Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Immunostimulatory הסוכן הערכה: הלימפה רקמות החילוץ, הזרקת תא דנדריטי תלויי-נתיב ההפעלה

doi: 10.3791/57640 Published: September 16, 2018

Summary

ניסיוני נהלי מיצוי הבאים של רקמות הלימפה כדי לבדוק את הפעלת תא דנדריטי הלימפה מתוארים לאחר טיפול nanomaterial immunostimulating.

Abstract

להערכה של סוכן טיפולית חדשה חיסוני או חיסון, ניתוח של הפעלת תא החיסון ברקמות לימפתי הוא חיוני. כאן, חקרנו אימונולוגי השפעות immunostimulant שומנים בדם הרומן-DNA בצורת ננו-חלקיק של נתיבי ממשל שונים העכבר: אוראלי, תוך-אפי, תת עורית, לו טביעות רגל, בקרום הבטן, תוך ורידי. זריקות אלה ישפיעו באופן ישיר את התגובה החיסונית, ולוקחים ברקמות לימפתי, ניתוח של הפעלת תא דנדריטי (DC) ברקמות מכריע חלקי בהערכות. החילוץ של בלוטות הלימפה mediastinal (mLNs) היא חשובה אבל מורכב למדי הגודל והמיקום של איבר זה. מתואר הליך stepwise קציר את הצומת לימפה במפשעה (iLN), mLN, טחול וניתוח DC הפעלה על ידי cytometry זרימה.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ההתקדמות אימונולוגיה ו ננו הובילו שפע של פוטנציאל אסטרטגיות טיפוליות חדשות עבור יישומים וההתערבות, כולל משלוח סמים immunostimulation. אופטימיזציה של המסלול המינהל הוא היבט חיוני המשפיעים על היעילות של סוכנים immunostimulatory. Nanoparticle immunostimulatory (INP) בהיקף של ה-DNA הוא אדג'וונט ננו-החיסון פיתח עצמית נאספו על ידי הפרדה microphase בגלל המבנה amphiphilic של השומנים-DNA1. לכן, פרוטוקולים עבור INP מעורבים הניהול של ה גשמי1 ויוו דרך מסלולים שונים, שלושה הליכים על קצירת רקמות המתאימים כגון הצומת לימפה במפשעה (iLN), mediastinal LN (mLN), טחול, הם תיאר. לבסוף, רקמות אלו נותחו עבור הפעלת תא דנדריטי (DC), התאים אנטיגן החזקים ביותר במערכת החיסונית. פרוטוקול זה גם יכול להיות מיושם להערכת אנטיגנים, נוגדנים או אחרים adjuvants המערכת החיסונית2.

בדקנו את ניסוח INP כי הוא סוכן הראו הבטחה גדולה. INP הוא קולטן דמוי אגרה 9 (TLR9) חומר אדג'וונט המכיל חומצות גרעין, עבור איזו הערכה של immunostimulation יעילות נדרש לבדוק שיטות הזרקה שונים3. בהקשר זה, הגירוי של Dc הוא נקודת קצה של עוצמה להערכת ויוו . לאחר מולקולות של אנטיגן או immunostimulatory הם phagocytosed על-ידי בקרי רקמות היקפיים או דם, תאים אלה נודדים לאיברים הלימפה כגון הטחול ואת שירותי ההגירה4,5. לפיכך, DC הפעלה נותחו בטחול, iLN, ו mLN של החיות מוזרק. כראוי קצירת רקמות אלו לכן חיוני גם להערכת התגובה החיסונית הרומן אדג'וונט או פתוגנים5. קצירת רקמות כאלה חשוב גם לפיתוח מתודולוגיה הרומן אימונולוגי כטיפול בסרטן. יתר על כן, פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לאמת את היעילות של תרופות אחרות, כגון כשל חיסוני האנטי-האדם וירוס הרפוי6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כל ההליכים ניסיוני כולל בידוד טיפול הקרבה, איברים בעלי חיים בוצעו בהתאמה קפדנית עם החוקים של טיפול בעלי חיים הבינלאומי, שימוש ועדת בריאות הציבור שנגחאי מרכז קלינית, המרכז הרפואי אסאן. פרוטוקול המחקר אושרה על ידי ועדות בהתאמה על אתיקה לניסויים בבעלי חיים במרכז הקליני של בריאות הציבור שנגחאי (מספר פרוטוקול העכבר: SYXK-2010-0098) ואת המרכז הרפואי אסאן (2016-02-168).

