Summary
Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll zur Unterscheidung von menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSCs) in Bauchspeicheldrüse/Zwölffingerdarm Homeobox Protein 1+ (PDX1+) Zellen für die Erzeugung von Pankreas Linien auf Basis des-Kolonie Typ Monolage Wachstums der einzelne Zellen zu trennen. Diese Methode ist geeignet für die Herstellung von homogenen hPSC-abgeleitete Zellen, Genmanipulation und Überprüfung.
Abstract
Menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSC)-abgeleitete Zellen der Bauchspeicheldrüse sind eine vielversprechende Zelle Quelle für regenerative Medizin und als Plattform für menschliche Entwicklungsprozesse zu studieren. Stufenweise gerichtet, Differenzierung, die Entwicklungsprozesse rekapituliert ist einer der wichtigsten Wege, einschließlich Bauchspeicheldrüse/Zwölffingerdarm Homeobox Protein 1+ Zellen der Bauchspeicheldrüse zu generieren (PDX1+) Pankreas Vorläuferzellen. Konventionelle Protokolle initiieren die Differenzierung mit kleinen Kolonien kurz nach dem Durchgang. Jedoch in den Zustand der Kolonien oder Aggregate, Zellen sind anfällig für Heterogenitäten, die die Differenzierung zu PDX1 behindern könnte+ Zellen. Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll zur Unterscheidung von hPSCs in PDX1+ Zellen. Das Protokoll besteht aus vier Schritten und initiiert die Differenzierung nach Aussaat dissoziierten Einzelzellen. Die Induktion von SOX17+ endgültige Entoderm Zellen folgte der Ausdruck der beiden primitiven Darm Rohr Marker, HNF1β und HNF4α und eventuelle Differenzierung in PDX1+ Zellen. Dieses Protokoll bietet einfache Handhabung zu verbessern und stabilisieren die Differenzierung Effizienz einiger hPSC Zeilen, die bisher gefunden wurden, um ineffizient in endodermische Linien oder PDX1 zu unterscheiden+ Zellen.
Introduction
Die Bauchspeicheldrüse besteht hauptsächlich aus exokrinen und endokrinen Zellen, und seine Dysfunktion oder Überlastung verursacht mehrere Krankheiten wie Pankreatitis, Diabetes und Bauchspeicheldrüsenkrebs. Um die Pathogeny des Pancreatopathy zu erhellen, ist es notwendig, den Entwicklungsprozess und die Funktion von Zellen der Bauchspeicheldrüse zu analysieren. Darüber hinaus ist eine stabile Zelle Versorgung mit robuste Qualität herstellen Zellgewebe/Supplementierung Therapie erforderlich. Menschlicher pluripotenter Stammzellen (hPSC)-abgeleitete Zellen der Bauchspeicheldrüse sind eine vielversprechende Zelle Quelle für diese Zwecke, und die Differenzierung Protokoll gegen Zellen der Bauchspeicheldrüse wurde intensiv studierte1,2,3, 4. Die jüngsten Fortschritte bei der in-vitro-Erzeugung von pankreatischer β-Zellen imitieren die Generation der β-Zellen bei erwachsenen Menschen, und diese Zellen zeigen therapeutische Wirksamkeit bei der Implantation in diabetischen Modell Mäuse2,3. Darüber hinaus ergab die Analyse der β-Zellen von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) von gesunden und Typ 1 Diabetes Patienten Spender generiert keine funktionalen Unterschiede, auch wenn Sie unter Stress5. Darüber hinaus wurden Krankheit Phänotypen in induzierte Pankreaszellen mit Patienten abgeleitet iPSCs oder hPSCs beherbergen genetische Mutationen am gleichen Standort wie die Patienten6,7teilweise reproduziert.
Um Zellen der Bauchspeicheldrüse aus hPSCs erstellen, wird schrittweise gezielte Differenzierung, die Entwicklungsprozesse rekapituliert verwendet. Die Bauchspeicheldrüse leitet sich aus dem Entoderm Layer des frühen Embryos, die Geschlecht-Bestimmung von Region Y-Box 17 (SOX17) zum Ausdruck bringt und Forkhead Box A2 (FOXA2)8. Basierend auf den Studien an Mäusen, bildet die endodermische Schicht der primitiven Darm-Schlauch, der durch den Ausdruck der Hepatozyten nuklearer Faktor 1-Beta (Hnf1β) und Hepatozyten nuklearer Faktor 4-Alpha (Hnf4α) gekennzeichnet ist. Das primitive Darm Rohr verlängert und in die Atemwege Gerät, Verdauungstrakt und Organe entwickelt. Nach Dehnung, der hinteren Foregut Bereich wird der mutmaßlichen Pankreas Region, wie durch den Ausdruck der transcriptional Faktor Bauchspeicheldrüse/Zwölffingerdarm Homeobox Protein 1 (PDX1)8,9,10markiert. Die dorsalen und ventralen Teil der PDX1+ Darm Rohr verdicken, Form pankreatischen Knospen, die durch die Co Ausdruck der Bauchspeicheldrüse Transkription Faktor 1 Untereinheit Alpha (PTF1A) und NK6 Homeobox 1 (NKX6.1)8,11gekennzeichnet sind. Dieser Ausdruck beginnt morphologische der pankreatischen Organogenese. Pankreas Entoderm Zellen, die Komponenten der pankreatischen Knospen sind, bilden ein verzweigtes röhrenförmigen Netz von epithelialen Strukturen12 und schließlich in exokrinen und endokrinen Zellen, einschließlich der β-Zellen Insulin-sezernierenden differenzieren und Glukagon-sezernierenden α-Zellen. Ausdruck der PDX1 ist zunächst der mutmaßlichen Pankreas Region erkannt wird dann während der gesamten Bauchspeicheldrüse Entwicklung beobachtet und zeigt Lokalisierung zu β und δ-Zellen9,13,14. Obwohl die Pdx1+ Zelle Bereich, der nicht Ptf1a oder Nkx6.1 zum Ausdruck bringt unterscheidet in den Magen Antrum, Zwölffingerdarm, extrahepatische Gallenwege und einige Darmzellen bei mittleren bis späten Stadium der Entwicklung in Mäusen9PDX1+ Zellen gelten als Vorfahren der Bauchspeicheldrüse in der frühen Entwicklungsphase beim Menschen.
Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll zur Unterscheidung von hPSCs in PDX1+ Zellen für die Erzeugung von Pankreas Abstammungen. Die Protokoll Eingeweihten Differenzierung durch impfen dissoziiert Einzelzellen15,16,17. Im Allgemeinen sind undifferenzierte hPSCs als Kolonien oder Zelle Aggregate in der Schwebe oder Adhäsion gepflegt. Infolgedessen initiieren die meisten Protokolle die Differenzierung kurz nach Passagierung Jedoch in den Zustand der Kolonien oder Aggregate, Zellen sind anfällig für räumliche und transkriptionelle Heterogenitäten18,19,20,21,,22, die behindern könnten die erster Differenzierung Schritt zur endgültigen Entoderm gefolgt von ineffizienten Differenzierung nach PDX1+ Zellen. Dieses Protokoll kann einfache Handhabung zur Verbesserung und Stabilisierung der Differenzierung Effizienz bieten einige hPSC-Linien, die bisher gefunden wurden, ineffizient, endodermische Linien und PDX1 unterscheiden+ Zellen23, 24 , 25.
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Protocol
Experimente mit hPSCs wurden von der Ethikkommission der Abteilung für Medizin und Graduate School of Medicine, Universität Kyoto genehmigt.
1. Vorbereitung der Materialien
Hinweis: Bereiten Sie alle Medien und Reagenzien für die Zellkultur in einer sterilen Umgebung. Wärmen Sie base Nährmedien auf Raumtemperatur (RT) vor dem Gebrauch. Medium für Differenzierung innerhalb 6 h bei RT. Details der Reagenzien verwendet wird finden Sie in Tabelle der Materialien.
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Differenzierung (Abbildung 1A)
- Stufe 1A Medium: Transfer RPMI 1640 Medium in ein Rohr mit einer Pipette. Fügen Sie die serumfreien Ergänzung, Activin A, CHIR99021 und Y-27632 zu einer Konzentration von 100 ng/mL, 1 X, 3 μM und 10 μM bzw..
- Stufe 1 b Medium: Transfer RPMI 1640 Medium in ein Rohr mit einer Pipette. Die serumfreien ergänzen, Activin A und CHIR99021 zu einer Konzentration von 100 ng/mL, 1 X, ≤1 μM bzw. hinzufügen.
Hinweis: Die Konzentration der CHIR99021 sollte niedriger sein als im Stadium 1A Medium und Zusatz ist nicht notwendig, aber es erhöht die Anzahl von Zellen. - Stufe 2 Medium: Transfer verbessert MEM (iMEM) Medium in ein Rohr mit einer Pipette. Fügen Sie die serumfreien Ergänzung und Keratinozyten Wachstumsfaktor (KGF) zu einer Konzentration von 0,5 x und 50 ng/mL, beziehungsweise.
- Stufe 3 Medium: iMEM Übertragungsmedium in ein Rohr mit einer Pipette. Hinzufügen die serumfreien Beilage, KGF, Birne, 3-Keto-N-Aminoethyl-N'- Aminocaproyldihydrocinnamoyl Cyclopamine (CYC) und 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic Säure (TTNPB) mit Pipette, Konzentrationen von 0,5 X, 50 ng/mL, 100 ng/mL, 0,5 μM und 10 nM, beziehungsweise.
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Durchflusszytometrie (FCM)
- 1 x Permeabilisierung/Waschpuffer: Transfer Wasser in ein Gefäß mit einer Pipette. Eine Konzentration von 1 X Permeabilisierung/Waschpuffer durch eine Pipette hinzufügen.
- FCM blockiert Lösung: Transfer 1 x Permeabilisierung/Waschpuffer in ein Rohr mit einer Pipette. Esel Serum mit einer Pipette zu einer Konzentration von 2 % (Vol/Vol) hinzufügen.
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Immunostaining
- Blockieren Lösung: Transfer Dulbecco Phosphate-Buffered Kochsalzlösung (DPBS) in ein Rohr mit einer Pipette. Fügen Sie Esel Serum und Triton X Pipette zu einer Konzentration von 5 % (Vol/Vol) und 0,4 % (Vol/Vol), beziehungsweise.
(2) hPSC Differenzierung zum hinteren Foregut Zellen/Bauchspeicheldrüsen Stammväter (PDX1+ Zellen)
Hinweis: Durchführen Sie alle Verfahren mit sterile Techniken. hPSCs werden bei 6-Well-Platten beschichtet durch eine synthetische Oberflächenmaterial für hPSCs mit hPSC Wartung Medium entsprechend des Herstellers Anweisungen17,26beibehalten. Wenn Zellen erreichen 50-80 % Konfluenz (Stufe 0) verwenden sie zur Differenzierung.
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Bereiten Sie Basalmembran Matrix-beschichteten Platten.
- Transfer 6 mL RPMI 1640 (4 °C) in einem Rohr auf 4 °C auf Eis gekühlt. Fügen Sie 2 mg der Basalmembran Matrix (4 °C) mit gekühlten 1 mL-Pipettenspitzen und mischen Sie gut durch sanfte Pipettieren um 0,33 mg/mL Basalmembran Matrix zu machen.
- 2 mL der verdünnten Basalmembran Matrix Transfer in jede Vertiefung des 6-Well Zellplatten Kultur mit einer Pipette. Legen Sie die Platten bei 37 °C für 60-90 min. im Inkubator. Danach halten Sie die Platten bei RT bis zur Verwendung (innerhalb von 3 h).
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Samen Sie der hPSCs und initiieren Sie Differenzierung zum endgültigen Entoderm (Stadium 1A) zu.
- Aspirieren Sie das eingesetzte Medium und 2 mL 0,5 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) (RT) pro Bohrloch mit Pipette, die hPSCs in der 6-Well-Platten kultiviert zu waschen.
- Aspirieren Sie 0,5 mM EDTA und 2 mL 0,5 mM EDTA pro Bohrloch mit Pipette. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C für 5 min.
- Aspirieren 0,5 mM EDTA und 1 mL hPSC Wartung Medium bei RT ergänzt mit 10 μM pro von Pipette gut Y-27632. Pipette vorsichtig, aber schnell zum Abblasen der angeschlossenen Zellen auf den Tellern und aufgehäuften Zellen in einzelne Zellen zu trennen. Die Zellsuspension nicht beim Pipettieren Blase.
- Übertragen die Zellsuspension in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen mit 4 mL hPSC Wartung Medium bei RT mit 10 μM ergänzt Y-27632. Pipette vorsichtig die Zellsuspension.
- Zählen Sie die Anzahl von Zellen in der Zellsuspension mit dem Trypan blau Fleck-Ausschluss-Verfahren.
- Mix 15 μl Zellsuspension und 15 μl Trypan blau in einem Rohr.
- 10 μL der Zellsuspension verdünnt mit Trypan blau auf Zelle zählen Folien in zweifacher Ausfertigung mit einer 10 μl Pipette zu übertragen.
- Zählen Sie die Zelle Nummer mit einem automatischen Zelle Zähler zu und rechnen Sie die Zelldichte in der Zellsuspension. Rentabilität ist in der Regel > 98 %.
- Aliquoten die Zellsuspension in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen bei 1-1,5 x 106 Zellen pro Bohrloch des 6-Well-Platten (1-1,5 x 105 Zellen/cm2).
- Zentrifugieren Sie die 50 mL-Tube mit 200 X g bei RT 5 min.
- Den Überstand mit einer Pipette abzusaugen und die Zellen mit 1 mL der Stufe 1A Medium (RT) pro Bohrloch Aufschwemmen. Sanft die Zellsuspension pipette und ein weiteres 1 mL Stufe 1A Medium (insgesamt, 2 mL pro Well).
- Aspirieren Sie die verdünnte Basalmembran Matrix in den Vertiefungen der die Zellplatten Kultur von einer 1.000 μl Pipette im Schritt 2.1.2 vorbereitet. Sofort mit dem nächsten Schritt fortfahren.
- Sanft pipette die Zellsuspension in Schritt 2.2.8 wieder. Sofort nach dem Mischen übertragen Sie die Zellsuspension (2 mL) in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte. Abdeckplatte mit einer Alu-Folie auf die Platte vor Licht zu schützen. Legen Sie die Platte in den sauberen Werkbank bei RT für 10-15 min.
Hinweis: Bewegen Sie die Platte nicht nach der Aussaat. - Legen Sie die Platte vorsichtig in einem 37 °C, 5 % CO2 -Inkubator (feuchte Atmosphäre) und Kultur für 24 h.
Hinweis: Schütteln Sie die Platte nicht nach der Aussaat.
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Induzieren Sie die Differenzierung in endgültige Entoderm (Stufe 1 b).
- Aspirieren Sie das eingesetzte Medium und 2 mL DPBS in die Vertiefungen mit Pipette. Wiederholen Sie die Streben und Ergänzung des DPBS einmal.
Hinweis: Um alle abgestorbenen Zellen aus der Monolage entfernen, schütteln Sie vorsichtig die Platte vor jedem Anspruch. - Abzusaugen Sie gebrauchte DPBS mit einer Pipette und 4 mL Stufe 1 b Medium (37 °C) pro Bohrloch. Legen Sie die Platte vorsichtig in 37 °C Inkubator (feuchte Atmosphäre des 5 % CO2) und Kultur für 48 h.
- Aspirieren Sie das eingesetzte Medium und 2 mL DPBS zum Brunnen mit Pipette. Wiederholen Sie die Streben und Ergänzung des DPBS einmal.
Hinweis: Entfernen Sie die abgestorbenen Zellen aus der Monolage durch sanftes Schütteln vor jedem Anspruch. - Abzusaugen Sie gebrauchte DPBS mit Pipette und 4 mL Stufe 1 b Medium (37 °C) pro Bohrloch. Legen Sie die Platte vorsichtig in den Inkubator (37 °C, feuchte Atmosphäre des 5 % CO2) und Kultur für 24 h.
- Aspirieren Sie das eingesetzte Medium und 2 mL DPBS in die Vertiefungen mit Pipette. Wiederholen Sie die Streben und Ergänzung des DPBS einmal.
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Induzieren Sie die Differenzierung in den primitiven Darm Rohr (Stufe 2).
- Aspirieren Sie das eingesetzte Medium und 2 mL DPBS zum Brunnen mit Pipette.
Hinweis: Entfernen Sie die abgestorbenen Zellen der Monolage durch sanftes Schütteln vor jedem Anspruch. - Abzusaugen Sie gebrauchte DPBS mit Pipette und 4 mL Stufe 2 Medium (37 °C) pro Bohrloch. Legen Sie die Platte in den Inkubator (37 °C, feuchte Atmosphäre des 5 % CO2) und Kultur für 4 Tage.
- Aspirieren Sie das eingesetzte Medium und 2 mL DPBS zum Brunnen mit Pipette.
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Induzieren die Differenzierung in PDX1+ Zellen (Stufe 3).
- Aspirieren Sie das eingesetzte Medium und 2 mL DPBS zum Brunnen mit Pipette. Wiederholen Sie die Streben und Ergänzung des DPBS einmal.
- Abzusaugen Sie gebrauchte DPBS mit Pipette und 4 mL Stufe 3 Medium (37 °C) pro Bohrloch. Legen Sie die Platte in den Inkubator (37 °C, feuchte Atmosphäre des 5 % CO2) und Kultur für 3 Tage.
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Die Differenzierung in endokrinen Zellen der Bauchspeicheldrüse zu induzieren.
- Führen Sie NKX6.1+ Zelle Induktion (Stufe 4, für 8 Tage) gefolgt von endokrinen Zellen Induktion (Stufe 5, 12 Tage) mit den zuvor beschriebenen Protokolle3,16,26. Charakterisieren und die endokrine Zelldifferenzierung Immunostaining und quantitative Real-Time reverse Transkription Polymerase Kettenreaktion (qRT-PCR) Analyse zu überprüfen.
Hinweis: Beziehen sich auf Toyoda Et Al.16 und Kimura Et Al.26 für detaillierte experimentelle Verfahren. Primer-Sequenzen für die qRT-PCR-Analyse finden Sie unter Tabelle 1 .
- Führen Sie NKX6.1+ Zelle Induktion (Stufe 4, für 8 Tage) gefolgt von endokrinen Zellen Induktion (Stufe 5, 12 Tage) mit den zuvor beschriebenen Protokolle3,16,26. Charakterisieren und die endokrine Zelldifferenzierung Immunostaining und quantitative Real-Time reverse Transkription Polymerase Kettenreaktion (qRT-PCR) Analyse zu überprüfen.
(3) Durchflusszytometrie (FCM)
- Aspirieren Sie das eingesetzte Medium und 2 mL 0,5 mM EDTA zum Brunnen mit Pipette. Wiederholen Sie die Aspiration und Zugabe von 0,5 mM EDTA ein Mal.
Hinweis: Schütteln Sie die Platte vorsichtig, um alle abgestorbenen Zellen aus der Monolage Zellen vor jedem Anspruch zu entfernen. - Trennen der Zellen (ca. 3-6 × 106 pro Bohrloch), fügen Sie 2 mL von 0,25 % Trypsin mit 0,5 mM EDTA pro Bohrloch. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C für ca. 5-10 min.
- Pipette vorsichtig, aber schnell zu distanzieren aufgehäuften Zellen in einzelne Zellen. Die Zellsuspension nicht beim Pipettieren Blase.
- Fügen Sie ca. 8-10 mL Basis Medium (RPMI 1640 oder iMEM, RT) mit 0,5 x serumfreien Ergänzung und 10 μM Y-27632 pro gut und mischen die Zellsuspension. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein Zentrifugenröhrchen.
- Zentrifugieren Sie das Rohr auf 300 X g bei RT 5 min.
- Den Überstand abgesaugt und Aufschwemmen der Zellen mit 2 mL 0,5 mM EDTA (RT). Pipette vorsichtig die Zellsuspension.
- Zentrifugieren Sie das Rohr auf 300 X g bei RT 5 min.
- Den Überstand abgesaugt und Aufschwemmen der Zellen mit 100 μL der Fixierung und Permeabilisierung Puffer pro 106 Zellen unter einer Haube. Pipette vorsichtig die Zellsuspension unter einer Haube. Halten Sie das Rohr bei RT für 30 min.
- Zentrifugieren Sie das Rohr auf 400 X g bei RT 5 min.
- Aspirieren des Überstands unter eine Haube und Aufschwemmen der Zellen mit 500 μL FCM blockiert Lösung pro 106 Zellen. Pipette vorsichtig die Zellsuspension. Halten Sie das Rohr bei RT für 30 min.
- 50 μL der Zellsuspension auf ein Rohr (ca. 1 x 105 Zellen) übertragen. Zentrifugieren Sie dem Rohr auf 400 X g bei RT 5 min entfernen den Überstand und Aufschwemmen der Zellen mit 100 μL der verdünnten Primärantikörper (siehe Tabelle der Materialien) in FCM blockiert Lösung und inkubieren Sie bei 4 °C für > 16 h.
- Zentrifugieren Sie das Rohr auf 400 X g bei RT für 5 min. Überstand zu entfernen und die Zellen mit 180 μL von 1 x Perm/Waschpuffer aufzuwirbeln.
- Zentrifugieren Sie dem Rohr auf 400 X g bei RT 5 min entfernen den Überstand und Aufschwemmen der Zellen mit 100 μL der verdünnten Sekundärantikörper (siehe Tabelle der Materialien) in FCM Lösung blockiert. Inkubation der Zellen bei RT 60 min oder bei 4 °C für > 16 h mit Lichtschutz.
- Zentrifugieren Sie das Rohr auf 400 X g bei RT für 5 min. Überstand zu entfernen und die Zellen mit 180 μL von 1 x Perm/Waschpuffer aufzuwirbeln.
- Zentrifugieren Sie dem Rohr auf 400 X g bei RT 5 min entfernen des Überstands und Aufschwemmen der Zellen mit 180 μL von 2 % Esel Serum in DPBS.
- Filtern Sie die Zellsuspension durch Übertragung auf eine 5 mL Runde Polystyrol Unterrohr mit einer Zelle Sieb (35 µm-Nylon-Mesh) und halten Sie bei 4 °C mit Schutz vor Licht bis die Analyse.
- Einen Teil der positiv gefärbten Zellen durch einen Flow Cytometer27zu analysieren.
4. Immunostaining
- Aspirieren Sie das eingesetzte Medium und 2 mL DPBS zum Brunnen mit Pipette. Wiederholen Sie die Streben und Ergänzung des DPBS einmal.
Hinweis: Schütteln Sie die Platte, um alle abgestorbenen Zellen aus der Monolage Zellen vor jedem Anspruch zu entfernen. - Fügen Sie 2 mL 4 % Paraformaldehyd (PFA) (4 °C) pro Bohrloch mit Pipette unter einer Haube. Halten Sie die Platte bei 4 °C für 20 Minuten.
- Der PFA mit Pipette unter eine Haube zu entfernen. Geben Sie 2 mL des DPBS bei RT in der Pipette unter einer Haube. Wiederholen Sie die Streben und Ergänzung des DPBS einmal.
- Fügen Sie 2 mL der blockierenden Lösung pro Bohrloch und lassen für 30 min bei RT.
- Aspirieren Sie die gebrauchte Lösung und 1 mL Primärantikörper (siehe Tabelle der Materialien) Lösung pro Bohrloch zu blockieren. Inkubation bei RT 60 min oder bei 4 °C für > 16 h.
- Aspirieren der verwendete Lösung, fügen Sie 2 mL des DPBS mit 0,4 % Triton x-100 und 10 min. wiederholen das Streben, Zugabe von Lösung und Inkubation einmal bei RT inkubieren.
- Aspirieren Sie die gebrauchte Lösung und 1 mL Sekundärantikörper (siehe Tabelle der Materialien) Lösung pro Bohrloch zu blockieren. 60 min mit Lichtschutz bei RT inkubieren.
- Aspirieren der verwendete Lösung, fügen Sie 2 mL des DPBS mit 0,4 % Triton x-100 (RT) und 5 min mit Lichtschutz bei RT inkubieren. Wiederholen Sie das Streben, Zugabe von Lösung und Inkubation zwei Mal.
- Nehmen Sie Mikrographen, die Differenzierung Effizienz unter einem Fluoreszenz-Mikroskop-28zu untersuchen.
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Representative Results
Verbreitende HiPSCs (585A129,30) verdichten sich und bilden eine homogene Monolayer (Abbildung 1 b), die zur Differenzierung geeignet ist. Undifferenzierte HiPSCs (Stufe 0) sind getrennt und neu ausgesät als Einzelzellen bei niedrigen Zelldichten (1-1,5 x 105 Zellen/cm2). Innerhalb von 1 h die Zellen sind an der Platte befestigt und zu Vorsprung zu zeigen beginnen. Am 1. Tag werden die Zellen stark vermehrt und gut verteilt, um 80-90 % der Fläche bedecken. Während Phase 1 b erscheinen die Medien trübe durch abgestorbene Zellen. Die Entfernung der abgestorbenen Zellen ist entscheidend für hocheffiziente Differenzierung, da abgestorbene Zellen wahrscheinlich das Überleben und die Differenzierung von Zellen, die darunter liegenden stören. An Tagen ca. 3-4 bilden Zellen ein homogenes Monolayer-Blatt, das als ein Kopfsteinpflaster Aussehen beschrieben werden kann. Zu diesem Zeitpunkt die meisten Zellen auszudrücken Geschlecht-Bestimmung von Region Y-Box 2 (SOX2), ein Marker für die undifferenzierte Zellen zu stoppen und stattdessen express einen definitive Entoderm Marker, SOX17, bei mehr als 90 % (Abb. 2A und B). Die meisten SOX17+ Zellen ausdrückliche FOXA2 (Abbildung 2A). Ausgehend von der Differenzierung eine unangemessene Zelle Dichte Kompromisse der Differenzierung Wirkungsgrad bei diesem Schritt (Abbildung 3). In den Stufen 2 und 3 Zelltod entspannt und das eingesetzte Medium ist nicht so trüb wie in Phase 1 b. Zellen zum Ausdruck bringen die primitiven Darm Rohr Marker, HNF1β und HNF4α (Abbildung 2) und schließlich express einen posteriore Foregut/Pankreas Stammvater Marker PDX1, bei mehr als 90 % (Abb. 2D und E). Die PDX1+ Zelle Induktion ist reproduzierbar in einer anderen HiPSC Linie, 1231A3 31und eine hESC-Line, KhES-3 32 (Abbildung 4). qRT-PCR-Ergebnisse der mRNA Expression Phase Markierungen waren konsistent mit Immunostaining (Abb. 5A). Die mRNA Expression von PDX1 zeigt sich auf Stufe 3 und Nachwort wesentlich erhöht.
PDX1+ Zellen in frühen Entwicklungsstadien haben das Potenzial, sich in nicht nur Pankreaszellen sondern auch Magen Antrum, Zwölffingerdarm, extrahepatische Gallenwege und ein Teil des Darms 9differenzieren. Die Differenzierung Potenzial von in vitro generierten PDX1+ Zellen, die Zellen der Bauchspeicheldrüse durch längere Kultur mit gemeldeten Protokolle für Bauchspeicheldrüsenkrebs Entoderm beurteilt werden können und pankreatischen endokrinen Zellen3,16, 26. die Ausdrücke des Pankreas Entoderm Marker, NKX6.1und zwei pankreatischen endokrinen Marker, INSULINund GLUCAGON, bzw. an den Tagen 19 (Stufe 4) und 31 (Stufe 5), beobachtet wurden (Abbildung 5).
Abbildung 1: repräsentatives Erscheinungsbild der Zellen unter schrittweise Differenzierung. (A) A Schema der gerichteten Differenzierung von hPSCs zum Pankreas Linien. Zahlen in Klammern geben Konzentrationen (Einheiten sind unten geschrieben). (B) repräsentative Hellfeld Mikrographen des HiPSCs wichtige Schritte der Differenzierung Kultur. 585A1 HiPSCs wurden getrennt als Einzelzellen und veranlasst, in endgültige Entoderm, primitive Darm Rohr und posterior Foregut/Pankreas Vorläuferzellen differenzieren. Die unteren Platten sind vergrößerte Ansichten der oberen Platten. RPMI, RPMI 1640; AA, Activin (ng/mL); CH, CHIR99021 (ΜM); KGF (ng/mL); NOG, Birne (ng/mL); CYC, 3-Keto-N-aminoethyl-N'-aminocaproyldihydrocinnamoyl Cyclopamine (μM); TTNPB, 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic Säure (nM). Skalieren von Balken = 300 μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: repräsentative Induktion gegenüber Pankreas Linien von HiPSCs. (A) der Anteil der SOX2–SOX17+ Zellen durch Durchflusszytometrie vor Differenzierung (Stufe 0) und am Tag 4 (Stufe 1 b) analysiert. Undifferenzierten HiPSCs (SOX2+SOX17–) wurden differenziert nach endgültiger Entoderm (SOX2–SOX17+). Die meisten SOX17+ Zellen Co ausgedrückt FOXA2. (B) repräsentative immunofluorescent Mikrographen an Tag 4 (Stufe 1 b). Die festen Zellen wurden für SOX17 (grün), SOX2 (rot) und Zellkerne (blau) gefärbt. (C) repräsentative immunofluorescent Mikrographen an den Tagen 4 (Stufe 1 b) und 8 (Stufe 2). Die festen Zellen waren für HNF1β (grün), HNF4α (rot) und Kerne (blau) gefärbt. (D) der Anteil der Zellen positiv für PDX1, wie an den Tagen 4 (Stufe 1 b) und 11 (Stufe 3) durch Durchflusszytometrie analysiert. (E) repräsentative immunofluorescent Mikrographen PDX1 (grün) und Zellkerne (blau) an Tag 11 (Stufe 3). Skalieren von Balken = 100 μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: repräsentative Induktion zur endgültigen Entoderm, initiiert von unterschiedlichen Zelldichten. (A) repräsentative Hellfeld Mikrographen Zellen 1 h nach Differenzierung. HiPSCs wurden getrennt als Einzelzellen und veranlasst, in endgültige Entoderm bei unterschiedlichen Zelldichten (1-50 x 104/cm2) zu differenzieren. Die unteren Platten sind vergrößerte Ansichten der oberen Platten. (B) der Anteil der SOX2–SOX17+ Zellen durch Durchflusszytometrie vor Differenzierung (Stufe 0) und am Tag 4 (Stufe 1 b) analysiert. (C) der Anteil der PDX1+ Zellen, die an den Tagen 8 (Stufe 2) und 11 (Stufe 3) von Durchflusszytometrie analysiert. Skalieren von Balken = 300 μm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Repräsentative Induktion in Richtung PDX1+ Zellen in HiPCSs und hes. Eine HiPSC Linie, 1231A3 (A), und eine hESC-Linie, KhES-3 (B), wurden differenziert zu endgültigen Entoderm und PDX1+ Zellen. Die Zusammensetzung der Zelle wurde Durchflusszytometrie analysiert. Der Anteil der SOX2–SOX17+ Zellen wurde analysiert, bevor Differenzierung (Stufe 0) und am Tag 4 (Stufe 1 b). Der Anteil der PDX1+ Zellen wurde an den Tagen 8 (Stufe 2) und 11 (Stufe 3) analysiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: repräsentative Induktion gegenüber Pankreas Entoderm und endokrinen Zellen. HiPSCs (585A1) wurden differenziert nach PDX1+ Zellen. Die Zellen wurden weiter differenziert in Pankreas Entoderm und endokrinen Zellen der Bauchspeicheldrüse mit gemeldeten Protokolle3,16,26. (A) mRNA Ausdruck der Bühne Markierungen wurden durch quantitative Real-Time Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) gemessen. Die Daten wurden auf GAPDH Ausdruck normiert und als Falte-Veränderungen in der Genexpression im Verhältnis zu den Spitzenwert vorgestellt. Beachten Sie, dass PDX1 Ausdruck erhöht wurde > 20-fold von Tag 8 (Stufe 2) bis 11 (Stufe 3) und bei > 100-fold von Tagen (Stufe 3) 11 bis 19 (Phase 4). Der Ausdruck in der Erwachsenen menschlichen Bauchspeicheldrüse wird als Bowle angezeigt. SOX2, schwarz; SOX17, lila; HNF1β, braun; HNF4α, orange; PDX1, hellgrün; NKX6.1, grün; INSULIN, blau; GLUCAGON, rot. (B) repräsentative immunofluorescent Mikrographen des Pankreas Entoderm Marker, NKX6.1 (rot), an den Tagen 11 (Stufe 3) und 19 (Phase 4). PDX1 (grün) und Zellkerne (blau) waren Co gebeizt. (C) repräsentative immunofluorescent Mikrographen zwei pankreatischen endokrinen Entscheidungsträger, Insulin (INS, grün) und Glukagon (GCG, rot), an den Tagen 19 (Stufe 4) und 31 (Stufe 5). Zellkerne (blau) wurden Co gebeizt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Gen Namen | Gen-symbol | Forward primer | Rückwärts-primer |
| Glyceraldehyde-3-phospha Te-dehydrogenase |
GAPDH | GAAGGTGAAGGTCGGAGTC | GAAGATGGTGATGGGATTTC |
| SRY-Box 2 | SOX2 | AGTCTCCAAGCGACGAAAAA | TTTCACGTTTGCAACTGTCC |
| SRY-Box 17 | SOX17 | CGCACGGAATTTGAACAGTA | TTAGCTCCTCCAGGAAGTGTG |
| HNF1 Homeobox B | HNF1Β | CCTCTCCTCCAAACAAGCTG | TGTTGCCATGGTGACTGATT |
| Hepatozyten nuklearer Faktor 4 alpha | HNF4Α | GAGCTGCAGATCGATGACAA | TACTGGCGGTCGTTGATGTA |
| Bauchspeicheldrüse und Zwölffingerdarm Homeobox 1 | PDX1 | AGCAGTGCAAGAGTCCCTGT | CACAGCCTCTACCTCGGAAC |
| NK6 Homeobox 1 | NKX6.1 | ATTCGTTGGGGATGACAGAG | TGGGATCCAGAGGCTTATTG |
| Glukagon | GCG | GAATTCATTGCTTGGCTGGT | CGGCCAAGTTCTTCAACAAT |
| Insulin | INS | CTACCTAGTGTGCGGGGAAC | GCTGGTAGAGGGAGCAGATG |
Tabelle 1: Primer für qPCR.
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Discussion
Die Generation der PDX1+ Zellen besteht aus mehreren Schritten; Daher ist es wichtig, Zellen zu gegebener Zeit zu behandeln. Unter den Schritten der Induktion Effizienz der endgültigen Entoderm wirkt sich weitgehend auf die endgültige Induktion Effizienz, möglicherweise durch Interferenzen von anderen kontaminierenden Abstammung-Zellen (d. h. Mesoderm und Ektoderm), die vermehren sich und/oder absondern können Faktoren, die die spezifische Differenzierung zu stören. Wenn der Anteil der SOX17+ Zellen ist weniger als 80 % am Tag 4 (Stufe 1 b), eine effiziente Induktion, PDX1+ Zellen wird voraussichtlich beeinträchtigt werden.
Undifferenzierte Zustände des hPSCs werden als Kolonien oder Aggregate von verdichteten Zellen beibehalten. Jedoch können Methoden, die die Differenzierung von Kolonien oder Aggregate beginnen Heterogenität, wegen verschiedenen Zelladhäsion und Dichte in der Kolonie, so leiden wie in Zentrum und Peripherie22, und weil Zellen in unterschiedlichen Phasen befinden der Zellzyklus-25. Auf der anderen Seite beginnt unsere Methode mit dissoziierten Einzelzellen, wodurch einen relativ homogenen Zustand der Zelladhäsion von Einzelzellen oder Zelldichte in jede einzelne Zelle. Im Hinblick auf die einheitliche Handhabung für jede Zelle, könnte unsere Methoden leichter als andere sein, die mit Kolonie oder Aggregation Kulturen beginnen.
Obwohl unser Protokoll verwendet werden kann, induzieren PDX1+ Zellen aus mehreren hPSC Linien, die Differenzierung könnte noch ineffizient sein. In solchen Fällen könnte Unterschiede im Adhäsion direkt nach der Aussaat unter den hPSC Linien könnte die Ursache sein, und Änderung der die Aussaatdichte eine Lösung-33. Abbildung 3 zeigt, dass unangemessene seeding Dichte Kompromisse Zelldifferenzierung in endgültige Entoderm und PDX1+ Zellen. Interessant ist, die optimale Zelldichte für PDX1+ Zelle Induktion war anders unter die Zell-Populationen, die erreicht > 90 % definitive Entoderm. Eine weitere Möglichkeit für ineffiziente Differenzierung ist die schlechter Pflegezustand der undifferenzierten hPSCs, die die Qualität der Pluripotenz trotz der Ausdruck der Marker für die undifferenzierten Zustand beeinträchtigt. In diesem Fall die hPSC Erweiterung Kultur sollte von frühe Passage eingefroren Bestände wieder aufgenommen werden oder Sub Klonen durchgeführt werden sollte, um hPSCs unter geeigneten Bedingungen zu erhalten. Im Falle von ineffizienten Differenzierung an Tagen 8 (Stufe 2) oder 11 (Stufe 3) sollte die Dauer dieser Schritte optimiert werden. Diese Idee zu unterstützen, die Dauer der Phase 3 ist entscheidend für den Erwerb der späteren Stadium Zelleigenschaften gezeigt worden und ist Zelle Zeile-abhängige Pankreas Linie34.
Die Generation der PDX1+ Zellen ist entscheidend für die in-vitro-Generation der Pankreaszellen. PDX1 ist funktional für pankreatische Entwicklung basierend auf Erkenntnissen aus Pdx1 null Mäuse, die Apancreatic35sind unerlässlich. Konsequent, Implantation von in vitro und in vivo Studien zeigten hPSC abgeleitet PDX1+ Zellen haben das Potenzial, alle Pankreas Komponenten, einschließlich exokrine entwickeln und endokrinen Zellen pankreatische β Zellen3,16 , 36 , 37. so die effiziente Erzeugung von PDX1+ Zellen aus hPSCs führt zu einer stabilen Pankreas Zelle-Versorgung für die Errichtung des β-Zell-Therapie gegen Diabetes und das Verständnis der menschlichen Bauchspeicheldrüse Entwicklung und Bauchspeicheldrüsen-Erkrankungen.
Die Grenzen dieser Methode beziehen sich auf das zweidimensionale (2D) Monolayer Kultur-Format eignet sich nicht für einige Zelltypen und Zelle Verarbeitung. In den letzten Jahren wurden dreidimensionale (3D) Kulturen gezeigt, die Generation von reifen Zellen und Geweben, möglicherweise durch Nachahmung der in-vivo Mikroumgebung zu fördern. Z. B. β-Zellen in 3D Kulturen erzeugt aber nicht 2D Monolayer-Kulturen könnte die Fähigkeit zu sezernieren Insulin als Reaktion auf extrazellulären Glukose Niveaus38erreichen.
Mit PDX1+ Zellen für die Erzeugung von entwicklungsgeschichtlich späteren Zelltypen, ist es wichtig, auf 3D Kulturen, wie z. B. Suspensionskulturen Aggregate, eingebettet in eine extrazelluläre Matrix zu verlagern und aggregierte Kulturen auf eine Luft-Flüssigkeit Schnittstelle3 , 16 , 37. Darüber hinaus 2D Monolayer-Kulturen erfordern mehr Fläche für die Kultivierung als Suspensionskulturen, Begrenzung der Skalierbarkeit. Die Verarbeitung von großen Mengen von Zellen für die kommerzielle Nutzung erfordert Änderungen wie z. B. die Verwendung von Microbeads. Zur gleichen Zeit eignet sich das vorliegende Verfahren für das Screening von Differenzierung auslösende Faktoren und die Erforschung der molekularen Mechanismen von Gentransfer.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde zum Teil unterstützt durch die Finanzierung der Japan Society für die Förderung von Science (JSPS) durch Scientific Research (C) (JSPS KAKENHI Grant Number15K09385 und 18 K 08510) t.t. und Beihilfe für JSPS Research Fellows (JSPS KAKENHI Grant-Nummer 17J07622), a.k., und die Japan-Agentur für medizinische Forschung und Entwicklung (AMED) durch seine Forschung gewähren "Core Center für iPS Zellforschung, Research Center-Netzwerk für die Realisierung der regenerativen Medizin" K.O. Die Autoren danken Dr. Peter Karagiannis für das Manuskript zu lesen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Keto-N-aminoethyl-N′-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine | Toronto Research Chemicals | K171000 | CYC |
| 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic acid | Santa Cruz Biotechnology | SC-203303 | TTNPB |
| 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
| Anti-CDX2 antibody [EPR2764Y] | Abcam | Ab76541 | Anti-CDX2, × 1/1000 dilution |
| B-27 Supplement (50 ×) | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | Serum-free supplement |
| BD FACSAria II Cell Sorter | BD Biosciences | For flow cytometry | |
| Biomedical freezer | SANYO | MDF-U538 | For -30 °C storing |
| Cell Counting Slides for TC10/TC20 Cell Counter, Dual-Chamber | BIO-RAD | 1450011 | Counting slide glass |
| CELL CULTURE MULTIWELL PLATE, 6 WELL, PS, CLEAR | Greiner bio-one | 657165 | For differentiation culture/6-well plate |
| Centrifuge | TOMY | AX-310 | For cell culturing |
| Centrifuge | TOMY | MX-305 | For RT-qPCR |
| CHIR99021 | Axon Medchem | Axon 1386 | |
| CLEAN BENCH | SHOWA KAGAKU | S-1601PRV | Clean bench |
| Corning CellBIND 6-well plate | Corning | 3335 | For feeder-free culture of hPSCs/6-well plate |
| Corning Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | Basement membrane matrix |
| Corning Synthemax II-SC Substrate | Corning | 3535 | For feeder-free culture of hPSCs/synthetic surface material for hPSCs |
| Cryostat | Leica | Leica CM1510 S | For immunostaining of aggregates. |
| Cytofix/Cytoperm Kit | Becton Dickinson | 554714 | Perm/Wash buffer is Permeabilization/Wash buffer. Cytofix/Cytoperm buffer is fixation and permeabilization buffer. |
| Dako pen | Dako | S2002 | For immunostaining of aggregates |
| dNTP mix (10 mM) | Thermo Fisher Scientific | 18427-088 | For RT-qPCR |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11055 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10036 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10040 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey Serum | Merck Millipore | S30 | Donkey serum |
| D-PBS(-) without Ca or Mg | Nacalai tesque | 14249-95 | DPBS |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | For feeder-free culture of hPSCs/hPSC maintenance medium |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | 5 mL round bottom polystyrene tube with cell strainer |
| Filter Tip, 1,000 µL | Watoson | 124-1000S | Use together with pipettes |
| Filter Tip, 20 µL | Watoson | 124-P20S | Use together with pipettes |
| Filter Tip, 200 µL | Watoson | 124-P200S | Use together with pipettes |
| Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X700 | For immunostaining |
| Forma Steri-Cycle CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 370A | Incubator |
| HNF-1β Antibody (C-20) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7411 | Anti-HNF1β, × 1/200 dilution |
| HNF-4α Antibody (H-171) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8987 | Anti-HNF4α, × 1/200 dilution |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | For nucleus staining, × 1/200 dilution |
| Human Pancreas Total RNA | Ambion | AM7954 | For RT-qPCR |
| Human PDX-1/IPF1 Antibody | R&D Systems | AF2419 | Anti-PDX1, goat IgG, × 1/200 dilution |
| Human SOX17 Antibody | R&D Systems | AF1924 | Anti-SOX17, × 1/200 dilution |
| Improved MEM Zinc Option medium | Thermo Fisher Scientific | 10373-017 | iMEM |
| Incubation chamber | Cosmo Bio | 10DO | For immunostaining of aggregates |
| Latex Examination Gloves | Adachi | ||
| MAS coated slide glass | Matsunami Glass | 83-1881 | For immunostaining of aggregates |
| MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | 4346907 | For RT-qPCR |
| Microscope | Olympus | CKX41N-31PHP | For cell culturing |
| Microtube | Watoson | 131-515CS | |
| Monoclonal Anti-α-Fetoprotein | SIGMA | A8452 | Anti-AFP, × 1/200 dilution |
| Nanodrop 8000 | Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Oligo dT | FASMAC | Custom made Oligo | For RT-qPCR of sequence is "TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT" |
| Paraformaldehyde, powder | Nacalai tesque | 26126-54 | PFA, fixative, diluted in DPBS |
| Pharmaceutical refrigerator | SANYO | MPR-514 | For 4 °C storing |
| PIPETMAN P | GILSON | Pipette | |
| Recombinant Human KGF/FGF-7 | R&D Systems | 251-KG | KGF |
| Recombinant Human Noggin | PeproTech | 120-10C | NOGGIN |
| Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A | R&D Systems | 338-AC | Activin A |
| ReverTra Ace (100 U/μL) | TOYOBO | TRT-101 | For RT-qPCR |
| RNase-free DNase Set (50) | QIAGEN | 79254 | For RT-qPCR |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | For RT-qPCR |
| RPMI 1640 with L-Gln | Nacalai tesque | 30264-85 | RPMI 1640 |
| Sealing Film for Real Time | Takara | NJ500 | For RT-qPCR |
| Serological pipettes 10 mL | Costar/Corning | 4488 | For cell culturing |
| Serological pipettes 25 mL | Costar/Corning | 4489 | For cell culturing |
| Serological pipettes 5 mL | Costar/Corning | 4487 | For cell culturing |
| Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAb | Cell signaling | 3579S | Anti-SOX2, × 1/200 dilution |
| StepOnePlus | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Sucrose | Nacalai tesque | 30406-25 | For immunostaining of aggregates |
| TB Green Premix Ex Taq II |
Takara | RR820B | For RT-qPCR |
| TC20 Automated Cell Counter | BIO-RAD | 1450101J1 | Automatic cell counter |
| Tissue-Tek OCT compound 4583 | Sakura Finetechnical | 4583 | For immunostaining of aggregates |
| Tissue-Tek Cryomold Molds/Adapters | Sakura Finetechnical | 4566 | For immunostaining of aggregates |
| Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| Trypan Blue | BIO-RAD | 1450021 | |
| Ultracold freezer | SANYO | MDF-U33V | For -80 °C storing |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | Dilute with DPBS to prepare 0.5 mM EDTA |
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Y-27632 | Wako | 251-00514 |
References
- D'Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 24 (11), 1392-1401 (2006).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
- Kondo, Y., Toyoda, T., Inagaki, N., Osafune, K. iPSC technology-based regenerative therapy for diabetes. Journal of Diabetes Investigation. 9 (2), 234-243 (2017).
- Millman, J. R., et al. Generation of stem cell-derived beta-cells from patients with type 1 diabetes. Nature Communications. 7, 11463 (2016).
- Zeng, H., et al. An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery. Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).
- Hosokawa, Y., et al. Insulin-producing cells derived from 'induced pluripotent stem cells' of patients with fulminant type 1 diabetes: Vulnerability to cytokine insults and increased expression of apoptosis-related genes. Journal of Diabetes Investigation. , (2017).
- Jennings, R. E., et al. Development of the human pancreas from foregut to endocrine commitment. Diabetes. 62 (10), 3514-3522 (2013).
- Jorgensen, M. C., et al. An illustrated review of early pancreas development in the mouse. Endocrine Reviews. 28 (6), 685-705 (2007).
- Jensen, J. Gene regulatory factors in pancreatic development. Developmental Dynamics. 229 (1), 176-200 (2004).
- Hald, J., et al. Generation and characterization of Ptf1a antiserum and localization of Ptf1a in relation to Nkx6.1 and Pdx1 during the earliest stages of mouse pancreas development. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (6), 587-595 (2008).
- Villasenor, A., Chong, D. C., Henkemeyer, M., Cleaver, O. Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis. Development. 137 (24), 4295-4305 (2010).
- Serup, P., et al. The homeodomain protein IPF-1/STF-1 is expressed in a subset of islet cells and promotes rat insulin 1 gene expression dependent on an intact E1 helix-loop-helix factor binding site. Biochemical Journal. 310 (Pt 3), 997-1003 (1995).
- Riedel, M. J., et al. Immunohistochemical characterisation of cells co-producing insulin and glucagon in the developing human pancreas. Diabetologia. 55 (2), 372-381 (2012).
- Mae, S. I., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 4, 1367 (2013).
- Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
- Toyoda, T., et al. Rho-Associated Kinases and Non-muscle Myosin IIs Inhibit the Differentiation of Human iPSCs to Pancreatic Endoderm. Stem Cell Reports. 9 (2), 419-428 (2017).
- Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D., Robey, P. G. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14 (1), 13-26 (2014).
- Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
- Nguyen, Q. H., et al. Single-cell RNA-seq of human induced pluripotent stem cells reveals cellular heterogeneity and cell state transitions between subpopulations. Genome Research. 28 (7), 1053-1066 (2018).
- Narsinh, K. H., et al. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 121 (3), 1217-1221 (2011).
- Rosowski, K. A., Mertz, A. F., Norcross, S., Dufresne, E. R., Horsley, V. Edges of human embryonic stem cell colonies display distinct mechanical properties and differentiation potential. Scientific Reports. 5, 14218 (2015).
- Torres-Padilla, M. E., Chambers, I. Transcription factor heterogeneity in pluripotent stem cells: a stochastic advantage. Development. 141 (11), 2173-2181 (2014).
- Cahan, P., Daley, G. Q. Origins and implications of pluripotent stem cell variability and heterogeneity. Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 14 (6), 357-368 (2013).
- Chetty, S., et al. A simple tool to improve pluripotent stem cell differentiation. Nature Methods. 10 (6), 553-556 (2013).
- Kimura, A., et al. Small molecule AT7867 proliferates PDX1-expressing pancreatic progenitor cells derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 24, 61-68 (2017).
- Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (91), e52010 (2014).
- Honvo-Houeto, E., Truchet, S. Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland. Journal of Visualized Experiments. (106), (2015).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Kajiwara, M., et al. Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 109 (31), 12538-12543 (2012).
- Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
- Suemori, H., et al. Efficient establishment of human embryonic stem cell lines and long-term maintenance with stable karyotype by enzymatic bulk passage. Biochemical and Biophysical Research Communication. 345 (3), 926-932 (2006).
- Gage, B. K., Webber, T. D., Kieffer, T. J. Initial cell seeding density influences pancreatic endocrine development during in vitro differentiation of human embryonic stem cells. PLoS One. 8 (12), e82076 (2013).
- Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
- Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice. Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).
- Kelly, O. G., et al. Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 29 (8), 750-756 (2011).
- Hohwieler, M., et al. Human pluripotent stem cell-derived acinar/ductal organoids generate human pancreas upon orthotopic transplantation and allow disease modelling. Gut. 66 (3), 473-486 (2017).
- Takeuchi, H., Nakatsuji, N., Suemori, H. Endodermal differentiation of human pluripotent stem cells to insulin-producing cells in 3D culture. Scientific Reports. 4, 4488 (2014).
