Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

יעיל הדור של הלבלב/תריסריון גנים Homeobox חלבון 1+ אבות הלבלב במעי הקדמי/אחורי של hPSCs בתרבויות אדהזיה

Published: March 27, 2019 doi: 10.3791/57641

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט להבחין בתאי גזע pluripotent אנושי (hPSCs) לתוך הלבלב/תריסריון גנים homeobox חלבון 1+ (PDX1+) תאים עבור הדור של שושלות הלבלב בהתבסס על הגידול חד שכבתי ללא-המושבה סוג של חלופה מועדפת תאים בודדים. שיטה זו מתאימה בהפקת הומוגנית נגזר hPSC תאים, מניפולציה גנטית וסינון.

Abstract

תא גזע pluripotent אנושי (hPSC)-נגזר בתאי הלבלב הם מקור תא מבטיח עבור רפואה רגנרטיבית ופלטפורמה ללמוד תהליכים פיתוחיים אנושי. Stepwise ביים בידול זה recapitulates תהליכים פיתוחיים היא אחת הדרכים הגדולות ביותר ליצירת תאי הלבלב כולל הלבלב/תריסריון גנים homeobox חלבון 1+ (PDX1+) ובתאים הלבלב. פרוטוקולים קונבנציונאלי ליזום את הבידול עם מושבות קטנות זמן קצר לאחר המעבר. עם זאת, במצב של מושבות או אגרגטים, התאים הם נוטים heterogeneities, אשר ייתכן ה"בלתי הבידול כדי PDX1+ תאים. כאן, אנו מציגים את פרוטוקול מפורט כדי להתמיין hPSCs PDX1+ תאים. הפרוטוקול כוללת ארבעה שלבים ויוזמת את הבידול על ידי תאים בודדים הפומבית זריעה. אינדוקציה של SOX17+ תאים האנדודרם סופית בעקבות הביטוי של סמנים צינור שני הבטן פרימיטיבית, HNF1β, HNF4α, בידול בסופו של דבר לתוך PDX1+ תאים. בפרוטוקול הנוכחי מספק טיפול קל, עשוי לשפר ולייצב את היעילות בידול של כמה שורות hPSC שנמצאו בעבר להבדיל באופן לא יעיל שושלות endodermal או PDX1+ תאים.

Introduction

הלבלב מורכבת בעיקר תאים האנדוקרינית אקסוקרינית, תפקוד לקוי או עומס יתר שלה גורם מספר מחלות, כמו לבלב, סוכרת וסרטן הלבלב. התירי את pathogeny של pancreatopathy, יש צורך לנתח את תהליך התפתחותי והתפקוד של תאים בלבלב. בנוסף, היצע תא יציב עם איכות נדרש להקים תא/רקמות תוספת של טיפול. תא גזע pluripotent אנושי (hPSC)-נגזר בתאי הלבלב הם מקור תא מבטיח למטרות אלו, פרוטוקול בידול כלפי בתאי הלבלב כבר למד באופן אינטנסיבי1,2,3, 4. התפתחויות אחרונות הדור במבחנה של תאי β בלבלב לחקות את הדור של תאי β אדם מבוגר, תאים אלה הצג יעילות טיפולית על ההשתלה לתוך מודל סוכרתית-עכברים-2,-3. בנוסף, ניתוח הנתונים של תאי β שנוצר בתאי גזע pluripotent מושרה (iPSCs) של בריאה, תורמים לחולה סוכרת סוג 1 גילה אין הבדלים תפקודיים כולל כאשר תחת מתח5. יתר על כן, המחלה פנוטיפים כבר חלקית שפירטתי ב המושרה בתאי הלבלב עם המטופל, נגזר iPSCs או hPSCs מחסה מוטציות גנטיות באותו אתר כמו המטופלים6,7.

לייצר תאי הלבלב hPSCs, משמש stepwise התמיינות מכוונת את recapitulates תהליכים התפתחותיים. הלבלב נגזרת לשכבת האנדודרם של העובר מוקדם, המבטאת סקס קביעת אזור Y-box 17 (SOX17) ו- forkhead תיבת A2 (FOXA2)8. על סמך המחקרים העכבר, השכבה endodermal טפסים ברכבת התחתית בטן פרימיטיבי, אשר מסומנת על ידי הביטוי של hepatocyte גרעיני גורם 1-בטא (Hnf1β) ו- 4 גרעיני גורם hepatocyte-alpha (Hnf4α). הצינור בטן פרימיטיביים מאריך ומפתחת לתוך מערכת הנשימה, מערכת העיכול, איברים. לאחר התארכות, האזור האחורי במעי הקדמי הופך האזור הלבלב הרב, שעורר, לפי המסומן על-ידי הביטוי של החלבון פקטור תעתיק הלבלב/תריסריון גנים homeobox 1 (PDX1)8,9,10. החלקים הגבי ו הגחון של PDX1+ בטן צינור לעבות את הטופס ניצנים הלבלב, אשר מסומנים על-ידי הביטוי שיתוף של הלבלב שעתוק מקדם 1 יחידה משנית אלפא (PTF1A), NK6 גנים homeobox (NKX6.1) 18,11. ביטוי זה מסמן את תחילת מורפולוגיים organogenesis הלבלב. תאי הלבלב האנדודרם, שהם מרכיבים של בלוטות הלבלב, יוצרים רשת צינורי מסועף של מבנים אפיתל12 , להבדיל בסופו של דבר לתוך תאים האנדוקרינית אקסוקרינית, לרבות תאי-β הורמון האינסולין, α מפריש גלוקגון-תאים. הביטוי של PDX1 הוא זוהה לראשונה אצל הרב, שעורר באזור הלבלב, אשר נצפית ואז במהלך פיתוח הלבלב כולו ומראה לוקליזציה β-אלפא-תאים ו9,13,14. למרות Pdx1+ אזור תא המבטאים לא Ptf1a או Nkx6.1 מבדילה את antrum קיבה, תריסריון, צינור המרה extrahepatic ואת מספר תאים מעיים באמצע לשלב מאוחר של התפתחות אצל עכברים9, PDX1+ תאים נחשבים המוצא לאגס התרבותי הלבלב בשלב התפתחותי מוקדם אצל בני אדם.

