding af lymfatisk væv til at teste lymfoide dendritiske celle aktivering er beskrevet efter behandling af en immunstimulerende nanomateriale.

Abstract

Evaluering af en ny terapeutisk agent for immunterapi eller vaccination er analyse af immun celle aktivering i lymfatisk væv afgørende. Her, vi undersøgte immunologiske effekter af en novel lipid-DNA immunostimulant i nanopartikel form fra forskellige administrationsveje i musen: oral, intranasal, subkutane, footpad, intraperitoneal, og intravenøs. Disse injektioner vil direkte påvirke immunrespons, og høst lymfatisk væv og analyse af dendritiske celler (DC) aktivering i væv er afgørende dele af disse evalueringer. Udvinding af mediastinale lymfeknuder (mLNs) er vigtig, men ganske komplekse på grund af størrelsen og placeringen af dette organ. En trinvis procedure til høst ingvinal lymfeknude (iLN), mLN og milt og analysere DC aktivering ved flowcytometri er beskrevet.

Introduction

Fremskridt inden for immunologi og nanomaterialer har ført til en overflod af potentielle nye terapeutiske strategier for programmer i biomedicin, herunder medicinafgivelse og immunostimulation. Optimering af ruten administration er et vigtigt aspekt, der påvirker effekten af immunstimulerende agenter. En immunstimulerende nanopartikel (INP) bestående af DNA er en nyudviklet nano-immune adjuverende selv samlet af microphase separation på grund af lipid-DNA¹amphiphilic struktur. Derfor protokoller for INP involverer administrationen af de materielle¹ i vivo via forskellige ruter, og tre procedurer for høst passende væv som den ingvinal lymfeknude (iLN), mediastinale LN (mio.), og milt, er beskrevet. Endelig blev disse væv analyseret for dendritiske celler (DC) aktivisering, de mest magtfulde antigen-præsenterer celler i immunsystemet. Denne protokol kan også anvendes til at vurdere antigener, antistoffer og andre immun adjuvanser².

Vi testede INP formulering, fordi det er en agent, der har vist lovende. INP er en Toll-lignende receptor 9 (TLR9) adjuverende materiale, der indeholder nukleinsyrer, for hvilke vurderingen af immunostimulation effektivitet er forpligtet til at teste forskellige injektion metoder³. I denne sammenhæng er stimulation af DCs en potent slutpunkt i vivo evaluering. Efter antigen eller immunstimulerende molekyler er phagocytosed af DCs i perifere væv eller blod, vandrer disse celler til lymfoid organer som milt og LNs^4,5. Således blev DC aktivering analyseret i milten, iLN og mLN af de injicerede dyr. Ordentligt høst af disse væv er derfor også afgørende for at vurdere immunrespons på en roman adjuverende eller patogener⁵. Sådanne væv høst er også vigtige for at udvikle en roman immunologiske metoder som en kræftbehandling. Denne protokol kan desuden bruges til at kontrollere effektiviteten af andre lægemidler, såsom anti-human immundefekt virus therapeutics⁶.

Protocol

Alle eksperimentelle procedurer herunder animalske håndtering, offer og orgel isolation blev udført i nøje overensstemmelse med reglerne i International Animal Care og brug Udvalget på Shanghai folkesundhed klinisk Center og Asan Medical Center. Undersøgelse-protokollen blev godkendt af de respektive udvalg på etik af dyr eksperimenter på Shanghai folkesundhed klinisk Center (mus protokolnummer: SYXK-2010-0098) og Asan Medical Center (2016-02-168).

1. forberedelse af materiale

Bemærk: En nano-adjuvans, INP, består af en selvsamlede lipid-DNA carrier, nemlig U4T, og CpG-motiv indeholdende oligonukleotid, eCpG, var ansat i den aktuelle undersøgelse at teste den passende injektion rute for immunterapi og vaccination i mus² . Vigtigere, andre potentielle terapeutiske molekyler som antigener, antistoffer og adjuverende agenter kan erstattes af INP og testet ved hjælp af den samme metode som beskrevet nedenfor.

