Summary
여기, 우리 췌 장/십이지 homeobox 단백질 1+ 로 인간의 만능 줄기 세포 (hPSCs)를 차별화 하는 상세한 프로토콜을 제시 (PDX1+) 췌 장 계보의 세대에 대 한 셀의 비 식민지 유형 단층 성장에 따라 단일 세포를 해리 했다. 이 메서드는 생산 하는 동종 hPSC 파생 된 세포, 유전자 조작 및 심사에 적합 합니다.
Abstract
인간 만능 줄기 세포 (hPSC)-파생 된 췌 장 세포는 재생 의학 및 인간 발달 과정을 공부 하는 플랫폼에 대 한 유망한 셀 소스. 개발 프로세스를이 분화 췌 장/십이지 homeobox 단백질 1+ 를 포함 한 췌 장 세포를 생성 하는 주요 방법 중 하나입니다 감독 stepwise (PDX1+) 췌 장의 조상 세포. 기존의 프로토콜 통과 직후 작은 식민지와 차별화를 시작합니다. 그러나, 식민지 또는 집계의 상태에서 세포 하는 경향이 수 PDX1 분화를 방해 수 있습니다 heterogeneities+ 세포. 여기, 선물이 PDX1에 hPSCs를 차별화 하는 상세한 프로토콜+ 세포. 프로토콜의 4 단계 구성 하 고 시드 해리 단일 세포로 분화를 시작. SOX17의 유도+ 최종 endoderm 셀 두 개의 기본 창 자 튜브 마커, HNF1β 및 HNF4α, 및 최종 분화 식 PDX1에 선행 되었다+ 세포. 현재 프로토콜 쉬운 처리를 제공 합니다 개선 및 안정화 endodermal 계보 또는 PDX1 비효율적으로 차별화 하는 이전 발견 된 일부 hPSC 라인의 분화 효율 수 있습니다+ 세포.
Introduction
췌 장 외 분 비 및 내 분 비 세포, 주로 구성 하 고 그것의 역 기능 또는 오버 로드 하면 여러 가지 질병, 췌 장 염, 당뇨병, 췌장암 등. Pancreatopathy의 pathogeny, 명료 하 발달 과정 및 췌 장 세포의 기능을 분석할 필요가 있다. 또한, 강력한 품질 안정적인 셀 공급 세포/조직 보충 치료를 설정할 필요 합니다. 인간 만능 줄기 세포 (hPSC)-파생 된 췌 장 세포는 이러한 목적에 대 한 유망한 셀 소스 그리고 췌 장 세포로 분화 프로토콜 집중적으로 공부1,2,3,되었습니다 4. 췌 장 β 세포의 생체 외에서 생성의 최근 발전 인간, 성인과 당뇨병 모델 마우스2,3에 이식 시 이러한 셀 표시 치료 효능에 β 세포의 생성을 모방. 또한, β 세포 건강의 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc) 및 타입-1 당뇨병 환자 기증자에서 생성 된 분석 스트레스5때 포함 하는 기능 차이가 나타났다. 또한, 질병 고기 환자 파생 Ipsc 또는 hPSCs 유전자 변이 환자6,7와 같은 사이트에 은닉 유도 된 췌 장 세포에 부분적으로 재현 되어 있다.
HPSCs에서 췌 장 세포를 생성, stepwise 감독된 차별화 개발 프로세스를이 사용 됩니다. 췌 지역 Y-상자 17 (SOX17)를 결정 하는 섹스를 표현 하 고 초기 배아의 endoderm 계층에서 파생 되 고 forkhead 상자 A2 (FOXA2)8. 마우스 연구를 바탕으로, endodermal 레이어 hepatocyte 핵 요인 1-베타 (Hnf1β)와 hepatocyte 핵 요인 4 알파 (Hnf4α)의 식에 의해 표시 된다 원시 창 자 관을 형성 한다. 기본 창 자 튜브 elongates 및 호흡 장치, 소화 관, 및 기관으로 개발 합니다. 신장, 후 후부 foregut 지역 된다 추정 췌 장 지역 1 (PDX1)8,,910transcriptional 인자 췌 장/십이지 homeobox 단백질의 식으로 표시. 등 쪽과 복 부 부분의 PDX1+ 직감 튜브 1 (NKX6.1)8,11췌 녹음 방송 요인 1 소 단위 알파 (PTF1A)와 NK6 homeobox의 공동 식에 의해 표시 된 양식 췌 장 새싹을 진하게. 이 식은 췌 장 organogenesis의 형태학 시작을 표시합니다. 췌 장 새싹의 구성 요소 췌 endoderm 세포 상피 구조12 의 분기 관 네트워크를 형성 하 고 결국 외 분 비 및 내 분 비 세포, 인슐린 분 비 β-세포 등으로 분화 하 고 글 루카 곤 분 비 α-셀입니다. 표현의 PDX1 전체 췌 장 개발을 통해 관찰 하 고 지역화 β와 δ 세포9,,1314를 보여줍니다 추정 췌 장 영역에서 먼저 검색 됩니다. 비록 있는 Pdx1+ Ptf1a 또는 Nkx6.1을 표현 하지 않는 셀 영역 위 동굴, 십이지 장, extrahepatic 담 즙 덕트 및 마우스9, PDX1 개발의 단계를 중간에 몇몇 장 세포로 분화+ 셀 인간의 초기 발달 단계에서 췌의 창시자 이라고 여겨진다.
