Summary
Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para diferenciar as células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) em proteína de pâncreas/duodeno homeobox 1+ (PDX1+) células para a geração de linhagens pancreáticas baseiam no crescimento não-colônia tipo monocamada de dissociou células únicas. Este método é adequado para produzir células hPSC-derivado homogêneas, a manipulação genética e rastreio.
Abstract
Células-tronco pluripotentes humanas (hPSC)-derivadas de células pancreáticas são uma fonte promissora de célula para medicina regenerativa e uma plataforma para estudar processos de desenvolvimento humanos. Dirigido por diferenciação que recapitula a processos de desenvolvimento é uma das principais maneiras de gerar células pancreáticas, incluindo a proteína de pâncreas/duodeno homeobox 1+ (PDX1+) células progenitoras pancreáticas. Protocolos convencionais iniciem a diferenciação com pequenas colônias logo após a passagem. No entanto, no estado de colônias ou agregados, as células são propensas a heterogeneidades, que podem dificultar a diferenciação para PDX1+ células. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para diferenciar hPSCs em PDX1+ células. O protocolo consiste em quatro etapas e inicia a diferenciação por semeadura de células únicas dissociadas. A indução de SOX17+ células da endoderme definitivo foi seguido pela expressão de marcadores de tubo dois instintos primitivos, HNF1β e HNF4α e eventual diferenciação em PDX1+ células. O presente protocolo proporciona fácil manuseio e pode melhorar e estabilizar a eficiência de diferenciação de algumas linhas de hPSC que anteriormente foram encontrados para diferenciar de forma ineficiente em linhagens endodermal ou PDX1+ células.
Introduction
O pâncreas é constituído principalmente por células endócrinas e exócrinas, e sua disfunção ou sobrecarga causa várias doenças, como a pancreatite, diabetes e câncer pancreático. Para elucidar a patogenia da pancreatopathy, é necessário analisar o processo de desenvolvimento e função das células do pâncreas. Além disso, um fornecimento estável de celular com qualidade robusta é necessária para estabelecer a terapia de suplementação de célula/tecido. Células-tronco pluripotentes humanas (hPSC)-derivadas de células pancreáticas são uma promissora fonte de células para esses fins, e o protocolo de diferenciação para células pancreáticas tem sido intensamente estudado1,2,3, 4. Avanços recentes na geração in vitro de células β pancreáticas imitam a geração das células β adulto humano e estas células mostrar efeito terapêutico sobre implante em diabético modelo ratos2,3. Além disso, a análise das células β, gerados a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) de saudável e tipo 1 diabetes pacientes doadores revelou sem diferenças funcionais, incluindo quando sob estresse5. Além disso, fenótipos de doença foram parcialmente reproduzidos em células pancreáticas induzidas com paciente-derivado iPSCs ou hPSCs, abrigando mutações genéticas no mesmo site que o pacientes6,7.
Para gerar células pancreáticas de hPSCs, é usada gradual diferenciação direcionada que recapitula a processos de desenvolvimento. O pâncreas é derivado da camada endoderme do embrião precoce, que expressa o sexo-determinando a região Y-caixa 17 (SOX17) e forkhead caixa A2 (FOXA2)8. Baseada em estudos de rato, a camada de endodermal forma tubo do intestino primitivo, que é marcado pela expressão do fator nuclear de hepatócito 1-beta (Hnf1β) e fator nuclear de hepatócito 4-alfa (Hnf4α). O tubo do intestino primitivo alonga e desenvolve-se o aparelho respiratório, aparelho digestivo e órgãos. Após o alongamento, a área posterior foregut torna-se região pancreática presuntiva, marcada pela expressão da proteína fator transcricional pâncreas/duodeno homeobox 1 (PDX1)8,9,10. As partes dorsais e ventrais do PDX1+ intestino tubo engrossar para pancreático botões de formulário, que são marcados pela expressão co de pâncreas transcrição fator 1 subunidade alfa (PTF1A) e NK6 homeobox 1 (NKX6.1)8,11. Esta expressão marca o início morfológico de organogênese do pâncreas. As células da endoderme do pâncreas, que são componentes dos brotos pancreáticos, formar uma rede tubular ramificada de estruturas epiteliais12 e eventualmente se diferenciar em células endócrinas e exócrinas, incluindo β-células secretoras de insulina e α-células secretoras de glucagon. Expressão de PDX1 é detectado primeiro na região do pâncreas presuntiva, que então é observada ao longo de todo o desenvolvimento do pâncreas e mostra a localização de células β - e δ9,13,14. Embora o Pdx1+ área de células que expressam não Ptf1a ou Nkx6.1 diferencia em antro gástrico, duodeno, biliar extra-hepática e algumas células intestinais em meio à fase tardia do desenvolvimento em ratos9, PDX1+ as células são consideradas os progenitores do pâncreas a fase inicial do desenvolvimento em seres humanos.
Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para diferenciar hPSCs em PDX1+ células para a geração de linhagens no pâncreas. A protocolo inicia diferenciação por semeadura dissociou células únicas15,16,17. Geralmente, hPSCs indiferenciadas são mantidas como colônias ou agregados de células em suspensão ou na adesão. Como resultado, a maioria dos protocolos iniciar a diferenciação logo após a passagem. No entanto, no estado de colônias ou agregados, as células são propensas a heterogeneidades espaciais e transcriptional18,19,20,21,22, que podem dificultar o primeiro passo de diferenciação para a endoderme definitivo seguido de diferenciação ineficiente para PDX1+ células. O presente protocolo pode oferecer fácil manuseio para melhorar e estabilizar a eficiência de diferenciação de algumas linhas de hPSC que anteriormente foram encontradas para diferenciar de forma ineficiente de endodermal linhagens e PDX1+ as células23, 24 , 25.
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Protocol
Experimentos utilizando hPSCs foram aprovados pelo Comitê de ética do departamento de medicina e pós-graduação faculdade de medicina, Universidade de Kyoto.
1. preparação de materiais
Nota: Prepare todas as mídias e os reagentes para cultura de células em um ambiente estéril. Aquecer a base de meios de cultura à temperatura ambiente (RT) antes do uso. Médio para diferenciação é usada dentro de 6 h em RT. detalhes dos reagentes estão listados na Tabela de materiais.
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Diferenciação (figura 1A)
- Médio de 1A fase: transferência de meio RPMI 1640 em um tubo com uma pipeta. Adicione o suplemento isento de soro, União A, CHIR99021 e Y-27632 a uma concentração de 1 x, 100 ng/mL, 3 μM e 10 μM, respectivamente.
- Médio de estágio 1B: transferir meio RPMI 1640 em um tubo com uma pipeta. Adicione o suplemento isento de soro, A de União e CHIR99021 a uma concentração de 1 x, 100 ng/mL, ≤ 1 μM, respectivamente.
Nota: A concentração de CHIR99021 deve ser menor do que no meio da 1A fase e além disso não é necessário, mas aumenta o número de células. - Médio de fase 2: meio de transferência melhorada MEM (iMEM) em um tubo com uma pipeta. Adicione o suplemento isento de soro e fator de crescimento de queratinócitos (KGF) a uma concentração de 0,5 x e 50 ng/mL, respectivamente.
- Médio de fase 3: transferência iMEM médio em um tubo com uma pipeta. Adicionar o suplemento isento de soro, KGF, NOGGIN, 3-ceto-N-aminoetil-N'- aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine (CYC) e ácido 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic (TTNPB), com uma pipeta para concentrações de 0,5 x 50 ng/mL, 100 ng/mL, 0,5 μM e 10 nM, respectivamente.
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Citometria de fluxo (FCM)
- tampão de permeabilização/lavagem 1X: transferência de água em um tubo por uma pipeta. Adicione tampão de permeabilização/lavagem por uma pipeta para uma concentração de 1 x.
- FCM obstrui a solução: 1x tampão de permeabilização/lavagem de transferência em um tubo por uma pipeta. Adicione soro de burro por uma pipeta para uma concentração de 2% (vol/vol).
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Immunostaining
- Solução de bloqueio: Phosphate-Buffered salina (DPBS de transferência Dulbecco) em um tubo por uma pipeta. Adicione soro de burro e Triton X com uma pipeta para concentrações de 5% (vol/vol) e 0,4% (vol/vol), respectivamente.
2. hPSC diferenciação para Posterior Foregut pancreático/células progenitoras (PDX1 células de+ )
Nota: Realizar todos os procedimentos usando técnicas estéreis. hPSCs são mantidas em placas de 6-poços revestidas por um material sintético de superfície para hPSCs com o hPSC meio de manutenção de acordo com instruções17,26 as indicações do fabricante. Quando células alcançar confluência de 50 a 80% (fase 0) usá-los para diferenciação.
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Prepare a membrana basal placas revestidas de matriz.
- Transferência de 6 mL de RPMI 1640 (4 °C) em um tubo de refrigeração a 4 °C no gelo. Adicione 2 mg de matriz da membrana basal (4 °C) com pontas de pipeta-mL 1 refrigeração e misture bem pipetando suave para fazer matriz de membrana basal de 0,33 mg/mL.
- 2 mL de matriz diluídos membrana basal de transferência a cada poço das placas de cultura de célula 6-poços por uma pipeta. Coloca as placas a 37 °C por 60-90 min em uma incubadora. Depois disso, mantenha as placas RT até uso (dentro de 3 h).
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Semente do hPSCs e iniciar a diferenciação a endoderme definitivo (1A fase).
- Aspire o meio usado e adicionar 2 mL de ácido etilenodiaminotetracético de 0,5 mM (EDTA) (RT) por alvéolo com uma pipeta para lavar o hPSCs cultivadas nas placas de 6-poços.
- Aspirar 0,5 mM EDTA e adicionar 2 mL de 0,5 mM EDTA por alvéolo com uma pipeta. Incube as placas a 37 °C por 5 min.