1. הכנת חומר

הערה: ננו אדג'וונט, INP, המורכב נשאית השומנים שהורכב עצמית-DNA, כלומר U4T, ואת מוטיב CpG המכיל oligonucleotide, eCpG, הועסק במחקר הנוכחי כדי לבדוק את המסלול המתאים הזרקת חיסוני, החיסון בעכברים2 . חשוב, מולקולות טיפולית פוטנציאליות אחרות כגון אנטיגנים, נוגדנים אדג'וונט סוכנים. הרבה מכדי INP ובדק באמצעות המתודולוגיה באותו המתוארים להלן.

  1. INP ניסוח2,4,7
    1. Anneal U4T (160 מיקרומטר, מנשא) עם eCpG (80 מיקרומטר, המכיל רצף אגוניסט TLR9) בנוכחות 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS, pH 7.4) ו- MgCl2 (2 מ מ). אמצעי האחסון סטנדרטי עבור חישול הוא בין 50 ו 110 µL בשפופרת PCR. מחממים את התערובת עד 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ואז לאט לאט מגניב (1 ° C של 16 דקות) עד 25 ° C באמצעות thermocycler. פרוטוקול מחזק דורש כ 2 h.
      התראה: הנוזל המכיל U4T רכה מאוד, יש לטפל בזהירות.
    2. להפוך את aliquots 50 µL התכשיר INP; השתמש µL 50 של החומר עבור כל זריקה.
      הערה: במקרה של µL 100 לכל זריקה, חזור על שלב 1.1 ןובשחב נאותה של מרכיבים.

2. כללי חיה נהלים

הערה: שיטות חלופיות לטיפול העכברים יכול לשמש בהתאם לדרישות מעבדה שאושרו פרוטוקולים בעלי חיים8. הסוג של עכברים בשימוש הוא בן שבוע 6 C57BL/6 ונקבה עכברים.

  1. רשימת חומרים
    1. להכין את נוזלי הרדמה (איזופלוריין), מכונת הרדמה, הקאמרית שאיפת פחמן דו-חמצני (CO2), גזה מעוקר, מלקחיים, העכבר restrainer, כפפות, מלקחיים מכור, 1 אינץ ויבתר מספריים, מספריים ויבתר 2 אינץ, אלכוהול עבור עיקור, מזרק אינסולין.
  2. הרדמה נשימתית
    הערה: הרדמה מוגדרת כחובה עבור לו טביעות רגל תוך-אפי, תת עורית, ולאחר זריקות תוך ורידי של עכברים9. תא אינדוקציה עם מכשיר אידוי מכונת וחמצן טנק מחובר משמש עבור הליך זה.
    1. מקם את החיה בבית הבליעה אינדוקציה וודא לסגור בחוזקה את המכסה.
    2. זרימת החמצן ב- 1 ליטר/דקה ולהגדיר את הגדרת מכשיר אידוי רמה אינדוקציה של 4% עבור איזופלוריין.
    3. משתנים את זמן החשיפה של חיות בבית הבליעה תלוי משקל בעלי חיים; עם זאת, יותר מ- 10 s של חשיפה ומעקב אחר כל 5 דקות יש צורך בהרדמה10.
      הערה: אין רפלקס פדלים מציינת הרדמה מוצלחת.
    4. כבה את סליל השראה איזופלוריין ואת זרימה 1 ליטר/דקה של חמצן כדי למנוע חשיפה אנשי איזופלוריין גז.
  3. הקרבה
    1. להכין תא CO2 שאיפת הקרבה בהתאם NIH "קווים מנחים עבור המתת חסד של מכרסמים באמצעות פחמן דו-חמצני"11.
  4. מבחן תגובת הבחילה לאשר כי החיה מוקרבת באופן מלא.
    1. ודא כי העכבר מוקרבת כראוי על ידי צובט את קצה הרגל שלו ולאשר את תגובת הבחילה. לא. אם יש היענות, חזור על שלב 2.2.
  5. חיטוי
    1. לחטא את כל פני שטחים המשמשים זריקות או ניתוח עם אלכוהול ספריי, גזה מעוקר.
  6. אחסון איברים
    1. להשתמש מלקחיים כדי להסיר כל הדם המקיפים את האיברים שנקטפו ושומן. לאחסן את רקמות שנקטפו אלה בנפרד צלחת פטרי עם 3 מ"ל של PBS. המכולה והידיעות media עשויות להשתנות בהתאם לדרישות נוהל עוקבות.

3. הזרקת מסלולים

  1. השתמש באחת מהשיטות הזרקת שישה לחקור תלויי-הזרקת החיסון תגובות: אוראלי, תוך-אפי, תת עורית, לו טביעות רגל, בקרום הבטן, ו-12,תוך ורידי8,13.

4. בידוד של הלימפה והטחול

הערה: השתמש עכברים רזה, צעיר ובריא (בן 6 שבועות) על הליכים אלה כי שומנים כי בדרך כלל לבנות סביב בלוטות הלימפה בעכברים בוגרים שקשה להסיר ולמנוע נאות ויזואליזציה של האיבר.

  1. מראש קציר צעדים
    הערה: סעיף זה מתאר מהקצירה שלאחר הזרקה של iLN, טחול, mLN של עכברים לניתוח גירוי המערכת החיסונית. עיין צעדים 2.3-2.5 על ההקרבה, מחסום פה תגובה ושיטות חיטוי.
    1. להצמיד את הגפיים של העכבר ללוח קצף כירורגי, לעקר את הצד הבטני של העכבר עם 70% אתנול.
    2. לבחור מיקום 2 ס מ מעל האזור הגניטלי של שימוש מכור מלקחיים להרים את מכסה העור החיצוני כמו אוהל. עושים חתך כ 1 ס"מ במיקום זה והחלק את המספריים (2 אינץ ') מתחת לעור, בהמשך מקצצים לנתיחה.
    3. עבור בעור, חתך אנכי דרך העור החיצוני עם שתי הזרועות של המספריים (2 אינץ '). חושפים את האיברים הפנימיים מכוסות צפק.
    4. להצמיד את השכבה החיצונית של העור.
  2. בידוד של הצומת לימפה במפשעה (iLN)
    1. אתר את iLN על הצד השמאלי של הרגל בעקבות המפגש של כלי הדם יורד הרגל השמאלית, אשר מופיע מכתב מוטה 'Y'.
      הערה: עבור עכברים subcutaneously מוזרק, לבחור iLN באותו הצד של המיקום הזרקה.
    2. לחשוף את שכבת עם מלקחיים שני כדי לקרוע את השומנים המכוסה שכבת ולקצור את iLN צהוב חיוור (צורת שעועית, 2 מ מ). לאחר מכן טיפול ואחסון של הרקמה, ראה שלב 2.6.
  3. בידוד של הטחול 14
    1. הופכים את אוהל במרכז הצפק באמצעות מכור מלקחיים ביד אחת ולהשתמש קטן דק מספריים (1 אינץ ') וביד השנייה לחתוך את הצפק.
    2. שימוש מכור מלקחיים ביד שמאל תופסים את המעי, הפוך את זה לאתר את הטחול, כמו שעועית אדומה (באורך של-14 מ מ) מחוברת בצד השמאלי העליון של הבטן העכבר.
    3. משוך בעדינות את הטחול עם עוד זוג מלקחיים ביד ימין תוך ניתוק איברים אחרים עם המלקחיים מכור. בצע את שלב 2.6 כדי לאחסן את הטחול.
      הערה: טיפול נדרש כאשר קצירת הטחול, כפי שהוא איבר רך פגום בקלות.
  4. בידוד של הצומת לימפה mediastinal (mLN)
    הערה: mLN הוא ממוקם כ 1 ס מ מתחת לצלעות, מכוסה על ידי איברים אחרים כגון הלב והריאות. בגלל מיקומו וגודלו קטן, חשוב לחשוף בקפידה את האזור שמסביב באמצעות מלקחיים ומספריים (1 אינץ ').
    1. לחתוך את הסרעפת תוך הפרדתה של הצלעות. . תחזיק את גופתו של הצלעות עם מלקחיים ולאחר מכן לחתוך את שמאל ואת צד ימין של הצלעות עם מספריים (1 אינץ '). להצמיד את הצלעות הקיצוץ לכתף של העכבר בצד ימין כדי לחשוף את הלב והריאות.
      הערה: הקפידו לא חותך יותר של כלי הדם סביב הלב והריאות, כמו ליזול דם מקשה מאוד לאתר את mLN שקוף זעירים. אם כל כלי הדם נחתכים, בעדינות לספוג את הדם באזור עם גזה.
    2. באמצעות מלקחיים מכור ביד ימין, סובב את הלב והריאות בעדינות ימינה עד עמוד השדרה חשוף. השתמש זוג מלקחיים רגיל ביד שמאל כדי להסיר את iLN עם המלקחיים מכור בכף יד ימין כדי לסייע עם זה קציר.
    3. . תפוס את הריאות, לסובב אותם עד עמוד השדרה חשוף באופן נרחב. MLN (שקוף שעועית בצורת מבנה בשטח של-2 מ מ בגודל) הינו ממוקם בין הריאות ואת עמוד השדרה.
    4. לנצל את המלקחיים מכור לחשוף את האזור סביב mLN ומלקחיים אחרים כדי לחלץ את הרקמה.
      הערה: mLN מוקף על ידי רקמות רבות אחרות אשר יש להסיר בזהירות עם מלקחיים לפני הקטיף.
    5. ראה שלב 2.7 לקבלת הוראות על אחסון של mLN שנקטפו.

5. הכנה של דגימות דנ

הערה: כדי assay את ההפעלה של בקרי קבוצת מחשבים iLN שנקטפו, בטחול, ו mLN, תא בודד השעיות של רקמות אלה מוכתמים מצומדת פלורסצנטיות נוגדנים ספציפיים DC סמנים, מולקולות co-stimulatory, וכן histocompatibility הגדולות מורכבות מולקולות, נותחו על ידי cytometry זרימה.

  1. הכנה של המתלים תא בודד: הטחול
    1. הוסף 5 מ של תרבות טרי בינוני (ס מ) לתוך צלחת תרבות 6 מ מ ומניחים את הדוגמאות על קרח.
    2. הסרת הרקמות הסובבות דם ושומן ולמקם את הרקמה המכסה של המנה תרבות.
    3. לחתוך את הרקמות לחלקים קטנים (< 1 מ"מ) עם מספריים מעוגלים. להשעות את השברים ב- PBS ואחריו ספינינג למטה הרקמה באמצעות צנטריפוגה ב 646 × g עבור 5 דקות והסרה של תגובת שיקוע.
    4. להשעות את הדגימות שוב ב- 3 מ"ל של ס מ ולעכל את השברים עם 200 µL של פתרון של 2% עוברית שור סרום (FBS) בתוספת collagenase הרביעי במשך 20 דקות.
    5. בעדינות שייק אנד דגירה המדגם ב 37 ° C עבור ה 1 לסנן את רקמות מתעכל דרך רשת ניילון (100 ננומטר) ולסובב אותם למטה. לשטוף את התאים ב 5 מ של PBS ולהסיר את תגובת שיקוע על ידי צנטריפוגה.
    6. מחדש להשעות התאים 5 מ של תא בידוד פתרון. לטעון מחדש שכבה נוספת של 5 מ של התא ברורה פתרון בידוד כדי ליצור אוסף שכבה אחרי שכבה מימית.
    7. Centrifuge תא ההכנה ב 2012 × g 10 דקות קבל תגובת שיקוע, שהינו השבר צפיפות בהיר (< 1.077 גרם/ס"מ3), לצורך ניתוח cytometry זרימה עוקבות.
    8. לספור את מספר תאים עם hemocytometer.
  2. הכנה של המתלים תא בודד: בלוטת לימפה
    1. בצע את שלב 5.1.1-5.1.2.
    2. הוסף 5 מ של ס מ באמצעות pipet 10-mL להשעות את התאים על ידי pipetting 3 - 4 פעמים. לאחר ביסודיות השעיית התאים, להשתמש רשת ניילון סטרילי כדי לסנן את התאים עבור אוסף צינור חרוטי 15-mL.
    3. ספין של התאים למטה ב × 646g למשך 7 דקות ב 4 ° C ולהסיר את תגובת שיקוע.
    4. הוסף אוטם נוספים 5 ס מ לתוך 10-mL pipet כדאי להשהות את התאים על ידי pipetting.