1. INP formulering^2,4,7
   1. Bind U4T (160 µM, carrier) med eCpG (80 µM, indeholdende en TLR9 agonist sekvens) i nærværelse af 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS, pH 7,4) og MgCl₂ (2 mM). Den standard volumen for udglødning er mellem 50 og 110 µL i PCR rør. Opvarm blandingen til 95 ° C i 10 min og derefter afkøles langsomt (1 ° C/16 min.) til 25 ° C ved hjælp af en thermocycler. Den udgloedning protokollen kræver ca 2 h.
      Forsigtig: U4T-holdige væsken er meget skummende og skal håndteres forsigtigt.
   2. Gøre 50 µL delprøver af INP forberedelse; bruge 50 µL af materialet for hver injektion.
      Bemærk: I tilfælde af 100 µL pr. injektion, Gentag trin 1.1 med korrekt beregning af ingredienser.

2. generelle dyre procedurer

Bemærk: Alternative metoder til håndtering af musene kan bruges afhængig af laboratorium krav og godkendte animalske protokoller⁸. Typen af mus bruges er 6 uger gamle C57BL/6 og kvindelige mus.

1. Liste over materialer
   1. Forberede den flydende bedøvelsesmiddel (isofluran), bedøvende maskine, kuldioxid (CO₂) indånding kammer, steriliseret gaze, pincet, mus Tilbageholderen, handsker, hooked pincet, 1-tommer dissekere saks, 2-tommer dissekere saks, alkohol for sterilisation, og insulin sprøjte.
2. Inhalant anæstesi
   Bemærk: Anæstesi er obligatorisk for intranasal, subkutane, footpad og intravenøse injektioner af mus⁹. En induktion kammeret med en vaporizer maskine og ilt tank tilsluttet er brugt til denne procedure.
   1. Placere dyret i salen, induktion og sikre hen til tæt slutning låg.
   2. Flow ilt på 1 L/min og angive indstillingen vaporizer til en induktion niveau på 4% for isofluran.
   3. Variere eksponeringstid for dyr i salen afhængigt af dyrenes vægt; dog mere end 10 s eksponering og overvågning hvert 5 min er nødvendig for anæstesi¹⁰.
      Bemærk: Ingen pedal refleks angiver vellykket anæstesi.
   4. Slukke for isofluran spole og flow 1 L/min ilt at forhindre personale eksponering for isofluran gas.
3. Offer
   1. Forberede et kammer for CO₂ indånding offer i henhold til NIH "retningslinjer for eutanasi af gnavere ved hjælp af kuldioxid"¹¹.
4. Test gag svar at bekræfte, at dyret er fuldt ofret.
   1. Kontroller, at musen er korrekt ofret ved at knibe spidsen af sin mund og bekræfter ikke gag svar. Hvis der er et svar, skal du gentage trin 2.2.
5. Desinfektion
   1. Desinficere alle arealer anvendes til injektioner eller dissektioner med alkohol spray og steriliseret gaze.
6. Orgel opbevaring
   1. Bruge pincet til at fjerne al fedt og blod omkring høstet organer. Gemme disse høstede væv individuelt i en petriskål, fyldt med 3 mL PBS. Container og medier kan variere afhængigt af de efterfoelgende procedure krav.

3. indsprøjtning ruter

1. Bruge seks injektion metoder til at undersøge injektion-afhængige immunrespons: oral, intranasal, subkutane, footpad, intraperitoneal, og intravenøs^8,12,13.

4. isolering af lymfeknuder og milt

Bemærk: Brug ung og sund lean mus (6 uger gamle) for disse procedurer, fordi de fedtstoffer, der typisk bygge omkring lymfeknuder i ældre mus er vanskelige at fjerne og kan forhindre korrekt visualisering af orglet.

