Summary
Aquí, presentamos un protocolo detallado para distinguir las células de vástago pluripotent humanas (hPSCs) en la proteína de páncreas/duodeno homeobox 1+ (PDX1+) las células para la generación de linajes pancreáticos basan en el crecimiento de monocapa tipo de Colonia no de disociar las células. Este método es adecuado para producir células derivadas del hPSC homogéneas, manipulación genética y selección.
Abstract
Célula de vástago de pluripotent humanas (hPSC)-derivado de las células pancreáticas son una fuente prometedora de células para la medicina regenerativa y una plataforma para el estudio de procesos de desarrollo humanos. Paso a paso dirigido a la diferenciación que recapitula los procesos de desarrollo es una de las principales formas de generar células pancreáticas incluyendo proteína de páncreas/duodeno homeobox 1+ (PDX1+) células progenitoras pancreáticas. Protocolos convencionales inician la diferenciación con pequeñas colonias poco después del paso. Sin embargo, en el estado de colonias o agregados de células son propensas a heterogeneidades, que podrían dificultar la diferenciación a PDX1+ las células. Aquí, presentamos un protocolo detallado para distinguir hPSCs en PDX1+ las células. El protocolo consta de cuatro pasos e inicia la diferenciación de células disociadas siembra. La inducción de SOX17+ las células del endodermo definitivo fue seguida por la expresión de marcadores de tubo de intestino primitivo dos, HNF1β y HNF4α y eventual diferenciación en PDX1+ las células. El presente Protocolo proporciona fácil manejo y puede mejorar y estabilizar la eficiencia de la diferenciación de algunas líneas de hPSC que previamente fueron encontrados ineficazmente diferenciarse en linajes endodérmicos o PDX1+ las células.
Introduction
El páncreas principalmente consiste en las células exocrinas y endocrinas, y su disfunción o sobrecarga causa varias enfermedades, como la pancreatitis, diabetes y cáncer de páncreas. Para aclarar la patogenia de la pancreatopathy, es necesario analizar el proceso de desarrollo y la función de las células pancreáticas. Además, una fuente estable de la célula con sólida calidad es necesaria para establecer la terapia de suplementación de tejido de la célula. Célula de vástago de pluripotent humanas (hPSC)-derivado de las células pancreáticas son una fuente prometedora de células para estos fines, y el protocolo de diferenciación hacia células pancreáticas ha sido intensamente estudiado1,2,3, 4. Los recientes avances en la generación in vitro de las células β pancreáticas mímico la generación de las células β en adultos humanos y estas células Mostrar eficacia terapéutica sobre implante en modelo diabético ratones2,3. Además, el análisis de las células β generados a partir de las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) saludable los donantes paciente de diabetes tipo 1 no reveló ninguna diferencia funcional incluyendo cuando está bajo estrés5. Por otra parte, fenotipos de la enfermedad han sido parcialmente reproducidos en células pancreáticas inducidas con iPSCs derivados del paciente o hPSCs que las mutaciones genéticas en el mismo sitio que los pacientes6,7.
Para generar células pancreáticas de hPSCs, se utiliza la diferenciación dirigida paso a paso que recapitula los procesos de desarrollo. El páncreas se deriva de la capa del endodermo del embrión temprano, que expresa el sexo determina la región Y-caja 17 (SOX17) y forkhead cuadro A2 (FOXA2)8. Basado en los estudios con ratones, la capa endodermal forma el tubo intestino primitivo, que se caracteriza por la expresión de hepatocitos factor nuclear 1-beta (Hnf1β) y el factor nuclear de hepatocito 4-alfa (Hnf4α). El tubo intestino primitivo se alarga y se convierte en el aparato respiratorio, tracto digestivo y órganos. Después de la elongación, el área posterior del foregut se convierte la presunta región pancreática, y marcada por la expresión de la proteína del factor transcripcional páncreas/duodeno homeobox 1 (PDX1)8,9,10. Las partes dorsales y ventrales de la PDX1+ tubo intestinal espesar a brotes pancreáticos forma, que se caracterizan por la coexpresión de páncreas transcripción factor 1 subunidad alfa (PTF1A) y NK6 homeobox 1 (NKX6.1)8,11. Esta expresión marca el comienzo morfológico de la organogénesis pancreática. Las células del páncreas endodermo, que son componentes de las yemas pancreáticas, forman una red tubular ramificada de estructuras epiteliales12 y finalmente se diferencian en células exocrinas y endocrinas, incluyendo β-células secretoras de insulina y α-células secretoras de glucagón. Expresión de PDX1 se detecta primero en la región pancreática presuntiva, que luego se observa a lo largo de todo el desarrollo pancreático y muestra localización de las células β y δ9,13,14. Aunque el Pdx1+ área de células que no expresan Ptf1a o Nkx6.1 distingue en el antro gástrico, duodeno, vía biliar extrahepática y algunas células intestinales en el centro a la última etapa de desarrollo en ratones9, PDX1+ las células son consideradas los progenitores del páncreas en la primera etapa del desarrollo en seres humanos.