여기, 선물이 PDX1에 hPSCs를 차별화 하는 상세한 프로토콜+ 세포 췌 장의 계보의 세대에 대 한. 시드 여 프로토콜 초기화 차별화 단일 셀15,,1617해리 했다. 일반적으로, undifferentiated hPSCs 식민지 또는 셀 집계 정지 또는 접착으로 유지 됩니다. 그 결과, 대부분 프로토콜 뿌리고 직후 차별화를 시작합니다. 그러나, 식민지 또는 집계의 상태에서 세포는 공간과 transcriptional heterogeneities18,19,20,,2122, 방해 수 있는 경향이 있는 첫 번째 차별화 단계로 최종 endoderm PDX1 비효율적인 차별화 뒤+ 세포. 현재 프로토콜 개선 및 차별화 효율성 안정화 쉽게 처리를 제공할 수 있습니다 이전 발견 된 일부 hPSC 라인의 endodermal 계보 및 PDX1 비효율적으로 차별화 하는+ 세포23, 24 , 25.
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Protocol
HPSCs를 사용 하 여 실험 의학의 학과 대학원의 대학, 교토대학의 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.
1입니다. 자료의 준비
참고: 메 마른 환경에서 세포 배양에 대 한 모든 미디어와 시 약을 준비 합니다. 사용 하기 전에 실내 온도 (RT) 기본 문화 미디어 워밍업. 매체는 차별화는 6 h는 시 약의 실시간 정보에 내에서 사용 되는 재료의 테이블에에서 나열 됩니다.
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분화 (그림 1A)
- 단계 1A 매체: 전송 RPMI 1640 매체는 피 펫을 사용 하 여 튜브에. 추가 혈 청 무료 보충, activin A, CHIR99021, 및 Y-27632 1 x 100 ng/mL, 3 μ M, 10 μ M의 농도를 각각.
- 단계 1B 매체: 전송 RPMI 1640 매체는 피 펫을 사용 하 여 튜브에. 혈 청 무료 보충, activin A와 CHIR99021 1 x, 100 ng/mL, ≤1 μ M의 농도를 각각 추가 합니다.
참고: CHIR99021의 농도 단계 1A 매체에 비해 낮은 해야 합니다. 추가, 필요 하지 않습니다 하지만 휴대폰 번호 증가. - 2 단계 매체: 전송 향상 메모리 (iMEM)는 피 펫을 사용 하 여 튜브에 매체. 혈 청 무료 보충와 추가 keratinocyte 성장 인자 (KGF) 0.5 x 50 ng/mL의 농도를 각각.
- 3 단계 매체: 전송 iMEM 매체를 피 펫을 사용 하 여 튜브에. 혈 청 무료 보충, KGF, 머리, 3-Keto-N-aminoethyl-N'추가-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine (CYC) 및 피 펫에 의해 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic 산 (TTNPB) 0.5의 농도 x, 50 ng/mL, 100 ng/mL, 0.5 μ M, 10 nM, 각각.
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Cytometry (FCM)
- Permeabilization/워시 버퍼 x 1: 전송 물 관으로는 피 펫. 1 x의 농도에 피 펫에 의해 Permeabilization/워시 버퍼를 추가 합니다.
- FCM 솔루션을 차단: 전송 Permeabilization/워시 버퍼 x 1 튜브로는 피 펫에 의해. 2% (vol/vol)의 농도에 피 펫에 의해 당나귀 혈 청을 추가 합니다.
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Immunostaining
- 솔루션을 차단: 전송 Dulbecco Phosphate-Buffered 염 분 (DPBS)는 피 펫에 의해 관으로. 추가 당나귀 세럼과 트리톤 X 피 펫에 의해 농도 5% (vol/vol) 및 0.4% (vol/vol), 각각.
2. hPSC 뒤 Foregut 셀/췌 장 창시자를 차별화 (PDX1+ 세포)
참고: 무 균 기술을 사용 하 여 모든 절차를 수행 합니다. hPSCs에 따라 제조 업체의 지침17,26hPSC 유지 보수 매체와 hPSCs에 대 한 합성 표면 재료 코팅 6 잘 플레이트에 유지 됩니다. 세포에 도달 하는 때 50-80 %confluency (단계 0) 차별화에 대 한 그들을 사용 합니다.
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지하실 막 매트릭스 코팅 접시를 준비 합니다.
- 전송 6 mL 튜브로 RPMI 1640 (4 °C)의 4 °C 얼음에 냉각. 지하실 멤브레인 매트릭스 (4 °C) 냉각 1 mL 피 펫 팁의 2 밀리 그램을 추가 하 고 부드러운 pipetting 0.33 mg/mL 지하실 멤브레인 행렬을 잘 혼합.
- 피 펫에 의해 6-잘 세포 배양 배지의 각 음을 희석된 지하실 멤브레인 매트릭스의 2 개 mL를 전송. 37 °C는 인큐베이터에서 60-90 분에 접시를 놓습니다. 그 후, (3 h) 이내 사용까지 RT 판 유지.
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hPSCs 씨 고 최종 endoderm (단계 1A)을 차별화를 시작.
- 사용된 매체 발음 고 피 펫 세척 hPSCs 6-잘 접시에 배양 하 여 잘 당 0.5 m m ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) (RT)의 2 개 mL를 추가 합니다.
- Aspirate 0.5 m EDTA m 고 피 펫에 의해 잘 당 0.5 m m EDTA의 2 개 mL를 추가 합니다. 37 °C 5 분 동안 접시를 품 어.
