Summary
Descriviamo un metodo novello per la consegna del plasmide del DNA nelle cellule uroteliali del mouse della vescica in vivo tramite cateterizzazione dell'uretra e l'elettroporazione. Offre un modo veloce e conveniente per la generazione di modelli murini autoctoni di malattie di vescica.
Abstract
Modelli murini geneticamente (GEMM) sono estremamente utili nel rivelare nuove conoscenze biologiche sui meccanismi di iniziazione e progressione delle malattie umane come il cancro. Topi knock-out condizionale e transgenici sono stati usati frequentemente per la sovraespressione genica o tipi di ablazione in specifici tessuti o cellule in vivo. Tuttavia, la generazione di modelli murini di germline possono essere lunghe e costose. Gli avanzamenti recenti nel gene editing tecnologie e la fattibilità di erogare plasmidi di DNA tramite l'infezione virale hanno permesso la rapida generazione di modelli di germline non autoctono del topo del cancro per parecchi organi. La vescica è un organo che è stato difficile per vettori virali accedere, a causa della presenza di uno strato di glicosaminoglicani che copre l'urotelio. Qui, descriviamo un nuovo metodo sviluppato nel laboratorio per la distribuzione efficiente dei plasmidi di DNA nel mouse vescica urotelio in vivo. Tramite instillazione intravescicale di plasmide del DNA pCAG-GFP ed elettroporazione della vescica esposta chirurgicamente, indichiamo che il plasmide del DNA possa essere consegnato in particolare le cellule uroteliali della vescica per espressione transitoria. Il nostro metodo fornisce un modo veloce e conveniente per la sovraespressione e atterramento di geni nella vescica del mouse e può essere applicato alla costruzione di GEMM di cancro alla vescica e altre malattie urologiche.
Introduction
Modelli murini geneticamente (GEMM) hanno giocato un ruolo essenziale ad ampliare la nostra conoscenza circa lo sviluppo animale, gene funzioni in vivoe meccanismi di malattia progressione1,2. Germline GEMM sono tradizionalmente sviluppato in due modi. Il primo è la creazione di topi transgenici di pronuclei iniezione del plasmide DNA seguito da trapianto di zigoti in femmine pseudopregnant. L'altra è la generazione di topi knock-out/knock-in di ricombinazione omologa in cellule staminali embrionali e lo sviluppo delle chimere. Knockout condizionale di geni nel tipo specifico dei tessuti o cellule di interesse comporta l'allevamento degli alleli geneticamente ingegnerizzati con siti Cre e flox per più generazioni. L'intero processo può essere costoso e richiede tempo, soprattutto se l'obiettivo è di indirizzare i geni multipli del tessuto-specifico. Recentemente, la modifica del gene tecnologie quali cluster regolarmente intercapedine ripetizioni brevi palindromi (CRISPR) sono state applicate a parecchi organi dei topi per indurre le alterazioni genetiche tessuto-specifico per il cancro autoctono modellazione3, 4,5,6,7 o mutazioni della malattia corretta in situ8,9. In questi studi, la consegna dei vettori gRNA solitamente è stata realizzata attraverso l'infezione adenoviral o lentivirale dell'organo o idrodinamico vena caudale iniezione. La relativa facilità di consegna dei componenti CRISPR il polmone ed il fegato ha notevolmente migliorato la comodità e l'efficienza di cancro in questi organi rispetto ai tradizionali modelli del mouse Cre-Lox basata di modellazione.
Il urothelium della vescica è dove la maggior parte dei tumori della vescica hanno origine. La consegna dei vettori di DNA per il urothelium della vescica per la terapia del gene o modellazione è ostacolata da uno strato di glicosaminoglicani sulla superficie apicale urothelial, che agisce come una barriera per l'aderenza di virus infettivi10,11. Diversi agenti di pretrattamento come Syn3 e dodecil-β-d-maltoside sono stati utilizzati per interrompere questa barriera e usufruire dell'adenovirus infezione efficienza12,13,14. Se il virus adeno-associato (AAVs) efficacemente può infettare la vescica non è stata segnalata. Nel complesso, un metodo di consegna di base non-virale sarebbe auspicabile. Qui, descriviamo un nuovo metodo sviluppato in laboratorio per consegna efficiente DNA del plasmide dell'urotelio del mouse tramite cateterizzazione dell'uretra e l'elettroporazione. Perché il nostro approccio non comporta pretrattamento chimico di strato di glicosaminoglicani o produzione di virus, significativamente semplifica la consegna dei plasmidi di DNA nell'urotelio vescica del mouse e dovrebbe facilitare vari studi in vivo di malattie di vescica.
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Protocol
Tutte le procedure qui descritte sono state eseguite in conformità con le linee guida e regolamenti istituzionali Animal Care e uso Committee (IACUC) della University of California Santa Cruz.
