Summary
Molekylär avbildning med matrix-assisted laser desorption/jonisering-baserad avbildning masspektrometri (MALDI-IMS) tillåter samtidig kartläggning av flera analyter i biologiska prover. Här presenterar vi ett protokoll för att upptäcka och visualisering av amyloid β protein på hjärnans vävnader av Alzheimers sjukdom och cerebral amyloid angiopati prover med MALDI-IMS.
Abstract
Neuropatologi av Alzheimers sjukdom (AD) kännetecknas av ackumulation och aggregering av amyloid β (Aβ) peptider till extracellulära plack i hjärnan. Aβ peptiderna, bestående av 40 aminosyror, genereras från amyloid prekursor protein (APP) av β - och γ-secretases. Aβ sätts inte bara i cerebral parenkymet, men också i leptomeningeal och cerebral kärlväggarna, känd som cerebral amyloid angiopati (CAA). Medan en mängd Aβ peptider identifierades, detaljerad produktion och distribution av enskilda Aβ peptider i patologiska vävnader i AD och CAA har inte behandlats fullt ut. Här utvecklar vi ett protokoll för matrix-assisted laser desorption/jonisering-baserad imaging masspektrometri (MALDI-IMS) på mänskliga obduktion hjärnans vävnader att erhålla omfattande protein mappning. För detta ändamål erhölls mänskliga kortikala exemplar från Hjärnbanken vid Tokyo Metropolitan Institutet för gerontologi. Fryst kryosnitt skärs och överförs till indium-tin-oxid (ITO)-belagda glasskivor. Spectra förvärvas med hjälp av MALDI-systemet med en rumslig upplösning upp till 20 µm. Sinapinic syra (SA) är enhetligt deponerade i bilden med antingen en automatisk eller en manuell spruta. Nuvarande tekniska fördelar med MALDI-IMS, kan en typisk uppsättning data med olika Aβ arter inom samma avsnitt av mänskliga obducerade hjärnor erhållas utan särskilda sonder. Dessutom med hög upplösning (20 µm) avbildning av en AD hjärna och svår CAA prov visar tydligt att Aβ1-36 till Aβ1-41 var insatta på leptomeningeal fartyg, medan Aβ1-42 och Aβ1-43 sattes in i cerebral parenkymet som senila plack (SP). Det är möjligt att anta MALDI-IMS som en standardmetod i kombination med klinisk, genetisk och patologiska observationer i Förstå AD, CAA, patologi och andra neurologiska sjukdomar baserat på den nuvarande strategin.
Introduction
För att göra en diagnos och förstå patogenesen av neurodegenerativa sjukdomar, är exakt molekylär identifiering av patologiska insättningar väsentliga1. Under AD, Aβ produceras för att göra SPs i cerebral parenkymet och deponeras i fartyg långt innan sjukdomen debut2,3,4,5,6. Aβ1-42 är den dominerande peptiden i SP av hjärnor med AD, andra Aβ varianter, till exempel N-terminal eller C-terminal förkortas eller modifierade Aβs, identifieras också i drabbade AD hjärnor7,8,9, 10. En fullständig bild av de breda utbud av Aβ arterna i människors hjärnor, särskilt med AD och cerebral amyloid angiopati (CAA)11, hjälper forskare förstå Aβ produktion, ämnesomsättning och nedfall.
Som det klassiska tillvägagångssättet av neuropatologi varit immunhistokemi (IHC) mest avgörande metod för att bestämma placeringen av Aβs i hjärnans vävnader12,13,14,15. I allmänhet kan inte IHC skilja molekyler när flera epitoper samexistera samtidigt. Däremot är en framväxande mass spectrometry-baserade proteomiska analys en värdefull metod speciellt för att analysera en mängd Aβ arter i hjärnans vävnader, som inte kan differentieras med antikroppar16,17. Konventionella mass spectrometry-baserad analys av hjärnan lysates och immuno-fällt prover inte upptäcker mindre Aβ peptider och förlorar distributionsinformation av Aβ i hjärnvävnaden.
I tidigare arbeten, har visualisera Aβ insättningar i mus hjärnor varit framgångsrik med en transgena djurmodeller av annons, till exempel APP23. Denna process måste dock fortfarande tekniska framsteg att jämföra IMS och IHC med avseende på upplösning och känslighet18,19,20. AD neuropatologi bör studeras på människors hjärnor, och använde vi MALDI-IMS teknik på mänskliga obduktion hjärnans vävnader för att få omfattande protein mappning21. För detta ändamål har vi utvecklat ett protokoll för en avancerad typ av masspektrometri som har fördelar i snabbhet, känslighet och reproducerbarhet.