- 0.5 m EDTA를 발음 하 고 10 μ M으로 보충 하는 RT에 hPSC 유지 보수 매체의 1 mL을 추가 당 피 펫에 의해 잘 Y-27632. 부드럽게 플라스틱 하지만 빨리 버릴 이멀전의 셀 단일 세포로 분리 하는 접시에 셀을 연결. Pipetting 동안 세포 현 탁 액을 거품 하지 않습니다.
- 10 μ M으로 보충 하는 RT에 hPSC 유지 보수 매체의 4 mL를 포함 하는 50 mL 원심 분리기 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 Y-27632. 부드럽게 플라스틱 셀 서 스 펜 션.
- Trypan 푸른 얼룩 제외 절차를 사용 하는 셀에에서 셀 번호를 계산 합니다.
- 세포 현 탁 액 및 튜브에서 Trypan 파랑의 15 μ의 믹스 15 μ.
- Trypan 블루 슬라이드 중복에서 계산 셀에 10 μ 피 펫에 의해 희석 셀 서 스 펜 션의 10 μ를 전송 합니다.
- 셀 번호는 자동 셀 카운터를 세 고 세포 현 탁 액에서 세포 밀도 계산. 생존은 일반적으로 > 98%.
- 약 수 1-1.5 x 106 셀 6 잘 플레이트 (1-1.5 x 105 셀/cm2)의 당에서 50 mL 원심 분리기 튜브에 세포 현 탁 액.
- 200 x g 에 RT 5 분에 50 mL 튜브 원심
- 피 펫을 사용 하 여 상쾌한 발음 하 고 잘 당 단계 1A 매체 (RT)의 1 mL로 세포를 resuspend. 부드럽게 세포 현 탁 액을 플라스틱을 단계 1A 매체 (잘 당 총, 2 mL)의 또 다른 1 mL를 추가 합니다.
- 세포 배양 배지 1000 μ 피 펫에 의해 단계 2.1.2에서에서 준비의 우물에 희석된 지하실 멤브레인 매트릭스 발음 즉시 다음 단계를 진행 합니다.
- 플라스틱 단계 2.2.8에서에서 세포 현 탁 액을 다시 부드럽게. 혼합, 직후 6 잘 플레이트의 각 음에 세포 현 탁 액 (2 mL)을 전송 합니다. 커버 빛에서 접시를 보호 하기 위해 알루미늄 호 일로 접시. 10-15 분에 대 한 실시간에 깨끗 한 벤치에 접시를 놓습니다.
참고: 시드 후 접시를 이동 하지 마십시오. - 부드럽게 37 °C, 5% CO2 배양 기 (습도 분위기)를 24 h에 대 한 문화에 접시를 놓습니다.
참고: 시드 후 접시를 흔들 하지 마십시오.
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결정적인 endoderm (단계 1B)으로 분화를 유도.
- 사용된 매체를 발음 하 고 피 펫에 의해 우물에 DPBS 2 mL를 추가 합니다. 포부와 한 번 DPBS의 추가 반복 합니다.
참고: 단층에서 모든 죽은 세포를 제거 하려면 각 열망 앞 접시를 흔들어 부드럽게. - 피 펫에 의해 사용된 DPBS 발음을 잘 당 단계 1B 매체 (37 °C)의 4 mL를 추가 합니다. 부드럽게 37 °C 배양 기 (습도 5% CO2분위기) 및 48 h에 대 한 문화에 접시를 놓습니다.
- 사용된 매체를 발음 하 고 피 펫에 의해 잘 DPBS 2 mL를 추가 합니다. 포부와 한 번 DPBS의 추가 반복 합니다.
참고: 각 열망 전에 부드러운 떨고는 단층에서 죽은 세포를 제거 합니다. - 피 펫에 의해 사용된 DPBS 발음을 잘 당 단계 1B 매체 (37 °C)의 4 mL를 추가 합니다. 부드럽게 24 h에 대 한 문화와 (37 °C, 5% CO2의 습도 분위기) 인큐베이터에 접시를 놓습니다.
- 사용된 매체를 발음 하 고 피 펫에 의해 우물에 DPBS 2 mL를 추가 합니다. 포부와 한 번 DPBS의 추가 반복 합니다.
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기본 창 관 (2 단계)으로 분화를 유도.
- 사용된 매체를 발음 하 고 피 펫에 의해 잘 DPBS 2 mL를 추가 합니다.
참고: 각 열망 전에 부드러운 떨고는 단층에서 죽은 세포를 제거 합니다. - 피 펫에 의해 사용된 DPBS 발음을 잘 당 2 단계 매체 (37 °C)의 4 mL를 추가 합니다. 4 일 동안 인큐베이터 (37 °C, 5% CO2의 습도 분위기)과 문화에 접시를 놓습니다.
- 사용된 매체를 발음 하 고 피 펫에 의해 잘 DPBS 2 mL를 추가 합니다.
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PDX1으로 분화를 유도+ 세포 (3 단계).
- 사용된 매체를 발음 하 고 피 펫에 의해 잘 DPBS 2 mL를 추가 합니다. 포부와 한 번 DPBS의 추가 반복 합니다.
- 피 펫에 의해 사용된 DPBS 발음 하 고 잘 당 3 단계 매체 (37 °C)의 4 mL를 추가 합니다. 3 일 동안 인큐베이터 (37 °C, 5% CO2의 습도 분위기)과 문화에 접시를 놓습니다.
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췌 장 내 분 비 세포로 분화를 유도.