Aquí, presentamos un protocolo detallado para distinguir hPSCs en PDX1+ de las células para la generación de linajes pancreáticos. El protocolo inicia la diferenciación por la siembra disocia las células15,16,17. En general, hPSCs indiferenciadas se mantienen como colonias o agregados de células en suspensión o en la adhesión. Como resultado, la mayoría de protocolos inician la diferenciación poco después pases. Sin embargo, en el estado de colonias o agregados de células son propensas a heterogeneidades espaciales y transcripcional18,19,20,21,22, que podrían dificultar la primer paso de diferenciación hacia endodermo definitivo seguido por ineficiente diferenciación PDX1+ las células. El presente Protocolo puede ofrecer un manejo fácil para mejorar y estabilizar la eficiencia de la diferenciación de algunas líneas de hPSC que previamente fueron encontrados para distinguir ineficazmente a linajes endodérmicos y PDX1+ células23, 24 , 25.
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Protocol
Experimentos con hPSCs fueron aprobados por el Comité de ética del Departamento de medicina y postgrado Facultad de medicina, Universidad de Kyoto.
1. preparación de materiales
Nota: Preparar todos los medios y reactivos para cultivo celular en un ambiente estéril. Calentamiento de base medios de cultivo a temperatura ambiente (RT) antes de su uso. Medio para la diferenciación se utiliza dentro de 6 h a RT. información de los reactivos se enumeran en la Tabla de materiales.
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Diferenciación (figura 1A)
- Medio de 1A etapa: transferencia de Medio RPMI 1640 en un tubo con una pipeta. Añadir el suplemento libre de suero, activin A, CHIR99021 y Y-27632 a una concentración de 1 x, 100 ng/mL, 3 μM y 10 μM, respectivamente.
- Medio de fase 1B: transferencia de Medio RPMI 1640 en un tubo con una pipeta. Añadir el suplemento libre de suero, activina A y CHIR99021 a una concentración de 1 x, 100 ng/mL, ≤ 1 μM, respectivamente.
Nota: La concentración de CHIR99021 debe ser menor que en medio de 1A etapa y además no es necesario, pero aumenta el número de celular. - Medio de la etapa 2: medio MEM de transferencia mejorado (iMEM) en un tubo con una pipeta. Añadir el suplemento libre de suero y factor de crecimiento de queratinocitos (KGF) a una concentración de 0,5 x y 50 ng/mL, respectivamente.
- Medio de la etapa 3: transferencia del iMEM medio en un tubo con una pipeta. Añadir el suplemento libre de suero, KGF, NOGGIN, 3-ceto-N-aminoetil-N'- aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine (CYC) y ácido 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic (TTNPB) con una pipeta para concentraciones de 0, 5 x, 50 ng/mL, 100 ng/mL, 0.5 μM y 10 nM, respectivamente.
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Citometría de flujo (FCM)
- 1 x buffer de permeabilización/lavado: transferencia de agua en un tubo con una pipeta. Añadir el tampón de lavado/permeabilización por una pipeta a una concentración de 1 x.
- Solución de bloqueo de la FCM: transfiera 1 x buffer de permeabilización/lavado en un tubo con una pipeta. Añadir suero de burro por una pipeta a una concentración del 2% (vol/vol).
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Inmunotinción
- Solución de bloqueo: salina (Phosphate-Buffered de DPBS de transferencia Dulbecco) en un tubo con una pipeta. Agregar suero de burro y Triton X pipeta a concentraciones de 5% (vol/vol) y 0.4% (vol/vol), respectivamente.
2. hPSC diferenciación Posterior del Foregut pancreática células progenitores (PDX1 células+ )
Nota: Llevar a cabo todos los procedimientos con técnicas estériles. hPSCs se mantienen en placas de 6 pocillos recubiertas por una superficie sintética para hPSCs con medio de mantenimiento hPSC según las instrucciones17,26 el fabricante. Cuando las células llegan a 50-80% de confluencia (etapa 0) utiliza para la diferenciación.
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Preparar la membrana del sótano las placas revestidas de matriz.
- Transferencia de 6 mL de RPMI 1640 (4 °C) en un tubo refrigerado a 4 °C en hielo. Añadir 2 mg de la matriz de la membrana del sótano (4 °C) con refrigerado 1 mL-Pipetas y mezclar bien mediante pipeteo suave para hacer la matriz de la membrana del sótano de 0,33 mg/mL.
- Transfiera 2 mL de la matriz de la membrana del sótano diluido en cada pocillo de las placas de cultivo celular 6-bien por una pipeta. Colocar las placas a 37 °C durante 60-90 minutos en una incubadora. Después, no las placas a temperatura ambiente hasta su uso (dentro de 3 h).
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La hPSCs de la semilla e iniciar la diferenciación al endodermo definitivo (Fase 1A).
- Aspire el medio utilizado y añadir 2 mL de ácido etilendiaminotetracético de 0,5 mM (EDTA) (RT) por pozo con una pipeta para lavar la hPSCs cultivadas en placas de 6 pozos.
- Aspirar 0,5 mM EDTA y añadir 2 mL de EDTA 0.5m por pozo con una pipeta. Incubar las placas a 37 °C durante 5 minutos.