1. Før høst trin
   Bemærk: Dette afsnit beskriver efter injektion høst af iLN, milt og mLN fra mus til at analysere immunstimulering. Henvise til trin 2,3-2,5 for offer, gag svar og desinfektionsmetoder.
   1. PIN lemmer af mus til kirurgisk skum bestyrelsen og sterilisere den ventrale side af musen med 70% ethanol.
   2. Vælg en placering 2 cm over kønsdelene og brug hooked pincet til at trække op den ydre hud dække som et telt. Gøre en ca 1 cm snit på denne placering, og skub saks (2 tommers) under huden, gør yderligere dissektion nedskæringer.
   3. For integument, skåret lodret gennem den ydre hud med begge arme saks (2 tommers). Afdække de indre organer er dækket med bughinden.
   4. Pin det yderste lag af huden.
2. Isolation af ingvinal lymfeknude (iLN)
   1. Find iLN på venstre side af benet efter sammen af blodkar på vej ned i venstre ben, der vises som en hældende brev 'Y'.
      Bemærk: For subkutant injiceres mus, vælge en iLN på samme side af injektion placering.
   2. Afdække laget med to pincet til at rippe overdækket lipid lag og høste de blege gule iLN (bønne form, 2 mm). Efterfølgende behandling og opbevaring af væv, under trin 2.6.
3. Isolation af milten ¹⁴
   1. Gøre et telt på midten af bughinden bruger hooked pincet i den ene hånd og bruge små tynde saks (1 tomme) i anden hånden til at skære bughinden.
   2. Brug hooked pincet i venstre hånd til at forstå tarmen og vende det om at finde rød bønne-lignende milten (længde ca 14 mm) knyttet til den venstre øvre side af musen maven.
   3. Træk forsigtigt ud milt med et andet sæt af pincet i højre hånd samtidig afmonterer andre organer med de krogede pincet. Følg trin 2.6 gemme milten.
      Bemærk: Pleje er nødvendig når hovedkød milten, da det er en let beskadigede bløde orgel.
4. Isolation af mediastinale lymfeknude (mio.)
   Bemærk: MLN er beliggende ca. 1 cm under ribbenene og er omfattet af andre organer såsom hjertet og lungerne. På grund af dens placering og lille størrelse er det vigtigt at omhyggeligt udsætte det omkringliggende område med pincet og saks (1-inch).
   1. Skære mellemgulvet og frigøre det fra ribbenene. Hold kroppen af ribbenene med pincet og derefter skære den venstre og højre side af ribben med saks (1-inch). PIN cutoff ribbenene over musens skulder på retten til at udsætte hjerte og lunger.
      Bemærk: passe på ikke for at skære nogen af blodkar omkring hjerte og lunger, som lækker blod gør det meget vanskeligt at finde den lille gennemskinnelige mLN. Hvis nogen blodkar er skåret, forsigtigt absorbere blod i området med gaze.
   2. Bruger hooked pincet i højre hånd, flip hjertet og lungerne forsigtigt til højre, indtil rygraden er eksponeret. Bruge et par af regelmæssige pincet i venstre hånd til at fjerne iLN med krogede pincet i højre hånd til at bistå med denne høst.
   3. Få fat i lungerne og vende dem indtil rygraden er bredt eksponeret. MLN (en gennemskinnelig bønne-formet struktur af ca. 2 mm i størrelsen) ligger mellem lungerne og rygsøjlen.
   4. Udnyt de krogede pincet til at afdække området omkring mLN og andre pincet til at udtrække væv.
      Bemærk: MLN er omgivet af talrige andre væv, som fjernes omhyggeligt med pincet før høst.
   5. Se trin 2,7 for instruktioner til opbevaring af de høstede mio.

5. forberedelse af proever til flowcytometri

Bemærk: For at assay aktivering af DCs i høstede iLN, milt og mLN, encellede suspensioner af disse væv farves med fluorescens-konjugerede antistoffer som DC-specifikke markører, co-stimulatory molekyler og store histocompatibility komplekse molekyler og analyseret ved flowcytometri.

