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Immunology and Infection

Immunostimulantes Agent Evaluation : Lymphoïde tissu Extraction et Injection Route-dépendante des cellules dendritiques Activation

doi: 10.3791/57640 Published: September 16, 2018

Summary

Les procédures expérimentales pour l’extraction ultérieure des tissus lymphatiques pour tester l’activation des cellules dendritiques lymphoïdes sont décrites après traitement d’un nanomatériau immunostimulante.

Abstract

Pour l’évaluation d’un nouvel agent thérapeutique pour l’immunothérapie ou vaccination, il est essentiel d’analyse de l’activation de cellules immunitaires dans les tissus lymphatiques. Ici, nous avons étudié les effets immunologiques d’un immunostimulant roman lipide-ADN sous forme de nanoparticules de voies d’administration différentes chez la souris : orale, par voie nasale, sous-cutanée, coussinet plantaire, intrapéritonéale et par voie intraveineuse. Ces injections influenceront directement la réponse immunitaire et la récolte des tissus lymphatiques et analyse de l’activation des cellules dendritiques (DC) dans les tissus sont des éléments essentiels de ces évaluations. L’extraction des ganglions lymphatiques médiastinaux (mLNs) est important mais assez complexe à cause de la taille et l’emplacement de cet organe. On décrit une méthode progressive pour récolte le ganglion inguinal (iLN), mLN et la rate et l’analyse d’activation DC par cytométrie en flux.

Introduction

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Avancées en immunologie et nanomatériaux ont conduit à une abondance de potentielles nouvelles stratégies thérapeutiques pour les applications en biomédecine, y compris l’immunostimulation et délivrance de médicaments. Optimisation de la voie d’administration est un aspect vital affectant l’efficacité des agents immunostimulantes. Une NANOPARTICULE immunostimulantes (INP) composé de l’ADN est un adjuvant de nano-immunitaire nouvellement développé Self-assemblé microphase séparation à cause de la structure amphiphile de lipide-ADN1. Par conséquent, les protocoles pour INP touchant l’administration du matériel1 in vivo par des voies différentes et trois procédures pour la récolte des tissus appropriés tels que le ganglion inguinal (iLN), médiastinale LN (mLN) et la rate, sont décrit. Enfin, ces tissus ont été analysés pour l’activation des cellules dendritiques (DC), les cellules présentatrices d’antigène plus puissants dans le système immunitaire. Ce protocole peut également être appliqué pour l’évaluation des antigènes, anticorps ou autres adjuvants immunitaires2.

Nous avons testé la formulation de l’INP, parce que c’est un agent qui a montré de grandes promesses. INP est un récepteur Toll-like 9 (TLR9) matériel adjuvant qui contient des acides nucléiques, pour laquelle évaluation d’immunostimulation efficacité est nécessaire pour tester l’injection différentes méthodes3. Dans ce contexte, la stimulation de la DCs est un puissant point de terminaison pour in vivo de l’évaluation. Après que les molécules de l’antigène ou immunostimulantes sont phagocytées par les contrôleurs de domaine dans les tissus périphériques ou le sang, ces cellules migrent vers les organes lymphoïdes comme la rate et le LNs4,5. Ainsi, activation de DC a été analysée dans la rate et iLN mLN des animaux injectées. Correctement la cueillette de ces tissus est donc aussi cruciale pour l’évaluation de la réponse immunitaire à un adjuvant ou agents pathogènes nouveaux5. La récolte de ces tissus est aussi importante pour le développement d’une nouvelle méthodologie immunologique comme une thérapie contre le cancer. En outre, ce protocole peut être utilisé pour vérifier l’efficacité d’autres médicaments, tels que les virus de l’immunodéficience humaine thérapeutique6.

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Protocol

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Toutes les procédures expérimentales, notamment l’isolement de manipulation, le sacrifice et organe animal ont été réalisées en stricte conformité avec les règles de l’International animalier et Comité de l’urbanisme au centre clinique de santé publique de Shanghai et Asan Medical Center. Le protocole de l’étude a été approuvé par les commissions respectives sur l’éthique de l’expérimentation animale au centre clinique de santé publique de Shanghai (numéro de protocole de la souris : SYXK-2010-0098) et Asan Medical Center (2016-02-168).