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול מפורט כדי להתמיין hPSCs PDX1+ תאים לדור של שושלות הלבלב. הבידול יוזם פרוטוקול על ידי זריעה הפומבית תאים בודדים15,16,17. באופן כללי, hPSCs מובחן מתוחזקים מושבות או אגרגטים תא השעיה או אדהזיה. כתוצאה מכך, ברוב הפרוטוקולים ליזום את הבידול זמן קצר לאחר passaging. עם זאת, במצב של מושבות או אגרגטים, התאים הם נוטים המרחבי, תעתיק heterogeneities18,19,20,21,22, אשר ייתכן ה"בלתי בידול צעד לקראת סופי האנדודרם ואחריו בידול לא יעיל כדי PDX1+ תאים. בפרוטוקול הנוכחי עשוי להציע טיפול קל כדי לשפר ולייצב את היעילות בידול של כמה שורות hPSC שנמצאו בעבר להבדיל באופן לא יעיל שושלות endodermal, PDX1+ תאים23, 24 , 25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ניסויים באמצעות hPSCs אושרו על ידי ועדת האתיקה של החוג לרפואה, בוגר ביה ס לרפואה, אוניברסיטת קיוטו.

1. הכנה של חומרים

הערה: להכין כל מדיה, ריאגנטים תרבית תאים בסביבה סטרילית. לחמם בסיס מדיה תרבות לטמפרטורת החדר (RT) לפני השימוש. בינוני עבור בידול משמש בתוך 6-אייץ '-RT. פרטים של ריאגנטים מפורטים בטבלה שלחומרים.

  1. בידול (איור 1 א')
    1. שלב 1A בינוני: העברת RPMI 1640 בינוני לתוך צינור באמצעות פיפטה של. להוסיף את תוסף ללא סרום activin A, CHIR99021, Y-27632 ריכוז של 1 x, 100 ננוגרם למ"ל, 3 μM ו- 10 μM, בהתאמה.
    2. בשלב 1B בינוני: העברת RPMI 1640 בינוני לתוך צינור באמצעות פיפטה של. להוסיף סרום ללא תוספת, activin A ו- CHIR99021 כדי ריכוז של 1 x, 100 ננוגרם למ"ל, ≤1 μM, בהתאמה.
      הערה: הריכוז של CHIR99021 צריך להיות נמוך מ שלב 1A בינוני, ו תוספת אינה נחוצה, אבל זה מגדיל את המספר הסלולרי.
    3. שלב 2 בינוני: MEM שיפור העברת (iMEM) בינוני לתוך צינור באמצעות פיפטה של. להוסיף סרום ללא תוספת של גורם גדילה תקין (KGF) ריכוז של 0.5 x ו- 50 ng/mL, בהתאמה.
    4. שלב 3 בינוני: העברת בינוני iMEM לתוך צינור באמצעות פיפטה של. להוסיף סרום ללא תוספת, KGF, בשכל, 3-Keto-N-aminoethyl-N'- aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine (CYC) וחומצה 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic (TTNPB) על ידי פיפטה כדי ריכוזים של 0.5 x 50 ng/mL, 100 ננוגרם למ"ל, 0.5 μM ו- 10 ננומטר, בהתאמה.
  2. Cytometry זרימה (FCM)
    1. 1 x Permeabilization/שטיפת מאגר: להעביר מים לתוך צינור על ידי פיפטה. להוסיף מאגר Permeabilization/שטיפת באמצעות פיפטה ריכוז 1 x.
    2. FCM חסימת פתרון: להעביר 1 x Permeabilization/שטיפת מאגר לתוך צינור על ידי פיפטה. להוסיף סרום חמור על-ידי פיפטה ריכוז של 2% (vol/כרך).
  3. Immunostaining
    1. חסימת פתרון: של העברת Dulbecco Phosphate-Buffered מלוחים (DPBS) לתוך צינור מאת פיפטה. להוסיף סרום חמור ו- X טריטון באמצעות פיפטה ריכוזים של 5% (vol/כרך) ו- 0.4% (vol/כרך), בהתאמה.

2. hPSC בידול אחורי במעי הקדמי תאים/הלבלב אבות (PDX1+ תאים)

הערה: לנהל את כל ההליכים באמצעות טכניקות סטרילי. hPSCs מתוחזקים על 6-ובכן צלחות מצופה ע י חומר משטח סינתטי עבור hPSCs hPSC תחזוקה בינונית על פי היצרן הוראות17,26. כאשר תאים להגיע 50-80% confluency (שלב 0) להשתמש בהם עבור בידול.