- Aspirar 0,5 mM EDTA e adicione 1 mL de meio de manutenção do hPSC no RT suplementado com 10 μM Y-27632 por bem com uma pipeta. Pipete suavemente, mas rapidamente para explodir fora anexadas células nas placas e para dissociar as células agrupadas em células únicas. Não bolhas a suspensão de eritrócitos durante a pipetagem.
- A suspensão de células em um tubo de centrífuga de 50 mL contendo 4 mL de meio de manutenção hPSC em RT suplementado com 10 μM de transferência Y-27632. Pipete suavemente a suspensão de eritrócitos.
- Conte o número de células na suspensão de célula usando o procedimento de exclusão de mancha azul Trypan.
- Mix 15 μL da suspensão de células e 15 μL de Trypan azul em um tubo.
- Transferência de 10 μL da suspensão celular diluída com Trypan azul para célula contando slides em duplicado por uma pipeta de 10 μL.
- Contar a célula número com um contador automático de células e calcular a densidade de células na suspensão de célula. Viabilidade é geralmente > 98%.
- Alíquota da suspensão de células em um tubo de centrífuga de 50 mL em 1-1.5 x 106 células por poço de placas boas 6 (1-1,5 x 105 células/cm2).
- Centrifugar o tubo de 50 mL a 200 x g em RT por 5 min.
- Aspirar o sobrenadante com uma pipeta e ressuspender as células com 1 mL de meio de 1A fase (RT) por poço. Delicadamente, pipetar a suspensão de células e adicionar outro 1 mL de meio de 1A fase (total, 2 mL por bem).
- Aspire a matriz diluídos da membrana basal dos poços das placas de cultura de células preparadas na etapa 2.1.2 por uma pipeta μL 1.000. Imediatamente para a próxima etapa.
- Delicadamente, pipete a suspensão de eritrócitos na etapa 2.2.8 novamente. Imediatamente após a mistura, transferi a suspensão de eritrócitos (2 mL) em cada poço de uma placa de 6. Cubra o prato com uma folha de alumínio para proteger a placa de luz. Coloque a placa no banco limpo no RT para 10-15 min.
Nota: Não mova a placa após a semeadura. - Delicadamente, coloque a placa em 37 °C, 5% CO2 incubadora (ambiente umidificado) e cultura por 24 h.
Nota: Não agite a placa após a semeadura.
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Induzi a diferenciação em definitivo endoderme (estágio 1B).
- Aspire o meio usado e adicionar 2 mL de DPBS nos poços com uma pipeta. Repita a aspiração e a adição de DPBS uma vez.
Nota: Para remover as células mortas a monocamada, agite suavemente a placa antes de cada aspiração. - Aspirar o DPBS usado por uma pipeta e adicionar 4 mL de meio de fase 1B (37 °C) por poço. Delicadamente, coloque a placa na incubadora 37 °C (umidificada atmosfera de 5% CO2) e cultura por 48 h.
- Aspire o meio usado e adicionar 2 mL de DPBS ao poço com uma pipeta. Repita a aspiração e a adição de DPBS uma vez.
Nota: Remova as células mortas a monocamada por agitação suave antes de cada aspiração. - Aspirar o DPBS usado por pipeta e adicionar 4 mL de meio de fase 1B (37 °C) por poço. Delicadamente, coloque a placa na incubadora (37 °C, umidificada atmosfera de 5% CO2) e cultura por 24 h.
- Aspire o meio usado e adicionar 2 mL de DPBS nos poços com uma pipeta. Repita a aspiração e a adição de DPBS uma vez.
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Induzi a diferenciação dentro do tubo do intestino primitivo (fase 2).
- Aspire o meio usado e adicionar 2 mL de DPBS ao poço com uma pipeta.
Nota: Remova as células mortas a monocamada por agitação suave antes de cada aspiração. - Aspirar o DPBS usado por pipeta e adicionar 4 mL de meio de fase 2 (37 °C) por poço. Coloque a placa na incubadora (37 °C, umidificada atmosfera de 5% CO2) e cultura por 4 dias.
- Aspire o meio usado e adicionar 2 mL de DPBS ao poço com uma pipeta.
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Induzir a diferenciação em PDX1+ células (fase 3).
- Aspire o meio usado e adicionar 2 mL de DPBS ao poço com uma pipeta. Repita a aspiração e a adição de DPBS uma vez.
- Aspirar o DPBS usado por pipeta e adicionar 4 mL de meio de fase 3 (37 °C) por poço. Coloque a placa na incubadora (37 °C, umidificada atmosfera de 5% CO2) e cultura por 3 dias.
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Induzi a diferenciação em células endócrinas no pâncreas.
- Realize a indução de célula NKX6.1+ (estágio 4, por 8 dias) seguida por indução de células endócrinas (estágio 5, por 12 dias) com protocolos descrito anteriormente3,16,26. Caracterizar e validar a diferenciação de células endócrinas por imunocoloração e análise de (qRT-PCR) reação em cadeia de polimerase transcrição reversa em tempo real quantitativa.
Nota: Consulte Toyoda et al16 e Kimura et al26 para obter procedimentos detalhados experimentais. Consulte a tabela 1 para sequências da primeira demão, usadas para análise de qRT-PCR.