Protocol
Här samlades vävnadsprover vid Tokyo Metropolitan Geriatric Hospital, som ger gemenskapen-baserade medicinska tjänster till den äldre befolkningen i Japan. De hjärna obduktion prover som används i studien registrerades till Hjärnbanken för åldrande forskning (BBAR) med informerat samtycke från den avlidnes släktingar. BBAR har godkänts av den etiska kommittén av Tokyo Metropolitan Geriatric Hospital och Institutet för gerontologi. För alla hjärnor registrerade vid brain bank, inhämtat vi skriftligt informerat medgivande för deras användning för medicinsk forskning från patienterna eller deras familjer. Patienterna placerades i ett kallt (4 ° C) rum inom 2 h efter döden att minska efter döden förändringar i hjärnan. Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av Doshisha University och Hjärnbanken för åldrande forskning, Tokyo Metropolitan Geriatric Hospital och Institutet för gerontologi.
1. beredning av vävnadssnitt för IMS
- Bearbetning av en människohjärna obducerade förlaga på vävnad
Observera: Kontrollera att steget prov förberedelse för IMS bevarar det ursprungliga tillståndet av vävnad. Undvik kontaminering och postmortala förändringar. Följande steg är avgörande.- Få mänskliga kortikala prover för IMS från hjärnor som var bort, bearbetas och lagras vid-80 ° C inom 8 h efter döden. Ta hjärnan preparatet från occipital cortex av AD patienter och åldersmatchade kontroller21.
- Beredning av frysta vävnadssnitt
- Skär vävnadssnitt på en kryostaten. Placera Konduktiv ITO-belagda glas objektglas släpper de kryostat21.
- Varm obduktion hjärnan preparatet från-80 ° C till-22 ° C inuti kryostaten.
- Bifoga ett nytt engångsblad i kryostaten för varje experiment. Försök alltid använda en ren del av bladet.
- Lägg frysta obduktion hjärnor på scenen tillsammans med en liten mängd OCT förening (tillräckligt för att täcka den centrala delen av scenen; se Tabell för material).
- Välj villkoren för tunna snittning. För IMS, använda en tjocklek av 10 – 12 μm för mänskliga hjärnan sektioner. För IMS och IHC, skära fem till sex sektioner från varje vävnadsprov.
- När bladet börjar bara skära vävnaden, vrid hjulet och ”ansikte” blocket tills alla vävnaden utsätts. Om det finns en liten strimma eller tår över avsnittet, vänta lite mer i kryostaten tills temperaturen justeringen automatiskt fixar det. Räkna med ett par sekunder innan öppning mot rullen med en vävnad under.
- Placera omedelbart vävnad slice på ITO-belagd sida av glasskiva. Tina på vävnad segmentet genom att sätta ett finger under bilden på den icke-ITO-belagd sidan. Vävnaden kommer att hålla till i bilden. säkerställa att vävnaden är lika platt som möjligt med inga rynkor. Utför det här steget i rumstemperatur.
Observera: Bära handskar, masker och en laboratorium klänning eftersom de mänskliga proverna kan innehålla biologiska föroreningar. När alla sektioner har gjorts för dagen, ren kryostaten, borstar och chuckar med laboratorium våtservetter och 200 mL 100% etanol.
- Sköljning av vävnadssnitt
- Sänk ned proverna i 40 – 100 mL 70% etanol för 30 s för att ta bort endogena lipider och oorganiska salter. Använd ett glas färgning burk.
- Tvätta av prov med 40 – 100 mL 100% etanol för 30 s, 40 – 100 mL Carnoys lösning för 3 min, 40 – 100 mL 100% etanol för 30 s, 40 – 100 mL 0,1% trifluorättiksyra (TFA) för 1 min och 40 – 100 mL 100% etanol för 30 s. användning ett glas färgning burk.
Obs: Carnoys lösning är ett fixativ som består av sex delar etanol, tre delar ättiksyra och en del kloroform. - Torrt i ett vakuum i 30 min.
- Behandling av avsnitten vävnad med en myrsyra ånga för en bättre jonisering av Aβ proteiner från obduktionen hjärnans vävnader
- Laga i ugn och inkubation glasskiva som ska användas för den efterföljande förångning med 5 mL 100% myrsyra. Att uppnå en tillfredsställande syrabehandling, hålla luftfuktigheten i inkubation glas skålen på mättnad nivå under hela detta steg och hålla temperaturen vid 60 ° C. Placera vävnad glasen i inkubation glas skålen samtidigt undvika nedsänkning i myrsyra och behandla i 6 min.
- Ta en optisk bild av proverna med en filmscanner, gel skanner, eller en digital Mikroskop, etc. utför det här steget i rumstemperatur. Anpassningen av den optiska bilden av proverna är nödvändigt när målet prov placeras inuti instrumentet. Vanligtvis kommer det inte vara möjligt att identifiera avsnittet vävnad under lagrets matris.
Obs: Det mest bekväma sättet att ta en optisk bild är att använda en office-scanner. Det är en bra idé att spara bilden i mappen imaging data lagring. - För att korrelera de optiska bilderna med prover, gör guide märken som syns både i optiska bilden och under i matrix-skiktet i den kamera optic. Det enklaste sättet är att plats minst tre korrigering vätska märken runt provet innan du tar den optiska bilden.
- Matrix ansökan
-
Beredning av matris
- I ett organiskt lösningsmedel-tolerant mikrorör, förbereda en 10 mg/mL SA lösning i 50% acetonitril (ACN) och 0,1% Transfettsyror. Grundligt lös SA sammansatta av vortexa eller kort ultraljudsbehandling för 10 min. Store lösningen i rumstemperatur fram till användning.
Obs: Det finns tre olika alternativ för matrix sprutning: med en airbrush, ett ultraljud spruta eller en automatisk spruta.
- I ett organiskt lösningsmedel-tolerant mikrorör, förbereda en 10 mg/mL SA lösning i 50% acetonitril (ACN) och 0,1% Transfettsyror. Grundligt lös SA sammansatta av vortexa eller kort ultraljudsbehandling för 10 min. Store lösningen i rumstemperatur fram till användning.
-
Besprutning matrisen med en airbrush
- Utföra åtgärden med en konstant rumstemperatur (20 – 23 ° C) och luftfuktighet (40 – 60 procent). Parametrar för att justera för optimal sprutning inkluderar storleken på droplet-programmet, mängden mist, vinkel och avstånd mellan munstycket och avsnittet vävnad och laboratorium temperatur och luftfuktighet. Justera dessa villkor genom att kontrollera mikroskopi resultaten.
Obs: Som begränsande faktorer inbegriper crystal storlek och homogenitet av matrix täckningen och oönskade migration/diffusionen av analyter, mindre är bättre för droppe storlek. Homogenitet är också punkten av inspektion.
- Utföra åtgärden med en konstant rumstemperatur (20 – 23 ° C) och luftfuktighet (40 – 60 procent). Parametrar för att justera för optimal sprutning inkluderar storleken på droplet-programmet, mängden mist, vinkel och avstånd mellan munstycket och avsnittet vävnad och laboratorium temperatur och luftfuktighet. Justera dessa villkor genom att kontrollera mikroskopi resultaten.
-
Sprutning matrisen med ett ultraljud spruta
- Ta bort vävnad för att sprutas från exsickatorn och placera den i kammaren. Kontrollera att vävnaden inte täcker sensorfönstret.
- Påbörja tillredningen genom att trycka på Start -knappen; prep tid är vanligtvis runt 90 min. Preparatet kommer att regleras automatiskt via övervakning av matris lagertjocklek och väta. Efter beredning är klar, ta bort bilden och lagra den i exsickatorn för 15 min innan du läser det i instrumentet MALDI.
- Ren sprutan med 2 – 3 mL 100% MeOH tills Sprayhuvudet visas Rengör.
Obs: En fin dimma av matrix droppar tillåts sjunka in i vävnaden som en gravitationell ark. En genomsnittliga droppstorlek av 20 μm genereras; alla droplet diameter är mindre än 50 μm.
-
Sprutning matrisen med en automatisk spruta
- Spraya modellösning på vävnadsytan med en automatisk spruta. En konstant flöde av uppvärmd slida gas (N2, inställd på 10 psi och 75 ° C) kommer att levereras conjointly med matrix lösning spray. Använda ett lösningsmedel pumpsystem (inställd på 10 psi och 0,15 mL/min) för att leverera modellösning.
Obs: Fungerar viktigast under säkerhetsdragskåp att undvika någon inandning av matrix aerosoler. Styr rumstemperatur och luftfuktighet för att reproducera homogen matris kristallisering.
- Spraya modellösning på vävnadsytan med en automatisk spruta. En konstant flöde av uppvärmd slida gas (N2, inställd på 10 psi och 75 ° C) kommer att levereras conjointly med matrix lösning spray. Använda ett lösningsmedel pumpsystem (inställd på 10 psi och 0,15 mL/min) för att leverera modellösning.
-
Beredning av matris
2. MALDI-IMS
-
Utföra ultrasnabbt masspektrometri.
- Utföra hög genomströmning och hög-rumslig-upplösning imaging experiment med MALDI-IMS utrustad med en 10 kHz nd: YAG (355 nm) laser.
- För masspektrometri mätningar, definiera områdena vävnad med hjälp av MALDI styrprogram och data analys programvara.
- Förvärva spektra i en positiv linjär läge med en massa rad m/z 2 000 – 20 000 och en rumslig upplösning på 20 och 100 µm.
- För att göra kalibreringen standard, upplösa peptid kalibreringen standard och protein kalibreringen standard med förhållandet 1:4 med alpha-Cyano-4-hydroxyl-caffeic syra (CHCA) i TA30 lösning (ACN:0.1% TFA = 30: 70) och späd sedan denna 10 x. Placera 1 μL av kalibrering standard i bilden på fyra olika platser.
- Med molekylär histologi programvara (se Tabell för material), överlagra flera enstaka bilder att finna rumsliga sambandet mellan olika signaler, såsom olika Aβ peptider colocalizing i SPs och kärlväggarna.
3. databearbetning
- För spektral justering, justera alla spectra en valda m/z-lista från en tidigare publikation21.
- Importera MALDI-IMS data set i statistisk analysprogramvara (se Tabell för material) med baslinjen subtraktion.
-
Spåra regioner av intresse (ROIs) baserat på histologiska kunskap.
- Utföra en univariat analys för genomsnittliga stödnivåerna, standardavvikelser, avtäckning av diskriminerande m/z-markörer (ROC analys), hypotes tester och upptäckten av colocalized m/z-värden.
-
Skapa en segmentering karta.
- Utföra en oövervakad multivariat analys för rumsliga segmentering av stora datamängder och en Komponentanalys för utvinning av underliggande trender.
- Välj anatomiska ROIs baserat på histologiska egenskaper, såsom parenkymet och subaraknoidalrummet.
- Tilldela strukturer som enskilda ROIs och korrelera dem med bearbetade MS data för att identifiera de associera peptider som tillät bild segmentering av regionen.
Representative Results
Sporadiska AD patienter med CAA (n = 5; medelålder = 83,2 y) och äldre patienter med senil plack gratis (SP O) och CAA (n = 5; medelålder = 77,2 y) var analyserats (tabell 1). De CAA fenotyperna av patient #3 var mest framträdande i denna studie. Distributioner av Aβ1-40 och Aβ1-42 insättningar i hjärnvävnad från patient #3 var visualiserat med MALDI-IMS (figur 1). Det fanns inga betydande signaler i nonpathological kontroll hjärnor (patienter #9 och #10), som visas i figur 1. Här, visualiserat MALDI-IMS tydligt att Aβ1-42 prioriterat deponerades som SPs i cerebral parenkymet. Kortare Aβs, såsom Aβ1-36 1-41, förvarades däremot prioriterat på leptomeningeal vaskulära områden (figur 1).
Utdelning av Aβ40 och Aβ42 var ytterligare verifieras med IHC med intilliggande frysta delar av vävnader. Den anti-Aβ40 antikroppen märkt CAA (pilar i figur 2B), som står i tydlig kontrast till fördelningen av Aβ42 i cerebral parenkymet som SPs. Vi är de första att upptäcka detta fragment i människors hjärnor Aβ1-41, och vi har genererat specifika antikroppar som kan skilja Aβ41 från Aβ40 andAβ4221.
Den rumsliga upplösningen i MALDI-IMS är i allmänhet den viktigaste faktorn att förbättras. I figur 1 och figur 2 visar MALDI-IMS med 100 µm pitch upplösning och få en övergripande fördelning profil för ett relativt stort område21. Det är svårt att definiera amyloid nedfall exakt på subaraknoidalrummet, inklusive vaskulär struktur. Att porträttera fina vävnad strukturer av subaraknoidal fartyg och ytan av hjärnbarken, högupplösta MALDI imaging (40 µm: figur 3; 20 µm: figur 4 och figur 5) utfördes. Som ett resultat, visat MALDI-IMS tydligt att kortare Aβs, såsom Aβ1-36 1-41, fördelas i väggarna i artärerna, vilket är jämförbart med IHC.
MALDI-IMS visade detaljerade fördelningorna av både Aβx-40 och Aβx-42 (x = 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9 och 11pE) i AD tillsammans med måttlig CAA hjärnan. Till exempel, medan Aβx-40 arter visade en liknande fördelning profil till Aβ1-40, Aβx-42 arter visade en annan spridningsbild med Aβ1-4221. Av det nuvarande protokollet tilldelas enda ion bilder av enskilda Aβ peptiderna observerats med MALDI-IMS Aβ arter. Däremot förvärvat image data kan undersökas med hjälp av oövervakade multivariat statistik för att få bild segmentering av anatomiska regioner av intresse för ytterligare analys av odefinierad proteiner. Figur 5 visar kartan segmentering erhålls med en halverar k-means analys tillämpas på samma avsnitt från patienten #321. Detta kluster metod identifierat framgångsrikt plaque-liknande strukturer i parenkymet (blå i figur 5 c) och vaskulära strukturer i subaraknoidalrummet (grön i figur 5 c). Det är intressant att hitta ett litet cirkulärt område i parenkymet, som upptäcks bara runt en liten arteriole i parenkymet, liksom i subaraknoidalrummet (lila i figur 5 c). Detta kontrolleras genom en enda ion bilder av dessa enskilda Aβ peptider i figur 5 d-5F.
Figur 1: MALDI-IMS av en fryst AD/CAA hjärnan avsnitt. Olika C-terminal trunkeras Aβ peptider i AD som åtföljer svår CAA (patient #3) visualiseras i vänstra panelen och kontroller (patient #9 på rätten och patienten #10 till vänster på alla bilder) i den högra panelen. Aβ1-36 till Aβ1-41 deponeras prioriterat i leptomeningeal blodkärl, medan Aβ1-42 och Aβ1-43 deponeras i cerebral parenkymet som senila plack i fall #3, det fanns ingen signal i kontroll patienternas hjärnor (fall #9 och #10). Upplösning = 100 μm. Skalstapeln = 5 mm. Denna siffra har ändrats med tillstånd från Kakuda et al.21. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: MALDI-IMS av frysta AD/CAA hjärnan sektioner och angränsande delar av occipital cortex från AD hjärnor. (A - C) frysta AD/CAA hjärnan avsnitten och (D och E) angränsande sektioner av occipital cortex från AD hjärnor var immun-färgade och fokuserade på arteriole och cerebral parenkymet, med hjälp av antikroppar mot Aβ40 (D: BA27) eller Aβ42 (E: anti-Aβ42 polyklonala). Båda analyser visat att Aβ40 prioriterat deponeras i leptomeningeal blodkärl (pilar i panelen D) och arterioler i subaraknoidalrummet och cerebral parenkymet utgör CAA. Aβ42 är däremot främst deponeras i SPs. IMS, upplösning = 100 μm. Skalstapeln = 5 mm (A, Boch C) = 5 mm, 500 (D och E). Denna siffra har ändrats med tillstånd från Kakuda et al.21. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: MALDI-IMS av frysta AD/CAA hjärnan sektioner (patient #3) med en upplösning på 40 µm. Olika C-terminal och N-terminala trunkeras och modifierade Aβ peptider i AD åtföljande svår CAA (patient #3). Aβ1-36 till Aβ1-41 deponeras prioriterat i leptomeningeal blodkärl, medan Aβ1-42 och Aβ1-43 deponeras i cerebral parenkymet som senila plack. Skala barer = 1 mm (A-B), 2 mm (övre vänstra). Upplösning = 40 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: MALDI-IMS av frysta AD/CAA hjärnan sektioner (patient #3) med en upplösning på 20 µm. I denna panel visas olika C-terminal och N-terminala trunkeras och modifierade Aβ peptider i AD åtföljande svår CAA (patient #3). Aβ1-36 till Aβ1-41 deponeras prioriterat i leptomeningeal blodkärl, medan Aβ1-42 och Aβ1-43 deponeras i cerebral parenkymet som senila plack. Skala barer = 200 μm (a, b, c), 1 mm (övre vänstra). Upplösning = 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: segmentering karta, erhålls genom MALDI-IMS av en frusen AD hjärna del, avslöjar förmodad senila plack, stort subaraknoidal fartyg strukturer och små parenkymal arterioler. (A) segmentering karta erhålls från en multivariat bildanalys av MALDI-IMS data. (B) Bisecting k-means baserad klustring analys identifierade plaque-liknande och fartyget-liknande strukturer i occipital cortex. Klustren och underordnade strukturer och deras relationer visas som noder (e.g.,1-0-0). (C), distinkta Aβ peptid lokalisering mönster som liknar plack (blå), subaraknoidal fartyg (grön) och arteriole (röd) strukturer. Observera att några röda kluster är också distribueras i subaraknoidalrummet. Detta kontrolleras genom en enda ion bilder av dessa enskilda Aβ peptider med 20 µm upplösning: (D) Aβ 1-40, (E) Aβ 1-41, och (F) Aβ 1-42. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Fallet | Kön | Ålder vid döden | Braak SP | CAA |
| 1 | M | 83 | C | 0,5 |
| 2 | M | 88 | C | 1 |
| 3 | M | 84 | C | 2 |
| 4 | M | 78 | C | 1 |
| 5 | M | 83 | C | 1 |
| 6 | M | 84 | O | 0 |
| 7 | M | 78 | O | 0 |
| 8 | M | 70 | O | 0 |
| 9 | M | 73 | O | 0 |
| 10 | M | 81 | O | 0 |
Tabell 1: kliniska och patologiska data av AD med CAA fall och år SP O försökspersoner. Mänskliga kortikala prover för IMS och IHC erhölls från Hjärnbanken vid Tokyo Metropolitan Institutet för gerontologi. Varje hjärna prov togs från occipital cortex av fem AD patienter och fem åldersmatchade kontroller. Omfattningen av amyloid nedfall som framgår av en Aβ monoklonal antikropp definierades av Braak SP (amyloid) stadier. På scenen O finns det nästan inga senila plack i hela isocortex. Skede C påverkas nästan alla områden som isocortical. AD hjärnor är oföränderlig skede C. Den här tabellen har ändrats med tillstånd från Kakuda et al.21.
Discussion
Här vi visat ett detaljerat protokoll och resultaten av visualisering av Aβ och dess isoformer från flera obducerade hjärnor med AD och CAA med MALDI-IMS. Aβs nedfall profil har drastiskt ändrats från Aβ1-42 till dess N - och C-terminal variationer. Aβ1-41 var först identifieras och visualiseras i människors hjärnor med det nuvarande protokollet och validerades ytterligare med IHC21. Med tanke på att morfologi av deponerade Aβ IMS med en högupplöst analys (20 μm) måste vara i bra avtal med IHC, bidra IMS och IHC också till att skilja Aβ insättningar av deras läge och protein innehåll, liksom av deras morfologi. Som hela experimentet beskrivs här genomfördes i occipital cortex, kommer att studera localizationen av olika beta-amyloid arter över alla regioner i hjärnan generaliseras med framtida experiment med hjälp av det nuvarande protokollet.
Kritiska steg inom protokollet är vävnad förberedelse åtgärder för att uppnå en effektiv jonisering av aggregerade proteiner i hjärnans vävnader. En matris lager krävs för att absorbera energin som laser och framkalla desorption och jonisering av analyter. I denna process är ett hela vävnaden avsnitt homogeneously belagd med små kristaller. Homogen cocrystallization av analyten med matrisen är avgörande för hög känslighet och artefakt-gratis bildbehandling. Alla tre spray metoder har sina fördelar. Manuell spray beläggning är en av de vanligaste metoderna. En airbrush är bekvämt; Det kräver dock skicklig drift. Som exakt och reproducerbar experimentell teknik är väsentliga, rekommenderas använder ett ultraljud spruta eller en automatisk spruta som beskrivs i de aktuella protokollen. Med avseende på ett ultraljud spruta, kommer det inte att påverkas av luftfuktighet och temperatur i rummet eftersom det sprutas in i en kammare. Under tiden, med en automatisk spruta, relativt bevarade rumslig upplösning med bra reproducerbarhet erhålls. Generellt, den rumsliga upplösningen som erhålls med de tre metoderna ökningen i storleksordningen 1) airbrush, (2) automatisk anordning och 3) ultraljud spruta.
Viktigast av allt, skapades detta protokoll ursprungligen för att upptäcka och visualisera Aβs i obducerade människohjärnan prover. Visualisering av Aβs med MALDI-IMS för APP23 möss, som genereras som en djurmodell av annons baserat på Svenska-typ mutationen av mänskliga APP, har rapporterats tidigare av andra med en existerande metod18,19. Det tidigare protokollet tillämpas på APP23 var dock inte tillräcklig för att visualisera Aβ i dess laterala upplösning och känslighet. Tidigare arbeten diskuterat att Aβ kickkoncentrationer utanför gränsen som vävnad är tydligt artefakter i APP23 imaging med deras Protokoll18,19. Det innebär att den så kallade 'oskärpa' mellan IMS och riktiga SPs bilder på grund av matris utvinning steg var oundvikligt med MALDI-typ imaging. Men i det nuvarande protokollet, oskärpa försvann och varje spektrum representeras varje enda SP i hjärnparenkymet.
Såsom visas här, vi kan spåra Aβ1-41 för första gången i AD och CAA hjärnor med MALDI-IMS samt med IHC, med en specifik antikropp av vår egen generation21. Enligt Aβ bearbetning modellen härrör Aβ1-38 från Aβ1-45 via Aβ1-42, medan Aβ1-41 härrör från Aβ1-45 av γ-sekretas stegvis klyvning27,28,29,30,31 . Detta innebär att det nuvarande protokollet stöder denna modell. När det gäller begränsningarna av denna teknik, måste vi överväga heterogenitet proverna från mänskliga obduktion hjärnan. Det mest kritiska steget, i en mening, är att bedöma kvalificerad obduktion hjärnvävnaden med etiska bevis. Med det nuvarande protokollet på dessa kvalificerade obduktion hjärnans vävnader, kan MALDI-IMS individuellt spåra hela fördelningen av de komplexa molekyler med flera ändringar, samt okända faktorer som reglerar patogenesen av AD, som ännu är att vara definieras. Dessutom att förstå övergripande patogenesen av olika neuropatologi i äldre människors hjärnor, måste det vara möjligt att anta MALDI-IMS som en standardmetod, i kombination med klinisk, genetisk och patologiska observationer i neurologiska sjukdomar .
Ett annat viktigt steg av MALDI-IMS är data mining processen från erhållna datauppsättningen, som alltid är tidskrävande. Manuell datautvinning av varje topp-distribution kräver användarna att klicka igenom varje bild och ser för distributioner som kan korrelera till morfologin av det analyserade provet. Automatiska rumsliga segmentering kan användas som första steg av data mining, ger en översikt av datauppsättningen och möjliggör snabb upptäckt av framträdande. I denna strategi, likheter mellan spektra i en viss region bestäms statistiskt och liknande spectra grupperas i ett kluster. Alla pixlar är färgkodade enligt deras kluster tilldelning (figur 5). I den aktuella AD/CAA-studien är området av intresse utrymmet av Aβ depositioner i parenkymal plack och subaraknoidal och parenkymal vaskulära strukturer. Två distinkta toppar som validerades ytterligare med IHC var m/z värden från Aβ1-40 och Aβ1-4221. Det är således lätt att hitta colocalized m/z med Aβ1-40 och Aβ1-42 vilket var redan kommenterad till N - och C-terminal trunkerade Aβ, samt okänd peptider, för vidare analys.
Weller och kollegor har rapporterat att Aβ ackumuleras i kärlväggen, mer runt artärer än runt vener21. Dessutom har det föreslagits att interstitiell vätska (ISF) innehåller Aβs som utsöndras från cerebral parenkymet till den lymfkörtel via en perivaskulär dränering väg22,23,24,25 ,26. Det nuvarande protokollet att generera en segmentering karta utifrån en uppsättning MALDI-IMS data med 20 µm upplösning stöder den eventuella förekomsten av perivaskulär dränering vägar i hjärnan (figur 5), som bidrar väsentligt till CAA i AD21 , 32. Dessutom kan vi upptäcka markör proteiner colocalized med plack och subaraknoidal vaskulatur genom att beräkna korrelationen av varje m/z-värden. Att förstå övergripande patogenesen av olika neuropatologi i äldre människors hjärnor, måste det vara möjligt att anta MALDI-IMS som en kraftfull metod i kombination med etablerade IHC data av klinisk, genetisk och patologiska observationer i neurologiska sjukdomar.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete var stöds delvis av bidrag för vetenskaplig forskning på innovativa områden (Brain Protein åldrande och demens kontroll 26117004; att M.I. och T.M.). Denna forskning var delvis stöds av strategiska forskningsprogrammet för hjärnan vetenskaper från Japan byrån för medicinsk forskning och utveckling (AMED). Alla experiment genomfördes i enlighet med riktlinjerna som anländer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryostat | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | CM1950 | |
| Indium tin oxide (ITO)-coated microscope glass slide | Bruker Daltonics | #237001 | |
| Blade (disposable) | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | #117394 | |
| O.C.T. Compound | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | FSC 22 Blue | |
| Scanner | EPSON | GT-980 | |
| Air-Brush | GSI Creos | PS274 | |
| Compressor | MRHOBBY | Mr.Linear compressor L5 | |
| Ultrasonic sprayer | Bruker Daltonics | ImagePrep | |
| Automatic sprayer | HTX Technologies | TM Sprayer | |
| Confocal-laser-scanning-microscope | Carl Zeiss Inc. | LSM 700 | |
| Ultra high speed MALDI instrument | Bruker Daltonics | rapifleX MALDI Tissuetyper | |
| MALDI control software | Bruker Daltonics | FlexControl 3.8 | |
| Data analysis software | Bruker Daltonics | FlexImaging 5.0 | |
| Molecular histology software | SCiLS, Bremen, Germany | SciLS Lab 2016a | |
| Statistical software | SCiLS, Bremen, Germany | SciLS Lab 2016a | |
| Sinapinic acid (SA) | Nacalai tesque | 30494-91 | |
| Alpha-Cyano-4-hydroxyl-cinnamic acid (CHCA) | Wako | 037-19261 | |
| Calibration standard | Bruker Daltonics | ||
| Biotinylated anti-mouse IgG antibodies | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA | ||
| Biotinylated anti-rabbit IgG antibodies | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA | ||
| Avidin and biotinylated HRP complex. | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA | Vectastain Elite ABC kit | |
| 3,3-diaminobenzidine (DAB) | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA | Vectastain Elite ABC kit |
References
- Kovacs, G. G. Molecular Pathological Classification of Neurodegenerative Diseases: Turning towards Precision Medicine. International Journal of Molecular Sciences. 17, E189 (2016).
- Selkoe, D. J. Alzheimer's disease: genes, proteins, and therapy. Physiological Reviews. 81, 741-766 (2001).
- Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years. EMBO Molecular Medicine. 8, 595-608 (2016).
- Braak, H., Braak, E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathologica. 82, 239-259 (1991).
- Braak, H., Alafuzoff, I., Arzberger, T., Kretzschmar, H., Del Tredici, K. Staging of Alzheimer disease-associated neurofibrillary pathology using paraffin sections and immunocytochemistry. Acta Neuropathologica. 112, 389-404 (2006).
- Bateman, R. J., et al. Dominantly Inherited Alzheimer Network. Clinical and biomarker changes in dominantly inherited Alzheimer's disease. The New England Journal of Medicine. 367, 795-804 (2012).
- Iwatsubo, T., et al. Visualization of A beta 42(43) and A beta 40 in senile plaques with end-specific A beta monoclonals: evidence that an initially deposited species is Abeta 42(43). Neuron. 13, 45-53 (1994).
- Reinert, J., et al. Deposition of C-terminally truncated Aβ species Aβ37 and Aβ39 in Alzheimer's disease and transgenic mouse models. Acta Neuropathologica Communications. 4, 24 (2016).
- Saido, T. C., et al. Dominant and differential deposition of distinct beta-amyloid peptide species, A beta N3(pE), in senile plaques. Neuron. 14, 457-466 (1995).
- Harigaya, Y., et al. Amyloid beta protein starting pyroglutamate at position 3 is a major component of the amyloid deposits in the Alzheimer's disease brain. Biochemical and Biophysical Research Communications. 276, 422-427 (2000).
- Vinters, H. V. Cerebral amyloid angiopathy. A critical review. Stroke. 18, 311-324 (1987).
- Saito, T., et al. Potent amyloidogenicity and pathogenicity of Aβ43. Nature Neuroscience. 14, 1023-1032 (2011).
- Sergeant, N., et al. Truncated beta-amyloid peptide species in pre-clinical Alzheimer's disease as new targets for the vaccination approach. Journal of Neurochemistry. 85, 1581-1591 (2003).
- Suzuki, N., et al. High tissue content of soluble beta 1-40 is linked to cerebral amyloid angiopathy. The American Journal of Pathology. 145 (2), 452-460 (1994).
- Miyasaka, T., et al. Visualization of newly deposited tau in neurofibrillary tangles and neuropil threads. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 64, 665-674 (2005).
- Portelius, E., et al. Mass spectrometric characterization of brain amyloid beta isoform signatures in familial and sporadic Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica. 120, 185-193 (2010).
- Kelley, A. R., Perry, G., Castellani, R. J., Bach, S. B. Laser-Induced In-Source Decay Applied to the Determination of Amyloid-Beta in Alzheimer's Brains. ACS Chemical Neuroscience. 7, 261-268 (2016).
- Stoeckli, M., Staab, D., Staufenbiel, M., Wiederhold, K. H., Signor, L. Molecular imaging of amyloid beta peptides in mouse brain sections using mass spectrometry. Analytical Biochemistry. , 33-39 (2002).
- Stoeckli, M., et al. MALDI MS imaging of amyloid. Methods in Enzymology. 412, 94-106 (2006).
- Seeley, E. H., Caprioli, R. M. Molecular imaging of proteins in tissues by mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 18126-18131 (2008).
- Kakuda, N., et al. Distinct deposition of amyloid-β species in brains with Alzheimer’s disease pathology visualized with MALDI imaging mass spectrometry. Acta Neuropathologica Communications. 5, 73 (2017).
- Weller, R. O., Djuanda, E., Yow, H. Y., Carare, R. O. Lymphatic drainage of the brain and the pathophysiology of neurological disease. Acta Neuropathologica. 117, 1-14 (2009).
- Weller, R. O., Boche, D., Nicoll, J. A. Microvasculature changes and cerebral amyloid angiopathy in Alzheimer's disease and their potential impact on therapy. Acta Neuropathologica. 118, 87-102 (2009).
- Weller, R. O., Subash, M., Preston, S. D., Mazanti, I., Carare, R. O. Perivascular drainage of amyloid-beta peptides from the brain and its failure in cerebral amyloid angiopathy and Alzheimer's disease. Brain Pathology. 18, 253-266 (2008).
- Morris, A. W., et al. Vascular basement membranes as pathways for the passage of fluid into and out of the brain. Acta Neuropathologica. 131, 725-736 (2016).
- Hawkes, C. A., et al. Perivascular drainage of solutes is impaired in the ageing mouse brain and in the presence of cerebral amyloid angiopathy. Acta Neuropathologica. 121, 431-443 (2011).
- Kakuda, N., et al. Equimolar production of amyloid beta-protein and amyloid precursor protein intracellular domain from beta-carboxyl-terminal fragment by gamma-secretase. Journal of Biological Chemistry. 281, 14776-14786 (2006).
- Matsumura, N., et al. γ-Secretase associated with lipid rafts: multiple interactive pathways in the stepwise processing of β-carboxyl-terminal fragment. Journal of Biological Chemistry. 289, 5109-5121 (2014).
- Morishima-Kawashima, M., et al. Effect of apolipoprotein E allele epsilon4 on the initial phase of amyloid beta-protein accumulation in the human brain. The American Journal of Pathology. 157, 2093-2099 (2000).
- Takami, M., et al. γ-Secretase: Successive tripeptide and tetrapeptide release from the transmembrane domain of β-carboxyl terminal fragment. The Journal of Neuroscience. 29, 13042-13052 (2009).
- Kakuda, N., et al. Altered γ-secretase activity in mild cognitive impairment and Alzheimer's disease. EMBO Molecular Medicine. 4, 344-352 (2012).
- Carlred, L., et al. Probing amyloid-b pathology in transgenic Alzheimer’s disease (tgArcSwe) mice using MALDI imaging mass spectrometry. Journal of Neurochemistry. 138, 469-478 (2016).
