Summary
在这里, 我们提出了一个详细的协议, 以区分人类多能干细胞 (Hpsc) 到胰十二指肠蛋白 1+ (pdx1+) 细胞的产生的非群体类型单层生长的基础上, 胰腺谱系离解的单细胞。该方法适用于同源 hPSC-derived 衍生细胞的产生、遗传操作和筛选。
Abstract
人多能干细胞 (hPSC) 衍生胰腺细胞是再生医学中一种很有前途的细胞来源, 也是研究人类发育过程的平台。分步定向分化, 重述发育过程是产生胰腺细胞的主要方法之一, 包括胰十二指肠蛋白同源蛋白 1+ (pdx1+) 胰腺祖细胞。传统的协议在通过后不久就开始与小菌落进行分化。然而, 在菌落或聚集的状态下, 细胞容易发生异质性, 这可能会阻碍对 PDX1+细胞的分化。在这里, 我们提出了一个详细的协议, 以区分 Hpsc 到 PDX1+细胞。该方案由四个步骤组成, 通过播种离解的单细胞启动分化。在诱导 SOX17+确定内皮细胞后, 将两个原始肠道管标记 HNF1Β和 hnf4α表达, 并最终分化为 pdx1+细胞。本协议提供了简单的处理, 并可能提高和稳定一些 hPSC 线的分化效率, 以前发现, 这些线路不有效地分化为内皮谱系或 PDX1+细胞。
Introduction
胰腺主要由外分泌细胞和内分泌细胞组成, 其功能障碍或超载导致胰腺炎、糖尿病和胰腺癌等多种疾病。为了阐明胰腺病的病因, 有必要对胰腺细胞的发育过程和功能进行分析。此外, 建立细胞组织补充治疗需要稳定的细胞供应和强大的质量。人类多能干细胞 (hpsc) 衍生的胰腺细胞是一个很有前途的细胞来源, 这是一个很有前途的细胞源, 和分化协议的胰腺细胞已深入研究1,2, 3, 4. 我的工作是什么？胰腺β细胞体外生成的新进展模仿了成人人β细胞的生成, 这些细胞在糖尿病模型小鼠2,3植入时显示出治疗效果。此外, 对健康和1型糖尿病患者捐献者诱导多能干细胞 (Ipsc) 产生的β细胞的分析显示, 包括在压力下 5, 没有功能差异.此外, 在与 6,7 患者相同的地点, 患者衍生的 ipsc 或 hpsc 存在基因突变, 导致胰腺细胞的疾病表型部分被复制。
为了从 Hpsc 中产生胰腺细胞, 采用了分步定向分化, 重述了发育过程。胰腺来源于早期胚胎的内皮层, 表达了性别决定性区域 y-盒 17 (SOX17) 和叉头盒 A2 (FOXA2)8。在小鼠研究的基础上, 内皮层形成原始的肠道管, 其特征是肝细胞核因子 1-beta (Hnf1β) 和肝细胞核因子 4-alpha (hnf4α) 的表达。原始的肠道管伸长并发展成呼吸系统、消化道和器官。伸长后, 后前部区成为推定胰腺区, 其特征是转录因子胰腺/十二指肠蛋白 1 (pdx1)8,9,10的表达。pdx1+肠道管的背侧和腹侧部分变厚形成胰芽, 其特征是胰腺转录因子1亚基α (ptf1a) 和 nk6 同源 box 1 (nkx6.1)8,11的共表达。这一表达标志着胰腺器官发生的形态开始。胰腺内真皮细胞是胰芽的组成部分, 形成一个分支管状的上皮结构网络 12,并最终分化为外分泌和内分泌细胞, 包括胰岛素分泌β细胞和葡萄糖分泌的α细胞。pdx1 的表达首先在推定胰腺区检测, 然后在整个胰腺发育过程中观察到, 并显示出β-和细胞9、13、14 的定位。虽然 Pdx1 + 细胞区不表达 Ptf1a或Nkx6.1 分化为胃狭窄, 十二指肠, 肝外胆管和一些肠道细胞在发育的中后期阶段在小鼠 9, pdx1+ 细胞在人类早期发育阶段被认为是胰腺的祖细胞。
在这里, 我们提出了一个详细的协议, 以区分 Hpsc 到 PDX1+细胞的胰腺谱系的生成。该方案通过播种离解的单细胞15、16、17来引发分化。一般情况下, 未分化的 Hpsc 在悬浮液或粘附中保持为菌落或细胞集体。因此, 大多数协议在传代后不久就开始分化。然而, 在菌落或聚集体的状态下, 细胞容易出现空间和转录异质性18、19、20、21、22, 这可能会阻碍向最终内皮的第一步分化, 然后是低效率的分化到 PDX1+细胞。本协议可以提供易于操作, 以提高和稳定一些 hPSC 线的分化效率, 这些线路以前被发现对内皮谱系和 PDX1+细胞23的分化效率很低,24,25岁
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Protocol
京都大学医学系和医学研究生院伦理委员会批准了使用 Hpsc 的实验。
1. 材料的制备
请注意:准备所有培养基和试剂, 以便在无菌环境中进行细胞培养。使用前将基础培养基加热至室温 (RT)。在 RT 使用培养基, 在6小时内使用. 试剂的详情列于物料表。
