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Developmental Biology

अग्ंयाशय के कुशल पीढ़ी/ग्रहणी Homeobox प्रोटीन 1+ पश् चवर्ती अग्रगुट/अग्ंयाशय आसंजन संस्कृतियों में hPSCs से Progenitors

Published: March 27, 2019 doi: 10.3791/57641
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Center for iPS Cell Research and Application (CiRA), Kyoto University

Summary

यहां, हम एक विस्तृत प्रोटोकॉल पेश करने के लिए मानव pluripotent स्टेम सेल (hPSCs) में अग्ंयाशय/ग्रहणी homeobox प्रोटीन 1+ (PDX1+) कोशिकाओं को अग्नाशय के वंश के उत्पादन के लिए गैर कॉलोनी प्रकार monolayer वृद्धि के आधार पर वियोजित एकल कोशिकाएँ. यह विधि समरूप hPSC-व्युत्पन्न कोशिकाओं, आनुवंशिक हेरफेर और स्क्रीनिंग के उत्पादन के लिए उपयुक्त है ।

Abstract

मानव pluripotent स्टेम सेल (hPSC)-प्राप्त अग्नाशय कोशिकाओं पुनर्योजी दवा के लिए एक होनहार सेल स्रोत और मानव विकास प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक मंच है । Stepwise का निर्देश दिया भिंनता है कि पुनर्पूंजीकरण विकासात्मक प्रक्रियाओं के प्रमुख तरीके अग्ंयाशय/ग्रहणी homeobox प्रोटीन 1+ (PDX1+) अग्नाशय के जनक कोशिकाओं सहित अग्नाशय की कोशिकाओं को उत्पंन करने में से एक है । पारंपरिक प्रोटोकॉल छोटी कालोनियों के साथ भेदभाव शीघ्र ही पारित होने के बाद शुरू करते हैं । हालांकि, कालोनियों या समुच्चय के राज्य में, कोशिकाओं विषमताओं के लिए प्रवण हैं, जो PDX1+ कोशिकाओं के लिए भेदभाव बाधा हो सकता है । यहां, हम PDX1+ कोशिकाओं में hPSCs अंतर करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । प्रोटोकॉल चार चरणों के होते है और वियोजित एकल कोशिकाओं बोने के द्वारा भेदभाव शुरू करता है । SOX17 के प्रेरण+ निश्चित अन्तः कोशिकाओं दो आदिम आंत ट्यूब मार्करों, HNF1β और HNF4α की अभिव्यक्ति के बाद किया गया था, और PDX1+ कोशिकाओं में अंतिम भेदभाव । वर्तमान प्रोटोकॉल आसान हैंडलिंग प्रदान करता है और सुधार और कुछ hPSC लाइनों कि पहले endodermal वंश या PDX1+ कोशिकाओं में निकम्मेपन अंतर पाया गया की भिंनता दक्षता को स्थिर कर सकते हैं ।

Introduction

अग्ंयाशय मुख्य रूप से बहिःस्त्रावी और अंत: स्रावी कोशिकाओं के होते हैं, और इसकी शिथिलता या अधिभार कई रोगों का कारण बनता है, ऐसे अग्नाशशोथ, मधुमेह और अग्नाशय के कैंसर के रूप में । pancreatopathy के रोगजनन को स्पष्ट करने के लिए, यह अग्नाशय कोशिकाओं के विकास की प्रक्रिया और समारोह का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक है । इसके अतिरिक्त, कोशिका/ऊतक पूरकता चिकित्सा स्थापित करने के लिए सुदृढ़ गुणवत्ता वाली एक स्थिर कोशिका आपूर्ति की आवश्यकता होती है । मानव pluripotent स्टेम सेल (hpsc)-व्युत्पन्न अग्नाशय कोशिकाओं इन प्रयोजनों के लिए एक होनहार सेल स्रोत हैं, और अग्नाशय कोशिकाओं की ओर भेदभाव प्रोटोकॉल गहन अध्ययन किया गया है1,2,3, 4. अग्नाशय के β कोशिकाओं की विट्रो पीढ़ी में हाल ही में अग्रिमों वयस्क मानव में β कोशिकाओं की पीढ़ी नकल, और इन कोशिकाओं मधुमेह मॉडल चूहों2,3में आरोपण पर चिकित्सकीय प्रभावकारिता दिखाने. इसके अलावा, β कोशिकाओं के विश्लेषण से उत्पंन प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSCs) के स्वस्थ और प्रकार 1 मधुमेह रोगी दाताओं से पता चला कोई कार्यात्मक मतभेद सहित जब तनाव के तहत5। इसके अलावा, रोग phenotypes आंशिक रूप से प्रेरित अग्नाशय के कोशिकाओं के साथ रोगी प्राप्त ipscs या hpscs रोगियों6,7के रूप में एक ही साइट में आनुवंशिक उत्परिवर्तन शरण में reproduced किया गया है.

hpscs से अग्नाशय कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए, पदश: का निर्देशन किया है कि विकास प्रक्रियाओं recapitulates का इस्तेमाल होता अग्ंयाशय प्रारंभिक भ्रूण, जो सेक्स का निर्धारण क्षेत्र Y-बॉक्स 17 (SOX17) और forkhead बॉक्स A2 (FOXA2)8व्यक्त की अन्तः परत से व्युत्पंन है । माउस के अध्ययन के आधार पर, endodermal परत आदिम पेट ट्यूब रूपों, जो हेपेटोसाइट परमाणु कारक 1 की अभिव्यक्ति द्वारा चिह्नित है-बीटा (Hnf1β) और hepatocyte परमाणु फैक्टर 4-अल्फा (Hnf4α). आदिम आंत ट्यूब elongates और श्वसन तंत्र, पाचन तंत्र, और अंगों में विकसित करता है । बढ़ाव के बाद, पश् चवर्ती अग्रगट क्षेत्र कल्पित अग्नाशई क्षेत्र बन जाता है, जैसा कि प्रतिकारी कारक अग्ंयाशय/ग्रहणी होमोबॉक्स प्रोटीन 1 (PDX1)8,9,10की अभिव्यक्ति द्वारा चिह्नित । PDX1+ आंत ट्यूब के पृष्ठीय और अधर भागों अग्नाशय कलियों, जो अग्ंयाशय प्रतिलेखन कारक 1 सबयूनिट अल्फा (PTF1A) और NK6 homeobox 1 (nkx 6.1)8,11के सह अभिव्यक्ति द्वारा चिह्नित कर रहे है के रूप में गाढ़ा । इस अभिव्यक्ति अग्नाशय के ऑर्गेनिजेनेसिस के रूपात्मक शुरू के निशान । अग्नाशय अन्तः कोशिकाओं, जो अग्नाशई कलियों के घटक हैं, उपकला संरचनाओं12 के एक बंटी ट्यूबलर नेटवर्क फार्म और अंततः बहिःस्त्रावी और अंत: स्रावी कोशिकाओं में अंतर, इंसुलिन स्रावी β कोशिकाओं सहित और glucagon-छिपाना α-कोशिकाओं । PDX1 की अभिव्यक्ति पहले प्रकल्पशील अग्नाशय क्षेत्र है, जो तो पूरे अग्नाशय के विकास में मनाया जाता है पर पाया जाता है, और β-और δ कोशिकाओं9,13,14को स्थानीयकरण से पता चलता है । हालांकि Pdx1+ कोशिका क्षेत्र है कि Ptf1a या Nkx 6.1 व्यक्त नहीं करता है गैस्ट्रिक विवर, ग्रहणी, extraयकृत पित्त नलिका और मध्य में कुछ आंतों की कोशिकाओं में फर्क9चूहों में विकास के देर चरण के लिए, Pdx1+ कोशिकाओं मनुष्यों में प्रारंभिक विकास के स्तर पर अग्ंयाशय के progenitors माना जाता है ।

