Summary
Dit protocol kan lezers te succesvol een varkens model van gesegmenteerde intestinale ischemie en vervolgens isoleren cultuur intestinale stamcellen voor de studie van epitheliale reparatie na letsel.
Abstract
Intestinale ischemie blijft een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit in menselijk en diergeneeskundig patiënten. Vele ziekteprocessen leiden tot intestinale ischemie, wanneer de bloedtoevoer en dus zuurstof is verlaagd naar de darm. Dit leidt tot de intestinale barrière verlies en schade aan het onderliggende weefsel. Intestinale stamcellen bevinden zich aan de voet van de crypten van Lieberkühn en zijn verantwoordelijk voor intestinale verlenging tijdens homeostase en volgende schade. Ex vivo cel cultuur technieken hebben toegestaan voor de succesvolle studie van de cel van de stam van de epitheliale interacties door de oprichting van kweekomstandigheden die ondersteuning bieden voor de groei van drie-dimensionale epitheliale orgel-achtige systemen (aangeduid als "enteroids" en" colonoids"van de kleine en grote darm, respectievelijk). Deze enteroids zijn samengesteld uit crypte en villosités-achtige domeinen en volwassen om alle van de celtypes gevonden binnen het epithelium te bevatten. Historisch, hebben lymfkliertest modellen gebruikt om te bestuderen van intestinale letsel. Een varkens model biedt echter diverse voordelen, waaronder een gelijkenis van grootte, alsmede de gastro-intestinale anatomie en de fysiologie aan die van de mens. Door gebruik te maken van een varkens model, stellen we een protocol waarin regiogebonden lusjes van intestinale ischemie binnen een enkel dier kunnen worden gemaakt, waardoor de studie van de verschillende punten van ischemische schade en herstellen in vivo. Daarnaast beschrijven we een methode om te isoleren en cultuur van de intestinale stamcellen uit de ischemische lusjes van de darm, waardoor de verdere studie van epitheliale reparatie, gemoduleerd door stamcellen, ex vivo.
Introduction
Intestinale ischemische schade, het resultaat van verminderde zuurstof beschikbaarheid te wijten aan een vermindering of volledige occlusie van de bloedstroom naar de darm, blijft een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit bij mens en dier patiënten1,2. Ischemische schade, samen met de latere ontsteking en cellulaire infiltratie, leidt tot mucosal barrière compromis. De mucosal barrière is cruciaal voor de preventie van bacteriële translocatie en bijbehorende toxines in de systemische circulatie3,4. De daaropvolgende reperfusie van ischemische weefsels kan resulteren in de vorming van reactieve zuurstof soorten die letsel5 verergeren kanbeschadigen. Aangezien intestinale ischemie zelden vermijdbare is, is meest recente onderzoek gericht op de bevordering van technieken voor vroegtijdige opsporing van ischemie en de ontwikkeling van nieuwe therapeutische benaderingen die reperfusie letsel of doel mucosal reparatie verminderen.
Dierlijke modellen zijn uitvoerig gebruikt te breiden onze kennis van de fundamentele wetenschap van ischemie-reperfusie letsel en blijven noodzakelijk voor translationeel onderzoek. Knaagdier modellen zijn de meest gebruikte vanwege hun vermogen om genetisch gemanipuleerde6. Meer recentelijk echter heeft het gebruik van grote diermodellen, specifiek het varken, gepleit voor toekomstige translationeel studies als gevolg van een aantal voordelen waaronder de varkens anatomische en fysiologische gelijkenissen met mens7,8. Een verscheidenheid van letsel modellen zijn ontwikkeld om te bestuderen van ischemie-reperfusie schade en omvatten volledige vasculaire occlusie, low-flow ischemie en regiogebonden mesenterische vasculaire occlusie. Een volledig overzicht van deze modellen is buiten het domein van dit artikel maar de auteurs directe lezers op een recente test3.
Naast in-vivo modellen biedt het gebruik van ex vivo cellulaire cultuur systemen een veelbelovend instrument om te studeren intestinale homeostase en reparatie na letsel. Intestinale stamcellen zijn verantwoordelijk voor cellulaire proliferatie en omzet van de epitheliale darmwand. Als geïsoleerd uit normale of gewonde darm, intestinale stamcellen kan worden gehandhaafd in de cultuur, en dienen als een gereedschap of model te bestuderen van de cel van de stam en epitheliale celbiologie. Methoden om te isoleren en deze driedimensionale cultuur systemen (enteroids en colonoids als afgeleid van de kleine en grote darm, respectievelijk genoemd) zijn beschreven voor een verscheidenheid van soorten en orgaan systemen9,10 ,11,12,13. In het bijzonder binnen het maag-darmkanaal, zijn de systemen van deze cultuur gebruikt om model gastro-intestinale aandoeningen zoals kanker, pathogen infectie en ontstoken darm ziekte14. Op dit moment zijn er geen verslagen beschrijven de isolatie en het onderhoud van intestinale stamcellen uit ischemically gewonde dunne darm in alle soorten. Daarom beschrijven hier we het proces van intestinale ischemie in een nieuwe, grote varkens diermodel waardoor reproduceerbare verwonding en de mogelijkheid om te isoleren van intestinale stamcellen uit normale en ischemically gewonden darm voor de bijkomende studie van herstel ex vivo.
Protocol
Voor deze experimenten, werden alle dierlijke studies goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de North Carolina State University.
1. voorbereiding voor cultuur
Opmerking: Alle reagentia staan in de Tabel van materialen. Specifieke groeifactor concentraties zijn vermeld in tabel 1.
- Bereid een 0.5 M ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) oplossing in gedestilleerd gedeïoniseerd water (ddH2van O). Meng voldoende en breng de pH op 7.4 met behulp van NaOH en/of HCl-oplossingen.
Opmerking: Make-up EDTA stockoplossing verse vóór elk experiment. - Dissociatie reagens #1 (DR #1) als volgt voorbereiden en plaatsen op het ijs: combineren met fosfaat gebufferde zoutoplossing zonder Ca2 + en Mg2 + (PBS), 0.5 M EDTA, 1 M 1,4-Dithiothreitol (DTT), 10 µM Y27632 en 1 X antibiotica-Antimycotic oplossing (Anti-Anti) met penicilline en streptomycine amfotericine-B.
Opmerking: Toevoegen Y27632 onmiddellijk voorafgaand aan de collectie van het weefsel. - Dissociatie reagens #2 (DR #2) als volgt voorbereiden en plaatsen in een waterbad 37 ° C: PBS combineren zonder Ca2 + en Mg2 +, 0.5 M EDTA, 10 µM Y27632 en 1 X Anti-Anti. Opmerking: Toevoegen Y27632 onmiddellijk voorafgaand aan de collectie van het weefsel.
- Intestinale epitheliale cel van de stam (IESC) media als volgt voorbereiden: Mix 25 mL geavanceerde DMEM/F12 medium met 1 X N2 supplement, 1 X B-27 aanvullen, 10 mM HEPES, 2 mM Glutamax en 1 X Anti-Anti. Bewaren bij 4 ° C tot gebruik.
- Een master mix van verminderde groeifactor kelder membraan matrix (matrix) en aanvullende groeifactoren als volgt voorbereiden: ontdooien van de matrix op ijs. In een microcentrifuge buis, voeg 100 ng/mL recombinante menselijke Noggin, 500 ng/mL recombinante menselijke R-Spondin 1, 50 ng/mL recombinante menselijke epidermale groeifactor (EGF), 100 ng/mL recombinante menselijke Wnt3a, 10 mM Nicotinamide, 10 nM gastrine, 500 nM A-83-01, 10 µM Y-27632 , 10 mM SB202190, 500 nM LY2157299 en 2,5 µM glycogeen synthase 3 kinase inhibitor van de omwenteling (GSK3i, CHIR99021). Wanneer de matrix wordt ontdooid, aan te vullen met de groeifactor mix (waardoor master mix) en sla op ijs.
Opmerking: Wees voorzichtig om te voorkomen dat de invoering van luchtbellen zoals dit artefact binnen de matrix patty tijdens beplating zal maken. - Vooraf warm een 24-well weefselkweek schotel in een incubator 37 ° C vóór het opstarten van cel isolatie procedures.
2. de chirurgische Model van ischemie en weefsel collectie
- Gebruik acht tot tien weken oude Yorkshire gekruist varkens van beide geslachten (aanbevolen). Verwijder alle diervoeders 16-18 h voorafgaand aan de operatie. Toestaan dat varkens toegang tot water te allen tijde.
- Plannen van de varkens te komen ten minste 48 uur vóór de experimenten met het oog op milieu acclimatisering.
Opmerking: Opgeleide veterinaire en/of laboratorium technici begeleid door een vergunning gegeven dierenarts geven routinematige dierenverzorgers en bijstand met verdoving procedures. - Premedicate van het varken met xylazine (1,5 mg/kg intramuscularly (IM)) en ketamine (11-20 mg/kg (IM)),15. Zodra bezadigd, intubate de orotracheally van het varken.
- Handhaven van varkens onder narcose met Isofluraan (2-5%) verdampt in 100% O2 tot het tijdstip van euthanasie.
- Plaatsen van een intraveneuze (IV) katheter (oor ader aanbevolen) en beheren van een vloeistof vervanging zoals lactated ringers oplossing tegen een tarief onderhoud van 15 mL/kg/h.
- Het uitvoeren van routinematige verdoving toezicht met inbegrip van de pols oxymetrie, electrocardiografie en indirecte bloeddruk metingen15. Toezicht op de ademhaling en de moeite van het varken en ventileren handmatig of mechanisch desgewenst als einde getijde CO2 boven 55-60 mmHg stijgt.
Opmerking: Passende verdoving wordt bevestigd door de voortdurende monitoring van trends in hartslag (bereik 80-130 slagen/min), niet-invasieve bloeddruk (gemiddelde arteriële druk 75-100 mmHg), respiratoire tarief (10-25 adem/min)16en periodieke controle afwezigheid van kaak en anale Toon. Diepte van anesthesie kan ook worden beoordeeld door mate van ontspanning van de spier en spier Fasciculatie na chirurgische stimulans. Oogbeschadigingen en/of reflexen zijn meestal van geen waarde16. Analgesia kan worden verstrekt, zoals aangegeven door het beleid van de IACUC instellingen. In dit geval kan een opioïden, zoals buprenorfine, tijdens een operatie worden toegediend. - Plaats het varken op een verwarming pad en beperken in dorsale lighouding voor de chirurgische ingreep.
- De ventrale buik scheren en prep met behulp van chirurgische scrub (chloorhexidine oplossing) en isopropyl alcohol.
- Maak een insnijding van de 8-10-cm ventral midline toegang krijgen tot de buik met een scalpel blad gecentreerd op de navel.
- Het identificeren van de dunne darm (jejunum) ongeveer 40 cm mondelinge naar de kruising ileocecal. Tien-cm lange lussen van jejunum door omtrek tweemaal ligating de darm af te bakenen, één cm tussen elke ligatuur, vóór het maken van daaropvolgende lussen 10 cm gelegen mondeling (Figuur 1).
- Maak twee lussen per tijdstip van ischemie grenzend aan elkaar, één voor ischemie en één voor ischemie met een extra 1h van reperfusie, indien gewenst. Tot volledige ischemie (geen stroom van slagaders of aders), klem of de mesenterische therapieën met bulldog vasculaire klemmen, gebogen Halstead mosquito hemostats of niet-absorbeerbare zijde van de 2-0 voor 1, 2, 3 en 4h afbinden en verwijder klemmen voor 1h van reperfusie, indien gewenst.
Opmerking: De auteurs gemaakt van alle lussen van ischemie in volgorde, beginnend met de ischemische lus van 4h en gevorderd verplaatsen proximally (totale chirurgie om tijd te minimaliseren). Om aan de mogelijkheid dat het naburige ischemische intestinale segmenten aangrenzende lussen kan beschadigen, kan de volgorde van de ischemische lussen worden gevarieerd. Dit kan totale chirurgische tijd wijzigen.
Opmerking: Het tijdsbestek van reperfusie kan gevarieerd worden afhankelijk van de onderzoeksvraag van belang of als therapieën wenst te beproeven reperfusie deperiode. Echter zoals weefselschade ernstiger van verhoging van de totale duur van ischemie alleen, reperfusie schade waarschijnlijk draagt niet bij tot verdere epitheliale schade. Reperfusie speelt waarschijnlijk een rol na milde perioden van ischemische schade. - Houd de buik bedekt of gesloten met behulp van een steriele handdoek en/of een handdoek klem tussen ischemie tijdstippen.
Opmerking: Binnen een enkel dier voor dit experiment, acht ischemische segmenten kunnen worden gemaakt. Een extra jejunal segment, ten minste 5-10 cm proximaal aan de laatste ischemische lus, die als een normale internecontrolekader dienen zal identificeren. - Ongeveer drie mesenterische schepen per bulldog vasculaire klem of gebogen Halstead mosquito hemostat belemmeren. Wees voorzichtig tijdens hemostat toepassing omdat de schepen zijn gemakkelijk getraumatiseerd. Probeer te stapelen de schepen binnen de kaken van de klemmen.
- Aan het einde van het experiment, volgende euthanasie met pentobarbital 85-100 mg/kg IV, verzamelen alle lussen van weefsel met behulp van metzenbaum de schaar, na de dood is bevestigd met geen hartslag auscultated en verlies van de cornea reflex. Begin met het verzamelen van een stuk van de controle van normale jejunum minstens 5 - 10 cm proximaal aan de laatste ischemische lus.
- Scheiden en opslaan van de lussen van elk punt van de tijd schade in kleine recipiënten van ijskoud PBS tot klaar voor crypt isolatie.
Opmerking: Indien gewenst, make ischemische lussen lang genoeg om te verdelen in afzonderlijke monsters voor histologie en intestinale cel van de stam cultuur; Nochtans, hebben de auteurs gevonden dat loops groter is dan ongeveer 10 cm lang waarschijnlijk zijn tot hemorragische.
3. crypt (de cel van de stam) isolatie van ischemische en controlelussen
- Elke lus van dunne darm met behulp van een 20-gauge draad en weefsel pincet bloot van de mucosal oppervlakte omkeren. Het binden van de boven- en onderkant van de lus veilig met de draad met hechtdraad (2-0 niet-absorbeerbare zijde of gelijkwaardig).
- Spoel na inversie, elke lus in ijs koud PBS luminal puin te verwijderen.
- Leg monsters onmiddellijk in 50 mL conische buizen met DR #1 op het ijs gedurende 30 minuten.
- Verzamelen van lussen die beginnen met de controle en volg met lusjes van incrementeel toenemende duur van ischemie. Lussen van minder beschadigde weefsel (d.w.z. controle en 1 h ischemische weefsel) kunnen krachtig, worden geschud breuk van de pols voor de beste resultaten. Weefsels van ernstig beschadigde weefsel (3 en 4 h van ischemie) moeten voorzichtig worden wiegde of omgekeerde alleen als teveel schudden leiden verstoring van de crypte en extra weefselvernietiging tot zal. Buizen moeten worden geschud of omgekeerd elke 5 min terwijl op ijs.
- Pipetteer monsters in DR #2 gedurende 10 minuten in een waterbad 37° C. Schud of omkeren buizen elke 5 min.
- Centrifugeer na het overbrengen van de weefsels, de conische buisjes met DR #1 van de 2-4 h beschadigd lussen te verwijderen van de EDTA supernatant (200 x g gedurende 5 minuten). Als deze weefsels zijn sterk beschadigd is het mogelijk dat de crypten hebben al worden losgekoppeld. Verwijderen van supernatant en resuspendeer de pellet met een klein volume van PBS (5 mL) en ga verder met stap 3.9.
- Monsters uit DR #2 verwijderen en plaatsen van weefselmonsters rechtstreeks in 25 mL koude PBS op ijs (label als Wash #1). Leg de monsters op een roteerschudapparaat op ijs op 60 rpm. Blijven schudden of omkeren van elke buis voor 30 s elke 2 tot en met 5 min.
- Na het overbrengen van de weefsels, draai de conische buisjes met DR #2 van de 2-4 h beschadigd lussen te verwijderen van de EDTA supernatant (200 x g gedurende 5 minuten). Als deze weefsels zijn sterk beschadigd is het mogelijk dat de crypten los moeten worden gezien. Verwijderen van supernatant en resuspendeer de pellet met een klein volume van PBS (5 mL) en ga verder met stap 3.9.
- Verwijderen van een hoeveelheid van 50 µL van Wash #1 (of van de DR) om te controleren of de mate van crypt dissociatie en hoeveelheid puin. Plaats van weefsel in een nieuwe conische tube van 50 mL (Wash #2, #3, etc.) gevuld met 25 mL koude PBS en schud totdat intact crypten geïsoleerd met minimale puin en villi zijn.
Opmerking: Het doel is om het isoleren van een schone breuk met intact crypten en minimale puin te kunnen. Elke extra wassen zal het schoonmaken van de cellen echter teveel schudden beginnen zal te resulteren in secundaire weefsel/celbeschadiging. Bovendien zal de beste resultaten met de minste verontreiniging worden bereikt als crypten zijn verguld uit een wassen stap en niet uit een dissociatie reagens stap. - Verwijder het resterende weefsel en de conische buisjes van 50 mL bij 200 x g Centrifugeer gedurende 5 minuten om te verwijderen van de bovendrijvende substantie en resuspendeer de resterende van de crypte pellet in kleinere hoeveelheid PBS (5 mL).
- Met behulp van een omgekeerde microscope, onderzoeken 50 µL aliquots van elk monster te bepalen aantal crypten/breuk. Het doel is 50-100 crypten/50 µL, omdat dit de grootte van de uiteindelijke matrix patty.
Opmerking: Als het monster te geconcentreerd is, blijven koud PBS toevoegen tot de gewenste concentratie wordt bereikt. Als voorbeeld ook verdund is, Bepaal hoeveel aliquots moest bereiken gewenste crypt opbrengst en aan te passen. - Aliquot passende volumecapaciteit van crypten (bepaald door de hoeveelheid opmerkingen) in een microcentrifuge buis. Bijvoorbeeld, als monster bevat 50 crypten/50 µL dan aliquoot 50 µL per patty X 3 repliceert = 150 µL / microcentrifuge buis. Als het monster alleen bevat 25 crypten/50 µL dan 2 aliquots nodig / patty X 3 repliceert = 300 µL/buis.
- Pellet crypten bij 200 x g gedurende 5 min bij 4° C.
- Zachtjes resuspendeer Ingehuld crypten met passende omvang van master mix (50 µL per putje). Meng door snel pipetteren 15 keer zonder dat er luchtbellen.
Opmerking: Cool vooraf het uiteinde van de pipet met koude steriel PBS voorafgaand aan de master mix aspirating. Dit zal helpen voorkomen dat de master mix uitspreiden. Tips kunnen ook in de koelkast bewaard worden en in de kap geplaatst onmiddellijk vóór gebruik. - Afzien van een 50 µL master mix plus crypt druppel in het midden van elk putje van een voorverwarmde 24 goed plaat.
- Incubeer de plaat van de cultuur gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
- Overlay elke matrix patty met 500 µL / goed van IESC media (geen extra groeifactoren die nodig zijn op dag 0, zoals zij zijn vervat in de master mix).
- 500 µL steriel PBS toevoegen aan elke ongebruikte putjes links op de plaat om vochtigheid.
- Aantal vergulde crypten op dag 0.
Opmerking: Het is handig om pre raster elke cel cultuur plaat in kwadranten om ervoor te zorgen dat nauwkeuriger tellen. - Aantal enterospheres elke 24 h tellen en controleren voor enteroid ontwikkeling dagelijks.
- Het toevoegen van groeifactoren aan elke goed elke 48 h. de IESC media elke 96 h Verwijder en vervang door 500 µL verse media (groeifactoren moet vervolgens worden toegevoegd aan media).
Representative Results
Volledige intestinale ischemie ontstond in kleine intestinale lussen door gebruik te maken van de vasculaire occlusie met hechtdraad of klemmen zoals afgebeeld in Figuur 1. Door het vrijgeven van de klemmen, kan een gecontroleerde periode van reperfusie worden uitgevoerd, waardoor aanvullende studie van latere reperfusie schade indien gewenst. Alle dieren overleefde tijdens de procedure met minimale complicatie tot euthanasie. De meest voorkomende chirurgische complicatie was hypotensie, die met suppletie van een positieve-inotrope zoals dobutamine opgelost.
Indien goed uitgevoerd, ischemische schade begint op het puntje van de intestinale villosités en migreren naar beneden in de crypte als de duur van de verhogingen van de ischemie (Figuur 2). Een veel voorkomende fout met de chirurgische techniek kan optreden wanneer de bloedvaten niet worden afgebonden of gelijkmatig geklemd. Het resultaat is een hemorragische ischemie (Figuur 3), waarin de ader dunwandige voordat de slagader instort, waardoor extra bloed naar de weefsels te infiltreren. Schromelijk wordt dit beschouwd als een donkere paarse serosal oppervlak (Figuur 3, links) in vergelijking met een bleker oppervlak tijdens volledige ischemie (Figuur 3, rechts).
Na verwijdering van de ischemische intestinale loops werden intestinale crypten met succes geïsoleerd volgens de dissociatie protocol (Figuur 4). Zoals verwacht, de crypten van meer zwaar beschadigde timepoints werden vaak gebroken (f; fragment) en crypte breuken bevatte meer achtergrond cellulaire puin in vergelijking met degenen die onderging van geen of lichte schade. Tijdens het protocol, moet de ernstig gewonde darm voorzichtig worden geschud Voorkom extra schade aan het onderliggende weefsel. Schudden ook ongeveer kan leiden tot verdere schade van de crypte en de meerderheid van de crypten eindigend in de DR oplossingen met EDTA, wat resulteert in extra verstoring.
Zodra verguld, crypten van alle tijdstippen van ischemie overleven en zijn in staat om zich te vestigen in cultuur (Figuur 5). Wanneer normale en licht beschadigde intestinale crypten zijn verguld in cultuur, enterospheres formulier binnen 24-48 uur. Met ernstige ischemische schade (3 en 4 h), de intestinale crypten overleven maar zijn beschadigd, wat resulteert in de vorming van veel kleinere bollen in eerste instantie. Door 72-120 h complexer enteroids met duidelijk centraal lumen en ontluikende structuren. Over het algemeen is er een verminderde groei efficiëntie van de crypten en een verminderde grootte van enteroids die zijn afgeleid van de zwaar beschadigde intestinale weefsel (Gonzalez, L.M., niet-gepubliceerde gegevens, 2017).
Figuur 1 : Chirurgische model van volledige intestinale ischemie in een varkens model. A) normale varkens jejunum die. B) mesenterische vaartuigen hebben zijn afgebonden met hechtdraad maken van intestinale ischemie. C) ischemie gemaakt met behulp van bulldog vasculaire klemmen toe voor weefsel reperfusie indien gewenst. D) intestinale therapieën onmiddellijk na verwijdering van de vasculaire klemmen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Histologische bewijs (haematoxyline en eosine (H & E) vlek) van toenemende epitheliale schade na langere duur van de volledige intestinale ischemie. Schade begint bij het puntje van de villosités met geleidelijk verlies van eencellige epitheliale laag, villosités afstomping en cellulaire schade uit te breiden tot de crypte basis met ernstig letsel (maximaal 4 h duur). 100 µm schaal bar. Ik = ischemie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Bruto en histologische bewijs van hemorragische ischemie. A) bruto foto vergelijken hemorragische ischemie (linker lus) en volledige ischemie (juiste lus). Wanneer de therapieën is niet afgebonden of geklemd gelijkmatig, kan bloed blijven om te infiltreren in de weefsels, resulterend in bijkomende ontstekingen en schade. B) H & E beelden van hemorragische ischemie van het verhogen van de duur van 1-4 h. Naast cellulaire schade gezien met volledige ischemie, is er bewijs van rode bloedcellen infiltratie in de omliggende lamina propria. 100 µm schaal bar. Ik = ischemie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Aliquots van intestinale crypten geïsoleerd van lussen van ischemische en normale darm. Complete, onbeschadigde intestinale crypten (sterretjes) werden met succes geïsoleerd uit elke lus van darm. Zoals verwacht, de crypten van meer zwaar beschadigde tijdstippen werden vaak gebroken (f; fragment) en crypte breuken bevatte meer achtergrond cellulaire puin in vergelijking met degenen die onderging van geen of lichte schade. 100 µm schaal bar. Ik = ischemie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Tijdsverloop van de cel van de stam van de intestinale groei na het isoleren van ischemische lusjes van de dunne darm. Bij het normale intestinale crypten werden uitplaten in cultuur, wordt enterospheres gevormd binnen 24-48 uur. Met ernstige ischemische schade (3 en 4 h), crypten overleven, maar in eerste instantie veel kleinere bollen vormen. Door 72-120 h complexer enteroids met duidelijk centraal lumen en ontluikende structuren. 20 µm schaal bar tenzij vermeld. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Groeifactor | Verdunningsmiddel | Voorraad concentratie | Voorraad verdunning | Werkende verdunning |
| R-Spondin | PBS | 100 X | 100 µg/ml | 1 µg/ml |
| Bekertje | SW/0.1%BSA | 1000 X | 100 µg/ml | 100 ng/ml |
| EFG | 10mM azijnzuur | 10.000 X | 500 µg Mo/ml | 50 ng/ml |
| A-83-01 | DMSO | 1000 X | 500 ΜM | 500 nM |
| SB202190 | DMSO | 3000 X | 30 mM | 10 ΜM |
| Nicotinamide | SW | 1000 X | 1 M | 1 mM |
| Gastrine | PBS | 10.000 X | 100 ΜM | 10 nM |
| Y-27632 | PBS | 1000 X | 10 mM | 10 ΜM |
| LY2157299 | DMSO | 10.000 X | 5 mM | 0,5 ΜM |
| CHIR99021 | PBS | 1000 X | 2.5 mM | 2,5 ΜM |
| Wnt3a | PBS | 2000 X | 200 µg Mo/ml | 100 ng/ml |
Tabel 1: groeifactor reagens tabel. Samenvatting van de groeifactor stamoplossingen en werkende oplossingen die in dit protocol worden gebruikt.
Discussion
De ontwikkeling van een varkens model van gesegmenteerde intestinale ischemie breidt op eerdere lymfkliertest modellen doordat voor de studie van meerdere tijdstippen van weefsel schade binnen hetzelfde dier. Er zijn verschillende punten van de kritische bespreking van dit protocol, met inbegrip van juiste schip afbinding, weefsel reperfusie en de cultuur van de cel van de succesvolle crypt.
Juiste schip Afbinding is essentieel voor het creëren van een model van volledige ischemie. Als de hechtdraad ongelijk is gebonden of de klem niet strakker volledig, bloed uit de dikwandige slagader kan blijven invoeren van het weefsel en kan niet afsluiten als gevolg van de ineenstorting van de ader dunwandige. Dit resulteert in extravasation van bloed in de lamina propria extra weefsel schade. Echter, afhankelijk van het soort ischemische schade bestudeerd, volledige of hemorragische ischemie kan wensen. Bijvoorbeeld, in het proces van intestinale transplantatie, de darm is volledig gescheiden blijft van de vasculaire levering (slagader en ader) tijdens de resectie fase van de procedure, die tot volledige intestinale ischemie leidt. Anderzijds echter wordt wanneer het mesenterium is gedraaid tijdens een gebeurtenis zoals een intestinale volvulus, de veneuze terugkeer vaak belemmerd eerst, wat leidt tot extra bloed in het weefsel voorafgaand aan de arteriële levering wordt belemmerd, waardoor hemorragische ischemie.
Ischemische schade resulteert in weefselschade, beginnend bij het uiteinde van de villosités en uit te breiden tot de basis van de crypte3. Tijdens ischemie, energie in de vorm van adenosinetrifosfaat blijft worden gebruikt en genereert de metaboliet hypoxanthine. Wanneer het weefsel is reperfused met zuurstof, hypoxanthine wordt gemetaboliseerd door xanthine oxidase en produceert superoxide vrije radicalen leidt tot mucosal schade en de aantrekkingskracht van weefsel beschadiging van neutrofielen17,18. Soorten verschillen in mucosale vasculaire architectuur evenals de variërende uitdrukking van xanthine oxidase, leiden tot wisselend reperfusie schade3. Katachtige en knaagdier modellen van ischemie-reperfusie zijn meer vatbaar voor reperfusie letsel van reactieve zuurstof metabolieten19,20. Daarentegen is varkens bleken te hebben minder xanthine oxidase, en dus minder reperfusie schade, waardoor dit model meer vergelijkbaar is met die van menselijke intestinale ischemie21. Op dit moment, werd het gebruik van knock-out of transgene varkens modellen om te studeren van intestinale letsel niet genoemd, waardoor dit een belangrijke beperking van dit model. Keuze van de juiste diermodel hangt af van het ziekteproces of specifieke voorwaarde de onderzoeker wil bestuderen. Bijvoorbeeld, zijn varkens modellen van ischemische schade tot 6 h beschreven22, overwegende dat de meest ischemische procedures in lymfkliertest modellen zijn 45-60 min23.
Succesvolle isolatie van intestinale cryptes uit normale en ischemically beschadigde darm zorgt voor de studie van epitheliale herstel in cultuur. Dit systeem kan de onderzoeker te uniek te concentreren op het epithelium alleen, aangezien er geen vasculaire levering of immuun cel component te overwegen. Dit biedt de mogelijkheid te bestuderen van epitheliale cel interacties en herstel na letsel naast het antwoord op verschillende groeifactoren, of behandelingen toegediend tijdens de operatie of de volgende crypt isolatie door aanvulling van de voedingsbodems. Deze stap blijft de moeilijkste, omdat los van de zwaar beschadigde lussen vereist zacht schudden en snelle verwijdering van de oplossingen van EDTA-bevattende ingeval de crypten zijn geworden voortijdig losgekoppeld. Als deze lusjes van de darm niet grondig worden gewassen, hebben de crypten het potentieel om besmet raken in cultuur. Dientengevolge, antibioticum-antimycotic oplossing toevoegde aan beide oplossingen DR naast de IESC media. Een ander punt van discussie richt zich op de darm verzameld als een normale controle. Als de dieren ondergaan anesthesie met mogelijke wijzigingen in de systemische weefsel perfusie, samen met de mogelijkheid van circulerende inflammatoire mediatoren ondergeschikt aan ischemie, kan zelfs "normale" controle weefsel niet vertegenwoordigen een echte controle. In deze experimenten is het voor de opmerking dat het besturingselement weefsel verscheen grove en histologisch vergelijkbaar met weefsel van dieren die niet ondergaan ischemie in andere experimenten (Gonzalez, L.M., niet-gepubliceerde gegevens, 2017).
Kortom beschrijft deze methode een reproduceerbare model van varkens intestinale ischemie, die nauw modellen wat er gebeurt in menselijke ischemische schade. Bovendien, het isolement van intestinale stamcellen uit ischemische lussen wordt beschreven, die dient om epitheliale reparatie en mogelijke respons op behandeling in cultuur te studeren.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit project werd ondersteund door de NIH K01OD0199, NIH T32 OD011130 NIH P30DK034987 en Dept. of klinische wetenschappen verspreiding Funds
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline, Ca2+, Mg 2+ free | Fisher Scientific | BP-399 | Dilute 1:10 |
| Distilled, deionized water (ddH2O) | Used to prepare EDTA and PBS | ||
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Thermo Scientific | 20688 | |
| Ethylenediamene tetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | ED45 | Make fresh before each experiment; pH 7.4 |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | 646563 | |
| Y-27632 | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | |
| B-27 Supplement | Life Technologies | 12587-010 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630-106 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | |
| Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B | Gibco | 15240-096 | Anti-Anti solution |
| Recombinant human Wnt-3a | R & D Systems | 5036 WN/CF | |
| Recombinant human Rspondin1 | R & D Systems | 4645- RS | |
| Recombinant human Noggin | R & D Systems | 6057-NG | |
| Recombinant human EGF | R & D Systems | 236-EG | |
| LY2157299 | SelleckChem | 52230 | |
| CHIR99021 | Cayman Chemical | 13122 | |
| Human [leu]15-Gastrin 1 | Sigma Aldrich | G9145 | |
| SB202190 | Sigma Aldrich | 57067 | |
| A83-01 | Tocris | 2939 | |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | |
| Acetic Acid | Sigma Aldrich | 695092 | |
| Water, WFI Quality | Corning, Inc. | 25-055-CM | Referred to as sterile water (SW); for growth factor stocks |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | |
| Matrigel Matrix, GFR | Corning, Inc. | 356231 | Phenol red free |
| 24 Well Culture Dish | Corning, Inc. | 3524 | |
| Conical Tube, 50 ml | Corning, Inc. | 430828 | |
| Scalpel Handle | World Precision Instruments | 500236 | |
| Carbon Steel Surgical Blade, No. 10 | World Precision Instruments | 504169 | |
| Tissue Forceps | World Precision Instruments | 15918 | |
| Debakey Tissue Forceps | World Precision Instruments | 501239 | |
| Mayo Scissors | World Precision Instruments | 501752 | Curved or straight |
| Metzenbaum Scissors | World Precision Instruments | 501739 | |
| Mosquito Forceps, Curved | World Precision Instruments | 503724-12 | Curved or straight (503728-12) |
| Hopkins Bulldog Clamp | Stoelting Co. | 52120-40P | Straight |
| Silk, 2-0 | Henry Schein | 685S-BUT | Any similar brand is acceptable |
| Towel Clamps | World Precision Instruments | 501700 | |
| Needle Holder | World Precision Instruments | V503382 | |
| Wire suture, 20 gauge | Henry Schein | 19075 | Cut and straighten before use. |
| Surgical Towels | Henry Schein | ST1833 | Any similar product is acceptable. |
| Lactated Ringers Solution | Henry Schein | 9851 | |
| Chlorhex antiseptic scrub (4%) | Henry Schein | VINV-CHMX-SCRB | Any similar brand is acceptable |
| Isopropyl Alcohol 70% | Henry Schein | MS071HS | Any similar brand is acceptable |
| IV catheter, 22 gauge | Henry Schein | 2225PUR | May need 20g or 24 g depending on size of the vein |
| Xylazine (100 mg/ml) | Henry Schein | 33198 | |
| Ketamine (100 mg/ml) | Henry Schein | 11695-6835-1 | Controlled medication |
| Isoflurane solution | Henry Schein | 10015516 | |
| Pentobarbital (Fatal Plus Euthanasia Solution (390 mg/ml)) | Vortech Pharm. | Multiple brands of Pentobarbital Sodium available. | |
| Heating pad | Gaymar | Tpump Core Warming System; others are available. | |
| Mindray Datascope Monitor | Mindray North America | Any equivalent piece of monitoring equipment acceptable | |
| Vaporizer | Vetland Medical | Recommended to use a Circle System w/ Y piece; multiple suppliers available. | |
| Fluid Pump | Abbott Hospira | Plum A+; Any similar manufacturer is recommended. |
References
- Eltzschig, H. K., Eckle, T. Ischemia and reperfusion--from mechanism to translation. Nat Med. 17 (11), 1391-1401 (2011).
- Blikslager, A. T. Treatment of gastrointestinal ischemic injury. Vet Clin North Am Equine Pract. 19 (3), 715-727 (2003).
- Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. Animal models of ischemia-reperfusion-induced intestinal injury: progress and promise for translational research. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 308 (2), 63-75 (2015).
- Podolsky, D. K. Mucosal immunity and inflammation. V. Innate mechanisms of mucosal defense and repair: the best offense is a good defense. Am J Physiol. 277 (3), 495-499 (1999).
- Collard, C. D., Gelman, S. Pathophysiology, clinical manifestations, and prevention of ischemia-reperfusion injury. Anesthesiology. 94 (6), 1133-1138 (2001).
- Mallick, I. H., Yang, W., Winslet, M. C., Seifalian, A. M. Ischemia-reperfusion injury of the intestine and protective strategies against injury. Dig Dis Sci. 49 (9), 1359-1377 (2004).
- Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. Porcine models of digestive disease: the future of large animal translational research. Transl Res. 166 (1), 12-27 (2015).
- Ziegler, A., Gonzalez, L. M., Blikslager, A. T. Large animal models: The key to translational discovery in digestive disease research. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 2 (6), 716-724 (2016).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Meneses, A. M. C., et al. Intestinal organoids-Current and future applications. Veterinary Sciences. 3 (4), 31 (2016).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy. J Vis Exp. (97), (2015).
- Dedhia, P. H., Bertaux-Skeirik, N., Zavros, Y., Spence, J. R. Organoid models of human gastrointestinal development and disease. Gastroenterology. 150 (5), 1098-1112 (2016).
- Swindle, M. M., Smith, A. C. Swine in the Laboratory: Surgery, Anesthesia, Imaging & Experimental Techniques, 3rd Ed. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2015).
- Riebold, T. W., Geiser, D. R., Goble, D. O. Large Animal Anesthesia: Principles and Techniques, 2nd Ed. , Iowa State University Press. Ames, Iowa. (1995).
- Parks, D. A., Granger, D. N. Contributions of ischemia and reperfusion to mucosal lesion formation. Am J Physiol. 250 (6), 749-753 (1986).
- Schoenberg, M. H., et al. Involvement of neutrophils in postischaemic damage to the small intestine. Gut. 32 (8), 905-912 (1991).
- Nilsson, U. A., et al. Free radicals and pathogenesis during ischemia and reperfusion of the cat small intestine. Gastroenterology. 106 (3), 629-636 (1994).
- Osborne, D. L., Aw, T. Y., Cepinskas, G., Kvietys, P. R. Development of ischemia/reperfusion tolerance in the rat small intestine. An epithelium-independent event. J Clin Invest. 94 (5), 1910-1918 (1994).
- Blikslager, A. T., Roberts, M. C., Rhoads, J. M., Argenzio, R. A. Is reperfusion injury an important cause of mucosal damage after porcine intestinal ischemia. Surgery. 121 (5), 526-534 (1997).
- Shegarfi, H., et al. Regulation of CCN1 (Cyr61) in a porcine model of intestinal ischemia/reperfusion. Innate Immun. 21 (5), 453-462 (2015).
- Gubernatorova, E. O., Perez-Chanona, E., Koroleva, E. P., Jobin, C., Tumanov, A. V. Murine model of intestinal ischemia-reperfusion injury. J Vis Exp. (111), (2016).