- Realize a indução de célula NKX6.1+ (estágio 4, por 8 dias) seguida por indução de células endócrinas (estágio 5, por 12 dias) com protocolos descrito anteriormente3,16,26. Caracterizar e validar a diferenciação de células endócrinas por imunocoloração e análise de (qRT-PCR) reação em cadeia de polimerase transcrição reversa em tempo real quantitativa.
3. fluxo Cytometry (FCM)
- Aspire o meio usado e adicionar 2 mL de 0.5 mM EDTA para o poço com uma pipeta. Repita a aspiração e a adição de 0,5 mM EDTA uma vez.
Nota: Agite a placa suavemente para remover as células mortas das células monocamadas antes de cada aspiração. - Para dissociar as células (aproximadamente 3-6 × 106 células por poço), adicionar 2 mL de 0,25% Trypsin contendo 0,5 mM EDTA por bem. Incube as placas a 37 °C por 5-10 min.
- Pipetar suavemente mas rapidamente para dissociar as células agrupadas em células únicas. Não bolhas a suspensão de eritrócitos durante a pipetagem.
- 8-10 ml de meio base (RPMI 1640 ou iMEM, RT) contendo 0,5 x suplemento isento de soro e 10 μM Y-27632 por bem e misturar a suspensão de eritrócitos. Transferi a suspensão de células para um tubo de centrifugação.
- Centrifugar o tubo a 300 x g em RT por 5 min.
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células com 2 mL de EDTA (RT) de 0,5 mM. Pipete suavemente a suspensão de eritrócitos.
- Centrifugar o tubo a 300 x g em RT por 5 min.
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células com 100 μL de tampão de fixação e permeabilização por 106 células sob um capuz. Pipete suavemente a suspensão de células sob um capuz. Mantenha o tubo no RT por 30 min.
- Centrifugar o tubo a 400 x g em RT por 5 min.
- Aspirar o sobrenadante sob um capuz e ressuspender as células com solução de bloqueio FCM 500 μL por 106 células. Pipete suavemente a suspensão de eritrócitos. Mantenha o tubo no RT por 30 min.
- Transferi 50 µ l de suspensão de células para um tubo (aproximadamente 1 x 105 células). Centrifugar o tubo a 400 x g em RT 5 min. Retire o sobrenadante e ressuspender as células com 100 μL do anticorpo primário diluído (ver Tabela de materiais) na FCM obstrui a solução e incubar a 4 °C para > 16 h.
- Centrifugar o tubo a 400 x g em RT por 5 min. Retire o sobrenadante e ressuspender as células com 180 μL de tampão de Perm/lavagem 1X.
- Centrifugar o tubo a 400 x g em RT 5 min. Retire o sobrenadante e ressuspender as células com 100 μL do anticorpo secundário diluído (ver Tabela de materiais) na FCM obstrui a solução. Incube as celulas em RT por 60 min ou a 4 °C para > 16 h com proteção da luz.
- Centrifugar o tubo a 400 x g em RT por 5 min. Retire o sobrenadante e ressuspender as células com 180 μL de tampão de Perm/lavagem 1X.
- Centrifugar o tubo a 400 x g em RT 5 min. Retire o sobrenadante e ressuspender as células com 180 μL de 2% de soro de burro em DPBS.
- Filtre a suspensão celular transferindo um 5 ml redonda poliestireno tubo inferior com um filtro de célula (35 µm de malha de nylon) e manter a 4 °C com proteção de luz até a análise.
- Analise uma proporção de células coradas positivamente por um citômetro de fluxo27.
4. imunocoloração
- Aspire o meio usado e adicionar 2 mL de DPBS ao poço com uma pipeta. Repita a aspiração e a adição de DPBS uma vez.
Nota: Agite suavemente a placa para remover as células mortas das células monocamadas antes de cada aspiração. - Adicionar 2 mL de paraformaldeído 4% (PFA) (4 °C) por alvéolo com uma pipeta sob um capuz. Manter a placa a 4 °C por 20 min.
- Remova o PFA com uma pipeta sob um capuz. Adicione 2 mL de DPBS no RT para o poço com uma pipeta sob um capuz. Repita a aspiração e a adição de DPBS uma vez.
- Adicionar 2 mL da solução de bloqueio por bem e manter a placa na RT por 30 min.
- Aspirar a solução usada e adicionar 1 mL de anticorpo primário (veja a Tabela de materiais) em solução por alvéolo de bloqueio. Incubar em RT por 60 min ou a 4 °C para > 16 h.
- Aspire da solução, adicione 2 mL de DPBS contendo 0,4% Triton X-100 e incubar a RT por 10 min. repetir a aspiração, a adição de solução e incubação de uma vez.
- Aspirar a solução usada e adicionar 1 mL de anticorpo secundário (consulte a Tabela de materiais) em solução por alvéolo de bloqueio. Incube a RT por 60 min com proteção da luz.
- Aspire da solução, adicione 2 mL de DPBS contendo 0,4% Triton X-100 (RT) e incube a RT por 5 min com proteção da luz. Repita a aspiração, a adição de solução e incubação duas vezes.
