Summary
Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för att skilja mänskliga pluripotenta stamceller (hPSCs) i bukspottkörteln/tolvfingertarmen homeobox protein 1+ (PDX1+) celler för generering av bukspottskörteln härstamningar baserat på icke-koloni typ enskiktslager tillväxten av dissocierade enstaka celler. Denna metod är lämplig för att producera homogen hPSC-derived celler, genmanipulation och screening.
Abstract
Mänskliga pluripotenta stamceller (hPSC)-härledda bukspottkörtelns celler är en lovande cell källa för regenerativ medicin och en plattform att studera mänskliga utvecklingsprocesser. Stegvis riktas differentiering som recapitulates utvecklingsprocesser är ett av de viktigaste sätten att generera bukspottkörtelns celler inklusive bukspottkörteln/tolvfingertarmen homeobox protein 1+ (PDX1+) bukspottskörteln stamceller. Konventionella protokoll initiera differentiering med små kolonier strax efter passage. Dock i tillståndet i kolonier eller aggregat, celler är benägna att heterogeneitiesna, vilket kan hämma differentieringen till PDX1+ celler. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för att skilja hPSCs in PDX1+ celler. Protokollet består av fyra steg och initierar differentieringen av sådd dissocierade enstaka celler. Induktion av SOX17+ slutgiltiga endoderm celler följdes av uttrycket av två primitiva gut tube markörer, HNF1β och HNF4α och eventuell differentiering in PDX1+ celler. Detta protokoll ger enkel hantering och kan förbättra och stabilisera differentiering effektiviteten i vissa hPSC linjer som tidigare hittades differentieras ineffektivt till endodermal härstamningar eller PDX1+ celler.
Introduction
Bukspottkörteln består huvudsakligen av exokrina och endokrina celler, och dess dysfunktion eller överbelastning orsakar flera sjukdomar, såsom pankreatit, diabetes och cancer i bukspottskörteln. För att belysa pathogeny av pancreatopathy, är det nödvändigt att analysera den utvecklingsprocess och funktion av bukspottkörtelns celler. Dessutom krävs en stabil cell leverans med robust kvalitet att upprätta cell/vävnad tillskott terapi. Mänskliga pluripotenta stamceller (hPSC)-härledda bukspottkörtelns celler är en lovande cell källa för dessa ändamål, och protokollet differentiering mot bukspottkörtelns celler har varit intensivt studerade1,2,3, 4. Senaste framstegen inom in vitro-produktion av pankreas β-celler härma generationen av β-celler i vuxen människa, och dessa celler Visa terapeutisk effekt vid implantering i diabetiker modell möss2,3. Dessutom visade analysen av β-celler som genereras från de inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) av friska och typ 1 diabetes patienten givare inga funktionella skillnader inklusive när under stress5. Dessutom har sjukdomen fenotyper återgivits delvis i inducerade bukspottkörtelns celler med patientderiverade iPSCs eller hPSCs härbärgerat genetiska mutationer i samma plats som patienter6,7.
För att generera bukspottkörtelns celler från hPSCs, används stegvis riktad differentiering som recapitulates utvecklingsprocesser. Bukspottkörteln härleds från endoderm lagret av det tidiga embryot, som uttrycker kön bestämma region Y-box 17 (SOX17) och forkhead box A2 (FOXA2)8. Baserat på studier som mus, bildar endodermal lagret primitiva gut röret, som präglas av uttrycket av hepatocyte nukleär faktor 1-beta (Hnf1β) och hepatocyte nukleär faktor 4-alpha (Hnf4α). Primitiva gut röret förlänger och utvecklas till den respiratoriska apparater, mag-tarmkanalen och organ. Efter töjning, blir området bakre framtarmen presumtiv bukspottskörteln regionen, som märkt av uttrycket av transkriptionell faktor bukspottkörteln/tolvfingertarmen homeobox protein 1 (PDX1)8,9,10. De dorsala och ventrala delarna av PDX1+ gut tube tjockna till formuläret bukspottskörteln knoppar, som är märkta med samtidig uttryck för bukspottkörteln transkription faktorn 1 subenhet alpha (PTF1A) och NK6 homeobox 1 (NKX6.1)8,11. Detta uttryck inleds morfologiska bukspottskörteln organogenesen. Bukspottskörteln endoderm celler, vilka är komponenterna i bukspottskörteln knopparna, bildar en förgrenad tubulär nätverk av epiteliala strukturer12 och så småningom differentieras till exokrina och endokrina celler, inklusive insulin-utsöndrar β-celler och glukagon utsöndrar α-cellerna. Uttryck för PDX1 upptäcks först vid presumtiva bukspottskörteln regionen, som är sedan firas under hela bukspottskörteln utveckling, och visar lokalisering till β - och δ-celler9,13,14. Även om Pdx1+ cellområde som inte uttrycker Ptf1a eller Nkx6.1 gör åtskillnad mellan in i den gastric antrum, tolvfingertarmen, extrahepatiska gallvägar och vissa intestinala celler på mitten till sent skede av utveckling i möss9, PDX1+ celler anses föräldraparets i bukspottkörteln på tidiga utvecklingsstadiet hos människor.
Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för att skilja hPSCs in PDX1+ celler för generering av bukspottskörteln härstamningar. Protokoll initierar differentieringen av sådd separerade enstaka celler15,16,17. I allmänhet hanteras odifferentierade hPSCs som kolonier eller cell aggregat i suspension eller vidhäftning. Som ett resultat, initiera de flesta protokoll differentiering strax efter passaging. Dock i tillståndet i kolonier eller aggregat, celler är benägna att rumsliga och transkriptionell heterogeneitiesna18,19,20,21,22, som kan hindra den första differentiering steg mot slutgiltiga endoderm följt av ineffektiva differentiering till PDX1+ celler. Detta protokoll kan erbjuda enkel hantering för att förbättra och stabilisera differentiering effektiviteten av vissa hPSC linjer som fanns tidigare för att skilja ineffektivt endodermal härstamningar och PDX1+ celler23, 24 , 25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Experiment med hPSCs godkändes av den etiska kommittén vid institutionen för medicin och Graduate School of Medicine, Kyoto University.
1. beredning av material
Obs: Förbereda alla media och reagenser för cellodling i en steril miljö. Värm upp bas kultur media till rumstemperatur (RT) före användning. Medium för differentiering används inom 6 h på RT. Detaljer av reagenser listas i Tabell för material.
-
Differentiering (figur 1A)
- Steg 1A medium: överföra RPMI 1640 medium i ett rör med pipett. Tillsätt serumfritt tillägg, activin A, CHIR99021 och Y-27632 till en koncentration av 1 x, 100 ng/mL, 3 μM och 10 μM, respektive.
- Etapp 1B medium: överföra RPMI 1640 medium i ett rör med pipett. Lägg till serumfritt tillägget, activin A och CHIR99021 till en koncentration av 1 x, 100 ng/mL, ≤1 μM, respektive.
Obs: Koncentrationen av CHIR99021 bör vara lägre än i etapp 1A medium, och dessutom är inte nödvändigt, men det ökar antalet cell. - Etapp 2 medium: överföring förbättrat MEM (iMEM) medium i ett rör med pipett. Tillsätt serumfritt tillägg och keratinocyter tillväxtfaktor (KGF) till en koncentration av 0,5 x och 50 ng/mL, respektive.
- Etapp 3 medium: överföring iMEM medium i ett rör med pipett. Lägg till serumfritt tillägget, KGF, skalle, 3-Keto-N-aminoethyl-N'- aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine (CYC) och 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic syra (TTNPB) med pipett till koncentrationer av 0,5 x, 50 ng/mL, 100 ng/mL, 0,5 μM och 10 nM, respektive.
-
Flödescytometri (FCM)
- 1 x permeabilisering-och/eller tvättbuffert: överföra vatten i ett rör med en pipett. Lägga till permeabilisering-och/eller tvättbuffert med en pipett till en koncentration av 1 x.
- FCM blockerar lösning: överför 1 x permeabilisering-och/eller tvättbuffert i ett rör med en pipett. Lägga till donkey serum med en pipett till en koncentration på 2% (vol/vol).
-
Immunfärgning
- Blockerar lösning: överföring Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) i ett rör med en pipett. Lägga till donkey serum och Triton X med pipett för koncentrationer av 5% (vol/vol) och 0,4% (vol/vol), respektive.
2. hPSC differentiering till bakre framtarmen celler/pankreas stamfäder (PDX1+ celler)
Obs: Genomföra alla förfaranden med steril teknik. hPSCs bibehålls på 6 brunnar belagd med ett syntetiskt ytmaterial för hPSCs med hPSC underhåll medium enligt tillverkarens instruktioner17,26. När celler nå 50-80% konfluens (Stadium 0) använda dem för differentiering.
-
Förbereda basalmembranet matrix-belagda plattor.
- Överföring 6 mL RPMI 1640 (4 °C) i ett rör kylas till 4 °C på is. Tillsätt 2 mg av basalmembranet matris (4 °C) med vätskekylda 1 mL-pipettspetsar och blanda väl genom varsam pipettering för att göra 0,33 mg/mL basalmembranet matris.
- 2 mL utspädd basalmembranet matrix överföring till varje brunn 6-väl cell kultur plattor med en pipett. Placera plattorna vid 37 °C i 60-90 min i en inkubator. Efteråt, hålla plattorna på RT fram till användning (inom 3 h).
-
Utsäde av hPSCs och initiera differentiering till slutgiltig endoderm (Stadium 1A).
- Aspirera används medlet och tillsätt 2 mL av 0,5 mM etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA) (RT) per brunn med pipett att tvätta den hPSCs odlade i 6-väl tallrikar.
- Aspirera 0,5 mM EDTA och tillsätt 2 mL av 0,5 mM EDTA per brunn med pipett. Inkubera plattorna vid 37 °C i 5 min.
- Aspirera 0,5 mM EDTA och tillsätt 1 mL av hPSC underhåll medium på RT kompletteras med 10 μM Y-27632 per brunn med pipett. Pipettera försiktigt men snabbt för att blåsa av kopplade celler på plattorna och att separera klampade celler till enstaka celler. Inte bubbla cellsuspensionen under pipettering.
- Överföra cellsuspensionen i ett 50 mL centrifugrör som innehåller 4 mL hPSC underhåll medium på RT kompletteras med 10 μM Y-27632. Pipettera försiktigt cellsuspension.
- Räkna antalet cell i cellsuspension med Trypan blå fläck utslagning procedur.
- Mix 15 μl cellsuspension och 15 μL Trypan blå i ett rör.
- Överför 10 μL av cellsuspensionen utspädd med Trypan blå till cell räknar diabilder i duplikat av 10 μL pipett.
- Räkna cellen nummer med en automatisk cell räknare och beräkna cell densiteten i cellsuspension. Lönsamhet är oftast > 98%.
- Alikvot cellsuspensionen i ett 50 mL centrifugrör på 1-1,5 x 106 celler per brunn 6-väl plattor (1-1,5 x 105 celler/cm2).
- Centrifugera i 50 mL tub på 200 x g på RT i 5 min.