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区别 (图 1 a)
- 阶段1A 介质: 使用移液器将 RPMI 1640 介质转移到试管中。加入无血清补充剂, 活性 a、CHIR99021 和 Y-27632, 浓度分别为1x、100 ngml、3μm 和10μm。
- 阶段1B 介质: 使用移液器将 RPMI 1640 介质转移到试管中。加入无血清补充剂, 活性 a 和 CHIR99021, 浓度分别为1x、100 ngml、≤1μm。
注: CHR99021 的浓度应低于第1 a 期介质, 并且不需要添加, 但它会增加电池数量。 - 第2阶段介质: 使用移液器将改进的 MEM (iMEM) 介质转移到试管中。加入无血清补充剂和角质形成细胞生长因子 (KGF), 浓度分别为 0.5 x 和 50 ngml。
- 第3阶段介质: 使用移液器将 iMEM 介质转移到试管中。加入无血清补充剂、KGF、NOGGIN、3-酮-n-氨基-n-氨基外给前列腺二氢肉桂酰环磷胺 (cyc) 和 4-e-2-(5, 6, 7, 8-四氢-5, 5, 8, 8-四甲基-2-萘基)-1-丙基]-苯甲酸 (ttnpb)浓度分别为 0.5 x、50 ngml、100 ngml、0.5μm 和10nm。
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流式细胞术 (FCM)
- 1 x 渗透/清洗缓冲液: 通过移液器将水输送到管子中。将移液器的渗透/洗涤缓冲液加入1x 的浓度。
- FCM 阻隔溶液: 通过移液器将1x 的每一次渗透/清洗缓冲液输送到试管中。将驴血清通过移液器加入到2% 的浓度 (vol/vol) 中。
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免疫染色
- 阻塞溶液: 将 Dulbecco 的磷酸盐缓冲盐水 (DPBS) 通过移液器输送到试管中。将驴血清和 Triton X 通过移液器加入, 浓度分别为 5% (vol/vol) 和 0.4% (vol/vol)。
2. hPSC 分化为后后后细胞胰腺祖细胞 (PDX1+细胞)
请注意:使用无菌技术执行所有程序。根据制造商的说明17、26, hpsc 在6孔板上进行维护, 该板材由带有 hpsc 维护介质的合成表面材料包覆。当细胞达到50-80 融合 (第0阶段) 时, 使用它们进行分化。
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准备基底膜基质涂层板。
- 将 RPMI 1640 ( 4°c) 的6毫升转移到冰上冷却至4°c的管中。加入2毫克的基底膜基质 ( 4°c) 与冷却 1 ml-移液器的尖端, 并通过温和的移液混合, 使 0.33 mL-pipette 基底膜基质。
- 用移液器将稀释后的基底膜基质2毫升转移到6井细胞培养板的每口井上。将板材置于37°c下, 在孵化器中放置60-90分钟。之后, 将板材保持在 RT, 直到使用 (3小时内)。
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将 Hpsc 播种, 并开始分化到最终的内皮 (1A 阶段)。
- 通过移液器将使用的培养基中的2毫升加入 0.5 mm 乙二胺四乙酸 (EDTA) (RT), 清洗在6孔板中培养的 Hpsc。
- 通过移液器吸收 0.5 mM edta, 每口每口添加2毫升 0.5 mM EDTA。在37°c下将板材取出5分钟。
- 在 RT 中加入1毫升的 hPSC 维护介质, 每口液中加入 10μm y-27632。移液器轻轻但迅速地吹掉板上附着的细胞, 并将聚集的细胞分解成单个细胞。在移液过程中不要将细胞悬浮液泡泡。
- 将细胞悬浮液转移到一个50毫升的离心管中, 其中含有4毫升的 hPSC 维护介质, 并辅以 10μm Y-27632。轻轻移液细胞悬浮液。
- 使用 Trypan 蓝色染色排除过程对细胞悬浮液中的细胞号进行计数。
- 在管内混合15Μl 的细胞悬浮液和15μl 的色氨酸蓝。
- 将用 Trypan Blue 稀释的细胞悬浮液10Μl 转移到细胞上, 用10μl 移液器将一式重复的滑块。
- 用自动单元格计数器计算单元格数, 并计算细胞悬浮液中的单元格密度。可行性通常是 & gt;98%。
- 在50毫升的离心管中倾斜细胞悬浮液, 每口6井板 (1-1. 1.5 x 10 细胞/厘米 2 ), 每管 1-1.5 x 10 6 细胞.