1. plasmide e preparazione di strumenti
- Per ogni vescica a transfect, preparare almeno 20 µ l di plasmide del DNA (1 µ g / µ l).
- Aggiungere 1 µ l di Trypan Blue il 20 µ l di soluzione di plasmide in una microcentrifuga da 1,5 mL. Pipetta per mescolare bene.
- Autoclave tutti chirurgico strumenti e sterilizzare l'area di lavoro con etanolo al 70%. Spruzzare frequentemente gli strumenti chirurgici e guanti con etanolo al 70% o utilizzare uno sterilizzatore del branello di vetro quando si eseguono le seguenti operazioni per mantenere condizioni di sterilità.
2. anestetizzante animale
- Utilizzare un sistema di anestesia top tavolo per anestetizzare l'animale con isoflurano. Girare sul serbatoio O2 e regolare il flussometro ossigeno a 1 L/min.
- Posto un topo C57BL/6J femmina adulto nella camera di induzione. Accendere e regolare il vaporizzatore di isoflurane al 3% per induzione. Il mouse dovrebbe essere in anestesia entro 2 min amministra buprenorfina analgesico (0,1 mg/kg) per via sottocutanea dopo la rimozione del mouse dalla camera di induzione per preemptive analgesia.
Nota: Nel presente protocollo, i topi femminili sono usati, come sono più facili da lavorare con durante la cateterizzazione di uretra. Il protocollo funziona anche per topi maschi, ma prestare particolare attenzione è necessaria quando si esegue il passaggio 3. - Applicare unguento oftalmico agli occhi dell'animale per prevenire la secchezza. Posizionare il mouse anestetizzato rivolto verso l'alto su un rilievo di riscaldamento con il suo naso nel cono di naso. Girare l'interruttore del circuito di aria per lasciare isoflurano andare attraverso il cono di naso.
- Trattenere la testa e il naso a cono con nastro adesivo. Regolare il vaporizzatore di isoflurane al 2% per la manutenzione.
- Trattenere le membra con nastro adesivo. Eseguire test toe-pizzico per assicurarsi che l'animale è in anestesia profonda e quindi radere la zona addominale.
3. urina svuotamento e lavaggio della vescica
- Applicare il lubrificante al catetere (24G, 2,11 cm di lunghezza, diametro esterno di 0,045 cm) e garantire che la sua superficie esterna è completamente coperto.
- Inserire il catetere nell'uretra apertura e spingere lentamente fino a raggiungere la vescica, momento in cui l'urina dovrebbe defluire attraverso il catetere. Premere delicatamente l'addome per aiutare lo svuotamento dell'urina.
- Verifica se il catetere è inserito correttamente nella vescica osservando automatico urina fuori-flusso. Evitare piercing la parete della vescica e uretra e applicare il lubrificante più volte se necessario.
- Scartare l'urina con una pipetta in un becher da rifiuti.
- Pipettare 80 µ l di tampone fosfato salino (PBS) nell'estremità esterna del catetere, con l'altra estremità ancora nella vescica. Con attenzione è possibile collegare una siringa da 1 mL al catetere. Spingere delicatamente la siringa per iniettare il PBS nella vescica. Lasciare alcuni PBS del catetere per evitare di creare bolle d'aria nella vescica.
- Rimuovere la siringa. Aspettare per la PBS drenare dalla vescica. Premere delicatamente l'addome per evacuare PBS.
- Scartare il PBS del catetere con una pipetta nel contenitore dei rifiuti.
- Ripetere PBS lavaggio (passaggi 3.4-3.6) per altre due volte.
Nota: È fondamentale lavorare delicatamente durante queste fasi di lavaggio. Sangue nel catetere o il fallimento di automatico fuori-fluire del liquido indica in genere l'uretra è trafitto. È anche importante evitare di introdurre bolle d'aria, come essi potranno diminuire l'efficienza di elettroporazione.
4. plasmide consegna
- Applicare etanolo al 70% all'addome del mouse e utilizzare un bisturi per praticare un'incisione verticale di 1 cm per aprire la pelle dell'addome sopra la vescica.
- Pipettare almeno 20 µ l di plasmide plus soluzione tripan blu in estremità esterna del catetere e collegare la siringa.
- Iniettare la soluzione di plasmide nella vescica. Se la vescica diventa blu, l'iniezione è successo. Lasciare un po' di liquido del catetere per evitare di creare bolle d'aria nella vescica.
- Afferrare l'orifizio uretrale esterno con pinzette e quindi rimuovere il catetere e la siringa. Utilizzare una stringa per stringere l'orifizio uretra esterno. Fare due anelli con la stringa e poi legare con due nodi.