  1. להכין קרום המרתף צלחות מצופים מטריצה.
    1. העברת 6 מ של RPMI 1640 (4 °C) לתוך צינור מקורר עד 4 °C על קרח. להוסיף 2 מ ג של מטריקס קרום המרתף (4 °C) עם מקורר-1 מ לפיפטה טיפים ולערבב היטב על ידי pipetting עדין כדי להפוך מטריצה קרום המרתף 0.33 מ"ג/מ"ל.
    2. להעביר 2 מ"ל של מטריקס קרום המרתף מדולל כל טוב של צלחות התרבות תאים 6-ובכן מאת פיפטה. מקם את הצלחות ב 37 ºC למשך 60-90 דקות בתוך אינקובטור. לאחר מכן, שמור את הצלחות ב RT עד לשימוש (במרחק של-3 שעות).
  2. זרע את hPSCs וליזום בידול מוחלט האנדודרם (שלב 1A).
    1. האחות המדיום בשימוש ולהוסיף 2 מ"ל של חומצה ethylenediaminetetraacetic 0.5 מ מ (EDTA) (RT) לכל טוב באמצעות פיפטה לשטוף את hPSCs תרבותי לוחית 6-. טוב.
    2. האחות 0.5 מ מ EDTA ולהוסיף 2 מ ל 0.5 מ מ EDTA לכל טוב מאת פיפטה. דגירה הצלחות ב- 37 ºC למשך 5 דקות.
    3. האחות 0.5 מ מ EDTA ולהוסיף 1 מ"ל hPSC תחזוקה בינוני ב RT בתוספת 10 μM Y-27632 לכל היטב על ידי פיפטה. פיפטה בעדינות אך במהירות כדי לפוצץ תאים על הלוחות ו מביצועם גושית תאים לתוך תאים בודדים. לא בועה התליה תא במהלך pipetting.
    4. העברת התליה תא בשפופרת צנטרפוגה 50 מ ל, המכיל 4 מיליליטר hPSC תחזוקה בינוני ב RT בתוספת 10 μM Y-27632. בעדינות pipette התליה תא.
    5. לספור את התא ההשעיה התא באמצעות ההליך אי-הכללה של הכתם Trypan Blue.
      1. ΜL מיקס 15 של הבולם תא, μL 15 של Trypan Blue בשפופרת.
      2. העברת μL 10 של ההשעיה תאים למהול Trypan Blue אל תא ספירת בשקופיות שכפל באמצעות פיפטה 10 μL.
      3. לספור את התא עם מונה הניתן תא אוטומטית מספר ולחשב את צפיפות התאים ההשעיה התא. הכדאיות בדרך כלל > 98%.
    6. Aliquot התליה תא בשפופרת צנטרפוגה 50 מ ב- 1-1.5 x 106 תאים לכל טוב של 6-ובכן צלחות (1-1.5 x5 10 תאים/cm2).
    7. Centrifuge הצינור 50 מ ל- 200 x g ב- RT במשך 5 דקות.
    8. וארוקן את תגובת שיקוע באמצעות פיפטה של, resuspend את התאים עם 1 מ"ל של שלב 1A בינוני (RT) לכל טוב. בעדינות pipette התליה תא ולהוסיף עוד 1 מ"ל של שלב 1A בינוני (סה כ, 2 מ לכל טוב).
    9. האחות המטריקס קרום המרתף מדולל ב הבארות של הלוחות התרבות תאים בשלב 2.1.2 שהכין על פיפטה μL 1,000. המשך לשלב הבא מיד.
    10. בעדינות pipette התליה תא בשלב 2.2.8 שוב. מיד לאחר ערבוב, להעביר התליה תא (2 מ"ל) לתוך כל טוב של צלחת 6-. טוב. מכסים את הצלחת עם רדיד אלומיניום כדי להגן על הבסיס מפני אור. מקם את הצלחת על הספסל נקי ב RT למשך 10-15 דקות.
      הערה: אל תזיז את הצלחת לאחר זריעה.
    11. הנח בעדינות את הצלחת 37 °C, 5% CO2 מיכלים (האווירה humidified) ואת תרבות במשך 24 שעות ביממה.
      הערה: אל תלחץ את הצלחת לאחר זריעה.
  3. זירוז הבידול לתוך סופית האנדודרם (בשלב 1B).
    1. האחות המדיום בשימוש ולהוסיף 2 מ של DPBS הבארות באמצעות פיפטה. חזור על השאיפה של תוספת של DPBS פעם אחת.
      הערה: להסרת תאים מתים טפט, לנער בעדינות את הצלחת לפני כל שאיפה.
    2. מחוק לגמרי את DPBS בשימוש על ידי פיפטה ולהוסיף 4 מיליליטר בשלב 1B בינוני (37 °C) לכל טוב. הנח בעדינות את הצלחת לתוך החממה 37 °C (humidified אווירה של 5% CO2) ואת תרבות במשך 48 שעות.
    3. האחות המדיום בשימוש ולהוסיף 2 מ של DPBS הבאר מאת פיפטה. חזור על השאיפה של תוספת של DPBS פעם אחת.
      הערה: להסיר את התאים המתים טפט ע י ניעור עדין לפני כל שאיפה.
    4. מחוק לגמרי את DPBS בשימוש על ידי פיפטה ולהוסיף 4 מיליליטר בשלב 1B בינוני (37 °C) לכל טוב. הנח בעדינות את הצלחת לתוך החממה (37 °C, האווירה humidified של 5% CO2) ואת תרבות במשך 24 שעות ביממה.
  4. זירוז הבידול לתוך הצינור בטן פרימיטיבי (שלב 2).
    1. האחות המדיום בשימוש ולהוסיף 2 מ של DPBS הבאר מאת פיפטה.
      הערה: להסיר את התאים המתים טפט ע י ניעור עדין לפני כל שאיפה.
    2. מחוק לגמרי את DPBS בשימוש על ידי פיפטה ולהוסיף 4 מ של שלב 2 בינוני (37 °C) לכל טוב. מקם את הצלחת לתוך החממה (37 °C, האווירה humidified של 5% CO2) ואת תרבות במשך 4 ימים.
  5. זירוז הבידול לתוך PDX1+ תאים (שלב 3).
    1. האחות המדיום בשימוש ולהוסיף 2 מ של DPBS הבאר מאת פיפטה. חזור על השאיפה של תוספת של DPBS פעם אחת.
    2. מחוק לגמרי את DPBS בשימוש על ידי פיפטה ולהוסיף 4 מיליליטר בשלב 3 בינוני (37 °C) לכל טוב. מקם את הצלחת לתוך החממה (37 °C, האווירה humidified של 5% CO2) ואת תרבות במשך 3 ימים.
  6. זירוז הבידול לתאים האנדוקרינית הלבלב.
    1. מבצע NKX6.1+ התא אינדוקציה (שלב 4, 8 ימים) ואחריו האנדוקרינית התא אינדוקציה (שלב 5, 12 ימים) עם פרוטוקולים שתואר לעיל3,16,26. לאפיין ולאמת את הבידול האנדוקרינית תא על-ידי immunostaining וניתוח תגובת שרשרת (לרביעיית-PCR) פולימראז כמותיים שעתוק במהופך בזמן אמת.
      הערה: עיין Toyoda ואח16 ו- et al. קימורה26 לפרוצדורות מפורטות ניסיוני. עיין טבלה 1 לקבלת רצפי פריימר המשמש לניתוח לרביעיית-PCR.

3. לזרום Cytometry (FCM)

