Summary
Vi præsenterer her, en detaljeret protokol for at differentiere humane pluripotente stamceller (hPSCs) i bugspytkirtlen/duodenum HOXD protein 1+ (PDX1+) celler for generation af pancreas lineages baseret på ikke-koloni type éncellelag vækst af adskilles enkelt celler. Denne metode er velegnet til producerer homogene hPSC-afledte celler, genmanipulation og screening.
Abstract
Humane pluripotente stamceller (hPSC)-afledte pancreas celler er en lovende celle kilde for regenerativ medicin og en platform til at studere menneskelige udviklingsprocesser. Trinvis instrueret differentiering, der sammenfatter udviklingsprocesser er en af de vigtigste måder at generere pancreas celler herunder bugspytkirtlen/duodenum HOXD protein 1+ (PDX1+) i bugspytkirtlen stamceller. Konventionelle protokoller indlede differentiering med små kolonier kort efter passage. Men i tilstanden af kolonier eller aggregater, celler er tilbøjelige til at heterogeneities, som kan hæmme differentiering til PDX1+ celler. Vi præsenterer her, en detaljeret protokol for at differentiere hPSCs i PDX1+ celler. Protokollen består af fire trin og initierer differentiering af seeding dissocierede enkelt celler. Induktion af SOX17+ endelige endoderm celler blev efterfulgt af udtryk for to primitive gut tube markører, HNF1β og HNF4α og eventuel differentiering i PDX1+ celler. Denne protokol giver nem håndtering og kan forbedre og stabilisere differentiering effektiviteten af nogle hPSC linjer, der fandtes tidligere for at differentiere ineffektivt i endodermal lineages eller PDX1+ celler.
Introduction
Bugspytkirtlen består hovedsageligt af eksokrine og endokrine celler, og dens dysfunktion eller overbelastning forårsager adskillige sygdomme som betændelse i bugspytkirtlen, diabetes og kræft i bugspytkirtlen. For at belyse pathogeny af pancreatopathy, er det nødvendigt at analysere den udviklingsmæssige proces og funktion i bugspytkirtlen celler. Derudover kræves en stabil celle forsyning med robust kvalitet at etablere celler/væv tilskud terapi. Humane pluripotente stamceller (hPSC)-afledte pancreas celler er en lovende celle kilde til disse formål, og differentiering protokol mod pancreas celler har været intensivt undersøgt1,2,3, 4. Seneste fremskridt inden for den in vitro-generation celleområde, pancreas β efterligne generation af β-celler i voksen menneskelige, og disse celler Vis terapeutiske virkning efter implantation i diabetisk model mus2,3. Derudover viste analyse af β celler genereret fra den inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) af sunde og type 1 diabetes patienten donorer ingen funktionelle forskelle, herunder når under stress5. Derudover er sygdom fænotyper blevet delvist gengivet i induceret i bugspytkirtlen celler med patienten-afledte iPSCs eller hPSCs husly genetiske mutationer i samme sted som patienter6,7.
Du kan generere i bugspytkirtlen celler fra hPSCs ved bruges trinvis styret differentiering, der sammenfatter udviklingsprocesser. Bugspytkirtlen er afledt fra endoderm lag af den tidlige embryon, som udtrykker sex bestemmelse af regionen Y-box 17 (SOX17) og forkhead boks A2 (FOXA2)8. Baseret på undersøgelser, mus, danner det endodermal lag primitive gut tube, som er præget af udtryk for hepatocyt nukleare faktor 1-beta (Hnf1β) og hepatocyt nukleare faktor 4-alpha (Hnf4α). Primitive gut tube elongates og udvikler sig til respiratorisk apparater, fordøjelseskanalen og organer. Efter strækforlængelse, posterior foregut område bliver regionen formodede i bugspytkirtlen som præget af udtryk for transcriptional faktor bugspytkirtlen/duodenum HOXD protein 1 (PDX1)8,9,10. De dorsale og ventrale dele af PDX1+ gut tube tykkere til form i bugspytkirtlen knopper, som er præget af fælles udtryk af bugspytkirtlen transskription faktor 1 subunit alpha (PTF1A) og NK6 HOXD 1 (NKX6.1)8,11. Dette udtryk markerer den morfologiske begyndelse i bugspytkirtlen organogenesis. Pancreas endoderm celler, som er komponenter af pancreas knopper, danner et forgrenet rørformede netværk af epitelial strukturer12 og i sidste ende udvikle sig til eksokrine og endokrine celler, herunder insulin-secernerende β-celler og Glucagon-secernerende α-cellerne. Udtryk for PDX1 registreres første ved den formodede pancreas region, som er så observeret gennem hele pancreas udvikling, og viser lokalisering til β-δ-cellerne og9,13,14. Selv om Pdx1+ celle-området, der ikke udtrykker Ptf1a eller Nkx6.1 differentierer i mavens antrum, duodenum, ekstrahepatisk galdegang og nogle tarmcellerne på midten til sent udviklingstrin i mus9, PDX1+ stamfaderen til bugspytkirtlen betragtes som celler den udviklingsmæssige tidligt i mennesker.
Vi præsenterer her, en detaljeret protokol for at differentiere hPSCs i PDX1+ celler for generation af pancreas lineages. Protokollen indviede differentiering af såning dissocieres enkelt celler15,16,17. Generelt, udifferentierede hPSCs vedligeholdes som kolonier eller celle aggregater i suspension eller vedhæftning. Som et resultat, indlede de fleste protokoller differentiering kort efter passaging. Dog i tilstanden af kolonier eller aggregater, celler er tilbøjelige til rumlige og transcriptional heterogeneities18,19,20,21,22, der kunne hæmme den første differentiering skridt mod endelige endoderm efterfulgt af ineffektive differentiering til PDX1+ celler. Denne protokol kan tilbyde nem håndtering for at forbedre og stabilisere differentiering effektivitet af nogle hPSC linjer, der fandtes tidligere for at differentiere ineffektivt at endodermal slægter og PDX1+ celler23, 24 , 25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Eksperimenter ved hjælp af hPSCs blev godkendt af den etiske komité i Institut for medicin og Graduate School of Medicine, Kyoto University.