- 앞에서 설명한 프로토콜3,,1626NKX6.1+ 세포 유도 (단계 4, 8 일에 대 한) 내 분 비 세포 유도 (단계 5, 12 일에 대 한) 다음을 수행 합니다. 특성화 고 immunostaining 및 양적 실시간 반전 녹음 방송 중 합 효소 연쇄 반응 (qRT-PCR) 분석에 의해 내 분 비 세포 분화를 확인.
참고: 도요다 외16 와 기무라 외.26 실험 하는 자세한 절차를 참조 하십시오. QRT-PCR 분석에 사용 되는 뇌관 순서 표 1 을 참조 하십시오.
- 앞에서 설명한 프로토콜3,,1626NKX6.1+ 세포 유도 (단계 4, 8 일에 대 한) 내 분 비 세포 유도 (단계 5, 12 일에 대 한) 다음을 수행 합니다. 특성화 고 immunostaining 및 양적 실시간 반전 녹음 방송 중 합 효소 연쇄 반응 (qRT-PCR) 분석에 의해 내 분 비 세포 분화를 확인.
3. Cytometry (FCM)
- 사용된 매체 발음 고 피 펫에 의해 잘 0.5 m EDTA m의 2 개 mL를 추가 합니다. 포부와 0.5 m EDTA의 추가 한 번 반복 합니다.
참고: 각 열망 전에 단층 세포에서 모든 죽은 세포를 제거 하는 부드럽게 접시를 흔들어. - 해리는 셀 (약 3-6 × 106 잘 당) 0.25%의 2 개 mL를 추가를 잘 당 0.5 m m EDTA를 포함 하는 트립 신. 37 °C 5-10 분 동안 접시를 품 어.
- 신속 하 게를 단일 셀으로 이멀전의 세포 분열 하지만 부드럽게 플라스틱. Pipetting 동안 세포 현 탁 액을 거품 하지 않습니다.
- 기본 매체 (RPMI 1640 또는 iMEM, RT)의 8-10 mL을 추가 포함 하는 혈 청 무료 보충 및 10 μ M x 0.5 Y-27632 당 고 세포 현 탁 액을 혼합. 원심 분리기 튜브에 세포 현 탁 액을 전송 합니다.
- 300 x g 에 RT 5 분에 튜브 원심
- 상쾌한 발음 하 고 0.5 m EDTA (RT)의 2 개 mL로 세포를 resuspend. 부드럽게 플라스틱 셀 서 스 펜 션.
- 300 x g 에 RT 5 분에 튜브 원심
- 상쾌한 발음 하 고 후드 아래 106 세포 당 고정 및 permeabilization 버퍼의 100 μ 셀 resuspend. 부드럽게 플라스틱 후드 아래 세포 현 탁 액. 30 분 동안 RT에서 튜브를 유지.
- 400 x g 에 RT 5 분에 튜브 원심
- 후드 아래 상쾌한 발음 하 고 106 셀 당 500 μ FCM 차단 솔루션 셀 resuspend. 부드럽게 플라스틱 셀 서 스 펜 션. 30 분 동안 RT에서 튜브를 유지.
- 관 (약 1 × 105 셀)에 세포 현 탁 액의 50 μ를 전송 합니다. 원심에서 400 x g RT에 대 한 5 분 제거 튜브는 상쾌한 고 희석된 주 항 체의 100 μ 셀 resuspend ( 재료의 표참조) FCM에 솔루션 및 4 °C에서 품 어 > 16 h.
- 5 분은 상쾌한 제거 하 고 파 마/워시 버퍼 x 1의 180 μ 셀 resuspend RT에서 400 x g 에서 튜브를 원심.
- 원심에서 400 x g RT에 대 한 5 분 제거 튜브는 상쾌한 고 희석된 이차 항 체의 100 μ 셀 resuspend ( 재료의 표참조) FCM 솔루션을 차단에. 60 분에 대 한 실시간 또는 4 °C에 대 한 셀을 품 어 > 16 h 빛 으로부터 보호.
- 5 분은 상쾌한 제거 하 고 파 마/워시 버퍼 x 1의 180 μ 셀 resuspend RT에서 400 x g 에서 튜브를 원심.
- 원심 관 5 분 제거에 대 한 RT에서 400 x g 에 상쾌한 고 DPBS에 2% 나 귀 혈 청의 180 μ 셀 resuspend.
- 분석까지 빛에서 셀 스 트레이너 (35 µ m 나일론 메쉬)와 4 °C와 보호에서 계속 하단 폴리스 티 렌 튜브 라운드 5 mL에 전송 하 여 세포 현 탁 액을 필터링 합니다.
- 교류 cytometer27에 의해 긍정적으로 얼룩진된 셀의 비율을 분석 합니다.
4입니다. Immunostaining
- 사용된 매체를 발음 하 고 피 펫에 의해 잘 DPBS 2 mL를 추가 합니다. 포부와 한 번 DPBS의 추가 반복 합니다.
참고: 부드럽게 흔들어 각 열망 전에 단층 세포에서 모든 죽은 세포를 제거 하는 접시. - 4 %paraformaldehyde (PFA)의 2 개 mL를 추가 (4 °C) 당 피 펫 후드 아래에 의해 잘. 4 °C 20 분 동안 접시를 유지.
- 피 펫 후드 아래는 PFA 제거 합니다. 피 펫 후드 아래 여 RT에서 잘 DPBS 2 mL을 추가 합니다. 포부와 한 번 DPBS의 추가 반복 합니다.
- 잘 당 차단 솔루션의 2 개 mL를 추가 하 고 RT에서 30 분 동안 접시를 유지.