  1. האחות המדיום בשימוש ולהוסיף 2 מ ל 0.5 מ מ EDTA הבאר מאת פיפטה. חזור על השאיפה של תוספת של 0.5 מ מ EDTA פעם אחת.
    הערה: לנער את הצלחת בעדינות כדי להסיר תאים מתים התאים חד שכבתי לפני כל שאיפה.
  2. כדי לבטל את התאים (כ 3-6 × 106 תאים לכל טוב), להוסיף 2 מ של 0.25% טריפסין המכילה 0.5 מ מ EDTA לכל טוב. דגירה הלוחות על 37 ºC למשך 5-10 דקות.
  3. פיפטה בעדינות אבל במהירות כדי מביצועם גושית תאים לתוך תאים בודדים. לא בועה התליה תא במהלך pipetting.
  4. הוסף 8-10 מ"ל של בסיס בינוני (RPMI 1640 או iMEM, RT) המכילה 0.5 x תוספת ללא סרום 10 μM Y-27632 לכל טוב ומערבבים התליה תא. העברת התליה תא לתוך שפופרת צנטרפוגה.
  5. Centrifuge את הצינור ב 300 x g ב- RT במשך 5 דקות.
  6. וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend את התאים עם 2 מ ל 0.5 מ מ EDTA (RT). בעדינות pipette התליה תא.
  7. Centrifuge את הצינור ב 300 x g ב- RT במשך 5 דקות.
  8. וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend את התאים עם 100 μL מאגר קיבעון, permeabilization לכל 106 תאים ברדס. בעדינות pipette התליה תא ברדס. שמור את הצינור ב RT למשך 30 דקות.
  9. Centrifuge את הצינור ב 400 x g ב- RT במשך 5 דקות.
  10. וארוקן את תגובת שיקוע ברדס, resuspend את התאים עם 500 μL FCM חסימת פתרון לכל 106 תאים. בעדינות pipette התליה תא. שמור את הצינור ב RT למשך 30 דקות.
  11. העברת μL 50 של התליה תא צינור (כ5 עונה 1 פרק 10 תאים). Centrifuge הצינור ב 400 x g ב- RT עבור 5 דק. הסר את תגובת שיקוע, resuspend את התאים עם 100 μL של נוגדן ראשוני מדולל (ראה טבלה של חומרים) ב- FCM חסימת פתרון, דגירה על 4 °C עבור > 16 h.
  12. Centrifuge את הצינור x 400 g ב- RT 5 דק. להסיר את תגובת שיקוע, resuspend את התאים עם 180 μL 1 x פרם/שטיפת מאגר.
  13. Centrifuge הצינור ב 400 x g ב- RT עבור 5 דק. הסר את תגובת שיקוע, resuspend את התאים עם 100 μL של נוגדנים משניים מדולל (ראה טבלה של חומרים) ב- FCM חסימת פתרון. דגירה התאים ב RT עבור 60 דקות או ב 4 °C עבור > 16 קמ"ש עם הגנה מפני אור.
  14. Centrifuge את הצינור x 400 g ב- RT 5 דק. להסיר את תגובת שיקוע, resuspend את התאים עם 180 μL 1 x פרם/שטיפת מאגר.
  15. Centrifuge הצינור ב- 400 x g ב- RT עבור 5 דק. הסר את תגובת שיקוע, resuspend את התאים עם 180 μL של 2% נסיוב חמור ב- DPBS.
  16. לסנן את המתלים התא על ידי העברת-מ ל סביב צינור פוליסטירן התחתון עם תא מסננת (רשת ניילון מיקרומטר 35), לשמור על 4 °C עם הגנה של אור עד הניתוח.
  17. לנתח שיעור של תאים באופן חיובי מוכתם על ידי cytometer זרימה27.

4. Immunostaining

  1. האחות המדיום בשימוש ולהוסיף 2 מ של DPBS הבאר מאת פיפטה. חזור על השאיפה של תוספת של DPBS פעם אחת.
    הערה: לנער בעדינות את הצלחת להסרת תאים מתים התאים חד שכבתי לפני כל שאיפה.
  2. להוסיף 2 מ של 4% paraformaldehyde (PFA) (4 °C) לכל טוב פיפטה ברדס. לשמור על הלוח 4 °C למשך 20 דקות.
  3. להסיר את כדורגלן בעזרת פיפטה ברדס. להוסיף 2 מ של DPBS ב RT לבאר באמצעות פיפטה ברדס. חזור על השאיפה של תוספת של DPBS פעם אחת.
  4. להוסיף 2 מ"ל של חסימה פתרון לכל טוב ולהשאיר את הצלחת ב RT למשך 30 דקות.
  5. האחות הפתרון בשימוש ולהוסיף 1 מ"ל של נוגדן ראשוני (ראה טבלה של חומרים) בחסימה פתרון לכל טוב. דגירה ב RT עבור 60 דקות או ב 4 °C עבור > 16 h.
  6. האחות הפתרון בשימוש, להוסיף 2 מ של DPBS המכילה 0.4% טריטון X-100 דגירה -RT במשך 10 דקות חוזר השאיפה, תוספת של פתרון הדגירה פעם אחת.
  7. האחות הפתרון בשימוש ולהוסיף 1 מ"ל של נוגדנים משניים (ראה טבלה של חומרים) בחסימה פתרון לכל טוב. תקופת דגירה-RT של 60 דקות עם הגנה מפני אור.
  8. האחות הפתרון בשימוש, להוסיף 2 מ של DPBS המכילה 0.4% טריטון X-100 (RT) דגירה -RT במשך חמש דקות עם הגנה מפני אור. חזור על השאיפה, תוספת של פתרון הדגירה פעמיים.
  9. קח micrographs לבחון את יעילות בידול תחת מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

HiPSCs כציוד (29,585A130) הם מרוכז ויוצרים טפט הומוגנית (איור 1B) מתאים בידול. HiPSCs מובחן (שלב 0) חלופה מועדפת, נזרע מחדש כתאי יחיד-צפיפות התאים נמוך (1-1.5 x5 10 תאים/cm2). בתוך 1 h, התאים מחוברים לצלחת ומתחילים להראות בליטה. יום 1, התאים הם התרבו, מחולק טוב כדי לכסות 80-90% על פני השטח. במהלך שלב 1B, התקשורת מופיעים מעונן בשל תאים מתים. הסרת תאים מתים הוא קריטי עבור בידול יעילים ביותר מאז תאים מתים עלול להפריע את הישרדות, התמיינות של תאים שוכב מתחת. בימים 3-4 תאים בצורת גיליון הומוגנית חד שכבתי יכול להיות מתואר מראה המרוצף. בשלב זה, רוב התאים עוצרים להביע סקס קביעת אזור Y-תיבת 2 (SOX2), סמן תאים מובחן, במקום להביע סמן האנדודרם סופית, SOX17, על יותר מ 90 אחוז(איור 2A ו- B). רוב SOX17+ תאים FOXA2 אקספרס (איור 2 א). מתחילים את הבידול עם פשרות צפיפות תאים לא הולם היעילות בידול בשלב זה (איור 3). על שלבים 2 ו- 3, מוות של תאים מרגיע, המדיום בשימוש עכור לא כמו בארץ בשלב 1B. התאים לבטא את סמני צינור בטן פרימיטיביים HNF1β ו- HNF4α (איור 2C) ולבטא בסופו של דבר במעי הקדמי האחורי/הלבלב קדמון סמן, PDX1, על יותר מ 90 אחוז(איור 2D ו- E). PDX1+ התא אינדוקציה היא לשחזור ב קו hiPSC אחר, 1231A3 31וקו hESC, KhES-3 32 (איור 4). לרביעיית-PCR תוצאות הביטוי mRNA של סמני הבמה עלו בקנה אחד עם immunostaining (איור 5A). הביטוי mRNA של PDX1 באה לידי ביטוי בשלב 3 ומגבירה באופן משמעותי אחרית דבר.

PDX1+ תאים בשלבים התפתחותיים מוקדם יש את היכולת להבדיל לתוך התאים לא רק הלבלב אך גם antrum קיבה, תריסריון, צינור המרה extrahepatic ו חלק של המעי 9. הפוטנציאל בידול של הפריה שנוצר PDX1+ תאים בתאי הלבלב יכול להיות מוערך על ידי תרבות מורחב עם פרוטוקולים המדווחת עבור האנדודרם הלבלב ואת האנדוקרינית הלבלב תאים3,16, 26. הביטויים של סמן האנדודרם הלבלב, NKX6.1שני סמנים האנדוקרינית הלבלב, אינסולין, גלוקגון, נצפו בימים 19 (שלב 4) ו- 31 (שלב 5), בהתאמה (איור 5).

Figure 1
איור 1: המראה הייצוגי של התאים תחת בידול stepwise. (א) A ערכה של בידול בבימויו של hPSCs שושלות הלבלב. המספרים בסוגריים מציינים ריכוזים (יחידות נכתבות להלן). (B) micrographs שדה בהיר נציג של hiPSCs-השלבים החשובים של תרבות בידול. 585A1 hiPSCs היו הפומבית בתור תאים בודדים, המושרה להבדיל האנדודרם סופית, הבטן פרימיטיביים שפופרת ואת קדמון במעי הקדמי האחורי/הלבלב. הלוחות התחתונה הן תצוגות מוגדלת של הלוחות העליונים. RPMI, RPMI 1640; AA, activin (ng/mL); CH, CHIR99021 (ΜM); KGF (ng/mL); ליקר, הראש (ng/mL); CYC, 3-Keto-N-aminoethyl-N'-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine (μM); TTNPB, חומצה 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic (ננומטר). גודל ברים = 300 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: אינדוקציה ייצוגית כלפי שושלות הלבלב מ- hiPSCs. (א) שיעור SOX2SOX17+ תאים נותחו על ידי cytometry זרימה לפני בידול (שלב 0), וביום 4 (בשלב 1B). מובחן hiPSCs (SOX2+SOX17) היו הבדיל לתוך האנדודרם סופית (SOX2SOX17+). רוב SOX17+ תאים FOXA2 ביטוי במשותף. (B) micrographs immunofluorescent הנציגה ביום 4 (בשלב 1B). התאים קבוע היו מוכתמים SOX17 (ירוק), SOX2 (אדום), גרעינים (כחול). (ג) micrographs immunofluorescent ייצוגית בימים 4 (בשלב 1B) ו- 8 (שלב 2). התאים קבוע היו מוכתמים HNF1β (ירוק), HNF4α (אדום), גרעינים (כחול). (ד) הפרופורציה של תאים חיוביים עבור PDX1, כפי נותחו על ידי cytometry זרימה בימים 4 (בשלב 1B) ו-11 (שלב 3). (E) נציג micrographs immunofluorescent של PDX1 (ירוק), גרעינים (כחול) ביום 11 (שלב 3). גודל ברים = 100 μm.  אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: אינדוקציה נציג לקראת סופי האנדודרם יזומות של צפיפויות שונות תא. (א) micrographs שדה בהיר נציג של תאים h 1 לאחר בידול. hiPSCs הפומבית בתור תאים בודדים, המושרה להבדיל לתוך האנדודרם סופית ב צפיפויות תאים שונים (1-50 x 104/cm2). הלוחות התחתונה הן תצוגות מוגדלת של הלוחות העליונים. (B) חלקם של SOX2SOX17+ תאים נותחו על ידי cytometry זרימה לפני בידול (שלב 0), וביום 4 (בשלב 1B). (ג) חלקם של PDX1+ תאים נותחו על ידי cytometry זרימה בימים 8 (שלב 2) ו-11 (שלב 3). גודל ברים = 300 μm.  אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: אינדוקציה ייצוגית כלפי PDX1+ תאים hiPCSs, hESCs. קו hiPSC, 1231A3 (א), ואת קו hESC, KhES-3 (B), היו הבדיל האנדודרם סופית, PDX1+ תאים. ההרכב תא נותחה על ידי cytometry זרימה. חלקם של SOX2SOX17+ תאים נותחה לפני בידול (שלב 0), וביום 4 (בשלב 1B). חלקם של PDX1+ תאים נותחו על ימים 8 (שלב 2) ו-11 (שלב 3).  אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: אינדוקציה נציג וכלפי האנדודרם הלבלב תאים אנדוקריני. hiPSCs (585A1) היו הבדיל לתוך PDX1+ תאים. התאים היו הבדיל עוד יותר לתוך הלבלב האנדודרם והתאים האנדוקרינית הלבלב עם פרוטוקולים שדווחה3,16,26. MRNA (A) ביטויים של הבמה סמני נמדדו על ידי כמותיים בזמן אמת תגובת שרשרת פולימראזית (PCR לרביעיית). הנתונים היו מנורמל לביטוי GAPDH והציג כמו הקיפול-שינוי גנים ביחס לערך שיא. שימו לב כי הביטוי PDX1 הוגדל ב > 20-fold ימים 8 (שלב 2) 11 (שלב 3), > 100-fold ימים 11 (שלב 3) 19 (שלב 4). הביטוי בלבלב האנושי למבוגרים מוצג Panc. SOX2, שחור; SOX17, סגול; HNF1β, חום; HNF4α, כתום; PDX1, ירוק בהיר; NKX6.1, ירוק; אינסולין, כחול; גלוקגון, אדום. (B) micrographs immunofluorescent ייצוגית של סמן האנדודרם הלבלב, NKX6.1 (אדום), בימים 11 (שלב 3) ו- 19 (שלב 4). PDX1 (ירוק), גרעינים (כחול) היו שיתוף מוכתם. (ג) micrographs immunofluorescent ייצוגית של שני עושי האנדוקרינית הלבלב, אינסולין (INS, ירוק), גלוקגון (GCG, אדום), בימים 19 (שלב 4) ו- 31 (שלב 5). גרעינים (כחול) היו שיתוף מוכתם.  אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

שם הגן סמל הגן פריימר לפנים פריימר הפוכה
גליצראלדהיד-3-phospha
טה דהידרוגנאז
GAPDH GAAGGTGAAGGTCGGAGTC GAAGATGGTGATGGGATTTC
זו מדיניות-תיבת 2 SOX2 AGTCTCCAAGCGACGAAAAA TTTCACGTTTGCAACTGTCC
זו מדיניות-box 17 SOX17 CGCACGGAATTTGAACAGTA TTAGCTCCTCCAGGAAGTGTG
HNF1 גנים homeobox B HNF1Β CCTCTCCTCCAAACAAGCTG TGTTGCCATGGTGACTGATT
hepatocyte גרעיני גורם 4 אלפא HNF4Α GAGCTGCAGATCGATGACAA TACTGGCGGTCGTTGATGTA
הלבלב, תריסריון גנים homeobox 1 PDX1 AGCAGTGCAAGAGTCCCTGT CACAGCCTCTACCTCGGAAC
NK6 גנים homeobox 1 NKX6.1 ATTCGTTGGGGATGACAGAG TGGGATCCAGAGGCTTATTG
גלוקגון GCG GAATTCATTGCTTGGCTGGT CGGCCAAGTTCTTCAACAAT
אינסולין תוספות CTACCTAGTGTGCGGGGAAC GCTGGTAGAGGGAGCAGATG

טבלה 1: צבעי יסוד qPCR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הדור של PDX1+ תאים מורכבת מרובי שלבים; לכן, חיוני לטיפול תאי בזמן המתאים. בין הצעדים, יעילות אינדוקציה האנדודרם סופי משפיע במידה רבה את היעילות אינדוקציה הסופי, יכול להיות הפרעה מזהמים שושלת היוחסין תאים אחרים (קרי, והמזודרם ו האאקטודרם), אשר עשוי להתרבות ו/או מפרישים על ידי גורמים לשבש התמיינות ספציפיים. אם היחס של SOX17+ תאים הוא נמוך מ- 80% ביום 4 (בשלב 1B), אינדוקציה יעיל כדי PDX1+ תאים הוא עלול להיות בסכנה.

הברית מובחן של hPSCs מתוחזקים מושבות או אגרגטים של תאים הדחוס. עם זאת, שיטות הפעלת את הבידול מושבות או אגרגטים סובלים הטרוגניות, בגלל הידבקות תאים שונות וצפיפות במושבה, כזה כמו בהמרכז והפריפריה22, ומכיוון תאים נמצאים בשלבים שונים של מחזור התא25. מצד שני, השיטה שלנו מתחיל עם חלופה מועדפת תאים בודדים, אשר מאפשר מדינה הומוגנית יחסית של הידבקות תאים של תאים בודדים או צפיפות התאים בכל תא ותא. מבחינת טיפול הומוגני עבור כל תא, השיטות שלנו אולי יהיה קל יותר מאשר לאחרים להתחיל עם המושבה או צבירת תרבויות.

למרות פרוטוקול שלנו יכול לשמש כדי לגרום PDX1+ תאים מתוך שורות מרובות hPSC, הבידול עדיין יכול להיות לא יעיל. במקרים כאלה, הבדלים במצב אדהזיה מיד לאחר זריעה בין הקווים hPSC יכול להיות הגורם ולאחר השינוי של צפיפות זריעה יכול להיות פתרון33. אכן, איור 3 מראה כי לא הולם זריעה תא צפיפות פשרות בידול האנדודרם סופית, PDX1+ תאים. מעניין, הצפיפות תא אופטימלית עבור PDX1+ התא אינדוקציה היה שונה בין האוכלוסיות תא להשיג > האנדודרם סופית 90%. אפשרות נוספת עבור בידול לא יעיל היא מצב תחזוקה לקויה hPSCs מובחן, אשר פוגעת האיכות של pluripotency למרות הביטוי של סמנים עבור המדינה מובחן. במקרה זה, צריך להיות החל מחדש את התרבות הרחבה hPSC מן המעבר מוקדם קפוא מניות או תת שיבוט יש לבצע כדי להשיג hPSCs בתנאים מתאימים. במקרה של בידול לא יעיל בימים 8 (שלב 2) או 11 (שלב 3), משך הזמן של שלבים אלה צריכים להיות מוטבת. רעיון זה, משך הזמן של שלב 3 הוכח קריטי עבור רכישת מאפייני תא בשלב מאוחר יותר ותמיכה תא תלויי-קו ב השושלת הלבלב34.

הדור של PDX1+ תאים הוא קריטי עבור הדור במבחנה של תאים בלבלב. PDX1 חיוני מבחינה פונקציונלית לפיתוח הלבלב המבוססים על ידע של עכברים null Pdx1, אשר apancreatic35. באופן עקבי, השרשה במבחנה, ויוו מחקרים הראו PDX1 נגזר hPSC+ תאים יש פוטנציאל להתפתח כל הרכיבים הלבלב, כולל אקסוקרינית, אנדוקרינית תאים כגון תאי β בלבלב3,16 , 36 , 37. לפיכך, הדור יעיל של PDX1+ תאים מהפניות hPSCs אספקה יציבה תאי הלבלב על הקמתה של טיפול בתאי β נגד סוכרת וההבנה של פיתוח לבלב אנושי ומחלות הלבלב.

המגבלות של שיטה זו קשורים לתבנית תרבות דו מימדי חד שכבתי (2D), אשר אינו מתאים כמה סוגי תאים ועיבוד התא. בשנים האחרונות, תרבויות תלת מימדי (3D) הוכחו לקדם את הדור של בוגר תאים ורקמות, כנראה עקב מחקה את microenvironment ויוו. לדוגמה, תאי β שנוצרו בתרבויות 3D אבל תרבויות טפט 2D לא יוכל להשיג את היכולת להפריש אינסולין בתגובה רמות גלוקוז חוץ-תאית38.

כדי להשתמש PDX1+ תאים לדור של סוגי תאים מבחינת מאוחר יותר, חשוב להעביר תרבויות תלת-ממד, כגון תרבויות השעיה של אגרגטים מוטבע בתוך מטריצה חוץ-תאית ואת תרבויות צבירה על נוזלי אוויר הממשק3 , 16 , 37. בנוסף, טפט 2D תרבויות דורשים שטח נוסף עבור culturing מאשר תרבויות ההשעיה, הגבלת מדרגיות. העיבוד של כמויות גדולות של תאים לשימוש מסחרי דורש שינויים כגון השימוש של גרגרי. במקביל, השיטה הנוכחית הינו מתאים ההקרנה של גורמים בתדר בידול, חקר המנגנונים המולקולריים על ידי העברה גנטית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמך בחלקה על ידי מימון מן האגודה יפן עבור הקידום של המדע (JSPS) דרך Scientific Research (C) (JSPS KAKENHI גרנט Number15K09385 ו- 18 K 08510) טי, מענק הסיוע עבור עמיתי מחקר JSPS (מספר גרנט KAKENHI של JSPS 17J07622) משום מקום, ועבור הסוכנות יפן למחקר רפואי, פיתוח (AMED) באמצעות המחקר שלה להעניק "מרכז הליבה עבור שב"ס תא מחקר, מרכז מחקר ברשת המימוש של רפואה רגנרטיבית"בנוקאאוט המחברים תודה ד ר פיטר Karagiannis לקרוא את כתב היד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Keto-N-aminoethyl-N′-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine Toronto Research Chemicals K171000 CYC
4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic acid Santa Cruz Biotechnology SC-203303 TTNPB
50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes Thermo Fisher Scientific 339652
Anti-CDX2 antibody [EPR2764Y] Abcam Ab76541 Anti-CDX2, × 1/1000 dilution
B-27 Supplement (50 ×) Thermo Fisher Scientific 17504-044 Serum-free supplement
BD FACSAria II Cell Sorter BD Biosciences For flow cytometry
Biomedical freezer SANYO MDF-U538 For -30 °C storing
Cell Counting Slides for TC10/TC20 Cell Counter, Dual-Chamber BIO-RAD 1450011 Counting slide glass
CELL CULTURE MULTIWELL PLATE, 6 WELL, PS, CLEAR Greiner bio-one 657165 For differentiation culture/6-well plate
Centrifuge TOMY AX-310 For cell culturing
Centrifuge TOMY MX-305 For RT-qPCR
CHIR99021 Axon Medchem Axon 1386
CLEAN BENCH SHOWA KAGAKU  S-1601PRV Clean bench
Corning CellBIND 6-well plate Corning 3335 For feeder-free culture of hPSCs/6-well plate
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced Corning 354230 Basement membrane matrix
Corning Synthemax II-SC Substrate Corning 3535 For feeder-free culture of hPSCs/synthetic surface material for hPSCs
Cryostat Leica Leica CM1510 S For immunostaining of aggregates.
Cytofix/Cytoperm Kit Becton Dickinson 554714 Perm/Wash buffer is  Permeabilization/Wash buffer. Cytofix/Cytoperm buffer is fixation and permeabilization buffer.
Dako pen Dako S2002 For immunostaining of aggregates
dNTP mix (10 mM) Thermo Fisher Scientific 18427-088 For RT-qPCR
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A11055 Secondary antibody, × 1/500 dilution
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 Thermo Fisher Scientific A10036 Secondary antibody, × 1/500 dilution
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 Thermo Fisher Scientific A10040 Secondary antibody, × 1/500 dilution
Donkey Serum Merck Millipore S30 Donkey serum
D-PBS(-) without Ca or Mg Nacalai tesque 14249-95 DPBS
Essential 8 Medium Thermo Fisher Scientific A1517001 For feeder-free culture of hPSCs/hPSC maintenance medium
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap Corning 352235 5 mL round bottom polystyrene tube with cell strainer
Filter Tip, 1,000 µL Watoson 124-1000S Use together with pipettes
Filter Tip, 20 µL Watoson 124-P20S Use together with pipettes
Filter Tip, 200 µL Watoson 124-P200S Use together with pipettes
Fluorescence Microscope Keyence BZ-X700 For immunostaining
Forma Steri-Cycle CO2 incubator Thermo Fisher Scientific 370A Incubator
HNF-1β Antibody (C-20) Santa Cruz Biotechnology sc-7411 Anti-HNF1β, × 1/200 dilution
HNF-4α Antibody (H-171) Santa Cruz Biotechnology sc-8987 Anti-HNF4α, × 1/200 dilution
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H3570 For nucleus staining, × 1/200 dilution
Human Pancreas Total RNA Ambion AM7954 For RT-qPCR
Human PDX-1/IPF1 Antibody R&D Systems AF2419 Anti-PDX1, goat IgG, × 1/200 dilution
Human SOX17 Antibody R&D Systems AF1924 Anti-SOX17, × 1/200 dilution
Improved MEM Zinc Option medium Thermo Fisher Scientific 10373-017 iMEM
Incubation chamber Cosmo Bio 10DO For immunostaining of aggregates
Latex Examination Gloves Adachi
MAS coated slide glass Matsunami Glass 83-1881 For immunostaining of aggregates
MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific 4346907 For RT-qPCR
Microscope Olympus CKX41N-31PHP For cell culturing
Microtube Watoson 131-515CS
Monoclonal Anti-α-Fetoprotein SIGMA A8452 Anti-AFP, × 1/200 dilution
Nanodrop 8000 Thermo Fisher Scientific For RT-qPCR
Oligo dT FASMAC Custom made Oligo  For RT-qPCR of sequence is "TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT"
Paraformaldehyde, powder Nacalai tesque 26126-54 PFA, fixative, diluted in DPBS
Pharmaceutical refrigerator SANYO MPR-514 For 4 °C storing
PIPETMAN P  GILSON Pipette
Recombinant Human KGF/FGF-7 R&D Systems 251-KG KGF
Recombinant Human Noggin PeproTech 120-10C NOGGIN
Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A R&D Systems 338-AC Activin A
ReverTra Ace (100 U/μL) TOYOBO TRT-101 For RT-qPCR
RNase-free DNase Set (50) QIAGEN 79254 For RT-qPCR
RNeasy Mini Kit QIAGEN 74104 For RT-qPCR
RPMI 1640 with L-Gln Nacalai tesque 30264-85 RPMI 1640
Sealing Film for Real Time Takara NJ500 For RT-qPCR
Serological pipettes 10 mL Costar/Corning 4488 For cell culturing
Serological pipettes 25 mL Costar/Corning 4489 For cell culturing
Serological pipettes 5 mL Costar/Corning 4487 For cell culturing
Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAb Cell signaling 3579S Anti-SOX2, × 1/200 dilution
StepOnePlus Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific For RT-qPCR
Sucrose Nacalai tesque 30406-25 For immunostaining of aggregates
TB Green
Premix Ex Taq II 
Takara RR820B For RT-qPCR
TC20 Automated Cell Counter BIO-RAD 1450101J1 Automatic cell counter
Tissue-Tek OCT compound 4583  Sakura Finetechnical 4583 For immunostaining of aggregates
Tissue-Tek Cryomold Molds/Adapters Sakura Finetechnical 4566 For immunostaining of aggregates
Triton X-100 Nacalai tesque 35501-15
Trypan Blue BIO-RAD 1450021
Ultracold freezer SANYO MDF-U33V For -80 °C storing
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher Scientific 15575-038 Dilute with DPBS to prepare 0.5 mM EDTA
Veriti Thermal Cycler Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific For RT-qPCR
Y-27632 Wako 251-00514

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. D'Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 24 (11), 1392-1401 (2006).
  2. Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
  3. Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
  4. Kondo, Y., Toyoda, T., Inagaki, N., Osafune, K. iPSC technology-based regenerative therapy for diabetes. Journal of Diabetes Investigation. 9 (2), 234-243 (2017).
  5. Millman, J. R., et al. Generation of stem cell-derived beta-cells from patients with type 1 diabetes. Nature Communications. 7, 11463 (2016).
  6. Zeng, H., et al. An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery. Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).
  7. Hosokawa, Y., et al. Insulin-producing cells derived from 'induced pluripotent stem cells' of patients with fulminant type 1 diabetes: Vulnerability to cytokine insults and increased expression of apoptosis-related genes. Journal of Diabetes Investigation. , (2017).
  8. Jennings, R. E., et al. Development of the human pancreas from foregut to endocrine commitment. Diabetes. 62 (10), 3514-3522 (2013).
  9. Jorgensen, M. C., et al. An illustrated review of early pancreas development in the mouse. Endocrine Reviews. 28 (6), 685-705 (2007).
  10. Jensen, J. Gene regulatory factors in pancreatic development. Developmental Dynamics. 229 (1), 176-200 (2004).
  11. Hald, J., et al. Generation and characterization of Ptf1a antiserum and localization of Ptf1a in relation to Nkx6.1 and Pdx1 during the earliest stages of mouse pancreas development. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (6), 587-595 (2008).
  12. Villasenor, A., Chong, D. C., Henkemeyer, M., Cleaver, O. Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis. Development. 137 (24), 4295-4305 (2010).
  13. Serup, P., et al. The homeodomain protein IPF-1/STF-1 is expressed in a subset of islet cells and promotes rat insulin 1 gene expression dependent on an intact E1 helix-loop-helix factor binding site. Biochemical Journal. 310 (Pt 3), 997-1003 (1995).
  14. Riedel, M. J., et al. Immunohistochemical characterisation of cells co-producing insulin and glucagon in the developing human pancreas. Diabetologia. 55 (2), 372-381 (2012).
  15. Mae, S. I., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 4, 1367 (2013).
  16. Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
  17. Toyoda, T., et al. Rho-Associated Kinases and Non-muscle Myosin IIs Inhibit the Differentiation of Human iPSCs to Pancreatic Endoderm. Stem Cell Reports. 9 (2), 419-428 (2017).
  18. Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D., Robey, P. G. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14 (1), 13-26 (2014).
  19. Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
  20. Nguyen, Q. H., et al. Single-cell RNA-seq of human induced pluripotent stem cells reveals cellular heterogeneity and cell state transitions between subpopulations. Genome Research. 28 (7), 1053-1066 (2018).
  21. Narsinh, K. H., et al. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 121 (3), 1217-1221 (2011).
  22. Rosowski, K. A., Mertz, A. F., Norcross, S., Dufresne, E. R., Horsley, V. Edges of human embryonic stem cell colonies display distinct mechanical properties and differentiation potential. Scientific Reports. 5, 14218 (2015).
  23. Torres-Padilla, M. E., Chambers, I. Transcription factor heterogeneity in pluripotent stem cells: a stochastic advantage. Development. 141 (11), 2173-2181 (2014).
  24. Cahan, P., Daley, G. Q. Origins and implications of pluripotent stem cell variability and heterogeneity. Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 14 (6), 357-368 (2013).
  25. Chetty, S., et al. A simple tool to improve pluripotent stem cell differentiation. Nature Methods. 10 (6), 553-556 (2013).
  26. Kimura, A., et al. Small molecule AT7867 proliferates PDX1-expressing pancreatic progenitor cells derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 24, 61-68 (2017).
  27. Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (91), e52010 (2014).
  28. Honvo-Houeto, E., Truchet, S. Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland. Journal of Visualized Experiments. (106), (2015).
  29. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  30. Kajiwara, M., et al. Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 109 (31), 12538-12543 (2012).
  31. Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
  32. Suemori, H., et al. Efficient establishment of human embryonic stem cell lines and long-term maintenance with stable karyotype by enzymatic bulk passage. Biochemical and Biophysical Research Communication. 345 (3), 926-932 (2006).
  33. Gage, B. K., Webber, T. D., Kieffer, T. J. Initial cell seeding density influences pancreatic endocrine development during in vitro differentiation of human embryonic stem cells. PLoS One. 8 (12), e82076 (2013).
  34. Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
  35. Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice. Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).
  36. Kelly, O. G., et al. Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 29 (8), 750-756 (2011).
  37. Hohwieler, M., et al. Human pluripotent stem cell-derived acinar/ductal organoids generate human pancreas upon orthotopic transplantation and allow disease modelling. Gut. 66 (3), 473-486 (2017).
  38. Takeuchi, H., Nakatsuji, N., Suemori, H. Endodermal differentiation of human pluripotent stem cells to insulin-producing cells in 3D culture. Scientific Reports. 4, 4488 (2014).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 145 הלבלב תאי גזע עובריים אנושיים תאי גזע pluripotent המושרה אנושי תאי גזע pluripotent אנושי בידול פיתוח הלבלב קדמון אחורי במעי הקדמי רפואה רגנרטיבית סוכרת
יעיל הדור של הלבלב/תריסריון גנים Homeobox חלבון 1<sup>+</sup> אבות הלבלב במעי הקדמי/אחורי של hPSCs בתרבויות אדהזיה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Toyoda, T., Kimura, A., Tanaka, H.,More

Toyoda, T., Kimura, A., Tanaka, H., Osafune, K. Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures. J. Vis. Exp. (145), e57641, doi:10.3791/57641 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter