Summary
После лечения иммуностимулирующее Наноматериал описаны экспериментальные процедуры для последующего извлечения лимфатической тканей для проверки активации лимфоидных дендритных клеток.
Abstract
Для оценки нового терапевтического агента для иммунотерапии или вакцинации анализ активации иммунных клеток в лимфатических тканей. Здесь, мы исследовали иммунологические эффекты иммуностимулирующим Роман липидов ДНК в виде наночастиц из администрации различных маршрутов в мышь: устные, интраназально, подкожно, зверолов, внутрибрюшинного и внутривенно. Эти инъекции непосредственно повлияет на иммунный ответ и уборки лимфатической ткани и анализ активации дендритных клеток (DC) в тканях, решающие части этих оценок. Извлечение лимфоузлов средостения (mLNs) важных, но довольно сложным из-за размера и расположения этого органа. Описана пошаговая процедура для уборки паховых лимфоузлов (iLN), млн и селезенки и анализа DC активации подачей cytometry.
Introduction
Достижения в области иммунологии и наноматериалов привели к обилие потенциальных новых терапевтических стратегий для приложений в биомедицине, включая поставку наркотиков и иммуностимуляция. Оптимизация администрирования маршрут является одним из важнейших аспектов, влияющих на эффективность иммуностимулирующее агентов. Иммуностимулирующее наночастиц (ИНП), состоящий из ДНК является недавно разработанный нано иммунной адъюванта, самостоятельно собранные микрофазовую разделения из-за структуры амфифильных липидов ДНК1. Таким образом протоколы для INP, с участием администрации материала1 в естественных условиях через различные маршруты и три процедуры для сбора соответствующих тканей, такие как паховых лимфоузлов (iLN), средостения LN (млн.) и селезенки, описал. Наконец эти ткани были проанализированы для активации дендритных клеток (DC), наиболее мощный антиген представляющих клеток в иммунной системе. Этот протокол также может применяться для оценки антигенов, антител или другие иммунные адъювантов2.
Мы протестировали ИЯФ формулировку потому, что он является агентом, который показал большие надежды. ИЯФ является Толл подобный рецептор 9 (TLR9) материал адъювант, содержащий нуклеиновые кислоты, для которых оценки иммуностимуляция эффективности требуется для тестирования различных инъекций методы3. В этом контексте стимуляция DCs является мощным конечной точки для оценки в естественных условиях . После того, как антиген или иммуностимулирующее молекулы являются phagocytosed DCs в периферических тканях и крови, эти клетки мигрируют в лимфоидных органов, таких как селезенке и LNs4,5. Таким образом DC активации был проанализирован в селезенке, iLN и млн вводят животных. Должным образом заготовка этих тканей поэтому также крайне важно для оценки иммунного ответа на роман адъювантом или патогенов5. Такие ткани уборки также имеет важное значение для разработки Роман иммунологические методологии как терапия рака. Кроме того этот протокол может использоваться для проверки эффективности других препаратов, таких как вирус иммунодефицита человека анти терапии6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные процедуры, включая животных обработки, жертву и орган изоляции были выполнены в строгом соответствии с правилами международного животное уход и использование Комитета в Шанхае клинический центр общественного здравоохранения и Асан медицинский центр. Протокол исследования был одобрен соответствующими комитетами по этике животных эксперименты в Шанхае общественного здравоохранения клинический центр (номер протокола мыши: SYXK-2010-0098) и Асан медицинский центр (2016-02-168).
1. Подготовка материала
Примечание: Нано адъюванта, INP, состоит из несущей собственн-собранные липидов ДНК, а именно U4T, и содержащий олигонуклеотида CpG мотив, eCpG, работал в текущем исследовании проверить соответствующие инъекций маршрут для иммунотерапии и вакцинации в мышей2 . Важно отметить, что других потенциальных терапевтических молекул, таких как антигенов, антител и адъювантной агентов может быть заменен для INP и протестированы с использованием той же методологии, описанной ниже.
- INP формулировка2,4,7
- Отжига U4T (160 мкм, перевозчик) с eCpG (80 мкм, содержащий последовательность агониста TLR9) в присутствии 1 x фосфат амортизированное saline (PBS, рН 7,4) и MgCl2 (2 мм). Стандартный объем для отжига является между 110 и 50 мкл в ПЦР-пробирку. Нагрейте смесь до 95 ° C в течение 10 мин и затем медленно остыть (1 ° C/16 мин) до 25 ° C, с помощью Термоциклер. Отжиг протокол требует около 2 ч.
Предупреждение: U4T-содержащие жидкость очень пенистый и должны быть тщательно обработаны. - Сделать 50 мкл аликвоты ИЯФ подготовки; Используйте 50 мкл материала для каждой инъекции.
Примечание: В случае 100 мкл на инъекцию, повторите шаг 1.1 с правильного расчета ингредиентов.
- Отжига U4T (160 мкм, перевозчик) с eCpG (80 мкм, содержащий последовательность агониста TLR9) в присутствии 1 x фосфат амортизированное saline (PBS, рН 7,4) и MgCl2 (2 мм). Стандартный объем для отжига является между 110 и 50 мкл в ПЦР-пробирку. Нагрейте смесь до 95 ° C в течение 10 мин и затем медленно остыть (1 ° C/16 мин) до 25 ° C, с помощью Термоциклер. Отжиг протокол требует около 2 ч.
2. Общие процедуры животных
Примечание: Альтернативные методы для обработки мышей может использоваться в зависимости от требования лаборатории и утвержденных животных протоколы8. Тип мыши используется является 6 week-old мышей C57BL/6 и женщин.
- Список материалов
- Подготовить жидкого цистит (изофлюрановая), цистит машина, палата Вдыхание углекислого газа (CO2), стерилизовать марлей, щипцы, мыши фиксатор, перчатки, подключили щипцы, рассечения ножницы 1-дюймовый, 2-дюймовый рассечения ножницы, алкоголь для стерилизации и инсулин шприца.
- Вдыхаемые анестезии
Примечание: Анестезии является обязательным для интраназального, подкожно, зверолов и внутривенные инъекции мышей9. Для выполнения этой процедуры используется камера индукции с испарителем машины и кислорода танк подключен.- Поместите животное в камере индукции и убедитесь в том, чтобы плотно закрыть крышку.
- Поток кислорода в 1 Л/мин и задайте параметр испарителем индукции уровень 4% для изофлюрановая.
- Различаются Выдержка животных в камере в зависимости от веса животного; Однако более чем 10 необходимых для анестезии10s воздействия и мониторинга каждые 5 мин.
Примечание: Не педали рефлекс указывает успешное анестезии. - Выключить изофлюрановая индуктора и потока 1 Л/мин кислорода для предотвращения облучения персонала для изофлюрановая газа.
- Жертвоприношение
- Подготовить камеру для CO2 ингаляции жертву в соответствии с низ «руководящие принципы для эвтаназии из грызунов с помощью углекислого газа»11.
- Ответ кляп в тест для подтверждения, что полностью приносится в жертву животное.
- Убедитесь, что мышь должным образом жертву щипать кончик его ноги и подтверждающий ответ не кляп. Если есть ответ, повторите шаг 2.2.
- Дезинфекция
- Лечить всех поверхностей используется для инъекций или вскрытия с алкоголем спрей и стерилизовать марлей.
- Орган для хранения
- Для удаления жира и крови, окружающие заготовленной органы Используйте щипцы. Храните эти заготовленной ткани индивидуально в чашке Петри, заполнены с 3 мл PBS. Контейнер и СМИ могут отличаться в зависимости от требования последующих процедур.
3. инъекции маршруты
- Используйте методы шести инъекций расследовать инъекций зависимых иммунных реакций: устные, интраназально, подкожно, зверолов, внутрибрюшинного и внутривенного8,12,13.
4. изоляция лимфатических узлов и селезенки
Примечание: Используйте молодых и здоровых мышей худой (6 недель) для выполнения этих процедур, так как жиры, которые обычно накапливаются вокруг лимфатических узлов в старых мышей трудно удалить и может помешать правильной визуализации органа.
- До сбора урожая шаги
Примечание: Этот раздел описывает впрыск уборки iLN, селезенка и млн от мышей для анализа иммунной стимуляции. Обратитесь к шагам 2.3-2.5 для жертвоприношения, кляп ответ и методы дезинфекции.- Закрепить конечностей мыши в Правление хирургического пены и стерилизовать вентральной стороне мыши с 70% этиловом спирте.
- Выберите расположение 2 см выше области половых органов и использование подключили щипцы подтянуть покрытие внешних кожи как палатку. Сделать надрез примерно 1 см в этом месте и слайд ножницы (2 дюйма) под кожу, делая дальнейших сокращений рассечение.
- Для кожного покрова резать вертикально через внешний кожу обеими руками ножницы (2 дюйма). Разоблачить внутренних органов, покрытые брюшины.
- Контактный внешний слой кожи.
-
Изоляция паховых лимфоузлов (iLN)
- Найдите на левой стороне ноги после совместно кровеносного сосуда, спускаясь на левую ногу, которая выглядит как наклонены буквы «Y» iLN.
Примечание: Для подкожно вводят мышей, выберите iLN на той же стороне инъекции местоположение. - Раскройте слой с двумя щипцы для рип покрыты липидного слоя и урожай бледно желтый iLN (форма фасоли, 2 мм). Для последующей обработки и хранения ткани смотрите шаг 2.6.
- Найдите на левой стороне ноги после совместно кровеносного сосуда, спускаясь на левую ногу, которая выглядит как наклонены буквы «Y» iLN.
-
Изоляция селезенки 14
- Палатка в центре брюшины использованием подключили щипцами в одной руке и использовать небольшие тонкие ножницы (1 дюйм) с другой стороны, сократить брюшины.
- Корнцанг использовать крючок в левой руке чтобы понять кишечника и переверните найти красный бин как селезенки (длина около 14 мм) прилагается к верхней левой части живота мыши.
- Осторожно выдвиньте селезенки с другой набор щипцов в правой руке во время отсоединения других органов с крючковатым щипцами. Выполните шаг 2.6 для хранения селезенки.
Примечание: Требуется осторожно при уборке селезенки, как это легко поврежденных мягких орган.
-
Изоляция лимфатических узлов средостения (млн)
Примечание: Млн-расположен примерно в 1 см под ребра и покрывается другими органами, например сердца и легких. Из-за ее расположение и небольшие размеры важно тщательно подвергать окрестности с помощью щипцов и ножницы (1-дюймовый).- Вырезать диафрагмы и отсоединить его от ребер. Держите тело ребер с щипцами, а затем вырезать левой и правой стороне ребра с ножницами (1-дюймовый). Закрепите отсечки ребра через плечо мыши на право подвергать сердца и легких.
Примечание: заботиться не вырезать любой из кровеносных сосудов вокруг сердца и легких, как утечка крови делает его очень трудно найти крошечные полупрозрачные млн. Если вырезать любой кровеносных сосудов, нежно поглощать крови в области марлей. - С помощью подключили щипцами в правой руке, флип сердца и легких нежно справа до тех пор, пока костяк подвергается. Используйте пару регулярных щипцами в левой руке для удаления iLN с крючковатым щипцами в правую руку, чтобы помочь с этой заготовки.
- Grab легких и флип их до тех пор, пока позвоночника широко подвергается. Млн (полупрозрачные фасолевидных структура размером примерно 2 мм) расположен между легких и позвоночника.
- Используйте подключили щипцы подвергать район вокруг млн и другие щипцы для извлечения ткани.
Примечание: Млн находится в окружении многочисленных других тканей, которые должны быть тщательно удалены с щипцами до сбора урожая. - Смотрите Шаг 2.7 для инструкций на хранение собранного млн.
- Вырезать диафрагмы и отсоединить его от ребер. Держите тело ребер с щипцами, а затем вырезать левой и правой стороне ребра с ножницами (1-дюймовый). Закрепите отсечки ребра через плечо мыши на право подвергать сердца и легких.
5. подготовка проб для проточной цитометрии
Примечание: Для анализа активации DCs в заготовленной iLN, селезенке и млн, сингл клеточной суспензии этих тканей запятнаны с флуоресцентным конъюгированных антител, как DC-специфических маркеров, co-stimulatory молекулы и гистосовместимости комплекс молекулы и анализируются проточной цитометрии.
-
Подготовка одной ячейки суспензий: Хандра
- Добавьте 5 мл свежей питательной среды (CM) в 6-мм культуры блюдо и поместить образцы на льду.
- Удаление крови и жировой тканям и место ткани в крышке культуры блюдо.
- Нарезать небольшие фрагменты тканей (< 1 мм) с изогнутые ножницы. Приостановить фрагменты в PBS, следуют спиннинг вниз ткани с помощью центрифуги на 646 × g 5 минут и удалить супернатант.
- Приостановить образцы снова в 3 мл см и дайджест фрагментов с 200 мкл раствора плода бычьим сывороточным 2% (ФБС) дополнены коллагеназы IV за 20 мин.
- Осторожно встряхнуть и инкубации образца при 37 ° C, за 1 ч. фильтра усваивается тканями через нейлоновая сетка (100 Нм) и крутить их вниз. Отдельные ячейки в 5 мл PBS вымыть и удалить супернатант центрифугированием.
- Вновь приостановите клетки в 5 мл ячейки изоляции решения. Повторно загрузите еще один слой 5 мл раствора изоляции Светлоклеточная сформировать водный слой за слоем стек.
- Центрифуга подготовка клетки в 2012 × g для 10 минут получить супернатанта, который легче массовая плотность (< 1,077 г/см3), для последующего потока cytometry анализ.
- Подсчитать количество ячеек с Горяева.
-
Подготовка одной ячейки суспензий: лимфоузлов
- Выполните шаг 5.1.1-5.1.2.
- Добавьте 5 мл см с помощью пипетки 10-мл приостановить клетки, закупорить 3 - 4 раза. После тщательно приостановления клетки, используйте стерильные нейлоновая сетка для фильтрации клетки для коллекции в 15 мл Конические трубки.
- Спиновые клетки вниз на 646 ×g 7 мин при температуре 4 ° C и удалить супернатант.
- Добавьте еще 5 мл см в 10-мл Пипетки лучше приостановить клетки, закупорить.
- Вымойте с PBS и подсчитать количество ячеек.
-
Анализ потока цитометрии
- Аликвота 0.5-1 × 106 клеток в каждую ячейку флуоресценции активированный, сортировка (FACS) трубки.
- Центрифуга на 646 × g при 4 ° C на 5 мин и удалить супернатант.
- Добавьте 5 мкл каждого разбавленный флуоресценции конъюгированных антител подготовка к клеткам вновь приостановить Пелле клеток и вихрь.
Примечание: Важно оградить Пелле клетки от воздействия света как можно больше, ведь светочувствительные дневно обозначенные антитела. Генерировать мастер смесь антител и всегда добавить блок ФК. - Подготовьте СУИМ буфера с использованием 100 мкл PBS, 1% тепло инактивированная регулярные FBS и азид натрия 0,1%.
- Поместите образец в трубе при 4 ° C на 30 мин смыть клетки с 2-4 мл СУИМ буфера и центрифуги образца при 1700 об/мин за 7 мин при 4 ° C.
- Вновь приостановите клетки в 500 мкл буфера СУИМ в темноте. Проанализируйте клетки проточной цитометрии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для оценки соответствующих инъекции маршруты ИЯФ для активации лимфатической ткани DC, DC населения как линии была определена как –CD11c+ клетки в селезенке, iLN и млн и проанализированы уровни выражения co-stimulatory молекул. Лечение ИЯФ подкожной (s.c.) и инъекции внутривенные (и.в.) способствовало существенному увеличению CD40, CD80 и CD86 выражение в селезенке и iLN DCs (Рисунок 2B и 2 C). Зверолов и внутрибрюшной (и.п.) для инъекций INP, также значительно вверх регулируются уровни выражения CD40, CD80 и CD86 в селезенке и iLN DCs, по сравнению с в элементе PBS-лечение (Рисунок 2B и 2 C). В стимулировали млн DCs интраназально (и.н.) для инъекций ИЯФ назначен высокий вверх регулирование co-stimulatory молекул, по сравнению с PBS-лечение управления (Рисунок 2D). и.п. и и.в. инъекции ИЯФ также индуцированной заметное увеличение co-stimulatory молекулы выражение в млн, а устный, s.c., и инъекции зверолов ИЯФ не побудить активации млн DCs (Рисунок 2D).
Рисунок 1 : Расположение точки внутрибрюшинной инъекции Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Точное местоположение внутривенной инъекции Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : DC активации в лимфатических органов анализируемой проточной цитометрии. Мышей C57Bl/6 вводили с INP шесть различных инъекций маршрутов и 24 ч после инъекции, селезенке, iLN и млн были собраны. (A) DC в лимфатической ткани клеток населения был определен как линии –CD11c+ клеток в живых лейкоцитов. (B-D) Уровни выражения CD40, CD80 и CD86 были проанализированы проточной цитометрии в селезенки (B), iLN (C) и (D) млн. Данные являются средними от анализ шести независимых выборок. Результаты выражаются в виде средства ± Среднеквадратичная ошибка среднего значения (SEM). Статистическая значимость различий между экспериментальной группами была рассчитана с использованием дисперсионный анализ с непарных студент t-теста. p значений < 0,05 были значительными. * < 0,05, ** < 0.01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Многие достижения в области нанотехнологий и иммунологии были достигнуты благодаря терапевтических исследований лекарств и иммуностимуляция. Тщательный подбор метода инъекций известен имеет важное значение для иммуностимуляция, который был в центре внимания настоящего исследования.
Различные инъекции маршруты были оценены для естественно-нетоксичный и биологически на основе ДНК материала, ИЯФ (иммуностимулирующее наночастиц), чтобы определить, какой маршрут принесли лучшие результаты. Этот подход также актуальна для доставки других терапевтических агентов, включая антитела, антигены или другие адъювантов.
Чтобы проанализировать иммунного ответа на такие инъекции, урожай лимфатической ткани (селезенка, iLN и млн) не требуется. Изоляция лимфатическую тканей является наиболее важным аспектом этого протокола и требует использования метода, который не был описан ранее в деталях. Кроме того подготовка одноклеточных подвеска для дальнейшего анализа иммунные клетки не был хорошо описаны. Это исследование сосредоточено на извлечение лимфатической ткани, особенно iLN, млн и селезенки, для анализа DC активации. Системные активации иммунного ответа произошла главным образом через иммунные клетки в селезенке. Кроме того иммунных реакций в определенных тканях контролировались близлежащие лимфатические узлы. Оценка разработанных иммунной модулирующее молекул должна проводиться для определения ли молекул может побудить иммунную стимуляции в тканях. Таким образом может использоваться метод для изоляции лимфатической ткани и анализа DC активации в тканях для недавно разработанных иммунной стимулирующее молекул.
Для оценки иммунного стимулирующее влияние INP, собрано iLN, млн и селезенки и INP было показано для содействия лимфатическую DC активации. Как определено ранее, ИЯФ эффективно цели TLR9 стимуляции в DCs в мыши2. Макрофаги также выразить цитозольной TLR9 в мышах. Таким образом ИЯФ инъекции может вызвать активации DC и макрофагов. Однако макрофаги находятся в периферических тканей, которые способствуют фагоцитоза микробов в ткани. Кроме того сравнительно слабее, чем в DCs антиген презентация возможностей и мигрирующих эффект на лимфатические ткани макрофагами. Таким образом оценке инъекций маршрут ИНПС для иммунной стимулирующее действие был пригоден для изучения DCs в лимфатической ткани.
Таким образом режим Адъювантная иммунной администрации должны рассматриваться очень внимательно для достижения успешного иммунотерапия и вакцинации с использованием мягких материалов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано творческие материалы открытие программы через национальных исследований фонда из Кореи (NRF) финансируется министерством науки, ИКТ и будущего планирования (СР 2017M3D1A1039421) и морской биотехнологии программой, финансируемой Министерство океанов и рыболовства, Республика Корея и Грант (20150220).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| phosphate buffer saline | Corning | 21-040-CVR | Washing organs |
| (PBS, pH 7.4) | |||
| isoflurane solution | Aesica Queenborough limited | 26675-46-7 | Anesthesia process |
| Tuberculin 1mL syringe - | Junglim | N/A | Injection |
| 50 mL conical tube | S.P.L | 50050 | Anesthesia process |
| 1mL Insulin Syringe | (BD Ultra-FineTMII)_short needle | 324826 | Intramuscular Injection |
| DMEM High Glucose | Hyclone | SH30081.01 | Storing organs |
| Histopaque | Sigma-Aldrich | 10771 | FACS analysis |
| Ethyl alcohol anhydrous 99.5 % | Daejung | 4022-4110 | Disinfectant |
| Equipments | |||
| FineCycler C100 (Thermocycler) | Ssufine | - | Anealing |
| Centrifuge | Centrifuge | ||
| FACS tube | FALCON | 2052 | FACS analysis |
| Automated High-performance Flow Cytometer | BD (USA), FACSVerse | - | FACS analysis |
References
- Park, H. Preparation of dodecynyl modified DNA nanoparticles with unmethylated CpG adjuvant and ovalbumin for immunostimulation. , Department of Chemistry. Pukyong National University, Master Thesis. (2016).
- Jin, J. O., Park, H., Zhang, W., de Vries, J. W., Gruszka, A., Lee, M. W., Ahn, D. R., Herrmann, A., Kwak, M. Modular delivery of CpG-incorporated lipid-DNA nanoparticles for spleen DC activation. Biomaterials. 115, 81-89 (2017).
- Pal, I., Ramsey, J. D. The role of the lymphatic system in vaccine trafficking and immune response. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (10-11), 909-922 (2011).
- Jin, J. O., Kwak, M., Xu, L., Kim, H., Lee, T. H., Kim, J. O., Liu, Q., Herrmann, A., Lee, P. C. W. Administration of soft matter lipid-DNA nanoparticle as the immunostimulant via multiple routes of injection in vivo. ACS Biomaterial Science & Engineering. 3 (9), 2054-2058 (2017).
- Worbs, T., Hammerschmidt, S. I., Förster, R. Dendritic cell migration in health and disease. Nature Review Immunology. 17 (1), 30-48 (2017).
- Milling, S. W. F., Jenkins, C., MacPherson, G. Collection of lymph-borne dendritic cells in the rat. Nature Protocols. 1 (5), 2263-2270 (2006).
- Desormeaux, A., Bergeron, M. G. Lymphoid tissue targeting of anti-HIV drugs using liposomes. Methods in Enzymology. 391, 330-351 (2005).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).
- Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).
- General anesthesia of mice and rats. , Animal Care and Use Standards Committee. (2016).
- Guidelines for the Euthanasia of Animals. , Veterinary Record. (2013).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration I. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration III. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- Mebius, R. E., Kraal, G. Structure and function of the spleen. Nature Review Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).