- 사용 되는 솔루션을 발음 하 고 기본 항 체의 1 mL을 추가 ( 재료의 표참조) 잘 당 솔루션을 차단에. 60 분에 대 한 실시간 또는 4 °C를 품 어 > 16 h.
- 사용 되는 솔루션을 발음, 0.4%를 포함 하는 DPBS의 2ml 추가 Triton X-100 10 분 반복 포부, 솔루션 화 한 번의 추가 대 한 RT에서 품 어와.
- 사용 되는 솔루션을 발음 하 고 이차 항 체의 1 mL을 추가 ( 재료의 표참조) 잘 당 솔루션을 차단에. 빛 으로부터 보호를 가진 60 분 RT에서 품 어.
- 사용 되는 솔루션을 발음, 0.4%를 포함 하는 DPBS의 2ml 추가 Triton X-100 (RT)와 빛 으로부터 보호를 가진 5 분 RT에서 품 어. 포부, 솔루션 및 외피의 추가 두 번 반복 합니다.
- 형광 현미경28에서 분화 효율 검사 현미경을 가져가 라.
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Representative Results
전파 hiPSCs (585A129,30) 집 광 하 고 차별화에 적합 (그림 1B) 동종 단층을 형성 한다. Undifferentiated hiPSCs (단계 0) 해리 그리고 다시 낮은 세포 밀도 (1-1.5 x 105 셀/cm2)에서 단일 셀으로 시드. 1 시간 이내 셀 접시에 연결 하 고 돌출 표시를 시작 합니다. 하루에 1, 셀 확산 하 고 잘 배포 표면적의 80-90%를 커버 하는. 단계 1B, 동안 미디어 때문에 죽은 세포 흐린 표시. 죽은 세포의 제거 때문에 죽은 세포 가능성이 방해 생존과 셀 아래 거짓말의 고효율 차별화에 대 한 중요 하다. 일 3-4에 셀 조약돌 모양으로 설명 될 수 있는 동종 단층 시트를 형성 한다. 이 시점에서, 대부분의 세포 표현 지역 Y-상자 2 (SOX2), 미 분화 세포에 대 한 마커를 결정 하는 섹스 중지 하 고 대신 최종 endoderm 마커, SOX17, (그림 2A , B) 90% 이상에서 표현. 대부분 SOX17+ 세포 표현 FOXA2 (그림 2A). 이 단계 (그림 3)에서 분화 효율 부적절 한 셀 밀도 타협과 감 별 법을 시작합니다. 단계 2와 3, 세포 죽음을 완화, 그리고 사용된 매체는 흐린 단계 1B에. 기본 창 자 튜브 마커 HNF1β 및 HNF4α을 표현 하는 셀 (그림 2C) 후부 foregut/췌 조상 마커, PDX1, (그림 2D 및 E) 90% 이상에서 결국 표현. PDX1+ 세포 유도 다른 hiPSC, 1231A3 31, 라인과 hESC 라인, KhES-3 32 (그림 4)에서 재현. qRT-PCR 결과 무대 마커의 mRNA 식의 immunostaining (그림 5A)과 일치 했다. PDX1 mRNA 표현 단계 3에서 분명 하다 그리고 afterword를 지속적으로 향상.
PDX1+ 초기 발달 단계에서 세포는 또한 위 동굴, 십이지 장, extrahepatic 담 즙 덕트 및 내장 9의 일부만 췌 장 세포로 분화 가능성이. 체 외의 감 별 법 잠재력 생성 PDX1+ 세포 췌 장 세포를 췌 장 endoderm 보고 프로토콜 확장된 문화에 의해 평가 될 수 있다 및 췌 장 내 분 비 세포3,16, 26. 췌 장 endoderm 표식, NKX6.1및 2 개의 췌 장 내 분 비 마커, 인슐린및 글 루카 곤의 식을 각각 19 (단계 4)와 (단계 5), 31 일에 관찰 되었다 (그림 5).
그림 1: stepwise 분화에서 세포의 대표적인 모습. (A) A 췌 장의 계보를 hPSCs에서 감독된 차별화의 체계. 괄호 안에 숫자는 농도 (단위는 아래 작성)을 나타냅니다. (B) 차별화 문화의 주요 단계에서 hiPSCs의 대표적인 밝은 분야 현미경. 585A1 hiPSCs 단일 세포로 해리 하 고 최종 endoderm, 원시 창 자 관 및 후부 foregut/췌 조상으로 분화를 유도 했다. 하단 패널은 상위 패널의 확대 보기입니다. RPMI RPMI 1640; AA, activin (ng/mL); 채널, CHIR99021 (Μ M); KGF (ng/mL); 노 그, 머리 (ng/mL); CYC, 3-Keto-N-aminoethyl-N'-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine (μ M); TTNPB, 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic 산 (nM) 바 규모 300 μ m를 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: hiPSCs에서 췌 장 혈통으로 대표적인 유도. (A) SOX2 비율-SOX17+ 세포 cytometry 차별화 (단계 0) 전과 하루 4 (단계 1B)에 의해 분석. HiPSCs undifferentiated (SOX2+SOX17-) 최종 endoderm에 분화 했다 (SOX2-SOX17+). 대부분 SOX17+ 공동 표현된 FOXA2 세포. (B) 하루에 4 (단계 1B) 대표 immunofluorescent 현미경. 고정된 셀 SOX17 (녹색), SOX2 (빨간색), 그리고 핵 (블루)에 대 한 얼룩 했다. (C) 일 4 (단계 1B), 8 (2 단계)에 대표 immunofluorescent 현미경. 