Summary
Procedure sperimentali per l'estrazione successiva di tessuti linfatici per testare l'attivazione delle cellule dendritiche linfoidi sono descritti dopo il trattamento di un nanomateriale immunostimulating.
Abstract
Per la valutazione di un nuovo agente terapeutico per l'immunoterapia o la vaccinazione, analisi di attivazione delle cellule immuni in tessuti linfatici è essenziale. Qui, abbiamo studiato gli effetti immunologici di un immunostimolante di romanzo del lipido-DNA in forma di nanoparticelle da vie di somministrazione differenti nel topo: orale, intranasale, sottocutanea, zampa, intraperitoneale ed endovenosa. Queste iniezioni influenzerà direttamente la risposta immunitaria e la raccolta dei tessuti linfatici e analisi dell'attivazione delle cellule dendritiche (DC) nei tessuti sono parti cruciali di queste valutazioni. L'estrazione dei linfonodi mediastinici (mLNs) è importante ma abbastanza complessa a causa della dimensione e la posizione di questo organo. È descritta una procedura graduale per la raccolta il linfonodo inguinal (iLN), mLN e la milza e l'analisi di attivazione delle DC tramite flusso cytometry.
Introduction
Progressi in immunologia e nanomateriali hanno portato ad un'abbondanza di nuove strategie terapeutiche potenziali per applicazioni nel campo della biomedicina, tra cui immunostimolazione e consegna della droga. Ottimizzazione della via di somministrazione è un aspetto fondamentale che influenzano l'efficacia degli agenti immunostimulatory. Una nanoparticella di immunostimulatory (INP) costituito da DNA è un nuova concezione adiuvante di nano-immunitario auto-assemblato da microphase separazione a causa della struttura anfifilica di lipido-DNA1. Di conseguenza, protocolli per INP che coinvolge amministrazione del materiale1 in vivo tramite percorsi diversi e tre procedure per la raccolta di tessuti appropriati come il linfonodo inguinal (iLN), LN (mLN) mediastinica e la milza, sono descritto. Infine, questi tessuti sono stati analizzati per l'attivazione delle cellule dendritiche (DC), le cellule presentanti l'antigene più potente del sistema immunitario. Questo protocollo può essere applicato anche per la valutazione di antigeni, anticorpi o altri adiuvanti immuni2.
Abbiamo testato la formulazione INP perché è un agente che ha mostrato grande promessa. INP è un recettore Toll-like 9 (TLR9) materiale ausiliario che contiene acidi nucleici, per la cui valutazione di immunostimolazione efficacia è necessario verificare iniezione differenti metodi3. In questo contesto, la stimolazione di DCs è un potente endpoint per la valutazione in vivo . Dopo molecole dell'antigene o immunostimulatory phagocytosed dal DCs in tessuti periferici o sangue, queste cellule migrano verso organi linfoidi come la milza e LNs4,5. Così, attivazione delle DC è stato analizzato in milza, iLN e mLN degli animali iniettati. Pertanto è anche cruciale per valutare la risposta immunitaria ad un romanzo di adiuvante o agenti patogeni5correttamente la raccolta di questi tessuti. Tale raccolta di tessuto è anche importante per lo sviluppo di una nuova metodologia immunologica come terapia del cancro. Inoltre, questo protocollo può essere utilizzato per verificare l'efficacia di altri farmaci, come il virus dell'immunodeficienza umana terapeutica6.
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Protocol
Tutte le procedure sperimentali tra cui isolamento di manipolazione, sacrificio e organo animale sono state eseguite in stretta conformità con le regole del Comitato uso presso centro clinico di salute pubblica di Shanghai e Asan Medical Center e International Animal Care. Il protocollo di studio è stato approvato dai rispettivi comitati di etica di animale esperimenti presso Shanghai Public Health Clinical Center (numero di protocollo del Mouse: SYXK-2010-0098) e Asan Medical Center (2016-02-168).