1. préparation du matériel

Remarque : Un nano-adjuvant, INP, composé d’un transporteur auto-assemblés lipide-ADN, à savoir U4T, et oligonucléotides contenant de motif du CpG, eCpG, était employé dans la présente étude pour tester l’itinéraire approprié injection d’immunothérapie et de la vaccination chez la souris2 . Important, autres molécules thérapeutiques potentiels tels que les antigènes, anticorps et d’agents de traitement adjuvant peuvent être substituées à l’INP et testés selon les mêmes méthodes décrites ci-dessous.

  1. INP formulation2,4,7
    1. Anneal U4T (160 µM, transporteur) avec eCpG (80 µM, qui contient une séquence d’agoniste TLR9) en présence de 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4) et MgCl2 (2 mM). La quantité standard de recuit est entre 50 et 110 µL dans un tube PCR. Porter le mélange à 95 ° C pendant 10 min et ensuite laisser refroidir lentement (1 ° C/16 min) à 25 ° C à l’aide d’un thermocycleur. Le protocole de recuit nécessite environ 2 h.
      ATTENTION : Le liquide contenant du U4T est très mousseux et doit être manipulé avec soin.
    2. Faire 50 µL d’extraits de la préparation de l’INP ; Utilisez 50 µL du matériau pour chaque injection.
      Remarque : Dans le cas de 100 µL par injection, répétez l’étape 1.1 avec le calcul correct des ingrédients.

2. le général Animal procédures

Remarque : Les méthodes alternatives pour la manipulation des souris peuvent être utilisés selon les exigences de laboratoire et les protocoles approuvés d’animaux8. Le type de souris utilisées est souris C57BL/6 et femelles de 6 semaines.

  1. Liste des matériaux
    1. Préparer le liquide anesthésique (isoflurane), machine anesthésique, chambre d’inhalation de dioxyde de carbone (CO2), gaze stérilisée, forceps, drisse de souris, gants, pince crochetée, 1po dissection ciseaux, ciseaux de dissection 2 pouces, alcool pour stérilisation et seringue à insuline.
  2. Inhalant anesthésie
    Remarque : L’anesthésie est obligatoire pour intranasale, sous-cutanée, coussinet plantaire et des injections intraveineuses de souris9. Une chambre à induction avec un réservoir de machine et de l’oxygène vaporisateur connecté est utilisée pour cette procédure.
    1. Placer l’animal dans la chambre de l’induction et assurez-vous de bien fermer le couvercle.
    2. Flux de l’oxygène à 1 L/min et réglez le vaporisateur à un niveau d’induction de 4 % pour l’isoflurane.
    3. Varier la durée d’exposition des animaux dans la chambre selon le poids de l’animal ; Cependant, plus de 10 s d’exposition et de surveiller toutes les 5 min est nécessaire pour l’anesthésie,10.
      Remarque : Aucun réflexe pédale n’indique anesthésie réussie.
    4. Mettez hors tension de l’inducteur de l’isoflurane et débit 1 L/min d’oxygène pour prévenir l’exposition du personnel au gaz isoflurane.
  3. Sacrifice
    1. Préparer une chambre pour le CO2 inhalation sacrifice selon le NIH « lignes directrices pour l’euthanasie de rongeurs à l’aide de dioxyde de carbone »11.
  4. Réponse de gag test pour confirmer que l’animal soit entièrement sacrifiée.
    1. Vérifiez que la souris est correctement sacrifiée en pinçant le bout de son pied et ne confirmant aucune réponse du gag. S’il y a une réponse, répétez l’étape 2.2.
  5. Désinfection
    1. Désinfecter toutes les surfaces utilisées pour les injections ou les dissections avec pulvérisation d’alcool et de gaze stérilisée.
  6. Stockage de l’orgue
    1. Forceps permet de supprimer tous les gras et le sang qui entoure les organes récoltés. Stocker ces tissus récoltées individuellement dans une boîte de Pétri contenant 3 mL de PBS. Le conteneur et les médias peuvent différer selon les exigences de la procédure ultérieure.