यहां, हम एक विस्तृत प्रोटोकॉल पेश करने के लिए PDX1 में hPSCs अंतर+ अग्नाशय वंश की पीढ़ी के लिए कोशिकाओं । प्रोटोकॉल को वियोजित एकल कोशिकाओं15,16,17बोने के द्वारा भेदभाव शुरू करता है । सामान्यतया, अविभेदित एचपीएससीज को कालोनियों अथवा कोशिका समुच्चय के रूप में निलंबन अथवा आसंजन में रखा जाता है । नतीजतन, अधिकांश प्रोटोकॉल passaging के बाद शीघ्र ही भेदभाव शुरू करते हैं । हालांकि, कालोनियों या समुच्चय के राज्य में, कोशिकाओं स्थानिक और transcriptional विषमताओं18,19,20,21,22, जो बाधा हो सकती करने के लिए प्रवण हैं निश्चित अन्तः PDX1+ कोशिकाओं के लिए अकुशल भेदभाव के बाद की ओर पहला भेदभाव कदम । वर्तमान प्रोटोकॉल आसान हैंडलिंग में सुधार करने के लिए और कुछ hPSC लाइनों कि पहले endodermal वंश और PDX1+ कोशिकाओं23के लिए निकम्मेपन अंतर पाया गया की भिंनता दक्षता को स्थिर करने की पेशकश कर सकते हैं, 24 , 25.

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Protocol

एचपीएससीज का प्रयोग करते हुए चिकित्सा विभाग और ग्रेजुएट स्कूल ऑफ मेडिसिन, क्योटो विश्वविद्यालय की आचार समिति द्वारा प्रयोग अनुमोदित किए गए थे ।

1. सामग्रियों की तैयारी

नोट: एक वातावरण में सेल संस्कृति के लिए सभी मीडिया और अभिकर्मकों तैयार । उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान (आरटी) के लिए आधार संस्कृति मीडिया को गर्म । अंतर के लिए मध्यम आरटी में 6 एच के भीतर प्रयोग किया जाता है । अभिकर्मकों का विवरण सामग्रियों की सारणीमें सूचीबद्ध है ।

  1. विभेद (चित्रा 1a)
    1. स्टेज 1A मध्यम: एक पिपेट का उपयोग कर एक ट्यूब में RPMI १६४० मध्यम स्थानांतरण । सीरम मुक्त पूरक, activin ए, CHIR99021, और वाई-२७६३२ 1x, १०० एनजी/एमएल, 3 μM और 10 μM की एकाग्रता के लिए, क्रमशः जोड़ें ।
    2. स्टेज 1B मध्यम: एक पिपेट का उपयोग कर एक ट्यूब में RPMI १६४० मध्यम स्थानांतरण । सीरम मुक्त पूरक, सक्रिय एक और CHIR99021 1x, १०० एनजी/एमएल, ≤ 1 μM, क्रमशः की एकाग्रता के लिए जोड़ें ।
      नोट: CHIR99021 की एकाग्रता चरण 1A मध्यम से कम होना चाहिए, और इसके अलावा आवश्यक नहीं है, लेकिन यह सेल संख्या बढ़ जाती है.
    3. स्टेज 2 मध्यम: एक पिपेट का उपयोग कर एक ट्यूब में सुधार मेम (iMEM) मध्यम स्थानांतरण. सीरम मुक्त पूरक और keratinocyte वृद्धि कारक (KGF) 0.5 x और ५० एनजी/एमएल, क्रमशः की एकाग्रता के लिए जोड़ें ।
    4. स्टेज 3 मध्यम: एक पिपेट का उपयोग कर एक ट्यूब में iMEM माध्यम स्थानांतरण । सीरम मुक्त पूरक, KGF, NOGGIN, 3-Keto-N-aminoethyl-N'-aminocaproyldihydroसिनेमोइल साइक्लोपैमीन (cyc) और 4-[(ई)-2-(5, जोड़ें 6, 7, 8-टेट्राहाइड्रो-5, 5, 8, 8-टेट्रामेथिल-2-नैफथैलेनिल) -1-प्रोपेन्सिल]-बेंजोइक अम्ल (TTNPB) से पिपेट तक क्रमश 05 x, ५० एनजी/एमएल, १०० एनजी/एमएल, ०.५ μM और 10 एनएम की सांद्रता ।
  2. फ्लो साइटोमेट्री (एफसीएम)
    1. 1x Permeabilization/वॉश बफर: एक पिपेट द्वारा एक ट्यूब में पानी हस्तांतरण । 1 एक्स की एकाग्रता के लिए एक पिपेट द्वारा Permeabilization/धोने बफर जोड़ें ।
    2. FCM अवरुद्ध समाधान: एक पिपेट द्वारा एक ट्यूब में 1x Permeabilization/ 2% (vol/vol) की एकाग्रता के लिए एक पिपेट द्वारा गधा सीरम जोड़ें ।
  3. प्रतिरोही अभिरंजक
    1. अवरुद्ध समाधान: एक पिपेट द्वारा एक ट्यूब में Dulbecco के फॉस्फेट-Buffered खारा (DPBS) हस्तांतरण । क्रमश: 5% (vol/vol) और ०.४% (vol/vol) की सांद्रता के लिए पिपेट द्वारा गधा सीरम और Triton एक्स जोड़ें ।

2. hPSC पीछे Foregut कोशिकाओं के लिए अवविरूपण/अग्नाशय Progenitors (PDX1+ कोशिकाओं)

नोट: बाँझ तकनीकों का उपयोग कर सभी प्रक्रियाओं आचरण. एचपीएससी को निर्माता के निर्देश17,26के अनुसार hpsc अनुरक्षण माध्यम के साथ hpscs के लिए सिंथेटिक सतह सामग्री द्वारा लेपित 6-well प्लेटों पर रखा जाता है । जब कक्ष 50-80% कन्फ्लुएंसी (चरण 0) तक पहुंचते हैं, तो उंहें भिंनता के लिए उपयोग करें ।