- Aspirera supernatanten med pipett och resuspendera cellerna med 1 mL etapp 1A medium (RT) per brunn. Försiktigt Pipettera cellsuspensionen och lägga till ytterligare 1 mL etapp 1A medium (totalt, 2 mL per brunn).
- Aspirera matrisen utspädda basalmembranet i brunnarna av cell kultur pläterar bereddes i steg 2.1.2 av 1000 μl pipett. Omedelbart gå vidare till nästa steg.
- Försiktigt Pipettera cellsuspensionen i steg 2.2.8 igen. Omedelbart efter blandning, överföra cellsuspensionen (2 mL) i varje brunn 6-bra platta. Täcka plattan med en aluminiumfolie att skydda plattan från ljus. Placera plattan i ren bänk på RT för 10-15 min.
Obs: Flytta inte plattan efter sådd. - Försiktigt placera plattan i en 37 °C, 5% CO2 inkubator (fuktad atmosfär) och kultur för 24 h.
Obs: Skaka inte plattan efter sådd.
-
Inducera differentiering in slutgiltiga endoderm (etapp 1B).
- Aspirera används medlet och tillsätt 2 mL av DPBS till brunnarna med pipett. Upprepa det aspiration och tillägg av DPBS en gång.
Obs: Ta bort alla döda celler från enskiktslager, skaka försiktigt plattan innan varje strävan. - Aspirera den används DPBS med en pipett och tillsätt 4 mL etapp 1B medium (37 °C) per brunn. Försiktigt placera plattan i 37 °C inkubator (fuktad atmosfär av 5% CO2) samt kultur för 48 h.
- Aspirera används medlet och tillsätt 2 mL av DPBS till brunnen med pipett. Upprepa det aspiration och tillägg av DPBS en gång.
Obs: Ta bort döda celler från enskiktslager genom mild omskakning före varje strävan. - Aspirera den används DPBS med pipett och tillsätt 4 mL etapp 1B medium (37 °C) per brunn. Försiktigt placera plattan i inkubator (37 °C, fuktad atmosfär av 5% CO2) samt kultur för 24 h.
- Aspirera används medlet och tillsätt 2 mL av DPBS till brunnarna med pipett. Upprepa det aspiration och tillägg av DPBS en gång.
-
Inducera differentieringen i primitiva gut röret (etapp 2).
- Aspirera används medlet och tillsätt 2 mL av DPBS till brunnen med pipett.
Obs: Ta bort döda celler från enskiktslager genom mild omskakning före varje strävan. - Aspirera den används DPBS med pipett och tillsätt 4 mL av etapp 2 medium (37 °C) per brunn. Placera plattan i inkubator (37 °C, fuktad atmosfär av 5% CO2) samt kultur i 4 dagar.
- Aspirera används medlet och tillsätt 2 mL av DPBS till brunnen med pipett.
-
Inducerar differentiering in PDX1+ celler (etapp 3).
- Aspirera används medlet och tillsätt 2 mL av DPBS till brunnen med pipett. Upprepa det aspiration och tillägg av DPBS en gång.
- Aspirera den används DPBS med pipett och tillsätt 4 mL av etapp 3 medium (37 °C) per brunn. Placera plattan i inkubator (37 °C, fuktad atmosfär av 5% CO2) samt kultur i 3 dagar.
-
Inducera differentieringen i bukspottkörtelns endokrina celler.
- Utföra NKX6.1+ cell induktion (etapp 4, 8 dagar) följt av endokrina cellen induktion (etapp 5, i 12 dagar) med tidigare beskrivna protokoll3,16,26. Karakterisera och validera den endokrina cell differentieringen av immunfärgning och kvantitativ realtids omvänd transkription polymeras-kedjereaktion (qRT-PCR) analys.
Obs: Hänvisa till Toyoda et al.16 och Kimura et al.26 för detaljerade experimentella procedurer. Se tabell 1 för primer sekvenser för qRT-PCR analys.
- Utföra NKX6.1+ cell induktion (etapp 4, 8 dagar) följt av endokrina cellen induktion (etapp 5, i 12 dagar) med tidigare beskrivna protokoll3,16,26. Karakterisera och validera den endokrina cell differentieringen av immunfärgning och kvantitativ realtids omvänd transkription polymeras-kedjereaktion (qRT-PCR) analys.
3. flödescytometri (FCM)
- Aspirera används medlet och tillsätt 2 mL av 0,5 mM EDTA till brunnen med pipett. Upprepa de aspiration och tillsats av 0,5 mM EDTA en gång.
Obs: Skaka plåten försiktigt för att ta bort alla döda celler från enskiktslager cellerna innan varje strävan. - Att separera celler (cirka 3-6 × 106 celler per brunn), tillsätt 2 mL av 0,25% Trypsin som innehåller 0,5 mM EDTA per brunn. Inkubera plattorna vid 37 °C i 5-10 min.
- Pipettera försiktigt men snabbt att dissociera klampade celler till enstaka celler. Inte bubbla cellsuspensionen under pipettering.
- Tillsätt 8-10 mL bas medium (RPMI 1640 eller iMEM, RT) som innehåller 0,5 x 10 μM och serumfritt tillägg Y-27632 per väl och blanda cellsuspension. Överföra cellsuspensionen i ett centrifugrör.
- Centrifugera röret vid 300 x g på RT i 5 min.
- Aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna med 2 mL 0,5 mM EDTA (RT). Pipettera försiktigt cellsuspension.
- Centrifugera röret vid 300 x g på RT i 5 min.
- Aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna med 100 μL av fixering och permeabilisering buffert per 106 celler under en huv. Pipettera försiktigt cellsuspensionen under en huv. Förvara tuben i RT i 30 min.