3. injection itinéraires

  1. Utilisez les méthodes de six injection pour étudier les réponses immunitaires dépendantes injection : par voie orale, par voie nasale, sous-cutanée, coussinet plantaire, intrapéritonéale et par voie intraveineuse8,12,13.

4. isolement des ganglions lymphatiques et la rate

Remarque : Utilisez la souris maigres jeunes et en bonne santés (âgés de 6 semaines) pour ces procédures car les graisses qui s’accumulent généralement dans les ganglions lymphatiques chez les souris âgées sont difficiles à enlever et peut empêcher la bonne visualisation de l’orgue.

  1. Récolte des étapes
    Remarque : Cette section décrit la récolte après l’injection de l’iLN, rate et mLN des souris pour analyser la stimulation immunitaire. Se référer aux étapes 2,3 à 2,5 pour le sacrifice, bâillonner la réponse et les méthodes de désinfection.
    1. Épingler les membres de la souris sur le panneau isolant chirurgicale et stériliser la face ventrale de la souris avec l’éthanol à 70 %.
    2. Choisir un emplacement 2 cm au-dessus de la zone génitale et pinces à usage accroché à tirer vers le haut de la couverture de l’épiderme comme une tente. Faire une coupe d’environ 1 cm à cet endroit et faire glisser les ciseaux (2 po) sous la peau, faire de nouvelles coupures de dissection.
    3. Pour le tégument, couper verticalement à travers l’épiderme avec les deux bras des ciseaux (2 pouces). Exposer les organes internes recouverts de péritoine.
    4. Épinglez la couche externe de la peau.
  2. Isolement du ganglion inguinal (iLN)
    1. Localiser l’iLN sur le côté gauche de la jambe suite à la conjonction du vaisseau sanguin dans la jambe gauche, qui apparaît comme une lettre inclinée « Y ».
      Remarque : Pour les souris injectées par voie sous-cutanée, choisissez un iLN du même côté de l’emplacement de l’injection.
    2. Découvrir la couche avec deux pinces pour déchirer la couche lipidique couverte et récolter l’iLN jaune pâle (forme de haricot, 2 mm). Pour un traitement ultérieur et le stockage du tissu, reportez-vous à l’étape 2.6.
  3. Isolement de la rate 14
    1. Faire une tente au centre du péritoine avec accroché des pinces dans une main et utiliser petite mince ciseaux (1 pouce) dans l’autre main pour couper le péritoine.
    2. Pinces à usage accroché dans la main gauche pour saisir l’intestin et retournez-le pour localiser la rate de type haricot rouge (longueur d’environ 14 mm) attachée à la partie supérieure gauche de l’abdomen de la souris.
    3. Retirez doucement la rate avec un autre ensemble de pinces dans la main droite tout en détachant des autres organes avec la pince crochetée. Suivez l’étape 2.6 pour stocker la rate.
      Remarque : Des soins sont nécessaire lorsqu’ils pêchent la rate, car c’est un organe mou facilement endommagé.
  4. Isolement du ganglion médiastinal (mLN)
    Remarque : Le mLN est situé à environ 1 cm sous les côtes et est couvert par d’autres organes comme le cœur et les poumons. En raison de son emplacement et de petite taille, il est important d’exposer avec soin les environs à l’aide de pinces et ciseaux (1 pouce).
    1. Couper le diaphragme et séparez-le de la membrure. Maintenir le corps des côtes avec une pince et puis couper les côtés gauche et droit des côtes avec des ciseaux (1 pouce). Epinglez les nervures coupure sur l’épaule de la souris sur le droit d’exposer le cœur et les poumons.
      Remarque : prendre soin de ne pas pour couper tout les vaisseaux sanguins autour du cœur et des poumons, comme une fuite de sang le rend très difficile de localiser le minuscule mLN translucide. Si les vaisseaux sanguins sont coupés, doucement absorber le sang dans la zone avec de la gaze.
    2. Avec une pincette crochetés à la main droite, mettez le cœur et les poumons doucement vers la droite jusqu'à ce que l’épine dorsale est exposée. Utilisez une paire de pinces régulières dans la main gauche pour supprimer l’iLN avec la pince crochetée à la main droite pour aider à cette récolte.
    3. Saisir les poumons et les retourner jusqu'à ce que l’épine dorsale est largement exposée. Le mLN (une structure translucide en forme de haricot d’environ 2 mm de taille) est situé entre les poumons et la colonne vertébrale.
    4. Utiliser la pince crochetée pour exposer la zone autour de la millions de francs et l’autre pince pour extraire le tissu.
      Remarque : Le mLN est entouré de nombreux autres tissus qui doivent être enlevés soigneusement avec une pince avant la récolte.
    5. Voir l’étape 2.7 pour obtenir des instructions sur le stockage les millions de francs récoltées.