1. Forberedelse af encellede suspensioner: milt
   1. Der tilsættes 5 mL af frisk næringssubstratet (CM) i 6-mm kultur skål og prøveemner på is.
   2. Fjern omgivende blod og fedt væv og placere vævet i låget af kultur parabol.
   3. Skær væv i små fragmenter (< 1 mm) med en buet saks. Suspendere fragmenter i PBS efterfulgt af spinning ned væv ved hjælp af en centrifuge 646 × g til 5 min og fjerne supernatanten.
   4. Suspendere prøverne igen i 3 mL af CM og fordøje fragmenter med 200 µL af løsning af 2% føtal bovint serum (FBS) suppleret med collagenase IV i 20 min.
   5. Forsigtigt ryste og inkuberes prøve ved 37 ° C for 1 h. filtrere fordøjet væv gennem nylon mesh (100 nm) og dreje dem ned. Vask de enkelte celler i 5 mL PBS og Fjern supernatanten ved centrifugering.
   6. Genopslæmmes celler i 5 mL af celle afsondrethed løsning. Re-indlæse endnu et lag af 5 mL af klare celle isolation løsning til at danne en vandige lag på lag-stakken.
   7. Centrifugeres celle forberedelse på 2012 × g i 10 min. Hent supernatant, som er den lysere tæthed fraktion (< 1.077 g/cm³), for efterfølgende flow flowcytometri analyse.
   8. Tæl antallet af celler med en hemocytometer.
2. Forberedelse af encellede suspensioner: lymfeknude
   1. Følg trin 5.1.1-5.1.2.
   2. Der tilsættes 5 mL af CM ved hjælp af en 10-mL pipette til at suspendere cellerne af pipettering 3 - 4 gange. Efter grundigt at suspendere cellerne, skal du bruge sterile nylon mesh til at filtrere celler til samling i en 15 mL konisk slange.
   3. Spin celler ned ved 646 ×g i 7 min. ved 4 ° C og Fjern supernatanten.
   4. Tilføje en ekstra 5 mL af CM i 10 mL pipette til bedre suspendere cellerne af pipettering.
   5. Vask med PBS og tæller antallet af celler.
3. Flow flowcytometri analyse
   1. Alikvot 0,5-1 × 10⁶ celler i hver fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) tube.
   2. Der centrifugeres ved 646 × g ved 4 ° C i 5 min og Opsug supernatanten.
   3. Tilføj 5 µL af hver fortyndet fluorescens-konjugeret antistof forberedelse til cellerne genopslæmmes celle pellet og vortex.
      Bemærk: Det er vigtigt at beskytte celle toerstoffet fra lys eksponering så meget som muligt, fordi fluorescently mærket antistoffer er lysfølsomt. Generere et antistof master mix og altid tilføje Fc blok.
   4. Forberede FACS buffer ved hjælp af 100 µL af PBS, 1% af varmen-inaktiverede regelmæssig FBS, og 0,1% natriumazid.
   5. Prøven anbringes i røret ved 4 ° C i 30 min. Skyl celler med 2-4 mL af FACS buffer og centrifugeres prøve på 1700 rpm i 7 min. ved 4 ° C.
   6. Genopslæmmes celler i 500 µL af FACS buffer i mørke. Analysere cellerne ved flowcytometri.

Representative Results

For at vurdere relevante injektion ruter af INP til aktivering af lymfatisk væv DC, DC befolkningen som afstamning var defineret som ^-CD11c⁺ celler i milt, iLN og mLN og analyseret udtryk niveauer af co-stimulatory molekyler. Behandling af INP af subkutant (s.c.) og intravenøs (IV) injektion forfremmet betydelige stigninger i CD40, CD80 og CD86 udtryk i milt og iLN DCs (figur 2B og 2 C). Footpad og intraperitoneal (i.p.) injektion af INP også betydeligt op-regulerede udtryk niveauer af CD40, CD80 og CD86 i milt og iLN DCs sammenlignet med i kontrolelementet PBS-behandlede (figur 2B og 2 C). I stimuleret mLN DCs fremmet intranasal (i.n.) injektion af INP de højeste op-regulering af co-stimulatory molekyler i forhold til, i kontrolelementet PBS-behandlede (figur 2D). i.p. og i.v. injektion af INP også induceret markante stigninger i co-stimulatory molekyle udtryk i mLN, mens oral, s.c., og footpad injektion af INP fremkalde ikke aktivering af mLN DCs (figur 2D).