    5. לשטוף עם PBS, לספור את מספר התאים.
  3. ניתוח cytometry זרימה
    1. Aliquot 0.5-1 × 106 תאים לתוך כל תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) שפופרת.
    2. צנטריפוגה-× 646 g ב- 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, וארוקן את תגובת שיקוע.
    3. להוסיף 5 הכנה נוגדן µL של כל אחד מדולל מצומדת פלורסצנטיות התאים להשעות מחדש את התא צניפה ואת מערבולת.
      הערה: חשוב להתגונן בגדר תא מחשיפה קל ככל האפשר. בגלל נוגדנים fluorescently שכותרתו הם רגישים לאור. ליצור תערובת בסיס נוגדן, תמיד להוסיף בלוק Fc.
    4. להכין מאגר FACS באמצעות µL 100 ל- PBS, 1% FBS רגיל חום-לא פעיל, אזיד הנתרן 0.1%.
    5. מקם את הדגימה בצינור ב 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות יש לשטוף התאים עם 2-4 מיליליטר FACS מאגר ו centrifuge המדגם-1700 סל ד במשך 7 דקות ב 4 º C.
    6. מחדש להשעות התאים µL 500 FACS מאגר בחושך. לנתח את התאים על ידי cytometry זרימה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כדי להעריך את נתיבי הזרקת המתאים של INP להפעלה ברקמות לימפתי DC, האוכלוסייה DC שושלת היוחסין מוגדר כ- CD11c+ תאים בטחול, iLN, ו mLN, ניתח את רמות הביטוי של מולקולות co-stimulatory. טיפול INP תת עורית (ש), הזרקה תוך ורידית (עירוי) קידם מגביר משמעותית בביטוי CD40, CD80 ו- CD86 ב- Dc הטחול ואת iLN (איור 2B ו- 2 C). לו טביעות רגל, בקרום הבטן (i.p.) הזרקה של INP גם במידה ניכרת למעלה מוסדר שרמות ביטוי CD40, CD80 ו- CD86 ב- Dc הטחול ואת iLN בהשוואה בפקד שטופלו PBS (איור 2B ו 2 C). ב mLN מגורה DCs, הזרקה תוך-אפי (i.n.) של INP בדרגה הגבוהה למעלה-ויסות מולקולות co-stimulatory בהשוואה לזה של הפקד שטופלו PBS (איור דו-ממדי). הזרקה i.p. , עירוי של INP המושרה גם עליות מסומן בביטוי מולקולה co-stimulatory mLN, תוך כדי, אוראלי, ספורטינג, הזרקת לו טביעות רגל INP אל תגרום / הפעלה של mLN בקרי קבוצת מחשבים (איור דו-ממדי).