- Aspirar 0,5 mM EDTA y añadir 1 mL de medio de mantenimiento hPSC en RT suplementado con 10 μM Y-27632 por pozo con una pipeta. Pipetee suavemente pero rápidamente a golpe Unidas células en las placas y disociar las células agrupadas en celdas individuales. No la burbuja de la suspensión de células durante el pipeteo.
- Transferir la suspensión de células en un tubo de centrífuga de 50 mL que contiene 4 mL de medio de mantenimiento hPSC a RT suplementado con 10 μM Y-27632. Pipetee suavemente la suspensión de células.
- Contar el número de células en la suspensión de células mediante el procedimiento de exclusión de tinción de azul de tripano.
- Mix 15 μL de suspensión celular y 15 μL de azul tripán en un tubo.
- Transferir 10 μL de la suspensión de células diluida con azul de tripano en celda contando los portaobjetos en duplicado por una pipeta de 10 μL.
- Cuenta la celda número con un contador celular automático y calcular la densidad de células en la suspensión de células. Viabilidad es generalmente > 98%.
- Parte alícuota de la suspensión de células en un tubo de centrífuga de 50 mL en 1-1.5 x 106 células por pocillo de las placas de 6 pozos (1-1.5 x 105 células/cm2).
- Centrifugar el tubo de 50 mL a 200 x g a temperatura ambiente durante 5 minutos.
- Aspirar el sobrenadante con una pipeta y resuspender las células con 1 mL de medio de 1A etapa (RT) por pozo. Pipetear la suspensión de células y añadir otro 1 mL de medio de 1A etapa (total, 2 mL por pozo).
- Aspirar la matriz membrana basal diluida en los pocillos de las placas de cultivo celular preparados en el paso 2.1.2 por pipeta 1.000 μL. Proceder inmediatamente al siguiente paso.
- Suavemente pipetear la suspensión de células en el paso 2.2.8 otra vez. Inmediatamente después de mezclar, transfiera la suspensión de células (2 mL) en cada pocillo de una placa de 6 pozos. Cubra la placa con un papel de aluminio para proteger la placa de la luz. Colocar la placa en el Banco limpio a temperatura ambiente durante 10-15 minutos.
Nota: No mueva la placa después de la siembra. - Coloque suavemente la placa a 37 °C, 5% CO2 incubadora (ambiente humidificado) y la cultura durante 24 h.
Nota: No agitar la placa después de la siembra.
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Inducir la diferenciación en endodermo definitivo (etapa 1B).
- Aspire el medio utilizado y añadir 2 mL de DPBS los pozos con una pipeta. Repetir la aspiración y la adición de DPBS una vez.
Nota: Para eliminar las células muertas de la monocapa, agitar suavemente la placa antes de cada aspiración. - Aspire la DPBS usado por una pipeta y añadir 4 mL de medio de la 1B de la etapa (37 °C) por pozo. Coloque suavemente la placa en la incubadora de 37 °C (ambiente humidificado de 5% CO2) y la cultura durante 48 h.
- Aspire el medio utilizado y añadir 2 mL de DPBS al pozo con una pipeta. Repetir la aspiración y la adición de DPBS una vez.
Nota: Retire las células muertas de la monocapa por agitación suave antes de cada aspiración. - Aspire la DPBS usado por pipeta y añadir 4 mL de medio de la 1B de la etapa (37 °C) por pozo. Coloque suavemente la placa en la incubadora (37 °C, atmósfera humidificada de 5% CO2) y la cultura durante 24 h.
- Aspire el medio utilizado y añadir 2 mL de DPBS los pozos con una pipeta. Repetir la aspiración y la adición de DPBS una vez.
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Inducir la diferenciación en el tubo del intestino primitivo (etapa 2).
- Aspire el medio utilizado y añadir 2 mL de DPBS al pozo con una pipeta.
Nota: Retire las células muertas de la capa monomolecular agitando suavemente antes de cada aspiración. - Aspire la DPBS usado por pipeta y añadir 4 mL de medio de etapa 2 (37 °C) por pozo. Coloque la placa en la incubadora (37 °C, atmósfera humidificada de 5% CO2) y la cultura durante 4 días.
- Aspire el medio utilizado y añadir 2 mL de DPBS al pozo con una pipeta.
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Inducir la diferenciación en PDX1+ las células (fase 3).
- Aspire el medio utilizado y añadir 2 mL de DPBS al pozo con una pipeta. Repetir la aspiración y la adición de DPBS una vez.
- Aspire la DPBS usado por pipeta y añadir 4 mL de medio de etapa 3 (37 °C) por pozo. Coloque la placa en la incubadora (37 °C, atmósfera humidificada de 5% CO2) y la cultura durante 3 días.
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Inducir la diferenciación en las células endocrinas pancreáticas.
- Realizar la inducción celular NKX6.1+ (etapa 4, durante 8 días) seguida por la inducción de células endocrinas (etapa 5, durante 12 días) con protocolos previamente descritos3,16,26. Caracterizar y validar la diferenciación de las células endocrinas por inmunotinción y análisis de (qRT-PCR) reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa en tiempo real cuantitativa.
Nota: Se refieren a Toyoda et al16 y Kimura et al26 para los procedimientos experimentales detallados. Consulte la tabla 1 para secuencias de la cartilla utilizadas para el análisis de qRT-PCR.
- Realizar la inducción celular NKX6.1+ (etapa 4, durante 8 días) seguida por la inducción de células endocrinas (etapa 5, durante 12 días) con protocolos previamente descritos3,16,26. Caracterizar y validar la diferenciación de las células endocrinas por inmunotinción y análisis de (qRT-PCR) reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa en tiempo real cuantitativa.
3. flujo Cytometry (FCM)
- Aspire el medio utilizado y añadir 2 mL de EDTA 0,5 mM para el pozo con una pipeta. Repetir la aspiración y la adición de EDTA 0,5 mM una vez.
Nota: Agitar la placa suavemente para eliminar las células muertas de las células de la monocapa antes de cada aspiración. - Para disociar las células (aproximadamente 3-6 × 106 células por pocillo), agregar 2 mL del 0.25% tripsina que contiene 0,5 mM EDTA por pozo. Incubar las placas a 37 °C durante 5-10 minutos.
- Pipetee suavemente pero rápidamente para disociar las células agrupadas en celdas individuales. No la burbuja de la suspensión de células durante el pipeteo.
- Añadir 8-10 mL de medio base (RPMI 1640 o iMEM, RT) que contiene 0,5 x suplemento libre de suero y 10 μM Y-27632 por bien y mezclar la suspensión de células. Transferir la suspensión de células en un tubo de centrífuga.
- Centrifugar el tubo a 300 x g a temperatura ambiente durante 5 minutos.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender las células con 2 mL de EDTA (RT) de 0,5 mM. Pipetee suavemente la suspensión de células.
- Centrifugar el tubo a 300 x g a temperatura ambiente durante 5 minutos.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender las células con 100 μL de tampón de fijación y permeabilización por 106 células bajo una campana. Pipetee suavemente la suspensión de células debajo de una campana. Mantenga el tubo a temperatura ambiente durante 30 minutos.
- Centrifugar el tubo a 400 x g a temperatura ambiente durante 5 minutos.
- Aspirar el sobrenadante bajo una campana y resuspender las células con solución de bloqueo de la FCM de μL 500 por 106 células. Pipetee suavemente la suspensión de células. Mantenga el tubo a temperatura ambiente durante 30 minutos.
- Transferir 50 μL de la suspensión de células a un tubo (aproximadamente 1 x 105 células). Centrifugar el tubo a 400 x g a temperatura ambiente durante 5 minutos Retire el sobrenadante y resuspender las células con 100 μL de anticuerpo primario diluido (véase Tabla de materiales) en FCM bloqueo solución e incubar a 4 °C para > 16 h.
- Centrifugar el tubo a 400 x g a temperatura ambiente por 5 minutos quite el sobrenadante y resuspender las células con 180 μL de 1 x de tampón de lavado/Perm.
- Centrifugar el tubo a 400 x g a temperatura ambiente durante 5 minutos Retire el sobrenadante y resuspender las células con 100 μL del anticuerpo secundario diluido (véase Tabla de materiales) en solución de bloqueo de la FCM. Incube las células a temperatura ambiente durante 60 minutos o a 4 °C por > 16 h con la protección de la luz.
- Centrifugar el tubo a 400 x g a temperatura ambiente por 5 minutos quite el sobrenadante y resuspender las células con 180 μL de 1 x de tampón de lavado/Perm.
- Centrifugar el tubo a 400 x g a temperatura ambiente por 5 minutos Retire el sobrenadante y resuspender las células con 180 μL de 2% de suero de burro en DPBS.
- Filtrar la suspensión de células mediante la transferencia en 5 mL tubo de poliestireno fondo redondo con una célula tamiz (malla de nylon de 35 μm) y guardar a 4 °C con protección de la luz hasta el análisis.
- Análisis de una proporción de células teñidas positivamente por un citómetro de flujo27.
4. inmunotinción
- Aspire el medio utilizado y añadir 2 mL de DPBS al pozo con una pipeta. Repetir la aspiración y la adición de DPBS una vez.
Nota: Agitar suavemente la placa para eliminar las células muertas de las células de la monocapa antes de cada aspiración. - Añadir 2 mL de paraformaldehído al 4% (PFA) (4 °C) por pozo con una pipeta debajo de una campana. Mantenga la placa a 4 °C por 20 min.
- Quite la PFA pipeta bajo una campana. Añadir 2 mL de DPBS en RT al pozo con una pipeta debajo de una campana. Repetir la aspiración y la adición de DPBS una vez.
- Añadir 2 mL de solución de bloqueo por bien y mantenga la placa a temperatura ambiente durante 30 minutos.
- Aspirar la solución y añadir 1 mL de anticuerpo primario (véase Tabla de materiales) en solución por pozo de bloqueo. Incubar a temperatura ambiente durante 60 minutos o a 4 °C por > 16 h.
- Aspirar la solución, añadir 2 mL de DPBS que contenga 0,4% Tritón X-100 e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos repetir la aspiración, además de la solución y la incubación una vez.