- 在 RT 以 200 x g的速度离心 50 Ml 管5分钟。
- 使用移液器吸吸上清液, 每口用1a 期介质 (RT) 1 毫升重新悬浮细胞。轻轻移液细胞悬浮液, 再加入1毫升的1A 级培养基 (共2毫升, 每口)。
- 在 1, 000μl 移液器2.1.2 制备的细胞培养板的井中吸收稀释的基底膜基质。立即继续执行下一步。
- 轻轻移液细胞悬浮步再次2.2.8。混合后, 立即将细胞悬浮液 (2 毫升) 转移到6井板的每一口井中。用铝箔覆盖板材, 以保护板材不受光线的影响。将板材放在 RT 干净的长凳上10-15。
请注意:播种后不要移动盘子。 - 轻轻将板材放入37°c、5% co2孵化器 (加湿气氛), 培养24小时。
请注意:播种后不要摇晃盘子。
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诱导分化为最终的内皮 (期 1B)。
- 采用移液器在井中加入2毫升的 DPBS。重复一次 DPBS 的愿望和添加。
请注意:要从单层中取出任何死细胞, 请在每次抽吸前轻轻摇晃板。 - 用移液器吸收使用过的 DPBS, 每口添加4毫升的1B 级介质 ( 37°c)。轻轻将板材放入37°c孵化器 (5% co2的加湿气氛), 培养48小时。
- 采用移液器在井中加入2毫升的 DPBS。重复一次 DPBS 的愿望和添加。
请注意:在每次抽吸前, 通过轻轻的晃动将死细胞从单层中取出。 - 用移液器吸收使用过的 DPBS, 每口在1B 期介质 ( 37°c) 中加入4毫升。轻轻将板材放入孵化器 ( 37°c, 加湿气氛为5% 二氧化碳), 培养24小时。
- 采用移液器在井中加入2毫升的 DPBS。重复一次 DPBS 的愿望和添加。
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诱导分化为原始的肠道管 (第2阶段)。
- 采用移液器在井中加入2毫升的 DPBS。
注: 每次抽吸前, 通过轻轻的晃动将死细胞从单层中取出。 - 用移液器吸收使用过的 DPBS, 每口添加4毫升的第2阶段介质 ( 37°c)。将板材放入孵化器 ( 37°c, 加湿气氛为5% 二氧化碳)并培养4天。
- 采用移液器在井中加入2毫升的 DPBS。
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诱导分化为 PDX1+细胞 (第3阶段)。
- 采用移液器在井中加入2毫升的 DPBS。重复一次 DPBS 的愿望和添加。
- 用移液器吸收使用过的 DPBS, 每口在3期介质 ( 37°c) 中加入4毫升。将板材放入孵化器 ( 37°c, 加湿气氛为5% 二氧化碳)并培养3天。
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诱导分化为胰腺内分泌细胞。
- 执行 nkx6.1+细胞诱导 (第4阶段, 8天), 然后进行内分泌细胞诱导 (第5阶段, 12天), 其先前描述的协议为 3、16、26。通过免疫染色和定量实时逆转录聚合酶链反应 (qRT-PCR) 分析, 表征和验证内分泌细胞分化。
请注意:有关详细的实验程序, 请参阅丰田章男等16人和木村等人26 人。关于用于 qRT-PCR 分析的引物序列, 请参见表 1 。
- 执行 nkx6.1+细胞诱导 (第4阶段, 8天), 然后进行内分泌细胞诱导 (第5阶段, 12天), 其先前描述的协议为 3、16、26。通过免疫染色和定量实时逆转录聚合酶链反应 (qRT-PCR) 分析, 表征和验证内分泌细胞分化。
3. 流式细胞仪 (FCM)
- 采用移液器将使用过的培养基加入2毫升 0.5 mM EDTA。重复一次 0.5 mM EDTA 的抽吸和添加。
请注意:轻轻摇晃板, 在每次抽吸前从单层细胞中取出任何死细胞。 - 要分离细胞 (每口井约 3-6x106个细胞), 加入 2 ml 0.25% 的胰蛋白酶, 每口井含有 0.5 MM EDTA。在37°c下将板材孵化5-10。
- 移液器温和但迅速地分离成单个细胞的细胞。在移液过程中不要将细胞悬浮液泡泡。
- 加入 8-10 mL 的碱基培养基 (RPMI 1640 或 iMEM, RT), 含有0.5倍无血清补充剂, 每口井 10Μm y-27632, 混合细胞悬浮液。将细胞悬浮液转移到离心管中。
- 在 RT 以 300 x克的速度离心管5分钟。
- 用 0.5 mM EDTA (RT) 的2毫升吸吸上清液并重新悬浮细胞。轻轻移液细胞悬浮液。
- 在 RT 以 300 x克的速度离心管5分钟。
- 在引擎盖下, 用100μl 的固定和渗透缓冲液吸住上清液并重新悬浮细胞 。轻轻将细胞悬浮液置于引擎盖下。将管材保持在 RT 30分钟。
- 在 RT 以 400 x g的速度离心管5分钟。
- 将上清液吸进引擎盖下, 每 10 6个细胞用 500μl FCM 阻隔溶液重新悬浮细胞.轻轻移液细胞悬浮液。将管材保持在 RT 30分钟。
- 将细胞悬浮液的50Μl 转移到试管中 (约 1 x10 5 细胞)。在 RT 以 400 x g的速度离心管 5分钟, 取出上清液, 在 fcm 阻滞溶液中用100Μl 稀释的原代抗体 (见材料表) 重新悬浮细胞, 并在4°c孵育 & gt;16 h。
- 在 RT 以 400 x克的速度离心管 5分钟, 取出上清液, 用180μl 的 1x Perm/Wash 清洗缓冲液重新悬浮电池。
- 在 RT 以 400 x克的速度离心管 5分钟, 取出上清液, 用100μl 稀释的二级二级抗体 (见材料表) 在 fcm 阻断溶液中重新悬浮细胞。在 RT 中将细胞培养 60分钟, 或在4°c时, 防止光线照射。