  1. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स लेपित प्लेटें तैयार ।
    1. स्थानांतरण 6 मिलीलीटर की RPMI १६४० (4 डिग्रीसेल्सियस) में एक ट्यूब ठंडा करने के लिए 4 डिग्रीसेल्सियस बर्फ पर. 2 मिलीग्राम के तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (4 डिग्रीसेल्सियस) के साथ ठंडा 1 मिलीलीटर-पिपेट युक्तियाँ और अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए ०.३३ मिलीग्राम/एमएल तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स बनाने के लिए कोमल ।
    2. एक पिपेट द्वारा 6 अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेटों के प्रत्येक अच्छी तरह से पतला तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के 2 मिलीलीटर हस्तांतरण । एक मशीन में 60-90 मिनट के लिए ३७ डिग्रीसेल्सियस पर प्लेटें प्लेस । इसके बाद, (3 ज के भीतर) का उपयोग जब तक आरटी पर प्लेटें रखें ।
  2. hpscs बीज और निश्चित अन्तः (स्टेज 1a) के लिए भेदभाव शुरू ।
    1. प्रयोग किया जाता मध्यम महाप्राण और 6-well प्लेटों में hPSCs सुसंस्कृत धोने के लिए अच्छी तरह से पिपेट द्वारा प्रति ०.५ मिमी एथिलिनेडिएमिनेटेट्राएसिटिक एसिड (एटीए) (आरटी) के 2 मिलीलीटर जोड़ें ।
    2. महाप्राण ०.५ मिमी EDTA और अच्छी तरह से पिपेट द्वारा प्रति ०.५ मिमी EDTA के 2 मिलीलीटर जोड़ें । 5 मिनट के लिए ३७ डिग्रीसेल्सियस पर प्लेटे सेते ।
    3. महाप्राण ०.५ मिमी EDTA और 1 मिलीलीटर hPSC अनुरक्षण मध्यम के साथ 10 μM Y-२७६३२ प्रति अच्छी तरह से पिपेट के साथ पूरक में जोड़ें । पिपेट धीरे लेकिन जल्दी से प्लेटों पर संलग्न कोशिकाओं को उड़ाने के लिए और एक कोशिकाओं में clumped कोशिकाओं को अलग करने के लिए । पिख्ता के दौरान सेल सस्पेंशन को बबल न करें ।
    4. 10 μM Y-२७६३२ के साथ आरटी पूरक पर hPSC अनुरक्षण माध्यम के 4 मिलीलीटर युक्त ५० मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में सेल निलंबन का स्थानांतरण । धीरे सेल निलंबन पिपेट ।
    5. Trypan नीला दाग बहिष्करण प्रक्रिया का उपयोग करके कक्ष में कक्ष संख्या गिनना.
      1. सेल निलंबन के 15 μL और एक ट्यूब में Trypan नीले रंग के 15 μL मिक्स ।
      2. एक 10 μL पिपेट द्वारा डुप्लिकेट में सेल गिनती स्लाइड पर Trypan ब्लू के साथ पतला सेल निलंबन के 10 μL स्थानांतरण ।
      3. एक स्वचालित सेल काउंटर के साथ सेल संख्या गिनती और सेल निलंबन में कोशिका घनत्व की गणना । व्यवहार्यता आमतौर पर 98% > है ।
    6. एक ५० मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 1-1.5 x 10 6-अच्छी तरह से प्लेट (1-1.5 x 105 कोशिकाओं/सेमी2) के प्रति4 कोशिकाओं में सेल निलंबन aliquot ।
    7. सेंट्रीफ्यूज 5 मिनट के लिए RT पर २०० x g पर ५० मिलीलीटर ट्यूब ।
    8. एक पिपेट का उपयोग supernatant महाप्राण और अच्छी तरह से प्रति चरण 1A मध्यम (आरटी) के 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं resuspend. धीरे सेल निलंबन पिपेट और चरण 1A मध्यम (कुल, 2 मिलीलीटर प्रति अच्छी तरह से) के एक और 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
    9. एक १,००० μL पिपेट द्वारा 2.1.2 कदम में तैयार सेल संस्कृति प्लेटों के कुओं में पतला तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स महाप्राण । तुरंत अगले कदम पर आगे बढ़ें ।
    10. धीरे से चरण 2.2.8 में सेल निलंबन पिपेट फिर से । मिश्रण के तुरंत बाद, एक 6-well थाली के प्रत्येक कूप में सेल निलंबन (2 मिलीलीटर) हस्तांतरण । थाली को प्रकाश से बचाने के लिए एक एल्यूमीनियम पन्नी के साथ प्लेट को ढक कर रखें । 10-15 मिनट के लिए आरटी में साफ बेंच में थाली प्लेस ।
      नोट: सीडिंग के बाद थाली न ले जाएं ।
    11. धीरे से एक ३७ डिग्रीसेल्सियस, 5% सह2 इनकूबेटर (humidified वातावरण) और 24 एच के लिए संस्कृति में थाली जगह है ।
      नोट: सीडिंग के बाद थाली न हिलाएं ।
  3. निश्चित अन्तः करण (चरण 1B) में विभेद को प्रेरित करते हैं ।
    1. इस्तेमाल किया मध्यम महाप्राण और पिपेट द्वारा कुओं के लिए DPBS के 2 मिलीलीटर जोड़ें । आकांक्षा और DPBS के अलावा एक बार दोहराएं ।
      नोट: monolayer से किसी भी मृत कोशिकाओं को हटाने के लिए, धीरे से प्रत्येक आकांक्षा से पहले थाली हिला ।
    2. एक पिपेट द्वारा इस्तेमाल किया DPBS महाप्राण और अच्छी तरह से प्रति चरण 1B मध्यम (३७ डिग्रीसेल्सियस) के 4 मिलीलीटर जोड़ें । धीरे से ३७ °C इनकूबेटर में थाली प्लेस (humidified वातावरण 5% सह2) और संस्कृति के लिए ४८ एच ।
    3. इस्तेमाल किया मध्यम महाप्राण और अच्छी तरह से पिपेट के लिए DPBS के 2 मिलीलीटर जोड़ें । आकांक्षा और DPBS के अलावा एक बार दोहराएं ।
      नोट: प्रत्येक आकांक्षा से पहले कोमल मिलाते हुए monolayer से मृत कोशिकाओं को हटा दें ।
    4. पिपेट द्वारा इस्तेमाल किया DPBS महाप्राण और अच्छी तरह से प्रति चरण 1B मध्यम (३७ डिग्रीसेल्सियस) के 4 मिलीलीटर जोड़ें । धीरे इंकूबेटर में थाली प्लेस (३७ डिग्रीसेल्सियस, 5% सह2के humidified वातावरण) और संस्कृति के लिए 24 एच ।
  4. आदिम पेट ट्यूब (चरण 2) में भेदभाव प्रेरित ।
    1. इस्तेमाल किया मध्यम महाप्राण और अच्छी तरह से पिपेट के लिए DPBS के 2 मिलीलीटर जोड़ें ।
      नोट: प्रत्येक आकांक्षा से पहले कोमल मिलाते हुए monolayer से मृत कोशिकाओं को हटा दें ।
    2. पिपेट द्वारा इस्तेमाल किया DPBS महाप्राण और चरण 2 मध्यम (३७ डिग्रीसेल्सियस) के प्रति अच्छी तरह से 4 मिलीलीटर जोड़ें । 4 दिनों के लिए मशीन (३७ डिग्रीसेल्सियस, 5% सह2के humidified वातावरण) और संस्कृति में थाली प्लेस ।
  5. PDX1 में विभेद को प्रेरित+ कोशिकाओं (स्टेज 3) ।
    1. इस्तेमाल किया मध्यम महाप्राण और अच्छी तरह से पिपेट के लिए DPBS के 2 मिलीलीटर जोड़ें । आकांक्षा और DPBS के अलावा एक बार दोहराएं ।
    2. पिपेट द्वारा इस्तेमाल किया DPBS महाप्राण और चरण 3 मध्यम (३७ डिग्रीसेल्सियस) के प्रति अच्छी तरह से 4 मिलीलीटर जोड़ें । मशीन में थाली प्लेस (३७ डिग्रीसेल्सियस, 5% सह2के humidified वातावरण) और 3 दिनों के लिए संस्कृति ।
  6. अग्नाशय अंत: स्रावी कोशिकाओं में विभेद प्रेरित.
    1. पहले वर्णित प्रोटोकॉल3,16,26के साथ nkx 6.1+ सेल प्रेरण (स्टेज 4, 8 दिनों के लिए) अंत: स्रावी सेल प्रेरण (चरण 5, 12 दिनों के लिए) के बाद प्रदर्शन करते हैं । की विशेषता है और immunostaining और मात्रात्मक वास्तविक समय रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (qrt-पीसीआर) विश्लेषण द्वारा अंत: स्रावी कोशिका भेदभाव को मांय ।
      नोट: विस्तृत प्रायोगिक प्रक्रियाओं के लिए टोयोडा एट अल.16 और किमुरा एट अल.26 देखें । qRT-पीसीआर विश्लेषण के लिए प्रयुक्त प्राइमरी दृश्यों के लिए तालिका 1 देखें ।

3. फ्लो साइटोमेट्री (एफसीएम)