- Centrifugera röret vid 400 x g på RT i 5 min.
- Aspirera supernatanten under en huv och resuspendera cellerna med 500 μL FCM blockerar lösning per 106 celler. Pipettera försiktigt cellsuspension. Förvara tuben i RT i 30 min.
- Överför 50 μL cellsuspension till en tub (ca 1 x 105 celler). Centrifugera röret vid 400 x g vid RT för 5 min. ta bort supernatanten och återsuspendera cellerna med 100 μL av utspädda primär antikropp (se Tabell för material) i FCM blockering lösning och inkubera vid 4 °C för > 16 h.
- Centrifugera röret vid 400 x g vid RT för 5 min. avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna med 180 μL 1 x Perm/tvättbuffert.
- Centrifugera röret vid 400 x g vid RT för 5 min. ta bort supernatanten och återsuspendera cellerna med 100 μL av utspädda sekundär antikropp (se Tabell för material) i FCM blockerar lösning. Inkubera cellerna på RT i 60 min eller vid 4 °C för > 16 h med skydd från ljus.
- Centrifugera röret vid 400 x g vid RT för 5 min. avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna med 180 μL 1 x Perm/tvättbuffert.
- Centrifugera röret vid 400 x g vid RT för 5 min. ta bort supernatanten och återsuspendera cellerna med 180 μL av 2% åsna serum i DPBS.
- Filtrera cellsuspensionen genom att överföra på en 5 mL rund botten polystyren röret med en cell sil (35 µm nylon mesh) och hålla vid 4 °C med skydd från ljus tills analysen.
- Analysera en del av positivt färgade celler genom en flöde cytometer27.
4. immunfärgning
- Aspirera används medlet och tillsätt 2 mL av DPBS till brunnen med pipett. Upprepa det aspiration och tillägg av DPBS en gång.
Obs: Skaka försiktigt på plattan för att ta bort alla döda celler från enskiktslager cellerna innan varje strävan. - Tillsätt 2 mL 4% paraformaldehyd (PFA) (4 °C) per brunn med pipett under en huv. Hålla plattan vid 4 °C i 20 min.
- Ta bort PFA med pipett under en huv. Tillsätt 2 mL av DPBS på RT till brunnen med pipett under en huv. Upprepa det aspiration och tillägg av DPBS en gång.
- Tillsätt 2 mL av blockerande lösning per brunn och hålla plattan på RT i 30 min.
- Aspirera används lösningen och tillsätt 1 mL av primär antikropp (se Tabell för material) för att blockera lösning per brunn. Inkubera vid RT i 60 min eller vid 4 °C för > 16 h.
- Aspirera används lösningen, tillsätt 2 mL av DPBS som innehåller 0,4% Triton x-100 och inkubera vid RT i 10 min. Upprepa aspiration, tillägg av lösning och inkubation en gång.
- Aspirera används lösningen och tillsätt 1 mL av sekundär antikropp (se Tabell för material) för att blockera lösning per brunn. Inkubera vid RT för 60 min med skydd från ljus.
- Aspirera används lösningen, tillsätt 2 mL av DPBS som innehåller 0,4% Triton x-100 (RT) och inkubera vid RT i 5 min med skydd från ljus. Upprepa aspiration, tillägg av lösning och inkubation två gånger.
- Ta micrographs att undersöka differentiering effektivitet under en fluorescens Mikroskop28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Förökningsmaterial hiPSCs (585A129,30) kondenseras och bildar en homogen enskiktslager (figur 1B) som är lämplig för differentiering. Odifferentierade hiPSCs (Stadium 0) är separerade och åter seedade som enstaka celler vid lågt tätheter (1-1,5 x 105 celler/cm2). Inom 1 h, cellerna är kopplade till plattan och börja Visa utstick. Dag 1, är cellerna frodats och väl fördelad för att täcka 80-90% av ytan. Under etapp 1B visas media grumlig på grund av döda celler. Borttagning av döda celler är avgörande för effektiv differentiering eftersom döda celler sannolikt störa överlevnad och differentiering av celler liggande under. Dag 3-4, bilda celler en homogen enskiktslager blad som kan beskrivas som en kullersten utseende. Vid denna punkt, de flesta celler sluta uttrycka kön bestämma region Y-box 2 (SOX2), en markör för odifferentierade celler, och i stället uttrycka en slutgiltig endoderm markör, SOX17, på mer än 90% (figur 2A och B). De flesta SOX17+ celler express FOXA2 (figur 2A). Börjar differentieringen med en olämplig cell densiteten kompromisser differentiering effektiviteten i detta steg (figur 3). På steg 2 och 3, celldöd slappnar av och använt mediet är inte lika suddigt som i steg 1B. Celler uttrycker de primitiva gut tube markörerna HNF1β och HNF4α (figur 2 c) och så småningom uttrycka en bakre framtarmen/bukspottskörteln stamceller markör, PDX1, på mer än 90% (figur 2D och E). PDX1+ cell induktion kan återskapas i en annan hiPSC linje, 1231A3 31och en hESC linje, KhES-3 32 (figur 4). qRT-PCR-resultat av mRNA uttryckt av scenen markörer överensstämde med immunfärgning (figur 5A). MRNA uttryck för PDX1 är uppenbar vid etapp 3 och ökar väsentligen efterord.
PDX1+ celler i tidiga utvecklingsstadier har potential att differentieras till inte bara bukspottkörtelns celler men också gastric antrum, tolvfingertarmen, extrahepatiska gallvägar och en del av tarmen 9. Den differentiering potentialen av in vitro-genererade PDX1+ celler i bukspottskörteln celler kan bedömas genom utökade kultur med rapporterade protokoll för bukspottskörteln endoderm och pankreas endokrina celler3,16, 26. uttrycken för bukspottskörteln endoderm markör, NKX6.1och två pankreas endokrina markörer, INSULINoch GLUKAGON, observerades på dagar 19 (etapp 4) och 31 (steg 5), respektive (figur 5).
Figur 1: representativa utseendet på cellerna under stegvis differentiering. (A) A system av riktad differentiering från hPSCs till bukspottskörteln härstamningar. Siffrorna inom parentes anger koncentrationer (enheter skrivs nedan). (B) representativa ljusa fältet micrographs av hiPSCs på viktiga steg av differentiering kultur. 585A1 hiPSCs var separerade som enstaka celler och inducerad differentieras till slutgiltig endoderm, primitiva gut tube och bakre framtarmen/bukspottskörteln stamceller. De lägsta panelerna är utvidgade vyer av övre paneler. RPMI, RPMI 1640; AA, activin en (ng/mL); CH, CHIR99021 (ΜM). KGF (ng/mL); NOG, skalle (ng/mL); CYC, 3-Keto-N-aminoethyl-N'-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine (μM). TTNPB, 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic syra (nM). Skala barer = 300 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: representativa induktion mot pankreas härstamningar från hiPSCs. (A), andelen SOX2–SOX17+ celler analyseras med flödescytometri före differentiering (Stadium 0) och dag 4 (etapp 1B). Odifferentierade hiPSCs (SOX2+SOX17–) var differentieras efter slutgiltiga endoderm (SOX2–SOX17+). De flesta SOX17+ celler tillsammans uttryckt FOXA2. (B) representanten Immunofluorescerande micrographs dag 4 (etapp 1B). Fast cellerna var färgas för SOX17 (grön), SOX2 (röd) och atomkärnor (blå). (C) representanten Immunofluorescerande micrographs på dag 4 (etapp 1B) och 8 (etapp 2). Fast cellerna var färgas för HNF1β (grön), HNF4α (röd) och atomkärnor (blå). (D) andelen celler som är positivt för PDX1, som analyseras med flödescytometri på dag 4 (etapp 1B) och 11 (etapp 3). (E) representanten Immunofluorescerande micrographs PDX1 (grön) och atomkärnor (blå) på dag 11 (etapp 3). Skala barer = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: representativa induktion mot slutgiltiga endoderm initieras från annan cell tätheter. (A) representativa ljusa fältet micrographs av celler 1 h efter differentiering. hiPSCs var separerade som enstaka celler och inducerad differentieras till slutgiltig endoderm vid annan cell tätheter (1-50 x 104/cm2). De lägsta panelerna är utvidgade vyer av övre paneler. (B) andelen SOX2–SOX17+ celler analyseras med flödescytometri före differentiering (Stadium 0) och dag 4 (etapp 1B). (C), andelen PDX1+ celler analyseras med flödescytometri dag 8 (steg 2) och 11 (etapp 3). Skala barer = 300 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Representativa induktion mot PDX1+ celler i hiPCSs och hESCs. En hiPSC linje, 1231A3 (A), och en hESC linje, KhES-3 (B), var åtskild till slutgiltig endoderm och PDX1+ celler. Cell sammansättning analyserades av flödescytometri. Andelen SOX2–SOX17+ celler analyserades före differentiering (Stadium 0) och dag 4 (etapp 1B). Andelen PDX1+ celler analyserades dag 8 (steg 2) och 11 (etapp 3). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: representativa induktion mot pankreas endoderm och endokrina celler. hiPSCs (585A1) var differentieras efter PDX1+ celler. Cellerna var ytterligare differentieras efter bukspottskörteln endoderm och bukspottkörtelns endokrina celler med rapporterade protokoll3,16,26. (A) mRNA uttryck av scenen markörer mättes av kvantitativ realtids polymeras-kedjereaktion (qRT-PCR). Uppgifterna var normaliserade till GAPDH uttryck och presenteras som den-faldig förändringen i genuttryck i förhållande till det högsta värdet. Observera att PDX1 uttryck höjdes på > 20-fold från dagar 8 (etapp 2) till 11 (etapp 3) och på > 100-faldig från dagar 11 (etapp 3) till 19 (etapp 4). Uttrycket i vuxen mänskliga bukspottkörteln visas som Panc. SOX2, svart; SOX17, lila; HNF1β, brun; HNF4α, orange; PDX1, ljusgrön; NKX6.1, grön; INSULIN, blå; GLUKAGON, red. (B) representanten Immunofluorescerande micrographs av bukspottskörteln endoderm markör, NKX6.1 (röd), på dag 11 (etapp 3) och 19 (etapp 4). PDX1 (grön) och atomkärnor (blå) var samtidig betsad. (C) representanten Immunofluorescerande micrographs av två pankreas endokrina beslutsfattare, insulin (INS, grön) och glukagon (GCG, röd), på dag 19 (etapp 4) och 31 (steg 5). Atomkärnor (blå) var samtidig betsad. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Gen namn | Gen symbol | Forward primer | Reverse primer |
| glyceraldehyd-3-phospha te-dehydrogenas |
GAPDH | GAAGGTGAAGGTCGGAGTC | GAAGATGGTGATGGGATTTC |
| SRY-box 2 | SOX2 | AGTCTCCAAGCGACGAAAAA | TTTCACGTTTGCAACTGTCC |
| SRY-box 17 | SOX17 | CGCACGGAATTTGAACAGTA | TTAGCTCCTCCAGGAAGTGTG |
| HNF1 homeobox B | HNF1Β | CCTCTCCTCCAAACAAGCTG | TGTTGCCATGGTGACTGATT |
| hepatocyte nukleär faktor 4 alpha | HNF4Α | GAGCTGCAGATCGATGACAA | TACTGGCGGTCGTTGATGTA |
| pankreas och duodenal homeobox 1 | PDX1 | AGCAGTGCAAGAGTCCCTGT | CACAGCCTCTACCTCGGAAC |
| NK6 homeobox 1 | NKX6.1 | ATTCGTTGGGGATGACAGAG | TGGGATCCAGAGGCTTATTG |
| glukagon | GCG | GAATTCATTGCTTGGCTGGT | CGGCCAAGTTCTTCAACAAT |
| insulin | INS | CTACCTAGTGTGCGGGGAAC | GCTGGTAGAGGGAGCAGATG |
Tabell 1: Primers för qPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Generering av PDX1+ celler består av flera steg; Därför är det viktigt att behandla celler vid lämplig tidpunkt. Bland stegen, slutgiltiga endoderm induktion effektivitet i hög grad påverkar den slutliga induktion effektiviteten, möjligen av störningar från andra kontaminerande härstamning celler (dvs, mesoderm och ektoderm), som kan föröka sig eller utsöndrar faktorer som störa viss differentiering. Om andelen SOX17+ celler är lägre än 80% på dag 4 (etapp 1B), en effektiv induktion till PDX1+ celler är sannolikt att äventyras.
Odifferentierad påstår av hPSCs bibehålls som kolonier eller aggregat av kompakterade celler. Dock kan metoder som börjar differentieringen från kolonier eller aggregat lida av heterogenitet, på grund av olika celladhesion och täthet i kolonin, sådan som i centrum och periferi22, och eftersom cellerna är i olika skeden i i cellcykeln25. Däremot, börjar vår metod med dissocierade enstaka celler, som möjliggör en relativt homogen stat av celladhesion av enstaka celler eller cell densiteten i varje enskild cell. När det gäller homogena hantering för varje cell, kan våra metoder vara lättare än andra att börja med kolonin eller aggregering kulturer.
Även om våra protokoll kan användas för att inducera PDX1+ celler från flera hPSC rader, differentiering kan fortfarande vara ineffektiva. I sådana fall skillnader i vidhäftning staten direkt efter sådd bland de hPSC linjerna kan vara orsaken, och modifiering av sådd densiteten kan vara en lösning33. Faktiskt, figur 3 visar att olämpligt sådd cell densiteten kompromisser differentiering in slutgiltiga endoderm och PDX1+ celler. Intressant, optimal cell densiteten för PDX1+ cell induktion var annorlunda bland de cellpopulationer som uppnått > 90% slutgiltiga endoderm. En annan möjlighet för ineffektiva differentiering är dåligt underhåll villkora av den odifferentierade hPSCs, som äventyrar kvaliteten på pluripotency trots uttrycket av markörer för odifferentierade tillståndet. I det här fallet den hPSC expansion kulturen bör vara återupptog från tidig passage fryst lager eller sub kloning bör utföras för att få hPSCs under lämpliga förhållanden. När det gäller ineffektiv differentiering på dagar 8 (etapp 2) eller 11 (etapp 3), bör varaktigheten av dessa åtgärder optimeras. Stödja denna idé, varaktigheten av etapp 3 har visats kritisk för att förvärva senare skede cellernas egenskaper och är cell linje-beroende i bukspottskörteln härstamning34.
Generering av PDX1+ celler är avgörande för in vitro-produktion av bukspottkörtelns celler. PDX1 är funktionellt viktigt för bukspottskörteln utveckling som bygger på kunskap från Pdx1 null möss, som är apancreatic35. In vitro- och in vivo implantation studier visade konsekvent, hPSC-derived PDX1+ celler har potential att utvecklas till alla bukspottskörteln komponenter, inklusive exokrina och endokrina celler såsom pankreas β-celler3,16 , 36 , 37. sålunda effektiv generering av PDX1+ celler från hPSCs leder till en stabil bukspottskörteln cell leverans för inrättandet av β cellterapi mot diabetes och förståelsen av mänskliga bukspottkörteln utveckling och pankreassjukdomar.
Begränsningarna med denna metod är relaterade till formatet tvådimensionell (2D) enskiktslager kultur, som inte är lämplig för vissa typer av celler och cell bearbetning. Under de senaste åren, har tredimensionella (3D) kulturer visat sig främja generering av mogna celler och vävnader, möjligen på grund av härma den Invivo mikromiljö. Till exempel β-celler genereras i 3D kulturer men inte 2D enskiktslager kulturer kunde uppnå förmåga att utsöndra insulin svar på extracellulära glukos nivåer38.
För att använda PDX1+ celler för generering av utvecklingsmässigt senare celltyper, det är viktigt att skifta till 3D kulturer, såsom suspension kulturer av aggregat inbäddade i en extracellulär matrix och sammanlagt kulturer på ett luft-vätska gränssnitt3 , 16 , 37. Dessutom 2D enskiktslager kulturer kräver mer yta för odling än suspension kulturer, begränsar skalbarhet. Bearbetning av stora mängder celler för kommersiell användning kräver ändringar såsom användning av Mikrokulor. Samtidigt är denna metod lämplig för screening av differentiering-inducerande faktorer och utforskandet av molekylära mekanismer av genöverföring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds delvis av finansiering från Japan Society för främjande av vetenskap (JSPS) genom Scientific Research (C) (JSPS KAKENHI Grant Number15K09385 och 18 K 08510) till T.T. och bidrag för JSPS Research Fellows (JSPS KAKENHI-licensnummer 17J07622) Arvidsson, och Japan läkemedelsmyndigheten för medicinsk forskning och utveckling (AMED) genom dess forskning bevilja ”Core Center för iPS cellforskning, Research Center nätverk för förverkligandet av regenerativ medicin” till K.O. Författarna vill tacka Dr Peter Karagiannis för att läsa manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Keto-N-aminoethyl-N′-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine | Toronto Research Chemicals | K171000 | CYC |
| 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic acid | Santa Cruz Biotechnology | SC-203303 | TTNPB |
| 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
| Anti-CDX2 antibody [EPR2764Y] | Abcam | Ab76541 | Anti-CDX2, × 1/1000 dilution |
| B-27 Supplement (50 ×) | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | Serum-free supplement |
| BD FACSAria II Cell Sorter | BD Biosciences | For flow cytometry | |
| Biomedical freezer | SANYO | MDF-U538 | For -30 °C storing |
| Cell Counting Slides for TC10/TC20 Cell Counter, Dual-Chamber | BIO-RAD | 1450011 | Counting slide glass |
| CELL CULTURE MULTIWELL PLATE, 6 WELL, PS, CLEAR | Greiner bio-one | 657165 | For differentiation culture/6-well plate |
| Centrifuge | TOMY | AX-310 | For cell culturing |
| Centrifuge | TOMY | MX-305 | For RT-qPCR |
| CHIR99021 | Axon Medchem | Axon 1386 | |
| CLEAN BENCH | SHOWA KAGAKU | S-1601PRV | Clean bench |
| Corning CellBIND 6-well plate | Corning | 3335 | For feeder-free culture of hPSCs/6-well plate |
| Corning Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | Basement membrane matrix |
| Corning Synthemax II-SC Substrate | Corning | 3535 | For feeder-free culture of hPSCs/synthetic surface material for hPSCs |
| Cryostat | Leica | Leica CM1510 S | For immunostaining of aggregates. |
| Cytofix/Cytoperm Kit | Becton Dickinson | 554714 | Perm/Wash buffer is Permeabilization/Wash buffer. Cytofix/Cytoperm buffer is fixation and permeabilization buffer. |
| Dako pen | Dako | S2002 | For immunostaining of aggregates |
| dNTP mix (10 mM) | Thermo Fisher Scientific | 18427-088 | For RT-qPCR |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11055 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10036 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10040 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey Serum | Merck Millipore | S30 | Donkey serum |
| D-PBS(-) without Ca or Mg | Nacalai tesque | 14249-95 | DPBS |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | For feeder-free culture of hPSCs/hPSC maintenance medium |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | 5 mL round bottom polystyrene tube with cell strainer |
| Filter Tip, 1,000 µL | Watoson | 124-1000S | Use together with pipettes |
| Filter Tip, 20 µL | Watoson | 124-P20S | Use together with pipettes |
| Filter Tip, 200 µL | Watoson | 124-P200S | Use together with pipettes |
| Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X700 | For immunostaining |
| Forma Steri-Cycle CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 370A | Incubator |
| HNF-1β Antibody (C-20) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7411 | Anti-HNF1β, × 1/200 dilution |
| HNF-4α Antibody (H-171) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8987 | Anti-HNF4α, × 1/200 dilution |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | For nucleus staining, × 1/200 dilution |
| Human Pancreas Total RNA | Ambion | AM7954 | For RT-qPCR |
| Human PDX-1/IPF1 Antibody | R&D Systems | AF2419 | Anti-PDX1, goat IgG, × 1/200 dilution |
| Human SOX17 Antibody | R&D Systems | AF1924 | Anti-SOX17, × 1/200 dilution |
| Improved MEM Zinc Option medium | Thermo Fisher Scientific | 10373-017 | iMEM |
| Incubation chamber | Cosmo Bio | 10DO | For immunostaining of aggregates |
| Latex Examination Gloves | Adachi | ||
| MAS coated slide glass | Matsunami Glass | 83-1881 | For immunostaining of aggregates |
| MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | 4346907 | For RT-qPCR |
| Microscope | Olympus | CKX41N-31PHP | For cell culturing |
| Microtube | Watoson | 131-515CS | |
| Monoclonal Anti-α-Fetoprotein | SIGMA | A8452 | Anti-AFP, × 1/200 dilution |
| Nanodrop 8000 | Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Oligo dT | FASMAC | Custom made Oligo | For RT-qPCR of sequence is "TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT" |
| Paraformaldehyde, powder | Nacalai tesque | 26126-54 | PFA, fixative, diluted in DPBS |
| Pharmaceutical refrigerator | SANYO | MPR-514 | For 4 °C storing |
| PIPETMAN P | GILSON | Pipette | |
| Recombinant Human KGF/FGF-7 | R&D Systems | 251-KG | KGF |
| Recombinant Human Noggin | PeproTech | 120-10C | NOGGIN |
| Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A | R&D Systems | 338-AC | Activin A |
| ReverTra Ace (100 U/μL) | TOYOBO | TRT-101 | For RT-qPCR |
| RNase-free DNase Set (50) | QIAGEN | 79254 | For RT-qPCR |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | For RT-qPCR |
| RPMI 1640 with L-Gln | Nacalai tesque | 30264-85 | RPMI 1640 |
| Sealing Film for Real Time | Takara | NJ500 | For RT-qPCR |
| Serological pipettes 10 mL | Costar/Corning | 4488 | For cell culturing |
| Serological pipettes 25 mL | Costar/Corning | 4489 | For cell culturing |
| Serological pipettes 5 mL | Costar/Corning | 4487 | For cell culturing |
| Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAb | Cell signaling | 3579S | Anti-SOX2, × 1/200 dilution |
| StepOnePlus | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Sucrose | Nacalai tesque | 30406-25 | For immunostaining of aggregates |
| TB Green Premix Ex Taq II |
Takara | RR820B | For RT-qPCR |
| TC20 Automated Cell Counter | BIO-RAD | 1450101J1 | Automatic cell counter |
| Tissue-Tek OCT compound 4583 | Sakura Finetechnical | 4583 | For immunostaining of aggregates |
| Tissue-Tek Cryomold Molds/Adapters | Sakura Finetechnical | 4566 | For immunostaining of aggregates |
| Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| Trypan Blue | BIO-RAD | 1450021 | |
| Ultracold freezer | SANYO | MDF-U33V | For -80 °C storing |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | Dilute with DPBS to prepare 0.5 mM EDTA |
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Y-27632 | Wako | 251-00514 |
References
- D'Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 24 (11), 1392-1401 (2006).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
- Kondo, Y., Toyoda, T., Inagaki, N., Osafune, K. iPSC technology-based regenerative therapy for diabetes. Journal of Diabetes Investigation. 9 (2), 234-243 (2017).
- Millman, J. R., et al. Generation of stem cell-derived beta-cells from patients with type 1 diabetes. Nature Communications. 7, 11463 (2016).
- Zeng, H., et al. An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery. Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).
- Hosokawa, Y., et al. Insulin-producing cells derived from 'induced pluripotent stem cells' of patients with fulminant type 1 diabetes: Vulnerability to cytokine insults and increased expression of apoptosis-related genes. Journal of Diabetes Investigation. , (2017).
- Jennings, R. E., et al. Development of the human pancreas from foregut to endocrine commitment. Diabetes. 62 (10), 3514-3522 (2013).
- Jorgensen, M. C., et al. An illustrated review of early pancreas development in the mouse. Endocrine Reviews. 28 (6), 685-705 (2007).
- Jensen, J. Gene regulatory factors in pancreatic development. Developmental Dynamics. 229 (1), 176-200 (2004).
- Hald, J., et al. Generation and characterization of Ptf1a antiserum and localization of Ptf1a in relation to Nkx6.1 and Pdx1 during the earliest stages of mouse pancreas development. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (6), 587-595 (2008).
- Villasenor, A., Chong, D. C., Henkemeyer, M., Cleaver, O. Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis. Development. 137 (24), 4295-4305 (2010).
- Serup, P., et al. The homeodomain protein IPF-1/STF-1 is expressed in a subset of islet cells and promotes rat insulin 1 gene expression dependent on an intact E1 helix-loop-helix factor binding site. Biochemical Journal. 310 (Pt 3), 997-1003 (1995).
- Riedel, M. J., et al. Immunohistochemical characterisation of cells co-producing insulin and glucagon in the developing human pancreas. Diabetologia. 55 (2), 372-381 (2012).
- Mae, S. I., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 4, 1367 (2013).
- Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
- Toyoda, T., et al. Rho-Associated Kinases and Non-muscle Myosin IIs Inhibit the Differentiation of Human iPSCs to Pancreatic Endoderm. Stem Cell Reports. 9 (2), 419-428 (2017).
- Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D., Robey, P. G. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14 (1), 13-26 (2014).
- Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
- Nguyen, Q. H., et al. Single-cell RNA-seq of human induced pluripotent stem cells reveals cellular heterogeneity and cell state transitions between subpopulations. Genome Research. 28 (7), 1053-1066 (2018).
- Narsinh, K. H., et al. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 121 (3), 1217-1221 (2011).
- Rosowski, K. A., Mertz, A. F., Norcross, S., Dufresne, E. R., Horsley, V. Edges of human embryonic stem cell colonies display distinct mechanical properties and differentiation potential. Scientific Reports. 5, 14218 (2015).
- Torres-Padilla, M. E., Chambers, I. Transcription factor heterogeneity in pluripotent stem cells: a stochastic advantage. Development. 141 (11), 2173-2181 (2014).
- Cahan, P., Daley, G. Q. Origins and implications of pluripotent stem cell variability and heterogeneity. Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 14 (6), 357-368 (2013).
- Chetty, S., et al. A simple tool to improve pluripotent stem cell differentiation. Nature Methods. 10 (6), 553-556 (2013).
- Kimura, A., et al. Small molecule AT7867 proliferates PDX1-expressing pancreatic progenitor cells derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 24, 61-68 (2017).
- Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (91), e52010 (2014).
- Honvo-Houeto, E., Truchet, S. Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland. Journal of Visualized Experiments. (106), (2015).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Kajiwara, M., et al. Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 109 (31), 12538-12543 (2012).
- Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
- Suemori, H., et al. Efficient establishment of human embryonic stem cell lines and long-term maintenance with stable karyotype by enzymatic bulk passage. Biochemical and Biophysical Research Communication. 345 (3), 926-932 (2006).
- Gage, B. K., Webber, T. D., Kieffer, T. J. Initial cell seeding density influences pancreatic endocrine development during in vitro differentiation of human embryonic stem cells. PLoS One. 8 (12), e82076 (2013).
- Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
- Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice. Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).
- Kelly, O. G., et al. Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 29 (8), 750-756 (2011).
- Hohwieler, M., et al. Human pluripotent stem cell-derived acinar/ductal organoids generate human pancreas upon orthotopic transplantation and allow disease modelling. Gut. 66 (3), 473-486 (2017).
- Takeuchi, H., Nakatsuji, N., Suemori, H. Endodermal differentiation of human pluripotent stem cells to insulin-producing cells in 3D culture. Scientific Reports. 4, 4488 (2014).