- 在 RT 以 400 x克的速度离心管 5分钟, 取出上清液, 用180μl 的 1x Perm/Wash 清洗缓冲液重新悬浮电池。
- 在 RT 以 400 x克的速度离心管 5分钟, 取出上清液, 并在 DPBS 中用 180μl 2% 的驴血清重新悬浮细胞。
- 过滤细胞悬浮液通过转移5毫升圆底部聚苯乙烯管与电池过滤器 (35μm 尼龙网), 并保持在4°c, 防止光线, 直到分析。
- 用流式细胞仪分析一定比例的阳性染色细胞。
4. 免疫染色
- 采用移液器在井中加入2毫升的 DPBS。重复一次 DPBS 的愿望和添加。
请注意:在每次抽吸之前, 轻轻摇晃盘子, 从单层细胞中取出任何死细胞。 - 在引擎盖下用移液器每口井加入2毫升4% 的甲醛 (PFA) ( 4°c)。将板材保持在4°c 下20分钟。
- 用移液器将 PFA 移除在引擎盖下。在 rt 用移液器在引擎盖下将 DPBS 添加2毫升。重复一次 DPBS 的愿望和添加。
- 每口井加入2毫升的堵液, 并将板材保持在 RT 30分钟。
- 吸收使用的溶液, 并在每口阻断溶液中加入1毫升的原代抗体 (见材料表)。在 RT 上或在4°c下 gt;16。
- 吸收使用的溶液, 加入含有 0.4% Triton X-100 的2毫升 DPBS, 在 RT 孵育 10分钟, 重复吸入, 加入溶液和孵育一次。
- 吸收使用的溶液, 并在每口阻断溶液中添加1毫升的二级抗体 (见材料表)。在 RT 中培养 60分钟, 并有防光保护。
- 吸收使用的溶液, 添加2毫升的 DPBS, 包含 0.4% Triton X-100 (RT), 并在 RT 孵育 5分钟, 防止光线。重复两次抽吸、添加溶液和孵育。
- 在荧光显微镜下进行显微检查, 以观察其分化效率28。
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Representative Results
传播的 hpsc (585a129,30) 被浓缩并形成一个适合分化的均匀单层 (图 1b)。未分化的 Hpsc (第0阶段) 在低细胞密度 (1-1. 1.5 x10 5 细胞 2) 时分离并重新播种为单细胞.在1小时内, 细胞连接到板上, 开始显示突起。在第一天, 细胞增殖, 分布良好, 覆盖80% 至90% 的表面积。在第一阶段 b, 由于死细胞, 介质出现多云。去除死细胞对于高效分化至关重要, 因为死细胞可能会干扰下面细胞的存活和分化。在 3-4天, 细胞形成一个均匀的单层片, 可以被描述为鹅卵石外观。此时, 大多数细胞停止表达确定性别的区域 y-盒 2 (SOX2), 这是未分化细胞的标记, 而是以90% 以上的速度表达明确的内皮标记 SOX17 (图 2a 和 b)。大多数 SOX17+细胞表示 Foxa2 (图 2a)。以不适当的细胞密度开始分化会影响此步骤的分化效率 (图 3)。在第2阶段和第3阶段, 细胞死亡放松, 使用的培养基不像第1 b 阶段那样多云。细胞以90% 以上的速度表达原始肠道管标记 HNF1Β和 hnf4α (图 2c), 并最终表达后前胰腺祖细胞标记 PDX1 (图 2D 和 e)。PDX1+细胞诱导可在另一条 hiPSC 线 (1231a3 31)和 hesc 线 Khes-3 32 ( 图 4) 中重现。级标记物 mRNA 表达的 qRT-PCR 结果与免疫染色结果一致 (图 5a)。PDX1 的 mRNA 表达在第3阶段表现得很明显, 并显著增加了后记。
PDX1+细胞在早期发育阶段不仅有可能分化为胰腺细胞, 还有可能分化为胃内、十二指肠、肝外胆管和部分肠道 9. 体外生成的 pdx1+细胞对胰腺细胞的分化潜力可以通过延长培养评估, 并报告胰腺内皮和胰腺内分泌细胞的协议 3,16, 26. 第19天 (第4阶段) 和第31天 (第5阶段) 分别观察到胰腺内皮标志物 Nkx6.1 和两个胰腺内分泌标记 Insulin 和glucacon的表达 (图 5).
图 1: 细胞在逐步分化下的代表性外观.(a) 一种从 Hpsc 到胰腺谱系的定向分化方案。括号中的数字表示浓度 (单位写在下面)。(b) 在分化培养的关键步骤中, 具有代表性的高职等私营保安公司明亮场显微镜。585A1 Hpsc 作为单细胞离解并诱导分化为最终的内皮、原始的肠道管和后前肢胰腺祖细胞。下面的面板是上面板的放大视图。RPMI, RPMI 1640;AA, 活性 a (Ng/ml);CH, 口径 99021 (μM);KGF (Ng/ml);NOG, NOGGIN (Ng/ml);CYC, 3-酮-n-氨基乙基-n '-氨基己基二氢肉桂酰环胺 (μM);TTNPB, 4-[(E)-2-(5, 6, 7, 8-四氢-5, 5, 8, 8-四甲基-2-萘基)-1-苯甲酸 (nM)。刻度柱 = 300μm。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 来自 Hpsc 的胰腺谱系的代表性诱导.(a) 分化前 (第0阶段) 和第4天 (第1 b阶段) 经流式细胞仪分析的 sox2-sox17 + 细胞的比例.未分化的高 Psc (SOX2+sox17-) 被分化为最终内皮 (sox2-sox17+).大多数 SOX17+细胞共同表达 FOXA2。(b) 第4天 (第1 b 阶段) 有代表性的免疫荧光显微镜。固定细胞被染色为 SOX17 (绿色)、SOX2 (红色) 和细胞核 (蓝色)。