Figure 1
איור 1 : מיקום של נקודת זריקה בקרום הבטן אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : מיקום מדויק לעירוי הזרקה אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : DC הפעלה באיברים הלימפה נותחו על ידי cytometry זרימה. עכברים C57BL/6 הוזרקו INP על ידי שישה מסלולים שונים זריקה ו- 24 שעות לאחר ההזרקה, הטחול, iLN, mLN נבצרו. (א) האוכלוסייה DC בתאי רקמת הלימפה הוגדר השושלת CD11c+ תאי לויקוציטים בשידור חי. (B-D) רמות ביטוי CD40, CD80 ו- CD86 נותחו על ידי cytometry זרימה בטחול (B), iLN (ג), ו mLN (D). הנתונים הם ממוצעים מן הניתוחים של ששת המדגמים עצמאית. תוצאות מבוטא באמצעים ± שגיאת התקן של הממוצע (SEM). מובהקות סטטיסטית של ההבדלים בין קבוצות הניסוי מחושב באמצעות ניתוח השונות של התלמיד אינטראקצית t-מבחן. p-ערכים < 0.05 נחשבו משמעותית. * < 0.05, * * < 0.01. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ההתקדמות הרבה ננוטכנולוגיה ו אימונולוגיה הושגו באמצעות מחקר טיפולית של תרופות, immunostimulation. בחירה זהירה של שיטת הזרקת ידוע להיות חשובה עבור immunostimulation, אשר היה מוקד המחקר הנוכחי.

מסלולים שונים זריקה הוערכו על טבעי רעיל ולא מתכלה מבוסס DNA חומר INP (ננו-חלקיק immunostimulatory), כדי לקבוע איזה קו הניבו את התוצאה הטובה ביותר. גישה זו רלוונטי גם להעברת סוכנים טיפוליים אחרים כולל נוגדנים, אנטיגנים או adjuvants אחרים.

כדי לנתח את התגובה החיסונית כדי זריקות כאלה, נדרשת הקציר של רקמת לימפה (טחול, iLN ו mLN). בידוד של רקמות הלימפה נמצא הדבר הקריטי ביותר של פרוטוקול זה, נדרש השימוש בטכניקה לא שתיארנו קודם לכן בפירוט. יתר על כן, הכנה של התליה תא יחיד לניתוח נוסף תאים חיסוניים לא התקבלה היטב תיאר. מחקר זה התמקד החילוץ של רקמות הלימפה, במיוחד iLN, mLN, וה טחול, לניתוח DC הפעלה. הפעלה מערכתית של התגובה החיסונית אירעה בעיקר דרך תאים חיסוניים של הטחול. בנוסף, תגובות מערכת החיסון ברקמות מסוימות היו בשליטת לימפה סמוכות. הערכה של מולקולות modulatory פיתח מערכת החיסון צריך להתנהל כדי לקבוע אם המולקולות יכול לגרום גירוי מערכת החיסון ברקמות. לכן, לשיטת הבידוד ברקמות לימפתי וניתוח של DC הפעלה ברקמות יכול לשמש עבור פיתח מערכת החיסון מולקולות מופחתים.

כדי להעריך את השפעת מופחתים המערכת החיסונית INP, נבצרו את iLN mLN, טחול, INP הוצגה כדי לקדם את הלימפה DC הפעלה. כפי שנקבע בעבר, INP ביעילות מטרות גירוי TLR9 ב Dc עכברים2. המקרופאגים גם לבטא TLR9 cytosolic בעכברים. לכן, הזרקת INP עלול לגרום DC והן מקרופאג הפעלה. עם זאת, מקרופאגים לשכון ברקמות היקפיים שתורמים phagocytosis של חיידקים בתוך הרקמה. יתר על כן, אנטיגן-מצגת קיבולת ותוצאה נודדות ברקמות לימפתי של מקרופאגים הם וזהובה חלש יותר מאשר אלה ב- Dc. לפיכך, הערכת תוואי הזרקת INPs עבור האפקט מופחתים החיסון היה מתאימים לבחינת DCs ברקמות לימפתי.