1. forberedelse af materialer
Bemærk: Forberede alle medier og reagenser til cellekultur i et sterilt miljø. Varm op base dyrkningsmedier til stuetemperatur (RT) før brug. Medium for differentiering bruges inden for 6 h på RT. detaljer af reagenser er angivet i Tabel af materialer.
-
Differentiering (figur 1A)
- Etape 1A medium: overføre RPMI 1640 medium ind i et rør, ved hjælp af en pipette. Tilføje serumfrit supplement, activin A, CHIR99021 og Y-27632 til en koncentration af 1 x, 100 ng/mL, 3 μM og 10 μM, henholdsvis.
- Stadium 1B medium: overføre RPMI 1640 medium ind i et rør, ved hjælp af en pipette. Tilføje serumfrit supplement, activin A og CHIR99021 til en koncentration af 1 x, 100 ng/mL, ≤1 μM, henholdsvis.
Bemærk: Koncentrationen af CHIR99021 skal være lavere end i Stadium 1A medium, og desuden er ikke nødvendigt, men det øger celle nummer. - Fase 2 medium: overførsel forbedret MEM (iMEM) medium ind i et rør, ved hjælp af en pipette. Tilføje serumfrit supplement og keratinocytter vækstfaktor (KGF) til en koncentration på 0,5 x og 50 ng/mL, henholdsvis.
- Fase 3 medium: overførsel iMEM medium ind i et rør, ved hjælp af en pipette. Tilføj den serumfrit supplement, KGF, NOGGIN, 3-Keto-N-aminoethyl-N'- aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine (CYC) og 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic syre (TTNPB) med pipette til koncentrationer af 0,5 x, 50 ng/mL, 100 ng/mL, 0,5 μM og 10 nM, henholdsvis.
-
Flowcytometri (FCM)
- 1 x Permeabilization/Wash buffer: overføre vand ind i et rør med pipette. Tilføje Permeabilization/Wash buffer med en pipette til en koncentration af 1 x.
- FCM blokering løsning: overføre 1 x Permeabilization/Wash buffer ind i et rør med pipette. Tilføje æsel serum med en pipette til en koncentration på 2% (vol/vol).
-
Immunfarvning
- Blokering løsning: overførsel Dulbecco Phosphate-Buffered saltvand (DPBS) ind i et rør med pipette. Tilføje æsel serum og Triton X med pipette til koncentrationer på 5% (vol/vol) og 0,4% (vol/vol), henholdsvis.
2. hPSC differentiering til Posterior Foregut celler/pancreas stamfaderen (PDX1+ celler)
Bemærk: Gennemføre alle procedurerne med steril teknik. hPSCs vedligeholdes på 6-godt plader overtrukket af en syntetisk overflademateriale til hPSCs med hPSC vedligeholdelse medium ifølge producentens instruktioner17,26. Når celler nå 50-80% confluency (fase 0) bruge dem til differentiering.
-
Forberede basalmembranen matrix-belagte plader.
- Overførsel 6 mL af RPMI 1640 (4 °C) ind i et rør afkøles til 4 °C på is. Tilsæt 2 mg af basalmembranen matrix (4 °C) med luftkølet 1 mL-pipette tips og bland godt ved blid pipettering for at gøre 0,33 mg/mL basalmembranen matrix.
- Overføre 2 mL fortyndet basalmembranen matrix til hver brønd af 6-godt celle kultur plader med en pipette. Læg pladerne ved 37 °C i 60-90 min. i en inkubator. Bagefter, holde pladerne på RT indtil brug (inden for 3 h).
-
Frø af hPSCs og indlede differentiering til endelige endoderm (Stadium 1A).
- Opsug den anvendte medium og tilsættes 2 mL 0,5 mM ethylendiamintetra syre (EDTA) (RT) pr. brønd med pipette at vaske hPSCs kulturperler i 6-godt plader.
- Opsug 0,5 mM EDTA og tilsættes 2 mL 0,5 mM EDTA pr. brønd med pipette. Inkuber plader ved 37 °C i 5 min.
- Opsug 0,5 mM EDTA og tilsættes 1 mL hPSC vedligeholdelse medium på RT suppleret med 10 μM Y-27632 pr. godt med pipette. Tilsæt forsigtigt men hurtigt for at blæse knyttet celler på pladerne og at adskille klumpet celler i enkelte celler. Boble ikke cellesuspension under pipettering.
- Overføre cellesuspension i et 50 mL centrifugeglas indeholdende 4 mL af hPSC vedligeholdelse medium på RT suppleret med 10 μM Y-27632. Forsigtigt afpipetteres cellesuspension.
- Antal celle celle suspension benytter Trypan blå plet udstødelse procedure.
- Mix 15 μl cellesuspension og 15 μl af Trypan blå i et rør.
- 10 μL af cellesuspension fortyndes med Trypan blå på celle tælle dias i to eksemplarer af 10 μL pipette overføres.
- Tæller cellen nummer med en automatisk celle counter og beregne celle tæthed i cellesuspension. Levedygtighed er normalt > 98%.
- Alikvot cellesuspension i et 50 mL centrifugeglas på 1-1.5 x 106 celler pr. brønd af 6-godt plader (1-1,5 x 105 celler/cm2).
- Der centrifugeres 50 mL tube på 200 x g på RT for 5 min.
- Opsug supernatanten ved hjælp af en pipette og resuspend celler med 1 mL af Etape 1A medium (RT) pr. brønd. Forsigtigt afpipetteres cellesuspension og tilføje en anden 1 mL af Etape 1A medium (samlede, 2 mL pr. brønd).
- Opsug den fortyndede basalmembran matrix i wells af celle kultur plader forberedt i trin 2.1.2 med 1000 μL pipette. Gå videre til næste trin straks.
- Forsigtigt afpipetteres cellesuspension taktfast 2.2.8 igen. Umiddelbart efter blandingen, overføre cellesuspension (2 mL) til hvert hul i en 6-godt plade. Dække pladen med en aluminiumsfolie at beskytte pladen fra lys. Pladen anbringes i den rene bænk på RT for 10-15 min.
Bemærk: Flyt ikke pladen efter såning. - Forsigtigt læg pladen i et 37 °C, 5% CO2 inkubator (fugtig atmosfære) og kultur i 24 timer.
Bemærk: Ryst ikke pladen efter såning.
-
Inducere differentiering i endelige endoderm (etape 1B).
- Opsug den anvendte medium og tilsættes 2 mL DPBS brønde med pipette. Gentag aspiration og tilsætning af DPBS én gang.
Bemærk: Hvis du vil fjerne alle døde celler fra éncellelag, Ryst forsigtigt plade før hver aspiration. - Opsug den anvendte DPBS med en pipette og tilsættes 4 mL af fase 1B medium (37 °C) pr. brønd. Anbring forsigtigt pladen ind i 37 °C inkubator (fugtig atmosfære med 5% CO2) og kultur for 48 h.
- Opsug den anvendte medium og tilsættes 2 mL DPBS til brønden med pipette. Gentag aspiration og tilsætning af DPBS én gang.
Bemærk: Fjerne de døde celler fra éncellelag af blid ryster før hver aspiration. - Opsug den anvendte DPBS med pipette og tilsættes 4 mL af fase 1B medium (37 °C) pr. brønd. Anbring forsigtigt pladen ind i inkubator (37 °C, befugtet atmosfære med 5% CO2) og kultur i 24 timer.
- Opsug den anvendte medium og tilsættes 2 mL DPBS brønde med pipette. Gentag aspiration og tilsætning af DPBS én gang.
-
Inducere differentiering i primitive gut tube (fase 2).
- Opsug den anvendte medium og tilsættes 2 mL DPBS til brønden med pipette.
Bemærk: Fjerne de døde celler fra éncellelag af blid ryster før hver aspiration. - Opsug den anvendte DPBS med pipette og tilsættes 4 mL af fase 2 medium (37 °C) pr. brønd. Læg pladen i inkubator (37 °C, befugtet atmosfære med 5% CO2) og kultur i 4 dage.
- Opsug den anvendte medium og tilsættes 2 mL DPBS til brønden med pipette.
-
Inducere differentiering i PDX1+ celler (fase 3).
- Opsug den anvendte medium og tilsættes 2 mL DPBS til brønden med pipette. Gentag aspiration og tilsætning af DPBS én gang.
- Opsug den anvendte DPBS med pipette og tilsættes 4 mL af fase 3 medium (37 °C) pr. brønd. Læg pladen i inkubator (37 °C, befugtet atmosfære med 5% CO2) og kultur i 3 dage.
-
Inducere differentiering i pancreas endokrine celler.
- Udføre NKX6.1+ celle induktion (fase 4, 8 dage) efterfulgt af endokrine celle induktion (fase 5, 12 dage) med tidligere beskrevet protokoller3,16,26. Karakterisere og validere de endokrine Celledifferentiering ved immunfarvning og kvantitative real-time reverse transkription polymerase kæde reaktion (qRT-PCR) analyse.
Bemærk: Henvise til Toyoda et al.16 og Kimura et al.26 for detaljerede eksperimentelle procedurer. Se tabel 1 for primer sekvenser bruges til qRT-PCR analyse.
- Udføre NKX6.1+ celle induktion (fase 4, 8 dage) efterfulgt af endokrine celle induktion (fase 5, 12 dage) med tidligere beskrevet protokoller3,16,26. Karakterisere og validere de endokrine Celledifferentiering ved immunfarvning og kvantitative real-time reverse transkription polymerase kæde reaktion (qRT-PCR) analyse.
3. flowcytometri (FCM)
- Opsug den anvendte medium og tilsættes 2 mL 0,5 mM EDTA til brønden med pipette. Gentag aspiration og tilsætning af 0,5 mM EDTA én gang.
Bemærk: Ryst plade forsigtigt for at fjerne alle døde celler fra éncellelag cellerne før hver aspiration. - At adskille celler (ca 3-6 × 106 celler pr. brønd), der tilsættes 2 mL 0,25% Trypsin indeholdende 0,5 mM EDTA pr. brønd. Inkuber plader ved 37 °C i 5-10 min.
- Tilsæt forsigtigt men hurtigt at adskille klumpet celler i enkelte celler. Boble ikke cellesuspension under pipettering.
- Tilføje 8-10 mL af base medium (RPMI 1640 eller iMEM, RT) indeholdende 0,5 x serumfrit supplement og 10 μM Y-27632 pr. godt og bland cellesuspension. Overføre cellesuspension til et centrifugeglas.
- Der centrifugeres rør på 300 x g på RT for 5 min.
- Opsug supernatanten og resuspend celler med 2 mL 0,5 mm EDTA (RT). Forsigtigt afpipetteres cellesuspension.
- Der centrifugeres rør på 300 x g på RT for 5 min.
- Opsug supernatanten og resuspend celler med 100 μL af fiksering og permeabilization buffer pr. 106 celler under en hætte. Forsigtigt afpipetteres cellesuspension under en hætte. Hold røret på RT for 30 min.
- Der centrifugeres tube på 400 x g på RT for 5 min.
- Opsug supernatanten under en hætte og resuspend celler med 500 μL FCM blokering løsning pr. 106 celler. Forsigtigt afpipetteres cellesuspension. Hold røret på RT for 30 min.
- Overføre 50 μL af en cellesuspension til et rør (ca 1 x 105 celler). Der centrifugeres tube på 400 x g på RT for 5 min. Fjern supernatanten og resuspend celler med 100 μL fortyndet primære antistof (Se Tabel af materialer) i FCM blokering løsning og inkuberes ved 4 °C for > 16 h.
- Der centrifugeres tube på 400 x g på RT for 5 min. Fjern supernatanten og resuspend celler med 180 μL 1 x Perm/Wash buffer.
- Der centrifugeres tube på 400 x g på RT for 5 min. Fjern supernatanten og resuspend celler med 100 μL fortyndet sekundær antistof (Se Tabel af materialer) i FCM blokering løsning. Inkuber cellerne på RT for 60 min. eller ved 4 °C for > 16 h med beskyttelse mod lys.
- Der centrifugeres tube på 400 x g på RT for 5 min. Fjern supernatanten og resuspend celler med 180 μL 1 x Perm/Wash buffer.
- Der centrifugeres tube på 400 x g på RT for 5 min. Fjern supernatanten og resuspend celler med 180 μL af 2% æsel serum i DPBS.
- Filtrere cellesuspension ved at overføre på en 5 mL rund bund polystyren rør med en celle si (35 µm nylon mesh) og holde ved 4 °C med beskyttelse mod lys indtil analysen.
- Analysere en del af positivt farvede celler af en flow Flowcytometret27.
4. immunfarvning
- Opsug den anvendte medium og tilsættes 2 mL DPBS til brønden med pipette. Gentag aspiration og tilsætning af DPBS én gang.
Bemærk: Ryst forsigtigt plade for at fjerne alle døde celler fra éncellelag cellerne før hver aspiration. - Der tilsættes 2 mL 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) (4 °C) pr. brønd med pipette under en hætte. Holde pladen ved 4 °C i 20 min.
- Fjerne PFA med pipette under en hætte. Tilsættes 2 mL af DPBS på RT til brønden med pipette under en hætte. Gentag aspiration og tilsætning af DPBS én gang.
- Der tilsættes 2 mL blokerende løsning pr. brønd og holde pladen på RT for 30 min.
- Opsug den anvendte løsning og tilsættes 1 mL af primære antistof (Se Tabel af materialer) i blokerende løsning pr. brønd. Ruger på RT for 60 min. eller ved 4 °C for > 16 h.
- Opsug den anvendte løsning, tilsættes 2 mL af DPBS 0,4 vægtprocent Triton X-100 og inkuberes ved RT i 10 min. Gentag aspiration, tilsætning af løsning og inkubering én gang.
- Opsug den anvendte løsning og tilsættes 1 mL af sekundær antistof (Se Tabel af materialer) i blokerende løsning pr. brønd. Der inkuberes ved RT i 60 min. med beskyttelse mod lys.
- Opsug den anvendte løsning, tilsættes 2 mL af DPBS 0,4 vægtprocent Triton X-100 (RT) og inkuberes ved RT for 5 min med beskyttelse mod lys. Gentag aspiration, tilsætning af løsning og inkubering to gange.
- Tage micrographs at undersøge differentiering effektivitet under et fluorescens mikroskop28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Formeringsmaterialets hiPSCs (585A129,30) er kondenseret og danner en homogen éncellelag (figur 1B), der er velegnet til differentiering. Udifferentierede hiPSCs (fase 0) er adskilt og re seedet som enkelt celler ved lav celle tætheder (1-1,5 x 105 celler/cm2). Inden for 1 time, cellerne er knyttet til pladen og begynde at vise fremspring. På dag 1, er cellerne tilvækst og godt fordelt til at dække 80-90% af arealet. Under fase 1B synes medierne uklar på grund af døde celler. Fjernelse af døde celler er kritisk for højeffektive differentiering, da døde celler sandsynligvis forstyrre overlevelse og differentiering af celler liggende nedenunder. På dage 3-4, danner celler en homogen éncellelag ark, der kan beskrives som en brosten udseende. På dette tidspunkt, de fleste celler stop udtrykker sex bestemmelse af regionen Y-box 2 (SOX2), en markør for udifferentierede celler, og i stedet udtrykker en definitiv endoderm markør, SOX17, på mere end 90% (figur 2A og B). De fleste SOX17+ celler udtrykkelige FOXA2 (figur 2A). Begyndende differentiering med en upassende celle tæthed kompromiser differentiering effektivitet på dette trin (figur 3). På trin 2 og 3, celledød slapper, og den anvendte medium er ikke så overskyet, som det er i fase 1B. Cellerne udtrykke primitive gut tube markører HNF1β og HNF4α (figur 2 c) og til sidst udtrykke en posterior foregut/pancreas stamfader markør, PDX1, på mere end 90% (figur 2D og E). PDX1+ celle induktion er reproducerbare på en anden hiPSC linje, 1231A3 31, og en menneskelige stamceller linje, KhES-3 32 (figur 4). qRT-PCR resultaterne af mRNA udtryk for fase markører var i overensstemmelse med immunfarvning (figur 5A). MRNA udtryk for PDX1 er tydelig i fase 3 og øger væsentligt efterskrift.
PDX1+ celler på tidligt udviklingstrin har potentiale til at differentiere til ikke kun i bugspytkirtlen celler, men også mavens antrum, duodenum, ekstrahepatisk galdegang og en del af tarmen 9. Differentiering potentiale af in vitro-genereret PDX1+ celler i bugspytkirtlen celler kan vurderes ved udvidet kultur med rapporterede protokoller for pancreas endoderm og pancreas endokrine celler,3,16, 26. udtryk af pancreas endoderm markør, NKX6.1og to i bugspytkirtlen endokrine markører, INSULINog GLUCAGON, blev observeret på dage 19 (fase 4) og 31 (trin 5), henholdsvis (figur 5).
Figur 1: repræsentative udseende af celler under trinvis differentiering. (A) A ordningen af styret differentiering fra hPSCs til pancreas lineages. Tallene i parentes angiver koncentrationer (enheder er skrevet nedenfor). (B) repræsentative lysfelt micrographs af hiPSCs på vigtige trin i differentiering kulturen. 585A1 hiPSCs blev adskilt som enkelt celler og tilskyndet til at differentiere i endelige endoderm, primitive gut tube og posterior foregut/pancreas stamfader. Panelerne lavere er udvidede udsigt over de øvre paneler. RPMI, RPMI 1640; AA, activin en (ng/mL); CH, CHIR99021 (ΜM); KGF (ng/mL); NOG, NOGGIN (ng/mL); CYC, 3-Keto-N-aminoethyl-N'-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine (μM); TTNPB, 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic syre (nM). Skalere barer = 300 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: repræsentative induktion mod pancreas lineages fra hiPSCs. (A) andelen af SOX2-SOX17+ celler analyseret ved flowcytometri før differentiering (fase 0) og på dag 4 (etape 1B). Udifferentierede hiPSCs (SOX2+SOX17-) blev differentieret til endelige endoderm (SOX2-SOX17+). De fleste SOX17+ celler Co udtrykt FOXA2. (B) repræsentative immunfluorescent micrographs på dag 4 (etape 1B). De faste celler blev farvet for SOX17 (grøn), SOX2 (rød) og kerner (blå). (C) repræsentative immunfluorescent micrographs på dage 4 (etape 1B) og 8 (fase 2). De faste celler blev farvet for HNF1β (grøn), HNF4α (rød) og kerner (blå). (D) andelen af celler positiv for PDX1, som analyseres ved flowcytometri på dage 4 (etape 1B) og 11 (fase 3). (E) repræsentative immunfluorescent micrographs af PDX1 (grøn) og kerner (blå) på dag 11 (fase 3). Skalere barer = 100 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: repræsentant induktion mod endelige endoderm indledt fra forskellige celle tætheder. (A) repræsentative lysfelt micrographs af celler 1 h efter differentiering. hiPSCs blev taget som enkelt celler og tilskyndet til at differentiere i endelige endoderm ved forskellige celle tætheder (1-50 x 104/cm2). Panelerne lavere er udvidede udsigt over de øvre paneler. (B) andel af SOX2-SOX17+ celler analyseret ved flowcytometri før differentiering (fase 0) og på dag 4 (etape 1B). (C) andelen af PDX1+ celler analyseret ved flowcytometri på dage 8 (fase 2) og 11 (fase 3). Skalere barer = 300 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Repræsentative induktion mod PDX1+ celler i hiPCSs og hESCs. En hiPSC linje, 1231A3 (A), og en menneskelige stamceller linje, KhES-3 (B), blev differentieret til endelige endoderm og PDX1+ celler. Celle sammensætning blev analyseret ved flowcytometri. Andelen af SOX2-SOX17+ celler blev analyseret før differentiering (fase 0) og på dag 4 (etape 1B). Andelen af PDX1+ celler blev analyseret på dage 8 (fase 2) og 11 (fase 3). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: repræsentative induktion mod pancreas endoderm og endokrine celler. hiPSCs (585A1) blev differentieret i PDX1+ celler. Cellerne blev yderligere opdeles i pancreas endoderm og pancreas endokrine celler med rapporterede protokoller3,16,26. (A) mRNA udtryk af fase markører blev målt ved kvantitative real-time polymerase kæde reaktion (qRT-PCR). Dataene blev normaliseret til GAPDH udtryk og præsenteret som fold-ændringer i genekspression i forhold til spidsværdien. Bemærk at PDX1 udtryk blev øget på > 20-fold fra dage 8 (fase 2) til 11 (fase 3) og på > 100-fold fra dage 11 (fase 3) til 19 (fase 4). Udtryk i den voksne menneskelige bugspytkirtlen er vist som Panc. SOX2, sort; SOX17, lilla; HNF1β, brun; HNF4α, orange; PDX1, lys grøn; NKX6.1, grøn; INSULIN, blå; GLUKAGON, red. (B) repræsentative immunfluorescent micrographs af pancreas endoderm markør, NKX6.1 (rød), på dage 11 (fase 3) og 19 (fase 4). PDX1 (grøn) og kerner (blå) var Co farves. (C) repræsentative immunfluorescent micrographs af to pancreas endokrine beslutningstagere, insulin (INS, grønne) og glukagon (GCG, red), på dage 19 (fase 4) og 31 (trin 5). Kerner (blå) var Co farves. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Gen navn | Gen symbol | Fremad primer | Omvendt primer |
| glyceraldehyd-3-phospha te dehydrogenase |
GAPDH | GAAGGTGAAGGTCGGAGTC | GAAGATGGTGATGGGATTTC |
| SRY-box 2 | SOX2 | AGTCTCCAAGCGACGAAAAA | TTTCACGTTTGCAACTGTCC |
| SRY-rubrik 17 | SOX17 | CGCACGGAATTTGAACAGTA | TTAGCTCCTCCAGGAAGTGTG |
| HNF1 HOXD B | HNF1Β | CCTCTCCTCCAAACAAGCTG | TGTTGCCATGGTGACTGATT |
| hepatocyt nukleare faktor 4 alpha | HNF4Α | GAGCTGCAGATCGATGACAA | TACTGGCGGTCGTTGATGTA |
| pancreas og duodenal HOXD 1 | PDX1 | AGCAGTGCAAGAGTCCCTGT | CACAGCCTCTACCTCGGAAC |
| NK6 HOXD 1 | NKX6.1 | ATTCGTTGGGGATGACAGAG | TGGGATCCAGAGGCTTATTG |
| glukagon | GCG | GAATTCATTGCTTGGCTGGT | CGGCCAAGTTCTTCAACAAT |
| insulin | INS | CTACCTAGTGTGCGGGGAAC | GCTGGTAGAGGGAGCAGATG |
Tabel 1: Primere for qPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Generation af PDX1+ celler består af flere trin; Derfor er det kritisk at behandle celler på et passende tidspunkt. Blandt skridt, endelige endoderm induktion effektivitet i høj grad påvirker den endelige induktion effektivitet, muligvis af interferens fra andre forurenende slægt celler (dvs. mesoderm og ectoderm), der kan formere sig og/eller udskiller faktorer, der forstyrre specifikke differentiering. Hvis andelen af SOX17+ celler er lavere end 80% på dag 4 (etape 1B), en effektiv induktion til PDX1+ celler er tilbøjelige til at blive kompromitteret.
Udifferentierede stater af hPSCs vedligeholdes som kolonier eller aggregater af komprimerede celler. Dog kan metoder, der starter differentieringen fra kolonier eller aggregater lide af heterogenitet, på grund af forskellige celle vedhæftning og tæthed i kolonien, sådan som i center og periferi22, og fordi cellerne på forskellige stadier i cellecyklus25. På den anden side starter vores metode med dissocierede enkelt celler, som muliggør en forholdsvis homogen tilstand af cellen vedhæftning af enkelt celler eller celle tæthed i hver enkelt celle. Med hensyn til ensartet håndtering for hver celle, kan vores metoder være lettere end andre, der starter med koloni eller sammenlægning kulturer.
Selv om vores protokol kan bruges til at fremkalde PDX1+ celler fra flere hPSC linjer, differentiering kunne stadig være ineffektiv. I sådanne tilfælde, forskelle i vedhæftningen stat lige efter såning blandt hPSC linjerne kunne være årsagen, og ændring af seeding massefylde kunne være en løsning33. Ja, figur 3 viser den upassende seeding celle tæthed kompromiser differentiering i endelige endoderm og PDX1+ celler. Interessant, optimal celle tætheden for PDX1+ celle induktion var forskellige blandt de cellepopulationer, der opnåede > 90% endelige endoderm. En anden mulighed for ineffektive differentiering er dårlig vedligeholdelse tilstand af den udifferentierede hPSCs, som kompromiser kvaliteten af pluripotency trods udtryk markører for udifferentierede staten. I dette tilfælde hPSC ekspansion kultur bør være genoptaget fra tidlig passage frosne bestande eller sub kloning bør udføres for at opnå hPSCs under betryggende forhold. I tilfælde af ineffektive differentiering på dage 8 (fase 2) eller 11 (fase 3), skal varigheden af disse skridt optimeres. Støtter denne idé, varigheden af fase 3 har vist sig kritisk for at erhverve senere fase celle egenskaber og er cell line-afhængige i pancreas lineage34.
Generation af PDX1+ celler er afgørende for den in vitro-generation af pancreas celler. PDX1 er funktionelt afgørende for pancreas udvikling baseret på viden fra Pdx1 null mus, som er apancreatic35. Konsekvent, in vitro- og in vivo implantation undersøgelser viste hPSC-afledt PDX1+ celler har potentiale til at udvikle sig til alle i bugspytkirtlen komponenter, herunder eksokrine og endokrine celler såsom pancreas β-celler3,16 , 36 , 37. således at effektiv generation af PDX1+ celler fra hPSCs fører til en stabil i bugspytkirtlen celle udbud for etablering af β celleterapi mod diabetes og forståelse for udvikling af menneskelige bugspytkirtlen og pancreas sygdomme.
Begrænsningerne ved denne metode er relateret til formatet todimensionale (2D) éncellelag kultur, som ikke er egnet til visse celletyper og celle behandling. I de seneste år, har tre-dimensionelle (3D) kulturer vist sig at fremme generation af modne celler og væv, muligvis på grund af efterligne den in vivo mikromiljø. For eksempel, β celler genereret i 3D kulturer men ikke 2D éncellelag kulturer kunne opnå evnen til at udskille insulin reaktion på ekstracellulære glucose niveauer38.