Figur 1 : Placering af intraperitoneal injektion punkt Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2 : Præcis placering af intravenøs injektion Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3 : DC aktivering i lymfatiske organer analyseret ved flowcytometri. C57BL/6 mus blev sprøjtet med INP af seks forskellige injektion ruter og 24 timer efter injektion, milt, iLN og mLN er høstet. (A) DC befolkningen i lymfatisk væv celler blev defineret som lineage ^-CD11c⁺ celler i live leukocytter. (B-D) Udtrykket niveauer af CD40, CD80 og CD86 blev analyseret ved flowcytometri i milten (B), iLN (C) og mLN (D). Data er gennemsnit fra analyser af seks uafhængige prøver. Resultaterne udtrykkes som middel ± standard fejl af middelværdien (SEM). Den statistiske signifikans af forskellene mellem eksperimenterende grupper blev beregnet ved hjælp af variansanalyse med uparret Student's t-test. p-værdier < 0,05 ansås for betydelig. * < 0,05, ** < 0,01. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Mange fremskridt inden for nanoteknologi og Immunologi har opnået gennem terapeutiske forskning medicinafgivelse og immunostimulation. Omhyggelig udvælgelse af injektion metode er kendt for at være vigtige for immunostimulation, som var genstand for den foreliggende undersøgelse.

Forskellige injektion ruter blev evalueret for et naturligt, ikke-giftige og biologisk nedbrydelige DNA-baseret materiale, INP (immunstimulerende nanopartikel), til at bestemme, hvilken rute gav det bedste resultat. Denne tilgang er også relevante for levering andre terapeutiske agenter, herunder antistoffer, antigener eller andre tilsætningsstoffer.

For at analysere immunrespons mod sådanne injektioner, er høst af lymfatisk væv (milt, iLN og mLN) påkrævet. Isolering af lymfatisk væv er den mest afgørende aspekt af denne protokol og krævede anvendelse af en teknik, der ikke er blevet beskrevet tidligere i detaljer. Desuden har udarbejdelse af encellede suspension for yderligere analysere immunceller ikke været godt beskrevet. Denne undersøgelse fokuserer på udvinding af lymfatisk væv, især iLN, mLN og milt, til at analysere DC aktivering. Systemisk aktivering af immunresponset opstod hovedsagelig gennem immunceller i milten. Derudover var immunrespons i den specifikke væv kontrolleret af nærliggende lymfeknuder. Evaluering af nyudviklede immun modulerende molekyler bør gennemføres for at bestemme, om molekylerne kan fremkalde immunstimulering i væv. Derfor, metoden til lymfatisk væv isolation og analyse af DC aktivering i væv kan bruges til nyudviklede immun stimulerende molekyler.

For at evaluere den immun stimulerende effekt af INP, iLN, mLN og milt er høstet og INP blev vist sig at fremme lymfe DC aktivering. Som tidligere bestemt mål INP effektivt TLR9 stimulation i DCs i mus². Makrofager express også cytosole TLR9 i mus. Derfor kan INP injektion fremkalde både DC og makrofag aktivering. Dog bor makrofager i perifere væv, der bidrager til fagocytose af mikrober i vævet. Derudover er antigen-præsentation kapacitet og vandrende effekt af lymfatisk væv af makrofager forholdsvis svagere end i DCs. Derfor var vurdere ruten injektion af INPs den immun-stimulerende effekt egnet til at undersøge DCs i det lymfatiske væv.

Derfor skal tilstanden af immun adjuverende administration betragtes meget omhyggeligt at opnå vellykkede immunterapi og vaccination ved hjælp af bløde materialer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
phosphate buffer saline	Corning	21-040-CVR	Washing organs
(PBS, pH 7.4)
isoflurane solution	Aesica Queenborough limited	26675-46-7	Anesthesia process
Tuberculin 1mL syringe -	Junglim	N/A	Injection
50 mL conical tube	S.P.L	50050	Anesthesia process
1mL Insulin Syringe	(BD Ultra-FineTM­II)_short needle	324826	Intramuscular Injection
DMEM High Glucose	Hyclone	SH30081.01	Storing organs
Histopaque	Sigma-Aldrich	10771	FACS analysis
Ethyl alcohol anhydrous 99.5 %	Daejung	4022-4110	Disinfectant
Equipments
FineCycler C100 (Thermocycler)	Ssufine	-	Anealing
Centrifuge			Centrifuge
FACS tube	FALCON	2052	FACS analysis
Automated High-performance Flow Cytometer	BD (USA), FACSVerse	-	FACS analysis