- Leve micrografias de examinar a eficácia de diferenciação sob um microscópio de fluorescência28.
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Representative Results
HiPSCs propagação (585A129,30) são condensados e formar uma monocamada homogênea (figura 1B) que é adequada para diferenciação. HiPSCs indiferenciados (fase 0) são dissociadas e re-semeados como células únicas, a densidade celular baixa (1-1,5 x 105 células/cm2). Dentro de 1 h, as células estão conectadas à placa e começarem a mostrar a protrusão. No dia 1, as células são proliferaram e bem distribuídas para cobrir 80-90% da área da superfície. Durante a fase 1B, a mídia aparece turva devido a células mortas. A remoção de células mortas é fundamental para a diferenciação altamente eficiente desde células mortas prováveis perturbam a sobrevivência e a diferenciação das células deitada por baixo. Nos dias 3-4, as células formam uma folha de monocamada homogêneo que pode ser descrita como uma aparência de paralelepípedos. Neste ponto, a maioria das células parar expressando sexo-determinando a região Y-caixa 2 (SOX2), um marcador para células indiferenciadas e em vez disso, expressam um marcador definitivo endoderme, SOX17, em mais de 90% (Figura 2A e B). SOX17 maioria das células de+ FOXA2 expresso (Figura 2A). Começando a diferenciação com um compromissos de densidade celular inadequada a eficiência de diferenciação neste passo (Figura 3). Em estágios 2 e 3, morte celular relaxa, e o meio usado não é tão limpo como no estágio 1B. Células expressam marcadores de tubo o instinto primitivo HNF1β e HNF4α (Figura 2) e, eventualmente, expressar um marcador de progenitor foregut posterior/pancreático, PDX1, em mais de 90% (Figura 2D e E). O PDX1+ indução de célula é reproduzível em outra linha de hiPSC, 1231A3 31e uma linha de hESC, KhES-3 32 (Figura 4). qRT-PCR resultados da expressão do mRNA dos marcadores de fase foram consistentes com immunostaining (Figura 5A). A expressão de RNAm de PDX1 é evidente no estágio 3 e aumenta substancialmente o posfácio.
PDX1+ células em estágios iniciais de desenvolvimento têm o potencial de se diferenciar em células não só no pâncreas, mas também o antro gástrico, duodeno, biliar extra-hepática e uma parte do intestino 9. O potencial de diferenciação de in-vitro gerado PDX1+ células às células do pâncreas podem ser avaliadas pela cultura estendida com protocolos relatados por endoderme do pâncreas e glândula endócrina do pâncreas células3,16, 26. as expressões de um marcador pancreático endoderme, NKX6.1e dois marcadores endócrinas do pâncreas, insulinae GLUCAGON, observaram-se nos dias 19 (etapa 4) e 31 (etapa 5), respectivamente (Figura 5).
Figura 1: aparência representativa de células com diferenciação gradual. (A), A esquema de diferenciação dirigida de hPSCs para linhagens do pâncreas. Os números entre parênteses indicam concentrações (unidades são escritas abaixo). (B) micrografias de campo brilhante representante do hiPSCs em etapas-chave da cultura diferenciação. 585A1 hiPSCs foram dissociadas como células únicas e induzidas a se diferenciar em definitivo endoderme, instinto primitivo tubo e progenitoras pancreáticas/foregut posterior. Os painéis inferiores são vistas alargadas dos painéis superiores. RPMI, RPMI 1640; AA, União um (ng/mL); CH, CHIR99021 (ΜM); KGF (ng/mL); NOG, NOGGIN (ng/mL); CYC, 3-Keto-N-aminoethyl-N'-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine (μM); TTNPB, ácido 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic (nM). Escala de barras = 300 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: indução representativa em direção do pâncreas linhagens de hiPSCs. (A), a proporção de SOX2–SOX17+ células analisadas por citometria de fluxo antes de diferenciação (fase 0) e no dia 4 (fase 1B). Indiferenciado hiPSCs (SOX2+SOX17–) eram diferenciadas em definitivo endoderme (SOX2–SOX17+). SOX17 maioria das células de+ FOXA2 co expressa. (B) micrografias de imunofluorescência representativo no dia 4 (fase 1B). As células fixas foram coradas por SOX17 (verde), SOX2 (vermelho) e núcleos (azul). (C) micrografias de imunofluorescência representativa nos dias 4 (fase 1B) e 8 (fase 2). As células fixas foram coradas por HNF1β (verde), HNF4α (vermelho) e núcleos (azuis). (D) a proporção de células positivas para PDX1, como analisados por citometria de fluxo nos dias 4 (fase 1B) e 11 (fase 3). (E) micrografias de imunofluorescência representativa de PDX1 (verde) e núcleos (azuis) no dia 11 (fase 3). Barras de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: indução representativa em direção a endoderme definitiva iniciada de densidades de célula diferente. (A) micrografias de campo brilhante representante de 1h após a diferenciação de células. hiPSCs foram dissociadas como células únicas e induzidas a se diferenciar em definitivo endoderme em densidades diferentes células (1-50 x 104/cm2). Os painéis inferiores são vistas alargadas dos painéis superiores. (B) a proporção de SOX2–SOX17+ células analisadas por citometria de fluxo antes de diferenciação (fase 0) e no dia 4 (fase 1B). (C) a proporção de PDX1+ células analisadas por citometria de fluxo, nos dias 8 (fase 2) e 11 (fase 3). Escala de barras = 300 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Indução representativa para PDX1+ células em hiPCSs e hESCs. Uma linha de hiPSC, 1231A3 (A), e uma linha hESC, KhES-3 (B), foram diferenciados para definitivo endoderme e PDX1+ células. A composição da célula foi analisada por citometria de fluxo. A proporção de SOX2–SOX17+ células foi analisado antes de diferenciação (fase 0) e no dia 4 (fase 1B). A proporção de PDX1+ células foi analisado nos dias 8 (fase 2) e 11 (fase 3). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: indução representativa em direção a endoderme do pâncreas e células endócrinas. hiPSCs (585A1) eram diferenciadas para PDX1+ células. As células foram mais diferenciadas em endoderme do pâncreas e células endócrinas no pâncreas com protocolos relatada de16,3,26. (A) mRNA expressões dos marcadores de fase foram medidos pela reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa (qRT-PCR). Os dados foram normalizados para expressão de GAPDH e apresentados como a dobra-mudança na expressão gênica em relação ao valor de pico. Observe que a expressão PDX1 foi elevada a > 20-fold de dias 8 (fase 2) para 11 (fase 3) e no > 100 vezes de dias 11 (fase 3) a 19 (estágio 4). A expressão no pâncreas humano adulto é mostrada como Panc. SOX2, preto; SOX17, roxo; HNF1β, marrom; Α HNF4, laranja; PDX1, luz verde; NKX6.1, verde; Insulina, azul; GLUCAGON, vermelho. (B) micrografias de imunofluorescência representativo de um marcador pancreático endoderme, NKX6.1 (vermelho), nos dias 11 (fase 3) e 19 (estágio 4). PDX1 (verde) e núcleos (azuis) foram co manchados. (C) representante imunofluorescência micrografias de duas fabricantes de endócrinas do pâncreas, insulina (INS, verde) e glucagon (GCG, vermelho), nos dias 19 (etapa 4) e 31 (etapa 5). Núcleos (azul) foram co manchados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Nome do gene | Símbolo do gene | Cartilha para a frente | Primeira demão reversa |
| gliceraldeído-3-phospha desidrogenase de te |
GAPDH | GAAGGTGAAGGTCGGAGTC | GAAGATGGTGATGGGATTTC |
| SRY-caixa 2 | SOX2 | AGTCTCCAAGCGACGAAAAA | TTTCACGTTTGCAACTGTCC |
| SRY-caixa 17 | SOX17 | CGCACGGAATTTGAACAGTA | TTAGCTCCTCCAGGAAGTGTG |
| Homeobox HNF1 B | HNF1Β | CCTCTCCTCCAAACAAGCTG | TGTTGCCATGGTGACTGATT |
| Alfa do fator nuclear 4 hepatócito | HNF4Α | GAGCTGCAGATCGATGACAA | TACTGGCGGTCGTTGATGTA |
| pancreática e duodenal homeobox 1 | PDX1 | AGCAGTGCAAGAGTCCCTGT | CACAGCCTCTACCTCGGAAC |
| NK6 homeobox 1 | NKX6.1 | ATTCGTTGGGGATGACAGAG | TGGGATCCAGAGGCTTATTG |
| glucagon | GCG | GAATTCATTGCTTGGCTGGT | CGGCCAAGTTCTTCAACAAT |
| insulina | INS | CTACCTAGTGTGCGGGGAAC | GCTGGTAGAGGGAGCAGATG |
Tabela 1: Primers para qPCR.
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Discussion
A geração de PDX1+ células é composto de várias etapas; Portanto, é fundamental para tratar as células no momento oportuno. Entre as medidas, a eficiência de indução da endoderme definitivo em grande parte, afeta a eficiência de indução final, possivelmente por interferência de outras contaminantes linhagem células (ou seja, mesoderme e ectoderme), que podem proliferar e/ou secretam fatores que interromper a diferenciação específica. Se a proporção de SOX17+ células é inferior a 80% no dia 4 (fase 1B), uma indução eficiente para PDX1+ células é susceptível de ser comprometida.
Indiferenciadas Estados de hPSCs são mantidos como colônias ou agregados de células compactadas. No entanto, métodos que iniciam a diferenciação das colônias ou agregados podem sofrer de heterogeneidade, por causa da aderência de célula diferente e densidade na colônia, tal como no centro e periferia22, e porque as células estão em diferentes fases de o ciclo celular25. Por outro lado, o nosso método começa com células únicas dissociadas, que permite a um Estado relativamente homogêneo de adesão celular de células únicas ou densidade celular em cada célula. Em termos de manipulação homogênea para cada célula, nossos métodos podem ser mais fácil do que outros que começam com culturas de colônia ou agregação.
Embora nosso protocolo pode ser usado para induzir PDX1+ células de várias linhas de hPSC, a diferenciação pode ser ineficiente. Em tais casos, as diferenças no estado de adesão logo após semeadura entre as linhas do hPSC poderiam ser a causa, e modificação da densidade semeadura poderia ser uma solução33. Com efeito, a Figura 3 mostra que inapropriado semeadura densidade compromissos diferenciação celular em definitivo endoderme e PDX1+ células. Curiosamente, a densidade celular ideal para PDX1+ indução de célula foi diferente entre as populações de células que alcançado > endoderme definitivo de 90%. Outra possibilidade para diferenciação ineficiente é a condição de manutenção pobre do hPSCs indiferenciadas, o que compromete a qualidade de pluripotência apesar da expressão de marcadores para o estado indiferenciado. Neste caso, a cultura de expansão hPSC deve ser recomeçada da passagem antecipada congelado estoques ou sub clonagem deve ser executado para obter hPSCs em condições adequadas. No caso de diferenciação ineficiente nos dias 8 (fase 2) ou 11 (fase 3), a duração dessas etapas deve ser otimizada. Apoiar esta ideia, a duração da fase 3 mostrou-se crítico para a aquisição de características de célula de fase posteriores e é célula linha dependente na linhagem do pâncreas34.
A geração de PDX1+ células é crucial para a geração in vitro de células do pâncreas. PDX1 é funcionalmente essencial para o desenvolvimento do pâncreas com base no conhecimento dos ratos nulos Pdx1, que são apancreatic35. Consistentemente, estudos in vitro e in vivo de implantação mostraram PDX1 hPSC-derivado+ células têm o potencial para desenvolver em todos os componentes do pâncreas, incluindo exócrinas e endócrinas células tais como β do pâncreas células3,16 , 36 , 37. assim, a geração eficiente de PDX1+ células de hPSCs leva a um fornecimento estável de células do pâncreas para o estabelecimento de terapia com células β contra a diabetes e a compreensão do desenvolvimento do pâncreas humano e doenças do pâncreas.
As limitações deste método estão relacionadas com o formato de cultura bidimensional (2D) monocamada, que não é adequado para alguns tipos de células e processamento de célula. Nos últimos anos, culturas de (3D) tridimensionais foram mostradas para promover a geração de células maduras e tecidos, possivelmente devido a imitar o microambiente in vivo. Por exemplo, células β gerado em culturas 3D mas culturas monocamada 2D não podem atingir a capacidade de secretar insulina em resposta aos níveis de glicose extracelular38.
Para usar o PDX1+ as células para a geração de desenvolvimento posteriores tipos de células, é importante a mudança para 3D culturas, tais como culturas de suspensão dos agregados incorporados em uma matriz extracelular e culturas agregadas em um ar-líquido de interface3 , 16 , 37. Além disso, culturas monocamada 2D exigem mais área de superfície para cultivo de culturas de suspensão, limitar a escalabilidade. O processamento de grandes quantidades de células para uso comercial requer modificações tais como o uso de microbeads. Ao mesmo tempo, o presente método é adequado para o rastreio de factores de diferenciação de indução e a exploração dos mecanismos moleculares por transferência de genes.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado em parte pelo financiamento da sociedade do Japão para a promoção da ciência (JSPS) através de Scientific Research (C) (JSPS KAKENHI Grant Number15K09385 e 18 K 08510) T.T., e subsídio para JSPS bolsistas de pesquisa (número de concessão KAKENHI de JSPS 17J07622) AK, e a agência de Japão para pesquisa médica e desenvolvimento (AMED) através da sua pesquisa conceder "Núcleo centro para pesquisa de células, a rede de centro de pesquisa para realização de medicina regenerativa de iPS" a K.O. Os autores agradecer Dr. Peter Karagiannis por ler o manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Keto-N-aminoethyl-N′-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine | Toronto Research Chemicals | K171000 | CYC |
| 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic acid | Santa Cruz Biotechnology | SC-203303 | TTNPB |
| 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
| Anti-CDX2 antibody [EPR2764Y] | Abcam | Ab76541 | Anti-CDX2, × 1/1000 dilution |
| B-27 Supplement (50 ×) | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | Serum-free supplement |
| BD FACSAria II Cell Sorter | BD Biosciences | For flow cytometry | |
| Biomedical freezer | SANYO | MDF-U538 | For -30 °C storing |
| Cell Counting Slides for TC10/TC20 Cell Counter, Dual-Chamber | BIO-RAD | 1450011 | Counting slide glass |
| CELL CULTURE MULTIWELL PLATE, 6 WELL, PS, CLEAR | Greiner bio-one | 657165 | For differentiation culture/6-well plate |
| Centrifuge | TOMY | AX-310 | For cell culturing |
| Centrifuge | TOMY | MX-305 | For RT-qPCR |
| CHIR99021 | Axon Medchem | Axon 1386 | |
| CLEAN BENCH | SHOWA KAGAKU | S-1601PRV | Clean bench |
| Corning CellBIND 6-well plate | Corning | 3335 | For feeder-free culture of hPSCs/6-well plate |
| Corning Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | Basement membrane matrix |
| Corning Synthemax II-SC Substrate | Corning | 3535 | For feeder-free culture of hPSCs/synthetic surface material for hPSCs |
| Cryostat | Leica | Leica CM1510 S | For immunostaining of aggregates. |
| Cytofix/Cytoperm Kit | Becton Dickinson | 554714 | Perm/Wash buffer is Permeabilization/Wash buffer. Cytofix/Cytoperm buffer is fixation and permeabilization buffer. |
| Dako pen | Dako | S2002 | For immunostaining of aggregates |
| dNTP mix (10 mM) | Thermo Fisher Scientific | 18427-088 | For RT-qPCR |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11055 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10036 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10040 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey Serum | Merck Millipore | S30 | Donkey serum |
| D-PBS(-) without Ca or Mg | Nacalai tesque | 14249-95 | DPBS |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | For feeder-free culture of hPSCs/hPSC maintenance medium |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | 5 mL round bottom polystyrene tube with cell strainer |
| Filter Tip, 1,000 µL | Watoson | 124-1000S | Use together with pipettes |
| Filter Tip, 20 µL | Watoson | 124-P20S | Use together with pipettes |
| Filter Tip, 200 µL | Watoson | 124-P200S | Use together with pipettes |
| Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X700 | For immunostaining |
| Forma Steri-Cycle CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 370A | Incubator |
| HNF-1β Antibody (C-20) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7411 | Anti-HNF1β, × 1/200 dilution |
| HNF-4α Antibody (H-171) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8987 | Anti-HNF4α, × 1/200 dilution |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | For nucleus staining, × 1/200 dilution |
| Human Pancreas Total RNA | Ambion | AM7954 | For RT-qPCR |
| Human PDX-1/IPF1 Antibody | R&D Systems | AF2419 | Anti-PDX1, goat IgG, × 1/200 dilution |
| Human SOX17 Antibody | R&D Systems | AF1924 | Anti-SOX17, × 1/200 dilution |
| Improved MEM Zinc Option medium | Thermo Fisher Scientific | 10373-017 | iMEM |
| Incubation chamber | Cosmo Bio | 10DO | For immunostaining of aggregates |
| Latex Examination Gloves | Adachi | ||
| MAS coated slide glass | Matsunami Glass | 83-1881 | For immunostaining of aggregates |
| MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | 4346907 | For RT-qPCR |
| Microscope | Olympus | CKX41N-31PHP | For cell culturing |
| Microtube | Watoson | 131-515CS | |
| Monoclonal Anti-α-Fetoprotein | SIGMA | A8452 | Anti-AFP, × 1/200 dilution |
| Nanodrop 8000 | Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Oligo dT | FASMAC | Custom made Oligo | For RT-qPCR of sequence is "TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT" |
| Paraformaldehyde, powder | Nacalai tesque | 26126-54 | PFA, fixative, diluted in DPBS |
| Pharmaceutical refrigerator | SANYO | MPR-514 | For 4 °C storing |
| PIPETMAN P | GILSON | Pipette | |
| Recombinant Human KGF/FGF-7 | R&D Systems | 251-KG | KGF |
| Recombinant Human Noggin | PeproTech | 120-10C | NOGGIN |
| Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A | R&D Systems | 338-AC | Activin A |
| ReverTra Ace (100 U/μL) | TOYOBO | TRT-101 | For RT-qPCR |
| RNase-free DNase Set (50) | QIAGEN | 79254 | For RT-qPCR |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | For RT-qPCR |
| RPMI 1640 with L-Gln | Nacalai tesque | 30264-85 | RPMI 1640 |
| Sealing Film for Real Time | Takara | NJ500 | For RT-qPCR |
| Serological pipettes 10 mL | Costar/Corning | 4488 | For cell culturing |
| Serological pipettes 25 mL | Costar/Corning | 4489 | For cell culturing |
| Serological pipettes 5 mL | Costar/Corning | 4487 | For cell culturing |
| Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAb | Cell signaling | 3579S | Anti-SOX2, × 1/200 dilution |
| StepOnePlus | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Sucrose | Nacalai tesque | 30406-25 | For immunostaining of aggregates |
| TB Green Premix Ex Taq II |
Takara | RR820B | For RT-qPCR |
| TC20 Automated Cell Counter | BIO-RAD | 1450101J1 | Automatic cell counter |
| Tissue-Tek OCT compound 4583 | Sakura Finetechnical | 4583 | For immunostaining of aggregates |
| Tissue-Tek Cryomold Molds/Adapters | Sakura Finetechnical | 4566 | For immunostaining of aggregates |
| Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| Trypan Blue | BIO-RAD | 1450021 | |
| Ultracold freezer | SANYO | MDF-U33V | For -80 °C storing |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | Dilute with DPBS to prepare 0.5 mM EDTA |
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Y-27632 | Wako | 251-00514 |
References
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