  1. इस्तेमाल किया महाप्राण और ०.५ मिमी EDTA के 2 मिलीलीटर के लिए अच्छी तरह से पिपेट द्वारा जोड़ें । आकांक्षा और ०.५ मिमी EDTA एक बार के अलावा दोहराएं ।
    नोट: एक आकांक्षा से पहले monolayer कोशिकाओं से किसी भी मृत कोशिकाओं को हटाने के लिए धीरे थाली शेक.
  2. कोशिकाओं को अलग करने के लिए (लगभग 3-6 × 10 अच्छी तरह से प्रति6 कोशिकाओं), ०.२५% Trypsin की 2 मिलीलीटर अच्छी तरह से प्रति ०.५ MM edta युक्त जोड़ें । 5-10 मिनट के लिए ३७ डिग्रीसेल्सियस पर प्लेटे सेते ।
  3. पिपेट धीरे लेकिन जल्दी से एक कोशिकाओं में clumped कोशिकाओं को अलग करना । पिख्ता के दौरान सेल सस्पेंशन को बबल न करें ।
  4. 8-10 मिलीलीटर आधार मध्यम (RPMI १६४० या iMEM, RT) युक्त 0.5 x सीरम-मुक्त पूरक और 10 μM Y-२७६३२ प्रति अच्छी तरह से जोड़ें और सेल निलंबन मिश्रण । सेल निलंबन एक अपकेंद्री ट्यूब में स्थानांतरण ।
  5. सेंट्रीफ्यूज ३०० एक्स जी पर ट्यूब 5 मिनट के लिए आरटी में ।
  6. supernatant महाप्राण और ०.५ मिमी EDTA (आरटी) के 2 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं resuspend । धीरे सेल निलंबन पिपेट ।
  7. सेंट्रीफ्यूज ३०० एक्स जी पर ट्यूब 5 मिनट के लिए आरटी में ।
  8. supernatant महाप्राण और एक डाकू के तहत 106 कोशिकाओं प्रति निर्धारण और permeabilization बफर के १०० μl के साथ कोशिकाओं resuspend । धीरे से एक डाकू के तहत सेल निलंबन पिपेट । 30 मिनट के लिए RT पर ट्यूब रखें ।
  9. सेंट्रीफ्यूज ४०० एक्स जी पर ट्यूब 5 मिनट के लिए आरटी में ।
  10. एक डाकू के तहत supernatant महाप्राण और 106 कोशिकाओं प्रति ५०० ΜL Fcm अवरुद्ध समाधान के साथ कोशिकाओं resuspend । धीरे सेल निलंबन पिपेट । 30 मिनट के लिए RT पर ट्यूब रखें ।
  11. एक ट्यूब (लगभग 1 x 105 कोशिकाओं) के लिए सेल निलंबन के ५० Μl स्थानांतरण । सेंट्रीफ्यूज पर ट्यूब ४०० एक्स जी पर 5 मिनट के लिए आर टी पर । supernatant निकालें और पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के १०० μl के साथ कोशिकाओं resuspend ( सामग्री की मेजदेखें) fcm अवरुद्ध समाधान में और 4 डिग्रीसेल्सियस पर > 16 एच के लिए इनसेबेट ।
  12. सेंट्रीफ्यूज ४०० एक्स जी पर ट्यूब 5 मिनट के लिए आरटी पर. supernatant निकालें और 1X perm के १८० μl के साथ कोशिकाओं resuspend/
  13. सेंट्रीफ्यूज पर ट्यूब ४०० एक्स जी पर 5 मिनट के लिए RT. supernatant निकालें और कमजोर माध्यमिक एंटीबॉडी के १०० μl के साथ कोशिकाओं resuspend ( सामग्री की मेजदेखें) fcm अवरुद्ध समाधान में । आरटी पर ६० मिनट के लिए कोशिकाओं को सेटे या 4 डिग्रीसेल्सियस > 16 के लिए प्रकाश से सुरक्षा के साथ एच ।
  14. सेंट्रीफ्यूज ४०० एक्स जी पर ट्यूब 5 मिनट के लिए आरटी पर. supernatant निकालें और 1X perm के १८० μl के साथ कोशिकाओं resuspend/
  15. सेंट्रीफ्यूज ४०० एक्स जी पर ट्यूब 5 मिनट के लिए आरटी पर. supernatant निकालें और dpbs में 2% गधा सीरम के १८० μl के साथ कोशिकाओं resuspend ।
  16. एक सेल छलनी (३५ μm नायलॉन जाल) के साथ एक 5 मिलीलीटर दौर नीचे polystyrene ट्यूब पर स्थानांतरित करके सेल निलंबन फिल्टर और विश्लेषण तक प्रकाश से सुरक्षा के साथ 4 डिग्रीसेल्सियस पर रहते हैं ।
  17. एक प्रवाह cytometer द्वारा सकारात्मक दाग कोशिकाओं के अनुपात का विश्लेषण27।

4. Immunostaining

  1. इस्तेमाल किया मध्यम महाप्राण और अच्छी तरह से पिपेट के लिए DPBS के 2 मिलीलीटर जोड़ें । आकांक्षा और DPBS के अलावा एक बार दोहराएं ।
    नोट: धीरे से एक आकांक्षा से पहले monolayer कोशिकाओं से किसी भी मृत कोशिकाओं को हटाने के लिए थाली हिला ।
  2. 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) (4 डिग्रीसेल्सियस) के 2 मिलीलीटर को एक हुड के नीचे पिपेट द्वारा अच्छी तरह से जोड़ें । थाली को 4 डिग्रीसेल्सियस पर 20 मिनट के लिए रखें ।
  3. एक डाकू के तहत पिपेट द्वारा पीएफए निकालें । एक डाकू के तहत पीटीटीई द्वारा आर टी पर DPBS के 2 मिलीलीटर अच्छी तरह से जोड़ें । आकांक्षा और DPBS के अलावा एक बार दोहराएं ।
  4. अच्छी तरह से प्रति अवरुद्ध समाधान के 2 मिलीलीटर जोड़ें और 30 मिनट के लिए आरटी पर थाली रखने के लिए ।
  5. इस्तेमाल किया समाधान महाप्राण और प्राथमिक एंटीबॉडी के 1 मिलीलीटर जोड़ने ( सामग्री की मेजदेखें) के प्रति अच्छी तरह से समाधान अवरुद्ध में । आर टी पर ६० मिनट के लिए या 4 डिग्रीसेल्सियस पर > 16 एच के लिए इनसेबेट ।
  6. इस्तेमाल किया समाधान महाप्राण, ०.४% Triton एक्स १०० और 10 मिनट के लिए आरटी में सेते युक्त DPBS के 2 मिलीलीटर जोड़ें । आकांक्षा, समाधान और ऊष्मायन एक बार के अलावा दोहराएं ।
  7. इस्तेमाल किया समाधान महाप्राण और माध्यमिक एंटीबॉडी के 1 मिलीलीटर जोड़ें ( सामग्री की मेजदेखें) के प्रति अच्छी तरह से समाधान अवरुद्ध में । आरटी पर ६० मिनट के लिए इनसेबेट प्रकाश से सुरक्षा के साथ ।
  8. इस्तेमाल किया समाधान महाप्राण, ०.४% Triton एक्स-१०० (आरटी) और आरटी पर 5 मिनट के लिए इंसेबेट से युक्त DPBS के 2 मिलीलीटर प्रकाश से सुरक्षा जोड़ें । आकांक्षा, समाधान और ऊष्मायन के अलावा दो बार दोहराएं ।
  9. एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत भेदभाव दक्षता की जांच करने के लिए माइक्रोग्राफ ले28।

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Representative Results

हिपसीज का प्रचार करना (585a129,30) सघन हैं और एक समरूप मोनोलेयर (चित्र 1b) के रूप में है जो विभेद के लिए उपयुक्त है । अविभेदित hiPSCs (स्टेज 0) को कम सेल घनत्व (1-1.5 x 105 कोशिकाओं/सेमी2) पर एकल कोशिकाओं के रूप में अलग और फिर से वरीयता प्राप्त कर रहे हैं । 1 ज के भीतर, कोशिकाओं थाली से जुड़े हुए हैं और फलाव दिखाने के लिए शुरू करते हैं । 1 दिन में, कोशिकाओं proliferated और अच्छी तरह से सतह क्षेत्र के 80-90% कवर करने के लिए वितरित कर रहे हैं । स्टेज 1B के दौरान, मीडिया में मृत कोशिकाओं के कारण बादल दिखाई देते हैं । मृत कोशिकाओं को हटाने अत्यधिक कुशल भेदभाव के लिए महत्वपूर्ण है के बाद से मृत कोशिकाओं की संभावना अस्तित्व और कोशिकाओं के भेदभाव के नीचे झूठ बोल परेशान । 3-4 दिन, कोशिकाओं एक समरूप monolayer शीट है कि एक cobblestone उपस्थिति के रूप में वर्णित किया जा सकता है फार्म । इस बिंदु पर, अधिकांश कोशिकाओं सेक्स का निर्धारण क्षेत्र Y-बॉक्स 2 (SOX2), अविभेदित कोशिकाओं के लिए एक मार्कर को व्यक्त करने बंद करो, और इसके बजाय एक निश्चित अन्तः मार्कर एक्सप्रेस, SOX17, अधिक से अधिक ९०% (चित्रा 2A और बी). अधिकांश SOX17+ कोशिकाओं एक्सप्रेस FOXA2 (चित्रा 2a) । एक अनुचित कोशिका घनत्व के साथ भेदभाव शुरू इस कदम पर भेदभाव दक्षता समझौता (चित्रा 3) । 2 और 3 चरणों में, कोशिका मृत्यु को आराम, और इस्तेमाल किया मध्यम बादल के रूप में नहीं है के रूप में यह चरण 1B में है । कोशिकाओं आदिम पेट ट्यूब मार्करों HNF1β और HNF4α (चित्र 2c) व्यक्त करते है और अंततः ९०% से अधिक (चित्र 2 डी और ई) पर एक पीछे foregut/अग्नाशय के जनक मार्कर, PDX1, एक्सप्रेस । PDX1+ सेल प्रेरण एक और hipsc लाइन, 1231A3 31, और एक Hesc लाइन, khes-3 ३२ (चित्रा 4) में reproducible है । qRT-पीसीआर स्टेज मार्कर की एमआरएनए अभिव्यक्ति के परिणाम immunostaining के साथ संगत थे (चित्रा 5A). PDX1 की एमआरएनए अभिव्यक्ति चरण 3 में स्पष्ट है और काफी हद तक बढ़ जाती है afterword ।

PDX1+ प्रारंभिक विकास के चरणों में कोशिकाओं को न केवल अग्नाशय कोशिकाओं पर भी अंतर करने की क्षमता है, लेकिन गैस्ट्रिक अंतर्वाहिका, ग्रहणी, extraयकृत पित्त नलिका और आंत का एक हिस्सा 9. विट्रो में की भिंनता क्षमता उत्पंन PDX1+ अग्नाशय कोशिकाओं को कोशिकाओं अग्नाशय अन्तः और अग्नाशय अंत: स्रावी कोशिकाओं के लिए रिपोर्ट प्रोटोकॉल के साथ विस्तारित संस्कृति द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है3,16, 26. एक अग्नाशय अन्तः मार्कर के भाव, nkx 6.1, और दो अग्नाशय अंत: स्रावी मार्कर, इंसुलिन, और ग्लूकागन, 19 दिनों (स्टेज 4) और 31 (स्टेज 5), क्रमशः (चित्रा 5) पर मनाया गया ।

Figure 1
चित्रा 1: पदश: भेदभाव के तहत कोशिकाओं के प्रतिनिधि उपस्थिति । (क) एचपीएससीज से अग्नाशई वंश के लिए निदेश की एक योजना । लघुकोष्ठक में संख्याएं संकेतित सांद्रता (इकाइयाँ नीचे लिखी जाती हैं) दर्शाती हैं । (ख) भेदभाव संस्कृति के प्रमुख कदमों पर हिप्सीज के प्रतिनिधि उज्ज्वल फील्ड माइक्रोग्राफ । 585a1 hipscs एकल कोशिकाओं के रूप में वियोजित थे और निश्चित अन्तः, आदिम पेट ट्यूब और पीछे foregut में अंतर करने के लिए प्रेरित/ निचले पैनलों ऊपरी पैनलों के विचारों में इजाफा कर रहे हैं । ्पमि, ्पमि १६४०; ए. ए., सक्रिय एक (एनजी/एमएल); CH, CHIR99021 (μM); KGF (एनजी/एमएल); NOG, NOGGIN (ng/mL); CYC, 3-Keto-N-aminoethyl-N'-aminocaproyldihydroसिनेमोइल साइक्लोपैमीन (μM); TTNPB, 4-[(ई)-2-(5, 6, 7, 8-Tetrahydro-5, 5, 8, 8-टेट्रामेथिल-2-नैफथैलेनिल) -1-propenyl]-बेंजोइक एसिड (एनएम) । स्केल पट्टियां = ३०० μm । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: हिप्सीज से अग्नाशय के वंश की ओर प्रतिनिधि प्रेरण । (क) SOX2-SOX17+ कोशिकाओं के अनुपात का विश्लेषण विभेदन (स्टेज 0) से पहले और 4 दिन (चरण 1b) पर प्रवाह कोशिकामिति द्वारा किया जाता है । अविभेदित hipscs (SOX2+SOX17-) निश्चित अन्तः (SOX2-SOX17+) में विभेदित थे । अधिकांश SOX17+ कोशिकाओं सह FOXA2 व्यक्त की है । (ख) 4 दिवस (चरण 1b) पर प्रतिनिधि इमयूनोफ्लोरोसेंट माइक्रोग्राफ । स्थिर कोशिकाएं SOX17 (हरा), SOX2 (लाल), और नाभिक (नीला) के लिए दाग थीं । (ग) 4 दिनों (चरण 1b) और 8 (चरण 2) पर प्रतिनिधि इमयूनोफ्लोरोसेंट माइक्रोग्राफ । स्थिर कोशिकाएं HNF1β (हरा), HNF4α (लाल) और नाभिक (नीला) के लिए दाग थीं । (घ) PDX1 के लिए धनात्मक कोशिकाओं का अनुपात, जैसा कि 4 दिनों (चरण 1b) और 11 (चरण 3) पर प्रवाह कोशिकामिति द्वारा विश्लेषित किया गया है । (ङ) दिनांक 11 (चरण 3) को PDX1 (हरित) और नाभिक (नीला) का प्रतिनिधिक इमयूनोफ्लोरोसेंट माइक्रोग्राफ । स्केल पट्टियां = १०० μm ।  कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: निश्चित अन्तः विभिन्न सेल घनत्व से शुरू की ओर प्रतिनिधि प्रेरण. (क) विभेदन के बाद कक्ष 1 ज के प्रतिनिधि उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोग्राफ । hipscs एकल कोशिकाओं के रूप में वियोजित थे और विभिन्न सेल घनत्व पर निश्चित अन्तः में अंतर करने के लिए प्रेरित (1-50 x 104/सेमी2). निचले पैनलों ऊपरी पैनलों के विचारों में इजाफा कर रहे हैं । (ख) SOX2-SOX17+ कोशिकाओं के अनुपात का विश्लेषण प्रवाह कोशिकामिति द्वारा विभेद (स्टेज 0) से पहले और 4 दिन (चरण 1b) पर किया जाता है । (ग) PDX1+ कोशिकाओं के अनुपात में 8 दिनों (चरण 2) और 11 (चरण 3) पर प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया । स्केल पट्टियां = ३०० μm ।  कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: PDX1+ hiPCSs और hescs में कोशिकाओं की ओर प्रतिनिधि प्रेरण । एक hiPSC लाइन, 1231A3 (एक), और एक hesc लाइन, khes-3 (बी), निश्चित अन्तः और PDX1+ कोशिकाओं को भेदभाव किया गया । कोशिका रचना का विश्लेषण प्रवाह कोशिकामिति द्वारा किया गया. SOX2-SOX17+ कोशिकाओं के अनुपात में विभेद (स्टेज 0) और 4 दिन (स्टेज 1b) से पहले विश्लेषण किया गया था । PDX1+ कोशिकाओं का अनुपात 8 दिनों (स्टेज 2) और 11 (स्टेज 3) पर विश्लेषित किया गया था ।  कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: अग्नाशय अन्तः और अंत: स्रावी कोशिकाओं की ओर प्रतिनिधि प्रेरण. hipscs (585a1) PDX1+ कोशिकाओं में विभेदित किया गया. कोशिकाओं को आगे अग्नाशय अन्तः और अग्नाशय अंत: स्रावी कोशिकाओं के साथ3,16,26प्रोटोकॉल में विभेदित थे । (क) स्टेज मार्करों के एमआरएनए अभिव्यक्तियों को मात्रात्मक रीयल-टाइम पॉलीमएज चेन रिएक्शन (क्यूआरटी-पीसीआर) द्वारा मापा गया था । डेटा Gapdh अभिव्यक्ति के लिए सामांयीकृत थे और जीन अभिव्यक्ति में गुना परिवर्तन के रूप में प्रस्तुत पीक मूल्य के सापेक्ष । ध्यान दें कि PDX1 अभिव्यक्ति > 20-दिनों से 8 (चरण 2) से 11 (चरण 3) और > 100-गुना 11 (चरण 3) से 19 (चरण 4) में वृद्धि हुई थी । वयस्क मानव अग्ंयाशय में अभिव्यक्ति Panc के रूप में दिखाया गया है । SOX2, काली; SOX17, बैंगनी; HNF1β, भूरा; HNF4α, नारंगी; PDX1, हल्का हरा; Nkx 6.1, हरे; इंसुलिन, नीला; Glucagon, लाल । (ख) एक अग्नाशय अन्तः मार्कर, nkx 6.1 (लाल), 11 दिनों (चरण 3) और 19 (स्टेज 4) पर प्रतिनिधि immunofluorescent माइक्रोग्राफ । PDX1 (green) और नाभिक (blue) के सह-दाग थे. (ग) दो अग्नाशय अंत: स्रावी निर्माताओं, इंसुलिन (भारतीय नौसेना पोत, ग्रीन) और ग्लूकागन (gcg, लाल), 19 दिनों (स्टेज 4) और 31 (चरण 5) पर के प्रतिनिधि immunofluorescent माइक्रोग्राफ । नाभिक (नीला) सह दाग थे ।  कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

जीन नाम जीन प्रतीक फॉरवर्ड प्राइमर रिवर्स प्राइमर
ग्लिसलडिहाइड-3-फॉशा
ते डिहाइड्रोजेनेज		 GAPDH गैगगगतगगगतकग्गगटीसी GAAGATGGTGATGGGATTTC
सरी-बॉक्स 2 SOX2 AGTCTCCAAGCGACGAAAAA TTTCACGTTTGCAACTGTCC
सरी-बॉक्स 17 SOX17 CGCACGGAATTTGAACAGTA TTAGCTCCTCCAGGAAGTGTG
HNF1 homeobox B HNF1β CCTCTCCTCCAAAAGCTG TGTTGCCATGGTGACTGATT
हेपैटकोशिका नाभिकीय गुणक 4 ऐल्फ़ा HNF4α गैगCTGCAGATGACAA TACTGGCGGTCGTTGATGTA
अग्नाशय और ग्रहणी homeobox 1 PDX1 AGCAGTGCAAGAGTCCCTGT CACAGCCTCTACCTCGGAAC
NK6 homeobox 1 NKX 6.1 ATTCGTTGGGGATGACAGAG TGGGATCCAGAGGCTTATTG
ग्लूकागन GCG GAATTCATTGCTTGGCTGGT CGGCCAAGTTCTTCAACAAT
इंसुलिन इन्स CTACCTAGTGTGCGGGGAAC GCTGGTAGAGGGAGCAGATG

तालिका 1: qPCR के लिए Primers ।

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Discussion

PDX1+ कोशिकाओं की पीढ़ी के कई कदम शामिल है; इसलिए, यह उचित समय पर कोशिकाओं का इलाज करने के लिए महत्वपूर्ण है । कदम के अलावा, निश्चित अन्तः की प्रेरण दक्षता मुख्यतः अंतिम प्रेरण दक्षता को प्रभावित करता है, संभवतः अन्य contaminating वंश कोशिकाओं से हस्तक्षेप द्वारा (यानी, मध्यजनस्तर और ectoderm), जो पैदा करना हो सकता है और/ विशिष्ट विभेद को बाधित करना । यदि SOX17+ कोशिकाओं का अनुपात दिन 4 (चरण 1b) पर ८०% से कम है, PDX1+ कोशिकाओं के लिए एक कुशल प्रेरण से समझौता होने की संभावना है ।

एचपीएससीज के अविभेदित राज्यों को कालोनियों अथवा संघनित प्रकोष्ठों के समुच्चय के रूप में रखा जाता है । हालांकि, विधियों कि कालोनियों या समुच्चय से भेदभाव शुरू विविधता से ग्रस्त हो सकता है, क्योंकि अलग सेल आसंजन और कॉलोनी में घनत्व, जैसे केंद्र और परिधि में22के रूप में, और क्योंकि कोशिकाओं में विभिंन चरणों में है सेल साइकिल25. दूसरी ओर, हमारी विधि वियोजित एकल कोशिकाओं के साथ शुरू होता है, जो हर एक कोशिका में एकल कोशिकाओं या कोशिका घनत्व के सेल आसंजन के एक अपेक्षाकृत समरूप राज्य में सक्षम बनाता है । प्रत्येक कोशिका के लिए समरूप हैंडलिंग के संदर्भ में, हमारे तरीकों से दूसरों की तुलना में आसान हो सकता है कि कॉलोनी या एकत्रीकरण संस्कृतियों के साथ शुरू करते हैं ।

हालांकि हमारे प्रोटोकॉल PDX1+ एकाधिक hpsc लाइनों से कोशिकाओं को प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, भेदभाव अभी भी अक्षम हो सकता है । ऐसे मामलों में, एचपीएससी लाइनों के बीच बोने के बाद आसंजन राज्य के अधिकार में अंतर कारण हो सकता है, और बोने की सघनता का संशोधन एक समाधान३३हो सकता है । वास्तव में, चित्रा 3 पता चलता है कि अनुचित बोने की कोशिका घनत्व निश्चित अन्तः और PDX1+ कोशिकाओं में भेदभाव समझौता । दिलचस्प है, PDX1 के लिए इष्टतम सेल घनत्व+ सेल प्रेरण सेल आबादी है कि 90% निश्चित endoderm > हासिल के बीच अलग था । अकुशल भेदभाव के लिए एक और संभावना अविभेदित hpscs, जो अविभेदित राज्य के लिए मार्कर की अभिव्यक्ति के बावजूद pluripotency की गुणवत्ता समझौता की खराब रखरखाव हालत है । इस मामले में, एचपीएससी विस्तार संस्कृति को उपयुक्त परिस्थितियों में एचपीएससीज को प्राप्त करने के लिए जल्दी से जमे हुए स्टाक या उप क्लोनिंग से पुन शुरू किया जाना चाहिए । 8 दिनों (स्टेज 2) या 11 (स्टेज 3) पर अकुशल भेदभाव के मामले में, इन चरणों की अवधि अनुकूलित किया जाना चाहिए । इस विचार का समर्थन, चरण 3 की अवधि बाद चरण सेल विशेषताओं को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण दिखाया गया है और कोशिका रेखा अग्नाशय वंश३४में निर्भर है ।

PDX1+ कोशिकाओं की पीढ़ी अग्नाशय कोशिकाओं के विट्रो पीढ़ी में के लिए महत्वपूर्ण है । PDX1 कार्यात्मक अग्नाशय के विकास के लिए आवश्यक है PDX1 अशक्त चूहों से ज्ञान पर आधारित है, जो३५है । लगातार, विट्रो में और vivo आरोपण अध्ययनों में hpsc-व्युत्पंन PDX1+ कोशिकाओं के सभी अग्नाशई घटकों में विकसित करने की क्षमता है पता चला है बहिःस्त्रावी और अंत: स्रावी कोशिकाओं सहित अग्नाशय β कोशिकाओं3,16 , ३६ , ३७. इस प्रकार, hPSCs से PDX1+ कोशिकाओं के कुशल उत्पादन मधुमेह और मानव अग्ंयाशय के विकास और अग्नाशय के रोगों की समझ के खिलाफ β कोशिका चिकित्सा की स्थापना के लिए एक स्थिर अग्नाशय के सेल की आपूर्ति की ओर जाता है ।

इस विधि की सीमाएँ द्वि-आयामी (2D) मोनोलेयर कल्चर फॉर्मेट से संबंधित हैं, जो कुछ सेल प्रकारों और सेल प्रोसेसिंग के लिए उपयुक्त नहीं है । हाल के वर्षों में, तीन आयामी (3 डी) संस्कृतियों परिपक्व कोशिकाओं और ऊतकों की पीढ़ी को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है, संभवतः vivo microenvironment में नकल उतार के कारण । उदाहरण के लिए, 3 डी संस्कृतियों में उत्पन्न β कोशिकाओं लेकिन 2 डी monolayer संस्कृतियों extracellular ग्लूकोज के स्तर३८के जवाब में इंसुलिन स्राते करने की क्षमता प्राप्त कर सकता है.

का उपयोग करने के लिए PDX1+ विकास बाद में सेल प्रकार की पीढ़ी के लिए कोशिकाओं, यह 3 डी संस्कृतियों, जैसे समुच्चय के निलंबन संस्कृतियों के लिए एक हवाई तरल इंटरफेस3 पर एक extracellular मैट्रिक्स और कुल संस्कृतियों में एंबेडेड के रूप में स्थानांतरित करने के लिए महत्वपूर्ण है , 16 , ३७. इसके अलावा, 2d monolayer संस्कृतियों निलंबन संस्कृतियों की तुलना में संवर्धन के लिए और अधिक सतह क्षेत्र की आवश्यकता है, scalability सीमित । वाणिज्यिक उपयोग के लिए कोशिकाओं की बड़ी मात्रा के प्रसंस्करण ऐसे microbeads के उपयोग के रूप में संशोधनों की आवश्यकता है । इसके साथ-साथ, वर्तमान पद्धति विभेद-उत्प्रेरण कारकों की स्क्रीनिंग तथा जीन अंतरण द्वारा आण्विक तंत्रों की खोज के लिए उपयुक्त है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम के हिस्से में वैज्ञानिक अनुसंधान के माध्यम से विज्ञान के संवर्धन के लिए जापान सोसायटी (JSPS) से धन द्वारा समर्थित किया गया था (सी) (JSPS KAKENHI अनुदान Number15K09385 और 18K08510) टीटी करने के लिए, और अनुदान में सहायता JSPS अनुसंधान अध्येताओं के लिए (JSPS KAKENHI अनुदान संख्या 17J07622) के लिए मुख़र्जी, और जापान एजेंसी चिकित्सा अनुसंधान और विकास के लिए (एमएड) अपने अनुसंधान अनुदान के माध्यम से "कोर केंद्र आईपीएस सेल रिसर्च के लिए, पुनर्योजी चिकित्सा की प्राप्ति के लिए अनुसंधान केंद्र नेटवर्क" K.O. करने के लिए लेखकों ने पांडुलिपि पढ़ने के लिए डॉ पीटर कर्गिआनस का शुक्रिया अदा की ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Keto-N-aminoethyl-N′-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine Toronto Research Chemicals K171000 CYC
4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic acid Santa Cruz Biotechnology SC-203303 TTNPB
50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes Thermo Fisher Scientific 339652
Anti-CDX2 antibody [EPR2764Y] Abcam Ab76541 Anti-CDX2, × 1/1000 dilution
B-27 Supplement (50 ×) Thermo Fisher Scientific 17504-044 Serum-free supplement
BD FACSAria II Cell Sorter BD Biosciences For flow cytometry
Biomedical freezer SANYO MDF-U538 For -30 °C storing
Cell Counting Slides for TC10/TC20 Cell Counter, Dual-Chamber BIO-RAD 1450011 Counting slide glass
CELL CULTURE MULTIWELL PLATE, 6 WELL, PS, CLEAR Greiner bio-one 657165 For differentiation culture/6-well plate
Centrifuge TOMY AX-310 For cell culturing
Centrifuge TOMY MX-305 For RT-qPCR
CHIR99021 Axon Medchem Axon 1386
CLEAN BENCH SHOWA KAGAKU  S-1601PRV Clean bench
Corning CellBIND 6-well plate Corning 3335 For feeder-free culture of hPSCs/6-well plate
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced Corning 354230 Basement membrane matrix
Corning Synthemax II-SC Substrate Corning 3535 For feeder-free culture of hPSCs/synthetic surface material for hPSCs
Cryostat Leica Leica CM1510 S For immunostaining of aggregates.
Cytofix/Cytoperm Kit Becton Dickinson 554714 Perm/Wash buffer is  Permeabilization/Wash buffer. Cytofix/Cytoperm buffer is fixation and permeabilization buffer.
Dako pen Dako S2002 For immunostaining of aggregates
dNTP mix (10 mM) Thermo Fisher Scientific 18427-088 For RT-qPCR
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A11055 Secondary antibody, × 1/500 dilution
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 Thermo Fisher Scientific A10036 Secondary antibody, × 1/500 dilution
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 Thermo Fisher Scientific A10040 Secondary antibody, × 1/500 dilution
Donkey Serum Merck Millipore S30 Donkey serum
D-PBS(-) without Ca or Mg Nacalai tesque 14249-95 DPBS
Essential 8 Medium Thermo Fisher Scientific A1517001 For feeder-free culture of hPSCs/hPSC maintenance medium
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap Corning 352235 5 mL round bottom polystyrene tube with cell strainer
Filter Tip, 1,000 µL Watoson 124-1000S Use together with pipettes
Filter Tip, 20 µL Watoson 124-P20S Use together with pipettes
Filter Tip, 200 µL Watoson 124-P200S Use together with pipettes
Fluorescence Microscope Keyence BZ-X700 For immunostaining
Forma Steri-Cycle CO2 incubator Thermo Fisher Scientific 370A Incubator
HNF-1β Antibody (C-20) Santa Cruz Biotechnology sc-7411 Anti-HNF1β, × 1/200 dilution
HNF-4α Antibody (H-171) Santa Cruz Biotechnology sc-8987 Anti-HNF4α, × 1/200 dilution
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H3570 For nucleus staining, × 1/200 dilution
Human Pancreas Total RNA Ambion AM7954 For RT-qPCR
Human PDX-1/IPF1 Antibody R&D Systems AF2419 Anti-PDX1, goat IgG, × 1/200 dilution
Human SOX17 Antibody R&D Systems AF1924 Anti-SOX17, × 1/200 dilution
Improved MEM Zinc Option medium Thermo Fisher Scientific 10373-017 iMEM
Incubation chamber Cosmo Bio 10DO For immunostaining of aggregates
Latex Examination Gloves Adachi
MAS coated slide glass Matsunami Glass 83-1881 For immunostaining of aggregates
MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific 4346907 For RT-qPCR
Microscope Olympus CKX41N-31PHP For cell culturing
Microtube Watoson 131-515CS
Monoclonal Anti-α-Fetoprotein SIGMA A8452 Anti-AFP, × 1/200 dilution
Nanodrop 8000 Thermo Fisher Scientific For RT-qPCR
Oligo dT FASMAC Custom made Oligo  For RT-qPCR of sequence is "TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT"
Paraformaldehyde, powder Nacalai tesque 26126-54 PFA, fixative, diluted in DPBS
Pharmaceutical refrigerator SANYO MPR-514 For 4 °C storing
PIPETMAN P  GILSON Pipette
Recombinant Human KGF/FGF-7 R&D Systems 251-KG KGF
Recombinant Human Noggin PeproTech 120-10C NOGGIN
Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A R&D Systems 338-AC Activin A
ReverTra Ace (100 U/μL) TOYOBO TRT-101 For RT-qPCR
RNase-free DNase Set (50) QIAGEN 79254 For RT-qPCR
RNeasy Mini Kit QIAGEN 74104 For RT-qPCR
RPMI 1640 with L-Gln Nacalai tesque 30264-85 RPMI 1640
Sealing Film for Real Time Takara NJ500 For RT-qPCR
Serological pipettes 10 mL Costar/Corning 4488 For cell culturing
Serological pipettes 25 mL Costar/Corning 4489 For cell culturing
Serological pipettes 5 mL Costar/Corning 4487 For cell culturing
Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAb Cell signaling 3579S Anti-SOX2, × 1/200 dilution
StepOnePlus Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific For RT-qPCR
Sucrose Nacalai tesque 30406-25 For immunostaining of aggregates
TB Green
Premix Ex Taq II 		 Takara RR820B For RT-qPCR
TC20 Automated Cell Counter BIO-RAD 1450101J1 Automatic cell counter
Tissue-Tek OCT compound 4583  Sakura Finetechnical 4583 For immunostaining of aggregates
Tissue-Tek Cryomold Molds/Adapters Sakura Finetechnical 4566 For immunostaining of aggregates
Triton X-100 Nacalai tesque 35501-15
Trypan Blue BIO-RAD 1450021
Ultracold freezer SANYO MDF-U33V For -80 °C storing
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher Scientific 15575-038 Dilute with DPBS to prepare 0.5 mM EDTA
Veriti Thermal Cycler Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific For RT-qPCR
Y-27632 Wako 251-00514

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References

  1. D'Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 24 (11), 1392-1401 (2006).
  2. Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
  3. Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
  4. Kondo, Y., Toyoda, T., Inagaki, N., Osafune, K. iPSC technology-based regenerative therapy for diabetes. Journal of Diabetes Investigation. 9 (2), 234-243 (2017).
  5. Millman, J. R., et al. Generation of stem cell-derived beta-cells from patients with type 1 diabetes. Nature Communications. 7, 11463 (2016).
  6. Zeng, H., et al. An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery. Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).
  7. Hosokawa, Y., et al. Insulin-producing cells derived from 'induced pluripotent stem cells' of patients with fulminant type 1 diabetes: Vulnerability to cytokine insults and increased expression of apoptosis-related genes. Journal of Diabetes Investigation. , (2017).
  8. Jennings, R. E., et al. Development of the human pancreas from foregut to endocrine commitment. Diabetes. 62 (10), 3514-3522 (2013).
  9. Jorgensen, M. C., et al. An illustrated review of early pancreas development in the mouse. Endocrine Reviews. 28 (6), 685-705 (2007).
  10. Jensen, J. Gene regulatory factors in pancreatic development. Developmental Dynamics. 229 (1), 176-200 (2004).
  11. Hald, J., et al. Generation and characterization of Ptf1a antiserum and localization of Ptf1a in relation to Nkx6.1 and Pdx1 during the earliest stages of mouse pancreas development. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (6), 587-595 (2008).
  12. Villasenor, A., Chong, D. C., Henkemeyer, M., Cleaver, O. Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis. Development. 137 (24), 4295-4305 (2010).
  13. Serup, P., et al. The homeodomain protein IPF-1/STF-1 is expressed in a subset of islet cells and promotes rat insulin 1 gene expression dependent on an intact E1 helix-loop-helix factor binding site. Biochemical Journal. 310 (Pt 3), 997-1003 (1995).
  14. Riedel, M. J., et al. Immunohistochemical characterisation of cells co-producing insulin and glucagon in the developing human pancreas. Diabetologia. 55 (2), 372-381 (2012).
  15. Mae, S. I., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 4, 1367 (2013).
  16. Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
  17. Toyoda, T., et al. Rho-Associated Kinases and Non-muscle Myosin IIs Inhibit the Differentiation of Human iPSCs to Pancreatic Endoderm. Stem Cell Reports. 9 (2), 419-428 (2017).
  18. Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D., Robey, P. G. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14 (1), 13-26 (2014).
  19. Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
  20. Nguyen, Q. H., et al. Single-cell RNA-seq of human induced pluripotent stem cells reveals cellular heterogeneity and cell state transitions between subpopulations. Genome Research. 28 (7), 1053-1066 (2018).
  21. Narsinh, K. H., et al. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 121 (3), 1217-1221 (2011).
  22. Rosowski, K. A., Mertz, A. F., Norcross, S., Dufresne, E. R., Horsley, V. Edges of human embryonic stem cell colonies display distinct mechanical properties and differentiation potential. Scientific Reports. 5, 14218 (2015).
  23. Torres-Padilla, M. E., Chambers, I. Transcription factor heterogeneity in pluripotent stem cells: a stochastic advantage. Development. 141 (11), 2173-2181 (2014).
  24. Cahan, P., Daley, G. Q. Origins and implications of pluripotent stem cell variability and heterogeneity. Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 14 (6), 357-368 (2013).
  25. Chetty, S., et al. A simple tool to improve pluripotent stem cell differentiation. Nature Methods. 10 (6), 553-556 (2013).
  26. Kimura, A., et al. Small molecule AT7867 proliferates PDX1-expressing pancreatic progenitor cells derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 24, 61-68 (2017).
  27. Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (91), e52010 (2014).
  28. Honvo-Houeto, E., Truchet, S. Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland. Journal of Visualized Experiments. (106), (2015).
  29. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  30. Kajiwara, M., et al. Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 109 (31), 12538-12543 (2012).
  31. Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
  32. Suemori, H., et al. Efficient establishment of human embryonic stem cell lines and long-term maintenance with stable karyotype by enzymatic bulk passage. Biochemical and Biophysical Research Communication. 345 (3), 926-932 (2006).
  33. Gage, B. K., Webber, T. D., Kieffer, T. J. Initial cell seeding density influences pancreatic endocrine development during in vitro differentiation of human embryonic stem cells. PLoS One. 8 (12), e82076 (2013).
  34. Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
  35. Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice. Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).
  36. Kelly, O. G., et al. Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 29 (8), 750-756 (2011).
  37. Hohwieler, M., et al. Human pluripotent stem cell-derived acinar/ductal organoids generate human pancreas upon orthotopic transplantation and allow disease modelling. Gut. 66 (3), 473-486 (2017).
  38. Takeuchi, H., Nakatsuji, N., Suemori, H. Endodermal differentiation of human pluripotent stem cells to insulin-producing cells in 3D culture. Scientific Reports. 4, 4488 (2014).

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विकास जीव विज्ञान मुद्दा १४५ अग्ंयाशय मानव भ्रूणीय स्टेम सेल मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल मानव pluripotent स्टेम सेल भेदभाव विकास अग्नाशय के जनक पीछे foregut पुनर्योजी चिकित्सा मधुमेह
अग्ंयाशय के कुशल पीढ़ी/ग्रहणी Homeobox प्रोटीन 1<sup>+</sup> पश् चवर्ती अग्रगुट/अग्ंयाशय आसंजन संस्कृतियों में hPSCs से Progenitors
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Toyoda, T., Kimura, A., Tanaka, H.,… More

Toyoda, T., Kimura, A., Tanaka, H., Osafune, K. Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures. J. Vis. Exp. (145), e57641, doi:10.3791/57641 (2019).

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