고정된 셀 (블루) HNF1β (녹색), HNF4α (적색) 및 핵 얼룩 했다. (D) 일 4 (단계 1B), 11 (3 단계)에 의해 cytometry 분석 PDX1에 대 한 긍정적인 셀의 비율. (E) PDX1 (녹색) 및 당일 11 (3 단계) (블루) 핵의 대표 immunofluorescent 현미경. 바 규모 = 100 μ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 다른 셀 밀도에서 시작 된 최종 endoderm 향해 대표 유도. (A) 대표 밝은 분야 현미경 세포 감 별 법 후 1 시간. hiPSCs 단일 셀으로 해리 그리고 다른 셀 밀도 (1-50 x 104/cm2)에서 최종 endoderm로 분화 하도록 유도 했다. 하단 패널은 상위 패널의 확대 보기입니다. (B) SOX2 비율-SOX17+ 세포 cytometry 차별화 (단계 0) 전과 하루 4 (단계 1B)에 의해 분석. (C) PDX1 비율+ 세포 일 8 (2 단계), 11 (3 단계)에 의해 cytometry 분석. 바 규모 300 μ m를 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 대표 유도 PDX1 향해+ hiPCSs 그리고 hESCs의 세포. HiPSC 선, 1231A3 (A), 그리고는 hESC 라인, KhES-3 (B), 최종 endoderm 및 PDX1 분화 되었다+ 세포. 셀 구성 cytometry에 의해 분석 되었다. SOX2 비율-SOX17+ 차별화 (단계 0) 전에 세포 분석은 하루에 4 (단계 1B). PDX1 비율+ 세포 일 8 (2 단계), 11 (3 단계)에 분석 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 내 분 비 세포 및 췌 장 endoderm 대표 유도. hiPSCs (585A1) PDX1로 분화 되었다+ 세포. 셀 추가 췌 endoderm 보고 프로토콜3,,1626췌 장 내 분 비 세포로 분화 되었다. (A) mRNA 무대 마커의 식 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (qRT-PCR)에 의해 측정 되었다. 데이터는 GAPDH 식으로 정규화 하 고 피크 값을 기준으로 유전자 발현에 배 변경으로 했다. PDX1 식에 증가 되었다 참고 > 20-fold 일 8 (2 단계) 11 (3 단계)에 > 100 일 11 (3 단계) 19 (단계 4)에서. 성인 인간의 췌에 식 Panc로 표시 됩니다. SOX2, 검정; SOX17, 자주색; HNF1β, 갈색; HNF4α, 오렌지; PDX1, 밝은 녹색; NKX6.1, 녹색; 인슐린, 블루; 글 루카 곤, 레드입니다. (B)는 췌 장 endoderm 마커, NKX6.1 (레드), 11 (3 단계)-19 (단계 4) 일에의 대표 immunofluorescent 현미경. PDX1 (녹색)와 핵 (파란색) 공동 스테인드 했다. (C) 두 명의 췌 장 내 분 비 제조 업체, 인슐린 (기능, 녹색)과 글 루카 곤 (GCG, 레드), 19 (4 단계)-31 (단계 5) 일의 대표 immunofluorescent 현미경. 핵 (파란색)은 공동 스테인드입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 유전자 이름 | 유전자 기호 | 앞으로 뇌관 | 반전 뇌관 |
| glyceraldehyde-3-phospha 테 효소 |
GAPDH | GAAGGTGAAGGTCGGAGTC | GAAGATGGTGATGGGATTTC |
| SRY-상자 2 | SOX2 | AGTCTCCAAGCGACGAAAAA | TTTCACGTTTGCAACTGTCC |
| SRY-상자 17 | SOX17 | CGCACGGAATTTGAACAGTA | TTAGCTCCTCCAGGAAGTGTG |
| HNF1 homeobox B | HNF1Β | CCTCTCCTCCAAACAAGCTG | TGTTGCCATGGTGACTGATT |
| hepatocyte 핵 요인 4 알파 | HNF4Α | GAGCTGCAGATCGATGACAA | TACTGGCGGTCGTTGATGTA |
| 췌 장 및 십이지 장 homeobox 1 | PDX1 | AGCAGTGCAAGAGTCCCTGT | CACAGCCTCTACCTCGGAAC |
| NK6 homeobox 1 | NKX6.1 | ATTCGTTGGGGATGACAGAG | TGGGATCCAGAGGCTTATTG |
| 글 루카 곤 | GCG | GAATTCATTGCTTGGCTGGT | CGGCCAAGTTCTTCAACAAT |
| 인슐린 | 기능 | CTACCTAGTGTGCGGGGAAC | GCTGGTAGAGGGAGCAGATG |
표 1: 정량 Pcr 위한 뇌관입니다.
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Discussion
PDX1 세대+ 세포의 여러 단계; 구성 따라서, 그것은 적절 한 시점에 세포를 치료 하는 중요 한입니다. 단계, 중 최종 endoderm의 유도 효율 크게 최종 유도 효율에 영향을, 가능성이 다른 오염 혈통 (즉, mesoderm, ectoderm)는 세포 증식 및 분 비 수 있습니다에서 간섭에 의해 그 요인 특정 차별화를 중단. 경우 SOX17의 비율+ 세포는 하루에 4 (단계 1B), 수 PDX1 효율적인 유도 80% 보다 낮은+ 세포 손상 될 가능성이 높습니다.
HPSCs의 미 분화 상태 식민지 또는 압축된 셀의 집계로 유지 됩니다. 그러나, 식민지 또는 집계에서 분화를 시작 하는 방법에서에서 고통을 수 있습니다이, 다른 세포 접착 및 식민지, 밀도 등 센터와 주변22에에 그리고 세포에서 다른 단계에 있기 때문에 세포 주기25. 다른 한편으로, 우리의 방법 해리 단일 세포로, 상대적으로 균질 성 국가의 단일 셀 또는 모든 단일 셀에 셀 밀도의 세포 접착을 가능 하 게 시작 합니다. 각 셀에 대 한 동질적인 처리의 관점에서 우리의 방법 식민지 또는 집계 문화로 시작 하는 다른 사람 보다 쉬울 수도 있습니다.
+ 여러 hPSC 라인에서 세포 유도 PDX1 우리의 프로토콜을 사용할 수 있지만 차별화 수 없습니다 효율적. 이러한 경우, hPSC 선 중 시드 후 바로 접착 상태 차이 원인, 고 시드 밀도의 수정 솔루션33수 있습니다. 실제로, 그림 3 은 그 부적 절 한 시드 셀 밀도 타협 차별화 최종 endoderm 및 PDX1+ 세포. 흥미롭게도, PDX1에 대 한 최적의 셀 밀도+ 세포 유도 하는 세포 인구 가운데 달랐다 > 90% 최종 endoderm. 비효율적인 차별화에 대 한 또 다른 가능성의 pluripotency 미 분화 상태에 대 한 마커의 표현에도 불구 하 고 품질을 타협 undifferentiated hPSCs의 불 쌍 한 유지 보수 상태 이다. 이 경우에, hPSC 확장 문화 주식 냉동 조기 통로에서 갔 해야 또는 하위 복제 적당 한 조건에서 hPSCs을 얻기 위해 수행 되어야 합니다. 일 8 (2 단계) 또는 11 (3 단계)에 비효율적인 차별화, 경우 다음이 단계 기간을 최적화 합니다. 이 아이디어를 지 원하는, 스테이지 3의 기간 나중 단계 셀 특성 인수에 대 한 중요 한 표시 되었습니다 및 셀 라인-췌 장 계보34에 종속.
PDX1 세대+ 세포는 췌 장 세포의 생체 외에서 생성에 대 한 중요 한. PDX1은 기능적으로 apancreatic35Pdx1 null 쥐에서 지식에 췌장암 개발 위해 필수적 이다. 일관 되 게, 생체 외에서 그리고 vivo에서 이식 연구 보여주었다 hPSC 파생 PDX1+ 세포 exocrine 포함 하 여 모든 췌 장 구성으로 개발 가능성이 있고 내 분 비 세포와 같은 췌 장 β 세포3,16 , 36 , 37. 따라서, 효율적인 세대 PDX1의+ hPSCs 리드에서 당뇨병에 대 한 β 세포 치료의 설립과 인간의 췌 장 개발 및 췌 장 질환의 이해에 대 한 안정적인 췌 장 세포 공급에 세포.
이 방법의 한계는 일부 세포 유형 및 세포 처리에 적합 하지 않습니다 2 차원 (2D) 단층 문화 형식으로 관련이 있습니다. 최근 몇 년 동안, 3 차원 (3D) 문화 성숙 세포와 조직, vivo에서 microenvironment를 흉내 낸으로 인해의 생성을 촉진 보여왔다. 예를 들어 3D 문화에서 β 세포 생성 하지만 하지 2D 단층 문화 세포 외 포도 당 레벨38에 인슐린을 분 비 하는 기능을 달성할 수 있었다.
PDX1 사용 하려면+ 발달 나중 세포 유형의 발생에 대 한 세포의 세포 외 매트릭스에 포함 된 서 스 펜 션 문화 등 3 차원 문화에 이동 하는 것이 중요 하다 및 공기-액체에 집계 문화 인터페이스3 , 16 , 37. 또한, 2D 단층 문화 확장성을 제한 하는 현 탁 액 문화 보다 경작에 대 한 더 많은 표면적을 필요. 상업적 사용에 대 한 셀의 대용량의 처리에 microbeads의 사용과 같은 수정을 필요합니다. 동시에 현재 메서드는 분화 유도 하는 요인의 검사 및 유전자 이동에 의해 분자 메커니즘의 탐사에 적합 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 일본 사회에서 대는 승진의 과학 (JSP) Scientific Research (C) (JSP KAKENHI 그랜트 Number15K09385와 18 K 08510)를 통해 고작, 및 특정에 대 한 자금 JSP 연구 휄 로우 (JSP KAKENHI 부여 번호에 의해 부분적으로 지원 17J07622)를 ko로 "ips 세포 연구, 재생 의료의 실현을 위한 연구 센터 네트워크 코어 센터" ak로, 그리고 의료 연구 및 개발 (아메드)의 연구를 통해 일본 기관에 부여 저자는 원고를 읽고 박사 피터 Karagiannis 감사 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Keto-N-aminoethyl-N′-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine | Toronto Research Chemicals | K171000 | CYC |
| 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic acid | Santa Cruz Biotechnology | SC-203303 | TTNPB |
| 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
| Anti-CDX2 antibody [EPR2764Y] | Abcam | Ab76541 | Anti-CDX2, × 1/1000 dilution |
| B-27 Supplement (50 ×) | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | Serum-free supplement |
| BD FACSAria II Cell Sorter | BD Biosciences | For flow cytometry | |
| Biomedical freezer | SANYO | MDF-U538 | For -30 °C storing |
| Cell Counting Slides for TC10/TC20 Cell Counter, Dual-Chamber | BIO-RAD | 1450011 | Counting slide glass |
| CELL CULTURE MULTIWELL PLATE, 6 WELL, PS, CLEAR | Greiner bio-one | 657165 | For differentiation culture/6-well plate |
| Centrifuge | TOMY | AX-310 | For cell culturing |
| Centrifuge | TOMY | MX-305 | For RT-qPCR |
| CHIR99021 | Axon Medchem | Axon 1386 | |
| CLEAN BENCH | SHOWA KAGAKU | S-1601PRV | Clean bench |
| Corning CellBIND 6-well plate | Corning | 3335 | For feeder-free culture of hPSCs/6-well plate |
| Corning Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | Basement membrane matrix |
| Corning Synthemax II-SC Substrate | Corning | 3535 | For feeder-free culture of hPSCs/synthetic surface material for hPSCs |
| Cryostat | Leica | Leica CM1510 S | For immunostaining of aggregates. |
| Cytofix/Cytoperm Kit | Becton Dickinson | 554714 | Perm/Wash buffer is Permeabilization/Wash buffer. Cytofix/Cytoperm buffer is fixation and permeabilization buffer. |
| Dako pen | Dako | S2002 | For immunostaining of aggregates |
| dNTP mix (10 mM) | Thermo Fisher Scientific | 18427-088 | For RT-qPCR |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11055 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10036 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10040 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey Serum | Merck Millipore | S30 | Donkey serum |