1. preparazione del materiale
Nota: Un nano-adiuvante, INP, composto da un elemento portante del lipido-DNA auto-assemblati, vale a dire U4T, e oligonucleotidi contenenti CpG-motivo, eCpG, è stato impiegato nello studio corrente per verificare la route di iniezione appropriato per immunoterapia e vaccinazione nei topi2 . D'importanza, altri potenziali molecole terapeutiche quali antigeni, anticorpi e agenti ausiliari possono essere sostituiti per INP e testato utilizzando la stessa metodologia descritta di seguito.
- INP formulazione2,4,7
- Tempri U4T (160 µM, elemento portante) con eCpG (80 µM, contenente una sequenza di TLR9 agonista) in presenza di 1x tampone fosfato salino (PBS, pH 7.4) e MgCl2 (2 mM). Il volume standard per ricottura è tra 50 e 110 µ l in un tubo PCR. Riscaldare la miscela a 95 ° C per 10 min e poi lentamente raffreddare (1 ° C/16 min) a 25 ° C utilizzando un termociclatore. Il protocollo di ricottura richiede circa 2 h.
Attenzione: Il liquido che contiene U4T è molto schiumoso e deve essere maneggiato con attenzione. - Rendere le aliquote della preparazione INP; 50-µ l utilizzare 50 µ l del materiale per ogni iniezione.
Nota: Nel caso di 100 µ l per iniezione, ripetere il passaggio 1.1 con corretto calcolo degli ingredienti.
- Tempri U4T (160 µM, elemento portante) con eCpG (80 µM, contenente una sequenza di TLR9 agonista) in presenza di 1x tampone fosfato salino (PBS, pH 7.4) e MgCl2 (2 mM). Il volume standard per ricottura è tra 50 e 110 µ l in un tubo PCR. Riscaldare la miscela a 95 ° C per 10 min e poi lentamente raffreddare (1 ° C/16 min) a 25 ° C utilizzando un termociclatore. Il protocollo di ricottura richiede circa 2 h.
2. generale animale procedure
Nota: Metodi alternativi per la gestione del mouse possono essere utilizzati a seconda delle esigenze di laboratorio e protocolli approvati animale8. Il tipo di topi usati è 6-settimana-vecchi topi femminili C57BL/6.
- Elenco dei materiali
- Preparare il liquido anestetico (isoflurano), macchina dell'anestetico, camera di inalazione di anidride carbonica (CO2), garza sterile, forcipe, dispositivo di ritenuta del mouse, guanti, forcipe uncinato, forbici per dissezione 1-inch, forbici per dissezione 2 pollici, alcool per sterilizzazione e siringa da insulina.
- Inhalant anestesia
Nota: L'anestesia è obbligatoria per grassatore intranasale, sottocutanea e iniezioni endovenose di topi9. Una camera di induzione con un serbatoio di ossigeno e macchina vaporizzatore collegato è utilizzata per questa procedura.- Metti l'animale nella camera di induzione e assicurarsi di chiudere ermeticamente il coperchio.
- L'ossigeno a 1 L/min di flusso e impostare il vaporizzatore ad un livello di induzione del 4% per l'isoflurano.
- Variare il tempo di esposizione di animali nella camera a seconda del peso dell'animale; Tuttavia, più di 10 s di esposizione e monitoraggio ogni 5 min è necessaria per l'anestesia10.
Nota: Nessun riflesso pedale indica successo anestesia. - Spegnere l'induttore di isoflurano e flusso di 1 L/min di ossigeno per evitare l'esposizione del personale a gas isoflurano.
- Sacrificio
- Preparare una camera per CO2 inalazione sacrificio secondo il NIH "linee guida per l'eutanasia di roditori utilizzando anidride carbonica"11.
- Risposta di gag di test per confermare che l'animale è completamente sacrificato.
- Verificare che il mouse correttamente è sacrificato pizzicare la punta del suo piede e non confermando nessuna risposta di bavaglio. Se c'è una risposta, ripetere il punto 2.2.