5. préparation des échantillons pour la cytométrie en flux

Remarque : Pour doser l’activation des contrôleurs de domaine dans l’iLN récolté, rate et mLN, des suspensions de cellules individuelles de ces tissus sont colorées avec des anticorps conjugués fluorescence comme marqueurs spécifiques à DC, les molécules de costimulation et majeur d’histocompatibilité complexes molécules et analysés par cytométrie en flux.

  1. Préparation de suspensions unicellulaires : rate
    1. Ajouter 5 mL de milieu de culture frais (CM) en 6 mm boîte de Petri et placer les échantillons sur la glace.
    2. Enlever les tissus environnants de sang et de la graisse et placer le tissu dans le couvercle de la boîte de Pétri.
    3. Couper les tissus en petits fragments (< 1 mm) avec des ciseaux courbes. Suspendre les fragments dans du PBS suivie de filer vers le bas le tissu à l’aide d’une centrifugeuse à 646 × g pendant 5 min et éliminer le surnageant.
    4. Suspendre les échantillons à nouveau dans 3 mL de CM et de digérer les fragments avec 200 µL de solution de 2 % sérum bovin fœtal (SVF) additionné de collagénase IV pendant 20 min.
    5. Agiter doucement et incuber les échantillons à 37 ° C pendant 1 h. filtrez les tissus digérés par l’intermédiaire de maille en nylon (100 nm) et tournez en bas. Laver les cellules individuelles dans 5 mL de PBS et éliminer le surnageant par centrifugation.
    6. Remettre en suspension les cellules dans 5 mL de solution d’isolement de cellules. Re-charger une autre couche de 5 mL de solution d’isolation de cellules claires pour former une pile de couche par couche aqueuse.
    7. Centrifuger la préparation de cellules à 2012 × g pendant 10 min. obtenir le surnageant, qui est la fraction de densité plus léger (< 1,077 g/cm3), pour analyse en cytométrie en flux ultérieurs.
    8. Compter le nombre de cellules avec un hémocytomètre.
  2. Préparation de suspensions unicellulaires : ganglion lymphatique
    1. Suivez l’étape 5.1.1-5.1.2.
    2. Ajouter 5 mL de CM en utilisant une pipette 10 mL de suspendre les cellules en pipettant également, 3 - 4 fois. Après avoir soigneusement suspendant les cellules, utilisez maille en nylon stérile pour filtrer les cellules pour la collecte dans un tube conique de 15 mL.
    3. Faites tourner les cellules vers le bas à 646 ×g pendant 7 min à 4 ° C et éliminer le surnageant.
    4. Ajouter 5 mL supplémentaire de CM en pipette 10 mL de mieux suspendre les cellules de pipetage.
    5. Laver avec du PBS et compter le nombre de cellules.
  3. Analyse en cytométrie en flux
    1. Aliquote de 0,5 à 1 × 106 cellules dans chaque cellule activée par fluorescence tri tube (FACS).
    2. Centrifuger à 646 × g à 4 ° C pendant 5 min et aspirer le surnageant.
    3. Ajouter 5 µL de chaque dilution conjugué fluorescence préparation d’anticorps aux cellules à remettre en suspension le culot cellulaire et vortex.
      Remarque : Il est important de protéger le culot cellulaire de l’exposition à la lumière autant que possible parce que les anticorps fluorescent étiquetés sont sensibles à la lumière. Générer un mélange maître anticorps et toujours ajouter le bloc Fc.
    4. Préparer le tampon de FACS avec 100 µL de PBS, 1 % de FBS régulière inactivés par la chaleur et 0,1 % d’azide de sodium.
    5. Placer l’échantillon dans le tube à 4 ° C pendant 30 min. Rincer les cellules avec 2 à 4 mL de FACS tampon et centrifuger l’échantillon à 1700 tr/min à 7 min à 4 ° C.
    6. Remettre en suspension les cellules de 500 µL de tampon de FACS dans l’obscurité. Analyser les cellules par cytométrie en flux.