Nota: Serraggio dell'uretrale è importante per impedire il riflusso del liquido del plasmide. - Accendere il generatore di elettroporazione con i seguenti parametri: 33V, 50 ms tempo di lavoro e 950 ms tempo di intervallo.
- Tenere la vescica con una pinzetta e pizzicare la vescica con due elettrodi. Spingere il pedale per eseguire l'elettroporazione.
Nota: Gli impulsi elettrici sono impostati a verificarsi 5 volte con brevi intervalli di tempo dopo ogni pressione del pedale. Il mouse può contrarsi in questo processo. Spingendo il pedale più di una volta può aumentare l'efficienza di consegna, ma anche molti impulsi elettrici possono danneggiare l'integrità del tessuto dell'urotelio.- Evitare il contatto tra le pinzette e gli elettrodi, come questo genererà una scintilla.
5. il recupero
- Suturare l'apertura addominale e pelle con sutura chirurgica sterile e clip. Applicare iodio sulla ferita.
- Rimuovere l'animale dal sistema isoflurano. Amministrare la buprenorfina analgesico (0,1 mg/kg) per via sottocutanea per alleviare il dolore post-operatorio.
- Tenere l'animale il termoforo e tornare alla gabbia a casa dopo il recupero completo. Controllare l'animale almeno una volta al giorno per la normale mobilità, abbeveraggio e alimentazione comportamenti e senza segni di infezione, fino a quando l'incisione è guarito e quindi rimuovere le clip. Se l'animale Visualizza il sintomo di dolore come ridotto toelettatura, aumentata aggressività e vocalizzazione, somministrare iniezioni successive di buprenorfina analgesico.
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Representative Results
Per dimostrare il successo di consegna del gene in urothelium della vescica, abbiamo usato il plasmide di15 pCAG-GFP per elettroporazione. 20 µ l di soluzione Trypan Blue e plasmide è stato iniettato attraverso l'uretra e 5 impulsi elettrici sono stati amministrati. Dopo 48 h, abbiamo dissecato la vescica del mouse e osservato le patch di fluorescenza di GFP sotto un microscopio di fluorescenza di dissezione, mentre un negativo di controllo della vescica che non subissero elettroporazione ha mostrato nessun segnale GFP (Figura 1A). Quando abbiamo effettuato l'immunofluorescenza colorazione dei tessuti della vescica sezionato con il cytokeratin (CK) 5, CK18, e gli anticorpi GFP, abbiamo trovato che la GFP segnale era presente in ombrello, intermedio e cellule basali, ma non nel muscolo di strato (Figura 1B), che indica buona specificità di consegna di plasmide nell'urotelio. Circa il 15% delle cellule uroteliali sono GFP+, e tale natura clonale dovrebbe essere l'ideale per il cancro poiché i tumori di solito avviare da singole celle di modellazione.
Figura 1: consegna di successo del plasmide pCAG-GFP per mouse vescica urothelium. (A) confronto di una vescica che ha subito l'elettroporazione (a destra) per una vescica di controllo negativo (a sinistra) mostrando che elettroporazione con successo la vescica verde acceso. (B) immunofluorescenza colorazione dei tessuti della vescica sezionato risultati pattern di espressione di mosaico delle cellule GFP+ in ombrello (CK18+), intermedio (CK5+CK18+) e basali (CK5+) urothelial strati. Barra della scala nel A corrisponde a 1 mm e in B a 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Elettroporazione migliora la permeabilità della membrana cellulare ed è una potente tecnologia per gene electrotransfer16. Consegna del gene in roditori vivente mediante elettroporazione è stato frequentemente utilizzato in neurobiologia campi17,18,19,20,21. Le sue potenziali applicazioni in molti altri organi non sono stati esplorati estesamente. A nostra conoscenza, il nostro metodo qui descritto è il primo rapporto di consegna di successo del gene mediante elettroporazione per il urothelium della vescica. Offre diversi vantaggi per i metodi di infezione dell'adenovirus/lentivirus-based. In primo luogo, il metodo di elettroporazione è più facile, più sicuro e più conveniente di adottare perché vengono utilizzati vettori non virali genetici e la consegna dei plasmidi a DNA per organo specifico siti in vivo è relativamente semplice. In secondo luogo, si evita la risposta immune dell'ospite indesiderato che sono spesso associati con la consegna di virus vettori22. In terzo luogo, nel caso di vescica, nega la necessità di pretrattamento chimico dello strato di glicosaminoglicani, che normalmente blocca il legame del virus alle cellule uroteliali.