For at bruge PDX1+ celler for generation af udviklingshæmmede senere celletyper, det er vigtigt at skifte til 3D kulturer, såsom suspension kulturer af aggregater indlejret i en ekstracellulære matrix og samlede kulturer på en luft-flydende interface3 , 16 , 37. Desuden 2D éncellelag kulturer kræver mere areal til dyrkning end suspension kulturer, begrænse skalerbarhed. Behandling af store mængder af celler til erhvervsbrug kræver ændringer såsom brugen af microbeads. På samme tid er den nuværende metode egnet til screening af differentiering-inducerende faktorer og udforskningen af molekylære mekanismer af genoverførsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet i en del af finansiering fra Japan samfundet for fremme videnskab (JSP'ER) gennem Scientific Research (C) (JSP'ER KAKENHI Grant Number15K09385 og 18 K 08510) til T.T. og licensbetaling for JSP'ER forskningsstipendiater (JSP'ER KAKENHI Grant antallet 17J07622) til A.K. og Japan Agency for medicinalforskning og udvikling (AMED) gennem sin forskning give "Core Center for iPS Cell Research, Research Center netværk for realisering af regenerativ medicin" til K.O. Forfatterne takke Dr. Peter Karagiannis for læsning af manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Keto-N-aminoethyl-N′-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine | Toronto Research Chemicals | K171000 | CYC |
| 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic acid | Santa Cruz Biotechnology | SC-203303 | TTNPB |
| 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
| Anti-CDX2 antibody [EPR2764Y] | Abcam | Ab76541 | Anti-CDX2, × 1/1000 dilution |
| B-27 Supplement (50 ×) | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | Serum-free supplement |
| BD FACSAria II Cell Sorter | BD Biosciences | For flow cytometry | |
| Biomedical freezer | SANYO | MDF-U538 | For -30 °C storing |
| Cell Counting Slides for TC10/TC20 Cell Counter, Dual-Chamber | BIO-RAD | 1450011 | Counting slide glass |
| CELL CULTURE MULTIWELL PLATE, 6 WELL, PS, CLEAR | Greiner bio-one | 657165 | For differentiation culture/6-well plate |
| Centrifuge | TOMY | AX-310 | For cell culturing |
| Centrifuge | TOMY | MX-305 | For RT-qPCR |
| CHIR99021 | Axon Medchem | Axon 1386 | |
| CLEAN BENCH | SHOWA KAGAKU | S-1601PRV | Clean bench |
| Corning CellBIND 6-well plate | Corning | 3335 | For feeder-free culture of hPSCs/6-well plate |
| Corning Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | Basement membrane matrix |
| Corning Synthemax II-SC Substrate | Corning | 3535 | For feeder-free culture of hPSCs/synthetic surface material for hPSCs |
| Cryostat | Leica | Leica CM1510 S | For immunostaining of aggregates. |
| Cytofix/Cytoperm Kit | Becton Dickinson | 554714 | Perm/Wash buffer is Permeabilization/Wash buffer. Cytofix/Cytoperm buffer is fixation and permeabilization buffer. |
| Dako pen | Dako | S2002 | For immunostaining of aggregates |
| dNTP mix (10 mM) | Thermo Fisher Scientific | 18427-088 | For RT-qPCR |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11055 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10036 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10040 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey Serum | Merck Millipore | S30 | Donkey serum |
| D-PBS(-) without Ca or Mg | Nacalai tesque | 14249-95 | DPBS |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | For feeder-free culture of hPSCs/hPSC maintenance medium |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | 5 mL round bottom polystyrene tube with cell strainer |
| Filter Tip, 1,000 µL | Watoson | 124-1000S | Use together with pipettes |
| Filter Tip, 20 µL | Watoson | 124-P20S | Use together with pipettes |
| Filter Tip, 200 µL | Watoson | 124-P200S | Use together with pipettes |
| Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X700 | For immunostaining |
| Forma Steri-Cycle CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 370A | Incubator |
| HNF-1β Antibody (C-20) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7411 | Anti-HNF1β, × 1/200 dilution |
| HNF-4α Antibody (H-171) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8987 | Anti-HNF4α, × 1/200 dilution |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | For nucleus staining, × 1/200 dilution |
| Human Pancreas Total RNA | Ambion | AM7954 | For RT-qPCR |
| Human PDX-1/IPF1 Antibody | R&D Systems | AF2419 | Anti-PDX1, goat IgG, × 1/200 dilution |
| Human SOX17 Antibody | R&D Systems | AF1924 | Anti-SOX17, × 1/200 dilution |
| Improved MEM Zinc Option medium | Thermo Fisher Scientific | 10373-017 | iMEM |
| Incubation chamber | Cosmo Bio | 10DO | For immunostaining of aggregates |
| Latex Examination Gloves | Adachi | ||
| MAS coated slide glass | Matsunami Glass | 83-1881 | For immunostaining of aggregates |
| MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | 4346907 | For RT-qPCR |
| Microscope | Olympus | CKX41N-31PHP | For cell culturing |
| Microtube | Watoson | 131-515CS | |
| Monoclonal Anti-α-Fetoprotein | SIGMA | A8452 | Anti-AFP, × 1/200 dilution |
| Nanodrop 8000 | Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Oligo dT | FASMAC | Custom made Oligo | For RT-qPCR of sequence is "TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT" |
| Paraformaldehyde, powder | Nacalai tesque | 26126-54 | PFA, fixative, diluted in DPBS |
| Pharmaceutical refrigerator | SANYO | MPR-514 | For 4 °C storing |
| PIPETMAN P | GILSON | Pipette | |
| Recombinant Human KGF/FGF-7 | R&D Systems | 251-KG | KGF |
| Recombinant Human Noggin | PeproTech | 120-10C | NOGGIN |
| Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A | R&D Systems | 338-AC | Activin A |
| ReverTra Ace (100 U/μL) | TOYOBO | TRT-101 | For RT-qPCR |
| RNase-free DNase Set (50) | QIAGEN | 79254 | For RT-qPCR |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | For RT-qPCR |
| RPMI 1640 with L-Gln | Nacalai tesque | 30264-85 | RPMI 1640 |
| Sealing Film for Real Time | Takara | NJ500 | For RT-qPCR |
| Serological pipettes 10 mL | Costar/Corning | 4488 | For cell culturing |
| Serological pipettes 25 mL | Costar/Corning | 4489 | For cell culturing |
| Serological pipettes 5 mL | Costar/Corning | 4487 | For cell culturing |
| Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAb | Cell signaling | 3579S | Anti-SOX2, × 1/200 dilution |
| StepOnePlus | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Sucrose | Nacalai tesque | 30406-25 | For immunostaining of aggregates |
| TB Green Premix Ex Taq II |
Takara | RR820B | For RT-qPCR |
| TC20 Automated Cell Counter | BIO-RAD | 1450101J1 | Automatic cell counter |
| Tissue-Tek OCT compound 4583 | Sakura Finetechnical | 4583 | For immunostaining of aggregates |
| Tissue-Tek Cryomold Molds/Adapters | Sakura Finetechnical | 4566 | For immunostaining of aggregates |
| Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| Trypan Blue | BIO-RAD | 1450021 | |
| Ultracold freezer | SANYO | MDF-U33V | For -80 °C storing |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | Dilute with DPBS to prepare 0.5 mM EDTA |
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Y-27632 | Wako | 251-00514 |
References
- D'Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 24 (11), 1392-1401 (2006).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
- Kondo, Y., Toyoda, T., Inagaki, N., Osafune, K. iPSC technology-based regenerative therapy for diabetes. Journal of Diabetes Investigation. 9 (2), 234-243 (2017).