- Disinfezione
- Disinfettare tutte le superfici utilizzate per iniezioni o dissezioni con alcool spray e garze sterilizzate.
- Deposito di organo
- Utilizzare pinze per rimuovere tutti i grasso e sangue che circonda gli organi raccolti. Conservare questi tessuti raccolti singolarmente in una capsula Petri riempito con 3 mL di PBS. Il contenitore e media può differire a seconda dei requisiti di procedura successiva.
3. iniezione rotte
- Utilizzare i metodi di sei iniezione per indagare le risposte immunitarie di iniezione-dipendente: orale, intranasale, sottocutanea, zampa, intraperitoneale ed endovenosa8,12,13.
4. isolamento dei linfonodi e milza
Nota: Utilizzare topi magri giovani e sani (6 settimane) per queste procedure perché i grassi che si accumulano in genere intorno i linfonodi in più vecchi topi sono difficili da rimuovere e possono impedire la corretta visualizzazione dell'organo.
- Passaggi di pre-raccolta
Nota: Questa sezione descrive la raccolta di post-iniezione di iLN, milza e mLN dai topi per l'analisi di stimolazione immune. Fare riferimento ai punti 2.3-2.5 per il sacrificio, gag risposta e metodi di disinfezione.- Appuntare le membra del mouse alla scheda di schiuma chirurgica e sterilizzare il lato ventrale del mouse con etanolo al 70%.
- Scegliere un percorso di 2 cm sopra la zona genitale e uso agganciato forcipe per sollevare il coperchio di pelle esterna come una tenda. Fare un taglio di circa 1 cm in questa posizione e far scorrere le forbici (2 pollici) sotto la pelle, ulteriori tagli di dissezione.
- Per il tegumento, tagliato verticalmente attraverso la pelle esterna con entrambe le braccia delle forbici (2 pollici). Esporre gli organi interni, ricoperti di peritoneo.
- Appuntare lo strato esterno della pelle.
-
Isolamento del linfonodo inguinal (iLN)
- Individuare il iLN sul lato sinistro del piedino che segue la congiunzione del vaso sanguigno andando giù la gamba sinistra, che appare come una lettera inclinata 'Y'.
Nota: Per i topi per via sottocutanea iniettati, scegliere un iLN sullo stesso lato del punto di iniezione. - Scoprire lo strato con due pinze per strappare lo strato lipidico coperto e raccolto il iLN giallo pallido (forma di fagiolo, 2 mm). Per il trattamento successivo e lo stoccaggio del tessuto, vedi punto 2.6.
- Individuare il iLN sul lato sinistro del piedino che segue la congiunzione del vaso sanguigno andando giù la gamba sinistra, che appare come una lettera inclinata 'Y'.
-
Isolamento della milza 14
- Fare una tenda al centro del peritoneo utilizzando agganciato forcipe in una mano e utilizzare piccole sottili forbici (1 pollice) con l'altra mano per tagliare il peritoneo.
- Forcipe di uso agganciato nella mano sinistra per afferrare l'intestino e capovolgerla per individuare rossa fagiolo-come milza (lunghezza di circa 14 mm) attaccata sul lato superiore sinistro dell'addome del mouse.
- Estrarre delicatamente la milza con un altro set di pinze nella mano destra mentre si toglie altri organi con il forcipe uncinato. Seguire il passaggio 2.6 per memorizzare la milza.
Nota: Cura è necessaria quando la milza, la raccolta come è un organo molle facilmente danneggiato.
-
Isolamento del linfonodo mediastinico (mLN)
Nota: Il mLN è situato a circa 1 cm sotto le costole ed è coperto da altri organi quali il cuore ed i polmoni. A causa della sua posizione e le dimensioni ridotte, è importante esporre con attenzione la zona circostante utilizzando pinze e le forbici (1 pollici).- Tagliare il diaframma e staccarlo dalle costole. Tenere il corpo delle costole con il forcipe e poi tagliare la parte sinistra e destra delle costole con le forbici (1 pollici). Appuntare le costole taglio sopra la spalla del mouse sul diritto di esporre il cuore ed i polmoni.
Nota: fare attenzione per non tagliare qualsiasi dei vasi sanguigni intorno al cuore e polmoni, come la fuoriuscita di sangue, lo rende molto difficile individuare il minuscolo mLN traslucido. Se sono tagliati in vasi sanguigni, delicatamente di assorbire il sangue nella zona con una garza. - Utilizzando forcipe uncinato nella mano destra, capovolgere il cuore ed i polmoni delicatamente verso destra fino a quando la spina dorsale è esposto. Utilizzare un paio di pinze regolari nella mano sinistra per rimuovere il iLN con il forcipe uncinato nella mano destra per aiutare con questa raccolta.
- Afferrare i polmoni e capovolgerli fino a quando la spina dorsale è ampiamente esposto. Il mLN (un traslucido struttura a forma di fagiolo di circa 2 mm di dimensione) si trova tra i polmoni e la colonna vertebrale.
- Utilizzare il forcipe uncinato per esporre l'area intorno il mLN e le altre pinze per estrarre il tessuto.
Nota: Il mLN è circondato da numerosi altri tessuti che devono essere tolte con cautela con il forcipe prima del raccolto. - Vedere il punto 2.7 per istruzioni a immagazzinare il raccolto mLN.
- Tagliare il diaframma e staccarlo dalle costole. Tenere il corpo delle costole con il forcipe e poi tagliare la parte sinistra e destra delle costole con le forbici (1 pollici). Appuntare le costole taglio sopra la spalla del mouse sul diritto di esporre il cuore ed i polmoni.
5. preparazione dei campioni per citometria a flusso
Nota: Per l'attivazione delle DC in raccolte iLN, milza e mLN di analisi, sospensioni unicellulari di questi tessuti sono macchiate con anticorpi coniugati fluorescenza come DC-specifici marcatori e molecole costimolatorie istocompatibilità complesse molecole e analizzati tramite flusso cytometry.
-
Preparazione di sospensioni unicellulari: milza
- Aggiungere 5 mL di terreno di coltura fresco (CM) nella piastra di coltura di 6 mm e mettere i campioni sul ghiaccio.
- Rimuovere i tessuti circostanti di sangue e grasso e posizionare il tessuto nel coperchio della piastra di coltura.
- Tagliare i tessuti in piccoli frammenti (< 1 mm) con forbici curve. Sospendere i frammenti in PBS seguita da filatura giù il tessuto utilizzando una centrifuga a 646 × g per 5 min e rimuovere il surnatante.
- Sospendere i campioni ancora in 3 mL di CM e digerire i frammenti con 200 µ l di soluzione di 2% siero bovino fetale (FBS) completato con collagenasi IV per 20 min.
- Agitare delicatamente e incubare il campione a 37 ° C per 1 h. filtro tessuti digeriti attraverso rete di nylon (100 nm) e la loro rotazione verso il basso. Lavare le singole cellule in 5 mL di PBS e rimuovere il surnatante mediante centrifugazione.
- Risospendere le cellule in 5 mL di soluzione di isolamento delle cellule. Ri-caricare un altro strato di 5 mL di soluzione di isolamento di cellule chiare per formare uno stack strato dopo strato acquoso.
- Centrifugare la preparazione delle cellule a 2012 × g per 10 min. Ottieni il surnatante, che è la frazione più leggera di densità (< 1,077 g/cm3), per analisi di citometria a flusso successivo.
- Contare il numero di cellule con un emocitometro.
-
Preparazione di sospensioni unicellulari: linfonodo
- Seguire il passo 5.1.1-5.1.2.
- Aggiungere 5 mL di CM usando una pipetta da 10 mL per sospendere le cellule pipettando 3 - 4 volte. Dopo la sospensione del accuratamente le celle, utilizzare maglia di nylon sterile per filtrare le celle per la raccolta in una provetta conica da 15 mL.
- Gira le cellule giù a 646 ×g per 7 min a 4 ° C e rimuovere il surnatante.
- Aggiungere un ulteriore 5 mL di CM nel dispensare 10 mL di meglio sospendere le cellule pipettando.
- Lavate con PBS e contare il numero di cellule.
-
Analisi di citometria a flusso
- Aliquota di 0,5-1 × 106 celle in ogni cella di fluorescenza-attivato l'ordinamento tubo (FACS).
- Centrifugare a 646 × g a 4 ° C per 5 min e aspirare il supernatante.
- Aggiungere 5 µ l di ogni diluito fluorescenza-coniugato anticorpo preparazione alle celle per risospendere il pellet cellulare e vortexare.
Nota: È importante proteggere il pellet cellulare da esposizione alla luce per quanto possibile, perché gli anticorpi fluorescente contrassegnati sono sensibili alla luce. Generare un mix master anticorpo e sempre aggiungere blocco Fc. - Preparare il tampone di FACS usando 100 µ l di PBS, 1% di FBS regolari inattivati e 0,1% di sodio azide.
- Collocare il campione nel tubo a 4 ° C per 30 min. Sciacquare le cellule con 2-4 mL di FACS buffer e centrifugare il campione a 1700 rpm per 7 min a 4 ° C.
- Risospendere le cellule in 500 µ l di tampone di FACS al buio. Analizzare le cellule tramite flusso cytometry.
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Representative Results
Per valutare percorsi appropriati iniezione di INP per l'attivazione del tessuto linfatico DC, la popolazione di DC come lignaggio è stata definita ---CD11c+ cellule nella milza, iLN e mLN e analizzati i livelli di espressione di molecole costimolatorie. Trattamento di INP iniezione endovenosa (i.v.) e sottocutanea (s.c.) ha promosso gli aumenti sostanziali nell'espressione CD40, CD80 e CD86 in milza e iLN DCs (Figura 2B e 2C). Zampa e iniezione intraperitoneale (i.p.) di INP anche considerevolmente up-regolato che i livelli di espressione di CD40, CD80 e CD86 in milza e iLN DCs rispetto a nel controllo PBS-trattati (Figura 2B e 2C). In mLN stimolato DCs, intranasale (i.n.) iniezione di INP promosso il più alta up-regolazione di molecole costimolatorie rispetto a quella del controllo PBS-trattati (Figura 2D). i.p. e i.v. iniezione di INP inoltre ha indotto i profondi aumenti in espressione di molecole costimolatorie in mLN, mentre orale, s.c., e iniezione di zampa di INP non ha indotto l'attivazione di mLN DCs (Figura 2D).
Figura 1 : Posizione del punto di iniezione intraperitoneale di Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Posizione precisa dell'iniezione endovenosa Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Attivazione delle DC negli organi linfatici analizzate tramite flusso cytometry. Topi C57BL/6 sono stati iniettati con INP da sei linee di iniezione differenti e 24 h dopo l'iniezione, la milza, iLN e mLN sono stati raccolti. (A) la popolazione di DC nelle cellule del tessuto linfatico è stata definita come lignaggio –CD11c+ cellule in vivo dei leucociti. (B-D) I livelli di espressione di CD40, CD80 e CD86 sono stati analizzati mediante citometria a flusso nella milza (B), iLN (C) e nel mLN (D). I dati sono valori medi ottenuti da analisi di sei campioni indipendenti. Risultati sono espressi come l'errore standard di ± mezzi di media (SEM). La significatività statistica delle differenze tra gruppi sperimentali è stata calcolata usando l'analisi della varianza con spaiata dello studente t-test. p-valori < 0.05 sono stati considerati significativi. * < 0.05, * * < 0.01. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Molti progressi nella nanotecnologia e immunologia sono stati raggiunti attraverso ricerca terapeutica della somministrazione di farmaci e immunostimolazione. Un'attenta selezione del metodo di iniezione è conosciuta per essere importante per immunostimolazione, che era l'obiettivo del presente studio.
Itinerari di iniezione differenti sono stati valutati per un naturalmente non tossici e biodegradabile basati sul DNA materiale, INP (immunostimulatory delle nanoparticelle), per determinare quale percorso ha reso il miglior risultato. Questo approccio è anche rilevante per la consegna di altri agenti terapeutici, tra cui gli anticorpi, antigeni o altri coadiuvanti.
Per analizzare la risposta immunitaria verso tali iniezioni, vendemmia del tessuto linfatico (milza, iLN e mLN) è richiesto. Isolamento dei tessuti linfatici è l'aspetto più cruciale del presente protocollo e richiedeva l'uso di una tecnica che non è stato descritto precedentemente in dettaglio. Inoltre, la preparazione della sospensione unicellulare per analizzare ulteriormente le cellule immuni non è stato ben descritto. Questo studio si è concentrato sull'estrazione di tessuti linfatici, particolarmente il iLN, mLN e la milza, per l'analisi di attivazione delle DC. Attivazione sistemica della risposta immunitaria si è verificato principalmente attraverso le cellule immunitarie nella milza. Inoltre, le risposte immunitarie nel tessuto specifico sono state controllate dai linfonodi vicini. Valutazione di nuova concezione molecole modulatory immuni dovrebbe essere condotti per determinare se le molecole possono indurre stimolazione immune nei tessuti. Pertanto, il metodo per l'isolamento di tessuto linfatico e analisi di attivazione delle DC nei tessuti può essere utilizzato per molecole stimolatore immunitario recente sviluppati.
Per valutare l'effetto stimolatore immunitario di INP, il iLN, mLN e la milza sono state raccolte e INP è stata indicata per promuovere linfatico attivazione delle DC. Come stabilito in precedenza, INP efficacemente mira TLR9 stimolazione in DCs in topi2. I macrofagi esprimono anche TLR9 citosolico in topi. Di conseguenza, iniezione INP può indurre l'attivazione del macrofago e DC. Tuttavia, i macrofagi risiedono nel tessuto periferico che contribuiscono alla fagocitosi dei microbi nel tessuto. Inoltre, la capacità di presentazione dell'antigene e migratorio effetto al tessuto linfatico dei macrofagi sono in modo paragonabile più deboli di quelli in DCs. Di conseguenza, valutare il percorso di iniezione dell'INPs per l'effetto stimolatore immunitario era adatto per l'esame DCs nel tessuto linfatico.
Pertanto, la modalità di somministrazione di adiuvante immune deve essere valutata molto attentamente per ottenere riuscita immunoterapia e vaccinazione utilizzando materiali morbidi.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata supportata dal programma di Creative materiali scoperta attraverso la nazionale Ricerca Fondazione della Corea (NRF) finanziato dal Ministero della scienza, ICT e futuro pianificazione (NRF-2017M3D1A1039421) e dal programma di biotecnologie Marine finanziato dalla Ministero degli oceani e pesca, Repubblica di Corea e una borsa di studio (20150220).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| phosphate buffer saline | Corning | 21-040-CVR | Washing organs |
| (PBS, pH 7.4) | |||
| isoflurane solution | Aesica Queenborough limited | 26675-46-7 | Anesthesia process |
| Tuberculin 1mL syringe - | Junglim | N/A | Injection |
| 50 mL conical tube | S.P.L | 50050 | Anesthesia process |
| 1mL Insulin Syringe | (BD Ultra-FineTMII)_short needle | 324826 | Intramuscular Injection |
| DMEM High Glucose | Hyclone | SH30081.01 | Storing organs |
| Histopaque | Sigma-Aldrich | 10771 | FACS analysis |
| Ethyl alcohol anhydrous 99.5 % | Daejung | 4022-4110 | Disinfectant |
| Equipments | |||
| FineCycler C100 (Thermocycler) | Ssufine | - | Anealing |
| Centrifuge | Centrifuge | ||
| FACS tube | FALCON | 2052 | FACS analysis |
| Automated High-performance Flow Cytometer | BD (USA), FACSVerse | - | FACS analysis |
References
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