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Representative Results

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Afin d’évaluer les itinéraires d’injection appropriée de l’INP pour l’activation du tissu lymphatique DC, la population de DC comme lignée a été définie comme CD11c+ des cellules de la rate et iLN mLN et analysé les niveaux d’expression des molécules de costimulation. Traitement de l’INP en sous-cutanée (s.c.) et l’injection par voie intraveineuse (i.v.) fait la promotion des augmentations substantielles dans l’expression de CD40, CD80 et CD86 dans la rate et iLN DCs (Figure 2 b et 2C). Coussinet plantaire et injection intrapéritonéale (i.p.) de l’INP également considérablement régulée que les niveaux d’expression de CD40, CD80 et CD86 dans la rate et iLN DCs comparativement à dans le témoin PBS (Figure 2 b et 2C). En mLN stimulée DCs, injection par voie nasale (i.n.) de l’INP a promu le plus élevé vers le haut-règlement des molécules de costimulation comparée à celle dans le témoin PBS (Figure 2D). une injection i.p. et i.v. de l’INP a également provoqué une hausse marquée dans l’expression des molécules de costimulation dans les millions de francs, tandis que de l’oral, s.c., et injection de coussinet plantaire de l’INP n’induit pas d’activation du mLN DCs (Figure 2D).

Figure 1
Figure 1 : Emplacement du point d’injection intrapéritonéale de S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Localisation précise de l’injection intraveineuse de S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Activation de DC dans les organes lymphatiques analysés par cytométrie en flux. Des souris C57BL/6 ont été injectés avec INP par six parcours différents injection et 24 h après que l’injection, la rate, iLN et millions de francs ont été récoltés. (A) la population de DC dans les cellules de tissu lymphatique a été définie comme CD11c du lignage + des cellules dans les leucocytes direct. (B-D) Les niveaux d’expression de CD40, CD80 et CD86 ont été analysés par cytométrie en flux dans la rate (B), iLN (C) et le mLN (D). Données sont des moyennes des analyses d’échantillons indépendants six. Les résultats sont exprimés comme le moyen ± erreur-type de la moyenne (SEM). La signification statistique des différences entre les groupes expérimentaux a été calculée à l’aide de l’analyse de variance avec de l’étudiant non-appariés t-test. valeurs p < 0,05 ont été considérés comme significatifs. * < 0,05, ** < 0,01. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

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Nombreuses avancées en nanotechnologie et en immunologie ont été obtenues par le biais de la recherche thérapeutique de l’administration de médicaments et d’immunostimulation. Une sélection rigoureuse de la méthode d’injection est connue pour être importante pour l’immunostimulation, qui a fait l’objet de la présente étude.

Itinéraires d’injection différentes ont été évalués pour un naturellement non toxiques et biodégradable basées sur l’ADN matériel, INP (immunostimulantes nanoparticules), afin de déterminer quel itinéraire ont donné les meilleurs résultats. Cette approche est également pertinente pour administrer des autres agents thérapeutiques notamment les anticorps, antigènes ou autres adjuvants.

Pour analyser la réponse immunitaire à ces injections, récolte de tissu lymphatique (rate, iLN et mLN) est requise. Isolement des tissus lymphatiques est l’aspect le plus crucial du présent protocole et exige l’utilisation d’une technique qui n’a pas été précédemment décrite en détail. En outre, la préparation de la suspension de cellules individuelles pour analyser les cellules immunitaires n’a pas été bien décrite. Cette étude s’est concentrée sur l’extraction des tissus lymphatiques, en particulier l’iLN, mLN et la rate, pour analyser l’activation DC. Activation systémique de la réponse immunitaire est produite principalement par l’intermédiaire de cellules immunitaires dans la rate. En outre, les réponses immunitaires dans les tissus spécifiques étaient contrôlés par les ganglions lymphatiques avoisinants. Évaluation des molécules modulatrices immunitaires nouvellement mis au point se fasse afin de déterminer si les molécules peuvent induire une stimulation immunitaire dans les tissus. Par conséquent, la méthode pour isoler le tissu lymphatique et l’analyse d’activation DC dans les tissus peut être utilisée pour des molécules stimulants immunitaires nouvellement mis au point.

Pour évaluer l’effet stimulant immunitaire de l’INP, l’iLN, mLN et la rate ont été récoltés et INP s’est avéré favorisent l’activation de DC lymphatique. Comme établi précédemment, INP cible efficacement TLR9 stimulation dans les PVD à souris2. Les macrophages expriment aussi TLR9 cytosolique chez la souris. Par conséquent, injection INP peut induire l’activation de DC et de macrophages. Toutefois, les macrophages résident dans les tissus périphériques qui contribuent à la phagocytose des microbes dans les tissus. En outre, la capacité d’antigène-présentation et l’effet migrateur au tissu lymphatique des macrophages sont comparativement plus faibles que celles dans les PVD. Par conséquent, évaluer l’itinéraire de l’injection de l’INPs pour l’effet stimulant immunitaire était approprié pour l’examen des contrôleurs de domaine dans le tissu lymphatique.

Par conséquent, le mode d’administration de l’adjuvant immunitaire doit être très soigneusement considéré atteindre immunothérapie réussie et vaccination utilisatrices de matériaux souples.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Cette recherche a été financée par le programme de découverte de matériaux créatifs grâce à la Fondation de la recherche nationale de Corée (NRF) financé par le ministère de la Science, les TIC et les futur Planning (FRO-2017M3D1A1039421) et par programme de biotechnologie Marine, financé par le Ministère des Océans et pêches, République de Corée et une subvention (20150220).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
phosphate buffer saline Corning 21-040-CVR Washing organs
(PBS, pH 7.4)
isoflurane solution  Aesica Queenborough limited 26675-46-7 Anesthesia process
Tuberculin 1mL syringe - Junglim N/A Injection
50 mL conical tube  S.P.L 50050 Anesthesia process
1mL Insulin Syringe  (BD Ultra-FineTM­II)_short needle 324826 Intramuscular Injection
DMEM High Glucose Hyclone SH30081.01 Storing organs
Histopaque  Sigma-Aldrich 10771 FACS analysis
Ethyl alcohol anhydrous 99.5 %  Daejung 4022-4110 Disinfectant
Equipments
FineCycler C100 (Thermocycler) Ssufine - Anealing
Centrifuge Centrifuge
FACS tube  FALCON 2052 FACS analysis
Automated High-performance Flow Cytometer BD (USA), FACSVerse - FACS analysis

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References

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Jin, J. O., Jang, S., Kim, H., Oh, J., Shim, S., Kwak, M., Lee, P. C. W. Immunostimulatory Agent Evaluation: Lymphoid Tissue Extraction and Injection Route-Dependent Dendritic Cell Activation. J. Vis. Exp. (139), e57640, doi:10.3791/57640 (2018).More

Jin, J. O., Jang, S., Kim, H., Oh, J., Shim, S., Kwak, M., Lee, P. C. W. Immunostimulatory Agent Evaluation: Lymphoid Tissue Extraction and Injection Route-Dependent Dendritic Cell Activation. J. Vis. Exp. (139), e57640, doi:10.3791/57640 (2018).

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