- Aspirar la solución y añadir 1 mL de anticuerpo secundario (véase Tabla de materiales) en solución por pozo de bloqueo. Incubar a temperatura ambiente durante 60 minutos con protección de la luz.
- Aspirar la solución, añadir 2 mL de DPBS que contenga 0,4% Tritón X-100 (RT) e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos con protección de la luz. Repetir la aspiración, además de la solución e incubación dos veces.
- Tomar micrografías para examinar la eficacia de diferenciación bajo un microscopio de fluorescencia28.
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Representative Results
Propagación hiPSCs (585A129,30) se condensan y forman una monocapa homogénea (figura 1B) que es conveniente para la diferenciación. HiPSCs indiferenciados (etapa 0) son disociados y volver a sembrar como células individuales en densidades bajas de la célula (1-1.5 x 105 células/cm2). Dentro de 1 h, las células se unen a la placa y comiencen a mostrar protrusión. El día 1, las células proliferan y bien distribuidas para cubrir el 80-90% de la superficie. Durante la etapa 1B, los medios de comunicación aparecerán turbia debido a las células muertas. La eliminación de células muertas es fundamental para diferenciación altamente eficiente ya que las células muertas probablemente molestar a la supervivencia y la diferenciación de las células que mienten por debajo. En los días 3 y 4, las células forman una hoja de monocapa homogénea que puede ser descrita como un aspecto de adoquín. En este momento, mayoría de las células dejar expresar el sexo determina la región Y caja 2 (SOX2), un marcador para las células no diferenciadas y en cambio expresa un marcador del endodermo definitivo, SOX17, en más del 90% (figura 2A y B). La mayoría SOX17+ células expresa FOXA2 (figura 2A). A partir de la diferenciación un compromisos de densidad celular inadecuado la eficiencia diferenciación en este paso (figura 3). En las etapas 2 y 3, muerte de la célula se relaja, y el medio utilizado no es tan turbio como lo es en la etapa 1B. Las células expresan los marcadores de tubo de intestino primitivo HNF1β y HNF4α (figura 2) y finalmente expresan un marcador del progenitor del foregut posterior, pancreático, PDX1, en más del 90% (Figura 2D y E). El PDX1+ celular inducción es reproducible en otra línea hiPSC, 1231A3 31y una línea de células, de KhES-3 32 (figura 4). resultados de qRT-PCR la expresión de mRNA de marcadores de fase eran constantes con inmunotinción (figura 5A). La expresión del mRNA de PDX1 es evidente en la etapa 3 y aumenta sustancialmente el epílogo.
PDX1+ las células en las primeras etapas del desarrollo tienen el potencial de diferenciarse en células pancreáticas no sólo pero también del antro gástrico, duodeno, vía biliar extrahepática y una parte del intestino 9. El potencial de diferenciación de in vitro genera PDX1+ las células a las células pancreáticas pueden evaluarse por la cultura extendida con los protocolos reportados para páncreas endodermo y endocrino pancreático células3,16, 26. las expresiones de un marcador de páncreas endodermo, NKX6.1y dos marcadores endocrinos pancreáticos, insulinay glucagón, se observaron durante los días 19 (etapa 4) y 31 (etapa 5), respectivamente (figura 5).
Figura 1: aspecto representativo de las células en diferenciación paso a paso. (A) A esquema de diferenciación dirigida de hPSCs linajes pancreáticos. Números entre paréntesis indican concentraciones (unidades se escriben a continuación). (B) micrográfos de campo brillante representante de hiPSCs en pasos clave de la cultura de la diferenciación. 585A1 hiPSCs disociados como células individuales e inducidas a diferenciarse en endodermo definitivo, tubo del intestino primitivo y progenitor del foregut posterior, pancreático. Los paneles inferiores son vistas ampliadas de los paneles superiores. RPMI, RPMI 1640; AA, activina (ng/mL); CH, CHIR99021 (ΜM); KGF (ng/mL); NOG, NOGGIN (ng/mL); CYC, 3-Keto-N-aminoethyl-N'-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine (μM); TTNPB, ácido 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic (nM). Barras de escala = 300 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Representante inducción hacia linajes pancreáticos de hiPSCs. (A) la proporción de SOX2–SOX17+ células analizadas por citometría de flujo antes de la diferenciación (etapa 0) y el día 4 (etapa 1B). Undifferentiated hiPSCs (SOX2+SOX17–) fueron distinguidos en endodermo definitivo (SOX2–SOX17+). La mayoría SOX17+ células FOXA2 Co expresado. (B) micrografías inmunofluorescentes representativa el día 4 (etapa 1B). Las células fijas fueron manchadas para núcleos (azul), SOX17 (verde) y SOX2 (rojo). (C) representante micrografías inmunofluorescentes días 4 (etapa 1B) y 8 (etapa 2). Las células fijas fueron manchadas para núcleos, HNF4α (rojo) y HNF1β (verde) (azul). (D) la proporción de células positivas para PDX1, analizada por citometría de flujo en los días 4 (etapa 1B) y 11 (fase 3). (E) representante micrografías inmunofluorescentes de PDX1 (verde) y de los núcleos (azul) el día 11 (etapa 3). Barras de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Representante inducción hacia el endodermo definitivo desde densidades de células diferentes. Micrografías de representante campo brillante (A) de 1 h después de la diferenciación de células. hiPSCs disociados como células individuales e inducidas a diferenciarse en endodermo definitivo a densidades de células diferentes (1-50 x 104/cm2). Los paneles inferiores son vistas ampliadas de los paneles superiores. (B) la proporción de SOX2–SOX17+ células analizadas por citometría de flujo antes de la diferenciación (etapa 0) y el día 4 (etapa 1B). (C) la proporción de PDX1+ células analizadas por citometría de flujo en los días 8 (etapa 2) y 11 (fase 3). Barras de escala = 300 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Representación inducción hacia PDX1+ las células hiPCSs y hESCs. Una línea hiPSC, 1231A3 (A), y una línea de células de KhES-3 (B), fueron distinguidos endodermo definitivo y PDX1+ las células. Se analizó la composición celular por citometría de flujo. La proporción de SOX2–SOX17+ analizó las células antes de diferenciación (etapa 0) y el día 4 (etapa 1B). La proporción de PDX1+ células se analizó en los días 8 (etapa 2) y 11 (fase 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Representante inducción hacia páncreas endodermo y las células endocrinas. hiPSCs (585A1) fueron distinguidos en PDX1+ las células. Las células fueron más distinguidas en páncreas endodermo y las células endocrinas pancreáticas con protocolos reportados3,16,26. (A) mRNA expresiones de marcadores de fase se midieron mediante reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa (qRT-PCR). Los datos fueron normalizados a la expresión de la GAPDH y presentados como el doble cambio en la expresión génica en relación con el valor de pico. Tenga en cuenta que expresión PDX1 se incrementó en > 20-fold de días 8 (etapa 2) y 11 (fase 3) en > 100-fold de días 11 (etapa 3) y 19 (etapa 4). La expresión en el páncreas humano adulto se muestra como Panc. SOX2, negro; SOX17, violeta; HNF1β, marrón; HNF4α, naranja; PDX1, verde claro; NKX6.1, verde; Insulina, azul; Glucagón, rojo. (B) representante inmunofluorescentes micrografías de un marcador de páncreas endodermo, NKX6.1 (rojo), los días 11 (etapa 3) y 19 (etapa 4). PDX1 (verde) y los núcleos (azul) fueron co manchados. (C) representante micrografías inmunofluorescentes de dos fabricantes endocrinos pancreáticos, insulina (INS, verde) y glucagón (GCG, rojo), los días 19 (etapa 4) y 31 (etapa 5). Los núcleos (azul) eran Co manchados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Nombre gen | Símbolo del gene | Primer avance | Primer revés |
| gliceraldehído-3-phospha deshidrogenasa de te |
GAPDH | GAAGGTGAAGGTCGGAGTC | GAAGATGGTGATGGGATTTC |
| SRY-caja 2 | SOX2 | AGTCTCCAAGCGACGAAAAA | TTTCACGTTTGCAACTGTCC |
| SRY-caja 17 | SOX17 | CGCACGGAATTTGAACAGTA | TTAGCTCCTCCAGGAAGTGTG |
| HNF1 homeobox B | HNF1Β | CCTCTCCTCCAAACAAGCTG | TGTTGCCATGGTGACTGATT |
| factor nuclear 4 alfa de hepatocito | HNF4Α | GAGCTGCAGATCGATGACAA | TACTGGCGGTCGTTGATGTA |
| caja homeo pancreática y duodenal 1 | PDX1 | AGCAGTGCAAGAGTCCCTGT | CACAGCCTCTACCTCGGAAC |
| NK6 homeobox 1 | NKX6.1 | ATTCGTTGGGGATGACAGAG | TGGGATCCAGAGGCTTATTG |
| glucagón | GCG | GAATTCATTGCTTGGCTGGT | CGGCCAAGTTCTTCAACAAT |
| insulina | INS | CTACCTAGTGTGCGGGGAAC | GCTGGTAGAGGGAGCAGATG |
Tabla 1: Cartillas para qPCR.
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Discussion
La generación de PDX1+ células se compone de varios pasos; por lo tanto, es fundamental para el tratamiento de las células en el momento adecuado. Entre las medidas, la eficacia de la inducción del endodermo definitivo afecta en gran medida la eficacia de la inducción final, posiblemente por interferencia de otras células contaminantes linaje (es decir, mesodermo y ectodermo), que pueden proliferar o secretar factores interrumpir la diferenciación específica. Si la proporción de SOX17+ las células es menor del 80% en el día 4 (etapa 1B), una inducción eficaz a PDX1+ células corre el riesgo de verse comprometida.
Estados indiferenciados de hPSCs se mantienen como colonias o agregados de células compactadas. Sin embargo, métodos que parten de la diferenciación de colonias o agregados pueden sufrir de heterogeneidad, debido a la adherencia de diversas células y densidad en la Colonia, tal como en el centro y la periferia22, y porque las células están en diferentes etapas el25del ciclo celular. Por otro lado, nuestro método comienza con células disociadas, que permite a un estado relativamente homogéneo de adhesión celular de las células o densidad celular en cada célula. En términos de manejo homogéneo para cada celda, nuestros métodos podrían ser más fáciles que otras que comienzan con las culturas de la Colonia o agregación.
Aunque nuestro protocolo se puede utilizar para inducir PDX1+ células de múltiples líneas de hPSC, la diferenciación todavía podría ser ineficiente. En tales casos, las diferencias en el estado de adherencia justo después de la siembra entre las líneas de hPSC podrían ser la causa, y modificación de la densidad de siembra podría ser una solución33. De hecho, la figura 3 muestra que inadecuado diferenciación de compromisos de densidad celular siembra en endodermo definitivo y PDX1+ las células. Curiosamente, la densidad celular óptima para PDX1+ inducción celular fue diferente entre las poblaciones celulares que > 90% endodermo definitivo. Otra posibilidad para la ineficiente diferenciación es la condición de falta de mantenimiento de la hPSCs indiferenciada, que compromete la calidad de la pluripotencia a pesar de la expresión de marcadores para el estado indiferenciado. En este caso, la cultura de expansión hPSC debe reanudó temprano paso congelado poblaciones o sub clonación se debe realizar para obtener hPSCs en condiciones adecuadas. En el caso de ineficiente diferenciación en días 8 (etapa 2) o 11 (etapa 3), la duración de estas etapas debe ser optimizada. Apoyando esta idea, la duración de la etapa 3 se ha demostrado fundamental para la adquisición de características más adelante de la célula de la etapa y es dependiente de la línea de linaje pancreático34.
La generación de PDX1+ las células es crucial para la generación in vitro de las células pancreáticas. PDX1 es funcionalmente imprescindible para desarrollo basado en el conocimiento de los ratones nulos Pdx1, que son apancreatic35. Estudios de implantación in vitro e in vivo demostraron constantemente, PDX1 derivado hPSC+ las células tienen el potencial para desarrollar en todos los componentes pancreáticos, incluyendo exocrine y endocrina de las células tales como células de páncreas β3,16 , 36 , 37. así, la generación eficiente de PDX1+ las células de hPSCs conduce a un suministro estable de la célula pancreática para el establecimiento de la terapia de la célula β contra la diabetes y la comprensión del desarrollo humano páncreas y enfermedades pancreáticas.
Las limitaciones de este método están relacionadas con el formato de la cultura de dos dimensiones (2D) monocapa, que no es adecuado para algunos tipos de células y procesamiento de células. En los últimos años, culturas (3D) tridimensionales han demostrado para promover la generación de células maduras y tejidos, posiblemente debido a la mímica del microambiente en vivo. Por ejemplo, las células β generan en 3D culturas pero cultivos monocapa no 2D podrían alcanzar la capacidad de secretar insulina en respuesta a los niveles de glucosa extracelular38.
Utilizar PDX1+ las células para la generación de desarrollo más tipos de células, es importante cambiar a 3D culturas, como las culturas de la suspensión de los agregados embebidos en una matriz extracelular y culturas agregadas a un líquido aire interfaz3 , 16 , 37. Además, las culturas monocapa 2D requieren mayor superficie para el cultivo de las culturas de la suspensión, limitando la escalabilidad. El procesamiento de grandes cantidades de células para uso comercial requiere modificaciones como el uso de microesferas. Al mismo tiempo, el presente método es conveniente para la detección de factores inductores de la diferenciación y la exploración de los mecanismos moleculares por la transferencia de genes.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado en parte por fondos de la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (JSP) a través de Scientific Research (C) (JSP KAKENHI Grant Number15K09385 y 18 K 08510) T.T. y subvenciones para investigadores de JSP (JSP KAKENHI número 17J07622) A.K., y la Agencia de Japón para la investigación médica y desarrollo (AMED) a través de su investigación conceder "Centro base para iPS red de centro de investigación para la realización de la medicina regenerativa, investigación con células" a K.O. Los autores agradecen a Dr. Peter Karagiannis por leer el manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Keto-N-aminoethyl-N′-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine | Toronto Research Chemicals | K171000 | CYC |
| 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic acid | Santa Cruz Biotechnology | SC-203303 | TTNPB |
| 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
| Anti-CDX2 antibody [EPR2764Y] | Abcam | Ab76541 | Anti-CDX2, × 1/1000 dilution |
| B-27 Supplement (50 ×) | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | Serum-free supplement |
| BD FACSAria II Cell Sorter | BD Biosciences | For flow cytometry | |
| Biomedical freezer | SANYO | MDF-U538 | For -30 °C storing |
| Cell Counting Slides for TC10/TC20 Cell Counter, Dual-Chamber | BIO-RAD | 1450011 | Counting slide glass |
| CELL CULTURE MULTIWELL PLATE, 6 WELL, PS, CLEAR | Greiner bio-one | 657165 | For differentiation culture/6-well plate |
| Centrifuge | TOMY | AX-310 | For cell culturing |
| Centrifuge | TOMY | MX-305 | For RT-qPCR |
| CHIR99021 | Axon Medchem | Axon 1386 | |
| CLEAN BENCH | SHOWA KAGAKU | S-1601PRV | Clean bench |
| Corning CellBIND 6-well plate | Corning | 3335 | For feeder-free culture of hPSCs/6-well plate |
| Corning Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | Basement membrane matrix |
| Corning Synthemax II-SC Substrate | Corning | 3535 | For feeder-free culture of hPSCs/synthetic surface material for hPSCs |
| Cryostat | Leica | Leica CM1510 S | For immunostaining of aggregates. |
| Cytofix/Cytoperm Kit | Becton Dickinson | 554714 | Perm/Wash buffer is Permeabilization/Wash buffer. Cytofix/Cytoperm buffer is fixation and permeabilization buffer. |
| Dako pen | Dako | S2002 | For immunostaining of aggregates |
| dNTP mix (10 mM) | Thermo Fisher Scientific | 18427-088 | For RT-qPCR |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11055 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10036 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10040 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey Serum | Merck Millipore | S30 | Donkey serum |
| D-PBS(-) without Ca or Mg | Nacalai tesque | 14249-95 | DPBS |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | For feeder-free culture of hPSCs/hPSC maintenance medium |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | 5 mL round bottom polystyrene tube with cell strainer |
| Filter Tip, 1,000 µL | Watoson | 124-1000S | Use together with pipettes |
| Filter Tip, 20 µL | Watoson | 124-P20S | Use together with pipettes |
| Filter Tip, 200 µL | Watoson | 124-P200S | Use together with pipettes |
| Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X700 | For immunostaining |
| Forma Steri-Cycle CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 370A | Incubator |
| HNF-1β Antibody (C-20) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7411 | Anti-HNF1β, × 1/200 dilution |
| HNF-4α Antibody (H-171) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8987 | Anti-HNF4α, × 1/200 dilution |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | For nucleus staining, × 1/200 dilution |
| Human Pancreas Total RNA | Ambion | AM7954 | For RT-qPCR |
| Human PDX-1/IPF1 Antibody | R&D Systems | AF2419 | Anti-PDX1, goat IgG, × 1/200 dilution |
| Human SOX17 Antibody | R&D Systems | AF1924 | Anti-SOX17, × 1/200 dilution |
| Improved MEM Zinc Option medium | Thermo Fisher Scientific | 10373-017 | iMEM |
| Incubation chamber | Cosmo Bio | 10DO | For immunostaining of aggregates |
| Latex Examination Gloves | Adachi | ||
| MAS coated slide glass | Matsunami Glass | 83-1881 | For immunostaining of aggregates |
| MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | 4346907 | For RT-qPCR |
| Microscope | Olympus | CKX41N-31PHP | For cell culturing |
| Microtube | Watoson | 131-515CS | |
| Monoclonal Anti-α-Fetoprotein | SIGMA | A8452 | Anti-AFP, × 1/200 dilution |
| Nanodrop 8000 | Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Oligo dT | FASMAC | Custom made Oligo | For RT-qPCR of sequence is "TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT" |
| Paraformaldehyde, powder | Nacalai tesque | 26126-54 | PFA, fixative, diluted in DPBS |
| Pharmaceutical refrigerator | SANYO | MPR-514 | For 4 °C storing |
| PIPETMAN P | GILSON | Pipette | |
| Recombinant Human KGF/FGF-7 | R&D Systems | 251-KG | KGF |
| Recombinant Human Noggin | PeproTech | 120-10C | NOGGIN |
| Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A | R&D Systems | 338-AC | Activin A |
| ReverTra Ace (100 U/μL) | TOYOBO | TRT-101 | For RT-qPCR |
| RNase-free DNase Set (50) | QIAGEN | 79254 | For RT-qPCR |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | For RT-qPCR |
| RPMI 1640 with L-Gln | Nacalai tesque | 30264-85 | RPMI 1640 |
| Sealing Film for Real Time | Takara | NJ500 | For RT-qPCR |
| Serological pipettes 10 mL | Costar/Corning | 4488 | For cell culturing |
| Serological pipettes 25 mL | Costar/Corning | 4489 | For cell culturing |
| Serological pipettes 5 mL | Costar/Corning | 4487 | For cell culturing |
| Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAb | Cell signaling | 3579S | Anti-SOX2, × 1/200 dilution |
| StepOnePlus | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Sucrose | Nacalai tesque | 30406-25 | For immunostaining of aggregates |
| TB Green Premix Ex Taq II |
Takara | RR820B | For RT-qPCR |
| TC20 Automated Cell Counter | BIO-RAD | 1450101J1 | Automatic cell counter |
| Tissue-Tek OCT compound 4583 | Sakura Finetechnical | 4583 | For immunostaining of aggregates |
| Tissue-Tek Cryomold Molds/Adapters | Sakura Finetechnical | 4566 | For immunostaining of aggregates |
| Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| Trypan Blue | BIO-RAD | 1450021 | |
| Ultracold freezer | SANYO | MDF-U33V | For -80 °C storing |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | Dilute with DPBS to prepare 0.5 mM EDTA |
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Y-27632 | Wako | 251-00514 |
References
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