| D-PBS(-) without Ca or Mg | Nacalai tesque | 14249-95 | DPBS |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | For feeder-free culture of hPSCs/hPSC maintenance medium |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | 5 mL round bottom polystyrene tube with cell strainer |
| Filter Tip, 1,000 µL | Watoson | 124-1000S | Use together with pipettes |
| Filter Tip, 20 µL | Watoson | 124-P20S | Use together with pipettes |
| Filter Tip, 200 µL | Watoson | 124-P200S | Use together with pipettes |
| Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X700 | For immunostaining |
| Forma Steri-Cycle CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 370A | Incubator |
| HNF-1β Antibody (C-20) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7411 | Anti-HNF1β, × 1/200 dilution |
| HNF-4α Antibody (H-171) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8987 | Anti-HNF4α, × 1/200 dilution |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | For nucleus staining, × 1/200 dilution |
| Human Pancreas Total RNA | Ambion | AM7954 | For RT-qPCR |
| Human PDX-1/IPF1 Antibody | R&D Systems | AF2419 | Anti-PDX1, goat IgG, × 1/200 dilution |
| Human SOX17 Antibody | R&D Systems | AF1924 | Anti-SOX17, × 1/200 dilution |
| Improved MEM Zinc Option medium | Thermo Fisher Scientific | 10373-017 | iMEM |
| Incubation chamber | Cosmo Bio | 10DO | For immunostaining of aggregates |
| Latex Examination Gloves | Adachi | ||
| MAS coated slide glass | Matsunami Glass | 83-1881 | For immunostaining of aggregates |
| MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | 4346907 | For RT-qPCR |
| Microscope | Olympus | CKX41N-31PHP | For cell culturing |
| Microtube | Watoson | 131-515CS | |
| Monoclonal Anti-α-Fetoprotein | SIGMA | A8452 | Anti-AFP, × 1/200 dilution |
| Nanodrop 8000 | Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Oligo dT | FASMAC | Custom made Oligo | For RT-qPCR of sequence is "TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT" |
| Paraformaldehyde, powder | Nacalai tesque | 26126-54 | PFA, fixative, diluted in DPBS |
| Pharmaceutical refrigerator | SANYO | MPR-514 | For 4 °C storing |
| PIPETMAN P | GILSON | Pipette | |
| Recombinant Human KGF/FGF-7 | R&D Systems | 251-KG | KGF |
| Recombinant Human Noggin | PeproTech | 120-10C | NOGGIN |
| Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A | R&D Systems | 338-AC | Activin A |
| ReverTra Ace (100 U/μL) | TOYOBO | TRT-101 | For RT-qPCR |
| RNase-free DNase Set (50) | QIAGEN | 79254 | For RT-qPCR |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | For RT-qPCR |
| RPMI 1640 with L-Gln | Nacalai tesque | 30264-85 | RPMI 1640 |
| Sealing Film for Real Time | Takara | NJ500 | For RT-qPCR |
| Serological pipettes 10 mL | Costar/Corning | 4488 | For cell culturing |
| Serological pipettes 25 mL | Costar/Corning | 4489 | For cell culturing |
| Serological pipettes 5 mL | Costar/Corning | 4487 | For cell culturing |
| Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAb | Cell signaling | 3579S | Anti-SOX2, × 1/200 dilution |
| StepOnePlus | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Sucrose | Nacalai tesque | 30406-25 | For immunostaining of aggregates |
| TB Green Premix Ex Taq II |
Takara | RR820B | For RT-qPCR |
| TC20 Automated Cell Counter | BIO-RAD | 1450101J1 | Automatic cell counter |
| Tissue-Tek OCT compound 4583 | Sakura Finetechnical | 4583 | For immunostaining of aggregates |
| Tissue-Tek Cryomold Molds/Adapters | Sakura Finetechnical | 4566 | For immunostaining of aggregates |
| Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| Trypan Blue | BIO-RAD | 1450021 | |
| Ultracold freezer | SANYO | MDF-U33V | For -80 °C storing |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | Dilute with DPBS to prepare 0.5 mM EDTA |
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Y-27632 | Wako | 251-00514 |
References
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