Le fasi più critiche in questo protocollo sono la cateterizzazione, il risciacquo e l'iniezione di plasmide. Molta attenzione e delicatezza sono necessarie per garantire che il catetere non perforare attraverso l'uretra o la parete della vescica durante l'esecuzione di inserimento e fissaggio/togliere la siringa. Applicare il lubrificante adeguato per coprire completamente l'esterno è essenziale anche la superficie del catetere. Un'altra causa probabile dell'errore è l'introduzione di bolle d'aria nella vescica durante l'iniezione di risciacquo e plasmide, poiché farà diminuire conduttività elettrica. Per evitare questo, si consiglia sempre lasciando un po' di liquido del catetere durante l'esecuzione di questi passaggi.
Il nostro protocollo dovrebbe funzionare per topi adulti di qualsiasi età, perché non abbiamo osservato una differenza nell'efficienza di consegna tra i più giovani (2 mesi) e più vecchi topi (1 anno). Diversi fattori possono influenzare l'efficienza di consegna del plasmide. Si consiglia di 20 µ l di plasmide come il minimo volume iniettabile come importo inferiore non può sufficientemente coprire la superficie interna della vescica. Aumento volume di plasmide e concentrazione generalmente produce maggiore penetrazione, ma è stato osservato alcun beneficio aggiuntivo per volumi oltre 60 µ l. dando più impulsi elettrici e toccando diverse aree superficiali della vescica con elettrodi avrà la più grande impatto sull'efficienza di consegna. I parametri di elettroporazione descritti in questo protocollo è impostato per consentire la permeabilizzazione delle cellule uroteliali, preservando l'integrità del tessuto, poiché più alta tensione tende ad indurre la morte delle cellule. È possibile modificare questi parametri per un'ulteriore ottimizzazione. Variazioni del mouse--mouse e la manipolazione del ricercatore possono influenzare notevolmente l'efficienza. A seconda l'obiettivo del progetto, si consiglia di eseguire prove per determinare i parametri ottimali per ogni esperimento specifico. Ad esempio, nel modellare l'inizio del cancro e crescita clonale, una penetrazione inferiore può essere desiderata.
Come una prova di principio per il nostro metodo di consegna, espressione di GFP possa essere fruiti nella vescica più presto 36 h dopo l'elettroporazione e può persistere per almeno due settimane. Con questo nuovo metodo, è ora possibile consegnare plasmidi di DNA alla vescica del mouse veloce ed economico per la sovraespressione genica o giù-regolamento ed editing genomico. Si apre nuove strade per studiare lo sviluppo della vescica e malattie, come pure la costruzione di modelli di cancro vescica autoctoni romanzo.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.
Acknowledgments
Ringraziamo il Professor Bin Chen, Dr. Yue Zhang e Kendy Hoang per aiuto con configurazione del sistema di elettroporazione. Quest'opera è stata sostenuta da sovvenzioni dal gruppo beneficio del cancro di Santa Cruz e NIH di Z.A.W.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD 1mL TB Syringe | Fisher | 148232E | |
| Buprenorphine | Sigma | B9275-50MG | |
| Dumont Tweezers | Roboz Surgical Instr | RS-5005 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| ECM830 SQ Wave Electroporator | Harvard Apparatus | 450052 | |
| Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters | Fisher Scientific | 14-841-21 | 24G, 2.11 cm length, 0.045 cm outer diameter |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors | Roboz Surgical Instr | RS-5135 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| Isoflurane | Vet one | 501017 | |
| K&H Heated Resting Mat for Small Animals, 9 By 12 Inches | Amazon | n/a | Cover the heat mat with paper towels |
| Ophthalmic ointment | Fisher | NC0849514 | |
| PBS, pH7.4 | Life Technologies | 10010049 | |
| Pipet tips 200 µL | USA Scientific | 1111-0206 | |
| Pipet Tips, Universal Fit; 0.1 to 10 µL | Fisher | 02707438(CS) | |
| PIPETMAN NEO P2 | Gilson | F144561 | |
| PIPETMAN NEO P200N | Gilson | F144565 | |
| plasmid CAG-GFP | Addgene | 16664 | |
| Platinum tweezertrode 5 mm | Harvard Apparatus | 450489 | 5 mm diameter |
| Scissors | Roboz Surgical Instr | RS-5880 | Treat with 70% ethanol before surgical use |
| String cord | Amazon | n/a | Mandala Crafts 150D 210D 0.8mm 1mm leather sewing stitching flat waxed thread string cord |
| Tape, Scotch | Fisher | 19047257 | |
| Therio-gel Veterinary Lubricant | PBS animal health | 353-736 | |
| Trypan Blue Stain | Life Technologies | 15250061 | |
| V-1 Table top system anesthesia | VetEquip | 901806 | |
| Vicryl violet suture 18" FS-2 cutting 5-0 | Fisher | NC0578475 | |
| Walgreens Povidone Iodine 10% | Walgreens | 953982 | |
| Wound clip | Fisher | 018045 | |
| Wound clip applier | Fisher | 01804 |
References
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