- Millman, J. R., et al. Generation of stem cell-derived beta-cells from patients with type 1 diabetes. Nature Communications. 7, 11463 (2016).
- Zeng, H., et al. An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery. Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).
- Hosokawa, Y., et al. Insulin-producing cells derived from 'induced pluripotent stem cells' of patients with fulminant type 1 diabetes: Vulnerability to cytokine insults and increased expression of apoptosis-related genes. Journal of Diabetes Investigation. , (2017).
- Jennings, R. E., et al. Development of the human pancreas from foregut to endocrine commitment. Diabetes. 62 (10), 3514-3522 (2013).
- Jorgensen, M. C., et al. An illustrated review of early pancreas development in the mouse. Endocrine Reviews. 28 (6), 685-705 (2007).
- Jensen, J. Gene regulatory factors in pancreatic development. Developmental Dynamics. 229 (1), 176-200 (2004).
- Hald, J., et al. Generation and characterization of Ptf1a antiserum and localization of Ptf1a in relation to Nkx6.1 and Pdx1 during the earliest stages of mouse pancreas development. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (6), 587-595 (2008).
- Villasenor, A., Chong, D. C., Henkemeyer, M., Cleaver, O. Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis. Development. 137 (24), 4295-4305 (2010).
- Serup, P., et al. The homeodomain protein IPF-1/STF-1 is expressed in a subset of islet cells and promotes rat insulin 1 gene expression dependent on an intact E1 helix-loop-helix factor binding site. Biochemical Journal. 310 (Pt 3), 997-1003 (1995).
- Riedel, M. J., et al. Immunohistochemical characterisation of cells co-producing insulin and glucagon in the developing human pancreas. Diabetologia. 55 (2), 372-381 (2012).
- Mae, S. I., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 4, 1367 (2013).
- Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
- Toyoda, T., et al. Rho-Associated Kinases and Non-muscle Myosin IIs Inhibit the Differentiation of Human iPSCs to Pancreatic Endoderm. Stem Cell Reports. 9 (2), 419-428 (2017).
- Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D., Robey, P. G. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14 (1), 13-26 (2014).
- Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
- Nguyen, Q. H., et al. Single-cell RNA-seq of human induced pluripotent stem cells reveals cellular heterogeneity and cell state transitions between subpopulations. Genome Research. 28 (7), 1053-1066 (2018).
- Narsinh, K. H., et al. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 121 (3), 1217-1221 (2011).
- Rosowski, K. A., Mertz, A. F., Norcross, S., Dufresne, E. R., Horsley, V. Edges of human embryonic stem cell colonies display distinct mechanical properties and differentiation potential. Scientific Reports. 5, 14218 (2015).
- Torres-Padilla, M. E., Chambers, I. Transcription factor heterogeneity in pluripotent stem cells: a stochastic advantage. Development. 141 (11), 2173-2181 (2014).
- Cahan, P., Daley, G. Q. Origins and implications of pluripotent stem cell variability and heterogeneity. Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 14 (6), 357-368 (2013).
- Chetty, S., et al. A simple tool to improve pluripotent stem cell differentiation. Nature Methods. 10 (6), 553-556 (2013).
- Kimura, A., et al. Small molecule AT7867 proliferates PDX1-expressing pancreatic progenitor cells derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 24, 61-68 (2017).
- Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (91), e52010 (2014).
- Honvo-Houeto, E., Truchet, S. Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland. Journal of Visualized Experiments. (106), (2015).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Kajiwara, M., et al. Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 109 (31), 12538-12543 (2012).
- Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
- Suemori, H., et al. Efficient establishment of human embryonic stem cell lines and long-term maintenance with stable karyotype by enzymatic bulk passage. Biochemical and Biophysical Research Communication. 345 (3), 926-932 (2006).
- Gage, B. K., Webber, T. D., Kieffer, T. J. Initial cell seeding density influences pancreatic endocrine development during in vitro differentiation of human embryonic stem cells. PLoS One. 8 (12), e82076 (2013).
- Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
- Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice. Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).
- Kelly, O. G., et al. Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 29 (8), 750-756 (2011).
- Hohwieler, M., et al. Human pluripotent stem cell-derived acinar/ductal organoids generate human pancreas upon orthotopic transplantation and allow disease modelling. Gut. 66 (3), 473-486 (2017).
- Takeuchi, H., Nakatsuji, N., Suemori, H. Endodermal differentiation of human pluripotent stem cells to insulin-producing cells in 3D culture. Scientific Reports. 4, 4488 (2014).