(c) 第4天 (第1 b 阶段) 和第8天 (第2阶段) 具有代表性的免疫荧光显微镜。固定细胞被染色 HNF1 β (绿色), hnf4α (红色) 和细胞核 (蓝色)。(d) 第4天 (第1 b 阶段) 和第11天 (第3阶段) 用流式细胞术分析 PDX1 阳性细胞的比例。(e) 第11天 (第3阶段) PDX1 (绿色) 和原子核 (蓝色) 的代表性免疫荧光显微镜图。刻度柱 = 100μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 从不同细胞密度开始的对最终内皮的代表性诱导.(a) 分化1小时后细胞的代表性明亮场显微图像。高 Psc 作为单个细胞离解, 并诱导在不同的细胞密度 (1-50x 10 4/cm 2)下分化为最终的内皮。下面的面板是上面板的放大视图。(b) 分化前 (第0阶段) 和第4天 (第1 b阶段) 经流式细胞仪分析的 sox2-sox17 + 细胞的比例.(c) 流式细胞术分析 PDX1+细胞在第8天 (第2阶段) 和第11天 (第3阶段) 的比例。刻度柱 = 300μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 对 HESCs 和 hESCs 中 PDX1+细胞的代表性诱导.将 hiPSC 线、1231A3 (a) 和 hESC 线 Khes-3 (b) 分化为最终内皮细胞和 pdx1+细胞。流式细胞仪对细胞组成进行了分析。在分化前 (第0阶段) 和第4天 (第1 b 阶段) 分析了 SOX2-SOX17 + 细胞的比例.在第8天 (第2阶段) 和第11天 (第3阶段) 分析了 PDX1+细胞的比例。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: 对胰腺内皮细胞和内分泌细胞的代表性诱导.Hpsc (585A1) 被分化为 PDX1+细胞。这些细胞进一步分化为胰腺内皮和胰腺内分泌细胞, 报告的寿命为 3、16、26.(a) 用定量实时聚合酶链反应 (qrt-pcr) 测定了阶段标记物的 mrna 表达。将这些数据归一化为Gapdh的表达, 并将其呈现为基因表达相对于峰值的折叠变化。请注意, Pdx1表达式从第8天 (第2阶段) 增加到11天 (第3阶段), 增加了 gt;20 倍, 从第11天 (第3阶段) 增加到19天 (第4阶段), 增加了 gt;100 倍。成人胰腺中的表达显示为 Panc。sox2, 黑色;Sox17, 紫色;hnf1β, 棕色;hnf4α, 橙色;pdx1, 浅绿色;Nkx6.1, 绿色;胰岛素, 蓝色;格隆, 红的(b) 第11天 (第3阶段) 和第19天 (第4阶段) 胰腺内皮标记 NKX6.1 (红色) 的典型免疫荧光显微镜图。PDX1 (绿色) 和原子核 (蓝色) 进行了共染。(c) 两个胰腺内分泌剂胰岛素 (ins, 绿色) 和胰高血糖素 (gcg, 红色) 的代表性免疫荧光显微镜图, 第19天 (第4阶段) 和第31天 (第5阶段)。核 (蓝色) 被共染色。 请点击这里查看此图的较大版本.
| 基因名称 | 基因符号 | 正向底漆 | 反向底漆 |
| 甘油-3-磷 脱氢酶 |
GAPDH | GAGGAGGGGAGTC | GAGAGGGATGGATTTC |
| sry 盒2 | SOX2 | AGCCCCACGAGAAAAA | TTTCACTTTGCACTCC |
| SRY-box 17 | SOX17 | CGACAGGAATGACAGTA | TAGCTCCCGAGGTGG |
| HNF1 同源 b | HNF1 β | CCTCCCCCACACACAGCTG | TTGTGCAGGGATTAGTT |
| 肝细胞核因子4α | HNF4Α | GAGCGCAGCCAGGACGACGAA | TACGGGGGGTGTGGATGTA |
| 胰腺和十二指肠同源1 | PDX1 | AGCAGGAGGCCTGT | CACCCTCCTTCGGAAC |
| NK6 同源1 | NKX6。1 | ATTCTGGGGATGACAGAG | TGGATCAGGCTTG |
| 胰 高 血糖 素 | GCG | GATTGATTTGTGTGTGT | CGCACATTTCACAAT |
| 胰岛素 | INS | CTACTAGGGGGAAC | GGGGGAGGGAGGAGGAGGAGGG |
表 1: qPCR 引物。
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Discussion
PDX1+单元的生成由多个步骤组成;因此, 在适当的时间治疗细胞是至关重要的。在这些步骤中, 最终内皮的诱导效率在很大程度上影响最终的诱导效率, 可能是通过其他污染谱系细胞 (即中胚层和外胚层) 的干扰, 这些细胞可能会增殖和分泌一些因素, 而这些因素会产生。破坏特定的分化。如果 SOX17+细胞的比例在第4天 (第1 b 阶段) 低于 80%, 则对 pdx1+细胞的有效诱导可能会受到损害。
Hpsc 的未分化状态被维持为压实细胞的菌落或聚集体。然而, 开始从菌落或集料分化的方法可能会受到异质性的影响, 因为不同的细胞粘附和密度在菌落,如在中心和周围 22, 并且因为细胞处于不同的阶段细胞周期25。另一方面, 我们的方法从离解的单个细胞开始, 这使得单个细胞的细胞粘附或每个单个细胞的细胞密度处于相对均匀的状态。在每个细胞的同质处理方面, 我们的方法可能比其他从菌落或聚集培养开始的方法更容易。
尽管我们的协议可用于从多个 hPSC 线诱导 PDX1+细胞, 但这种分化仍然可能效率低下。在这种情况下, hPSC 线之间在播种后的粘附状态差异可能是原因, 而改变播种密度可能是一个解决方案33。事实上,图 3显示, 不适当的种子细胞密度会损害分化为最终的内皮细胞和 pdx1+细胞。有趣的是, PDX1+细胞诱导的最佳细胞密度在达到 gt;90 确定内皮的细胞群体中是不同的。效率低下的区别的另一种可能性是未区分的 Hpsc 的维护条件差, 这损害了多能性的质量, 尽管没有区别状态的标记表示。在这种情况下, 应从早期冷冻库存中重新开始 hPSC 扩张培养, 或进行亚克隆, 以便在适当的条件下获得 Hpsc。在第8天 (第2阶段) 或第11天 (第3阶段) 的区别化效率低下的情况下, 应优化这些步骤的持续时间。支持这一观点的是, 第3阶段的持续时间对于获得后期细胞特征至关重要, 在胰腺谱系34中与细胞系有关。
PDX1+细胞的产生对胰腺细胞的体外生成至关重要。基于 Pdx1 空鼠的知识, PDX1 在功能上是必不可少的, 因为 Pdx1 空小鼠是胰腺35。在体外和体内植入研究中, hPSC-derived 衍生的 pdx1+细胞有可能发育成所有胰腺成分, 包括外分泌和内分泌细胞, 如胰腺β细胞3,16,36,37. 因此, hpsc 高效生成 pdx1 + 细胞, 为建立糖尿病β细胞治疗和了解人类胰腺发育和胰腺疾病提供了稳定的胰腺细胞供应。
该方法的局限性与二维 (2D) 单层培养形式有关, 不适合某些细胞类型和细胞处理。近年来, 三维 (3D) 培养已被证明可以促进成熟细胞和组织的生成, 这可能是由于模仿体内的微环境。例如, 在3D 培养中产生的β细胞, 而不是2D 单层培养中产生的β细胞, 可以获得分泌胰岛素的能力, 以应对细胞外葡萄糖水平38。
要使用 PDX1+细胞生成发育后期细胞类型, 重要的是要转移到3d 培养, 如细胞外基质中嵌入的聚合悬浮培养物和气液界面上的聚合培养物3,16,37. 此外, 与悬浮培养相比, 二维单层培养需要更多的表面积, 限制了可扩展性。为商业用途而加工大量细胞需要修改, 如使用微珠。同时, 该方法适用于诱导分化因子的筛选和基因转移分子机制的探索。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了日本科学促进会 (JSPS) 通过科学研究 (C) (JPS KAKENHI Grant Number15K09385 和 18K08510) 至 t. t. 和 Jps 研究研究员补助金 (JPS KAKENGRANT 编号) 的资助。17J07622) 至 a. k. 和日本医学研究与发展机构 (AMED), 通过向 k. o 提供 "研究所细胞研究核心中心、再生医学实现研究中心网络" 的研究赠款。作者感谢彼得·卡拉吉安尼斯博士阅读了手稿。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Keto-N-aminoethyl-N′-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine | Toronto Research Chemicals | K171000 | CYC |
| 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic acid | Santa Cruz Biotechnology | SC-203303 | TTNPB |
| 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
| Anti-CDX2 antibody [EPR2764Y] | Abcam | Ab76541 | Anti-CDX2, × 1/1000 dilution |
| B-27 Supplement (50 ×) | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | Serum-free supplement |
| BD FACSAria II Cell Sorter | BD Biosciences | For flow cytometry | |
| Biomedical freezer | SANYO | MDF-U538 | For -30 °C storing |
| Cell Counting Slides for TC10/TC20 Cell Counter, Dual-Chamber | BIO-RAD | 1450011 | Counting slide glass |
| CELL CULTURE MULTIWELL PLATE, 6 WELL, PS, CLEAR | Greiner bio-one | 657165 | For differentiation culture/6-well plate |
| Centrifuge | TOMY | AX-310 | For cell culturing |
| Centrifuge | TOMY | MX-305 | For RT-qPCR |
| CHIR99021 | Axon Medchem | Axon 1386 | |
| CLEAN BENCH | SHOWA KAGAKU | S-1601PRV | Clean bench |
| Corning CellBIND 6-well plate | Corning | 3335 | For feeder-free culture of hPSCs/6-well plate |
| Corning Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | Basement membrane matrix |
| Corning Synthemax II-SC Substrate | Corning | 3535 | For feeder-free culture of hPSCs/synthetic surface material for hPSCs |
| Cryostat | Leica | Leica CM1510 S | For immunostaining of aggregates. |
| Cytofix/Cytoperm Kit | Becton Dickinson | 554714 | Perm/Wash buffer is Permeabilization/Wash buffer. Cytofix/Cytoperm buffer is fixation and permeabilization buffer. |
| Dako pen | Dako | S2002 | For immunostaining of aggregates |
| dNTP mix (10 mM) | Thermo Fisher Scientific | 18427-088 | For RT-qPCR |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11055 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10036 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10040 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey Serum | Merck Millipore | S30 | Donkey serum |
| D-PBS(-) without Ca or Mg | Nacalai tesque | 14249-95 | DPBS |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | For feeder-free culture of hPSCs/hPSC maintenance medium |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | 5 mL round bottom polystyrene tube with cell strainer |
| Filter Tip, 1,000 µL | Watoson | 124-1000S | Use together with pipettes |
| Filter Tip, 20 µL | Watoson | 124-P20S | Use together with pipettes |
| Filter Tip, 200 µL | Watoson | 124-P200S | Use together with pipettes |
| Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X700 | For immunostaining |
| Forma Steri-Cycle CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 370A | Incubator |
| HNF-1β Antibody (C-20) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7411 | Anti-HNF1β, × 1/200 dilution |
| HNF-4α Antibody (H-171) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8987 | Anti-HNF4α, × 1/200 dilution |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | For nucleus staining, × 1/200 dilution |
| Human Pancreas Total RNA | Ambion | AM7954 | For RT-qPCR |
| Human PDX-1/IPF1 Antibody | R&D Systems | AF2419 | Anti-PDX1, goat IgG, × 1/200 dilution |
| Human SOX17 Antibody | R&D Systems | AF1924 | Anti-SOX17, × 1/200 dilution |
| Improved MEM Zinc Option medium | Thermo Fisher Scientific | 10373-017 | iMEM |
| Incubation chamber | Cosmo Bio | 10DO | For immunostaining of aggregates |
| Latex Examination Gloves | Adachi | ||
| MAS coated slide glass | Matsunami Glass | 83-1881 | For immunostaining of aggregates |
| MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | 4346907 | For RT-qPCR |
| Microscope | Olympus | CKX41N-31PHP | For cell culturing |
| Microtube | Watoson | 131-515CS | |
| Monoclonal Anti-α-Fetoprotein | SIGMA | A8452 | Anti-AFP, × 1/200 dilution |
| Nanodrop 8000 | Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Oligo dT | FASMAC | Custom made Oligo | For RT-qPCR of sequence is "TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT" |
| Paraformaldehyde, powder | Nacalai tesque | 26126-54 | PFA, fixative, diluted in DPBS |
| Pharmaceutical refrigerator | SANYO | MPR-514 | For 4 °C storing |
| PIPETMAN P | GILSON | Pipette | |
| Recombinant Human KGF/FGF-7 | R&D Systems | 251-KG | KGF |
| Recombinant Human Noggin | PeproTech | 120-10C | NOGGIN |
| Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A | R&D Systems | 338-AC | Activin A |
| ReverTra Ace (100 U/μL) | TOYOBO | TRT-101 | For RT-qPCR |
| RNase-free DNase Set (50) | QIAGEN | 79254 | For RT-qPCR |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | For RT-qPCR |
| RPMI 1640 with L-Gln | Nacalai tesque | 30264-85 | RPMI 1640 |
| Sealing Film for Real Time | Takara | NJ500 | For RT-qPCR |
| Serological pipettes 10 mL | Costar/Corning | 4488 | For cell culturing |
| Serological pipettes 25 mL | Costar/Corning | 4489 | For cell culturing |
| Serological pipettes 5 mL | Costar/Corning | 4487 | For cell culturing |
| Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAb | Cell signaling | 3579S | Anti-SOX2, × 1/200 dilution |
| StepOnePlus | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Sucrose | Nacalai tesque | 30406-25 | For immunostaining of aggregates |
| TB Green Premix Ex Taq II |
Takara | RR820B | For RT-qPCR |
| TC20 Automated Cell Counter | BIO-RAD | 1450101J1 | Automatic cell counter |
| Tissue-Tek OCT compound 4583 | Sakura Finetechnical | 4583 | For immunostaining of aggregates |
| Tissue-Tek Cryomold Molds/Adapters | Sakura Finetechnical | 4566 | For immunostaining of aggregates |
| Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| Trypan Blue | BIO-RAD | 1450021 | |
| Ultracold freezer | SANYO | MDF-U33V | For -80 °C storing |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | Dilute with DPBS to prepare 0.5 mM EDTA |
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Y-27632 | Wako | 251-00514 |
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