לכן, במצב של מערכת החיסון אדג'וונט הממשל הריכוזיות בזהירות רבה כדי להשיג חיסוני מוצלחת, חיסון תוך שימוש בחומרים רכים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי תוכנית גילוי חומרים יצירתית באמצעות לאומי מחקר קרן של קוריאה (ב- NRF) ממומן על ידי משרד המדע, תקשוב העתיד תכנון (ה-NRF-2017M3D1A1039421), על-ידי תוכנית ביוטכנולוגיה ימית במימון משרד של אוקיינוסים, חלוצת, הרפובליקה של קוריאה, מענק (20150220).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
phosphate buffer saline Corning 21-040-CVR Washing organs
(PBS, pH 7.4)
isoflurane solution  Aesica Queenborough limited 26675-46-7 Anesthesia process
Tuberculin 1mL syringe - Junglim N/A Injection
50 mL conical tube  S.P.L 50050 Anesthesia process
1mL Insulin Syringe  (BD Ultra-FineTM­II)_short needle 324826 Intramuscular Injection
DMEM High Glucose Hyclone SH30081.01 Storing organs
Histopaque  Sigma-Aldrich 10771 FACS analysis
Ethyl alcohol anhydrous 99.5 %  Daejung 4022-4110 Disinfectant
Equipments
FineCycler C100 (Thermocycler) Ssufine - Anealing
Centrifuge Centrifuge
FACS tube  FALCON 2052 FACS analysis
Automated High-performance Flow Cytometer BD (USA), FACSVerse - FACS analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Park, H. Preparation of dodecynyl modified DNA nanoparticles with unmethylated CpG adjuvant and ovalbumin for immunostimulation. Department of Chemistry. Pukyong National University, Master Thesis. (2016).
  2. Jin, J. O., Park, H., Zhang, W., de Vries, J. W., Gruszka, A., Lee, M. W., Ahn, D. R., Herrmann, A., Kwak, M. Modular delivery of CpG-incorporated lipid-DNA nanoparticles for spleen DC activation. Biomaterials. 115, 81-89 (2017).
  3. Pal, I., Ramsey, J. D. The role of the lymphatic system in vaccine trafficking and immune response. Advanced Drug Delivery Reviews. 63, (10-11), 909-922 (2011).
  4. Jin, J. O., Kwak, M., Xu, L., Kim, H., Lee, T. H., Kim, J. O., Liu, Q., Herrmann, A., Lee, P. C. W. Administration of soft matter lipid-DNA nanoparticle as the immunostimulant via multiple routes of injection in vivo. ACS Biomaterial Science & Engineering. 3, (9), 2054-2058 (2017).
  5. Worbs, T., Hammerschmidt, S. I., Förster, R. Dendritic cell migration in health and disease. Nature Review Immunology. 17, (1), 30-48 (2017).
  6. Milling, S. W. F., Jenkins, C., MacPherson, G. Collection of lymph-borne dendritic cells in the rat. Nature Protocols. 1, (5), 2263-2270 (2006).
  7. Desormeaux, A., Bergeron, M. G. Lymphoid tissue targeting of anti-HIV drugs using liposomes. Methods in Enzymology. 391, 330-351 (2005).
  8. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).
  9. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50, (5), 600-613 (2011).
  10. General anesthesia of mice and rats. Animal Care and Use Standards Committee. (2016).
  11. Guidelines for the Euthanasia of Animals. Veterinary Record. (2013).
  12. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration I. Journal of Visualized Experiments. (2018).
  13. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration III. Journal of Visualized Experiments. (2018).
  14. Mebius, R. E., Kraal, G. Structure and function of the spleen. Nature Review Immunology. 5, (8), 606-616 (2005).
Immunostimulatory הסוכן הערכה: הלימפה רקמות החילוץ, הזרקת תא דנדריטי תלויי-נתיב ההפעלה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jin, J. O., Jang, S., Kim, H., Oh, J., Shim, S., Kwak, M., Lee, P. C. W. Immunostimulatory Agent Evaluation: Lymphoid Tissue Extraction and Injection Route-Dependent Dendritic Cell Activation. J. Vis. Exp. (139), e57640, doi:10.3791/57640 (2018).More

Jin, J. O., Jang, S., Kim, H., Oh, J., Shim, S., Kwak, M., Lee, P. C. W. Immunostimulatory Agent Evaluation: Lymphoid Tissue Extraction and Injection Route-Dependent Dendritic Cell Activation. J. Vis. Exp. (139), e57640, doi:10.3791/57640 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter