Summary
Qui, presentiamo un protocollo per visualizzare le cellule immunitarie incorporate in una matrice di collagene (3D) tridimensionale utilizzando la microscopia a luce-foglio. Questo protocollo elabora anche come tenere traccia di migrazione cellulare in 3D. Questo protocollo può essere impiegato per altri tipi di cellule in sospensione nella matrice 3D.
Abstract
In vivo, l'attivazione, proliferazione e funzione delle cellule immuni tutti si verificano in un ambiente tridimensionale (3D), per esempio nei linfonodi o tessuti. Fino a data, la maggior parte dei sistemi in vitro si basano su superfici bidimensionali (2D), come piastre di coltura cellulare o vetrini coprioggetti. A condizioni fisiologiche in modo ottimale mimare in vitro, utilizziamo una matrice di collagene 3D semplice. Il collagene è uno dei principali componenti della matrice extracellulare (ECM) ed è stato ampiamente utilizzato per costituire matrici 3D. Per l'imaging 3D, la tecnologia sviluppata di recente la microscopia luce-foglio (noto anche come microscopia di illuminazione su un unico piano) è dotata di acquisizione ad alta velocità, profondità di penetrazione grande, candeggio basso e fotocitotossicità. Inoltre, la microscopia luce-foglio è particolarmente vantaggiosa per misurazioni a lungo termine. Qui descriviamo un protocollo ottimizzato come impostare e gestire le cellule immuni umane, ad esempio primario umani linfociti T citotossici (CTL) e cellule natural killer (NK) nella matrice collagene 3D per l'utilizzo con la microscopia di luce-foglio per l'imaging di cellule vive e campioni fissati. La procedura di acquisizione e analisi di migrazione delle cellule delle immagini sono presentati. Un'attenzione particolare è data per evidenziare i passaggi critici e fattori per la preparazione dei campioni e analisi dei dati. Questo protocollo può essere impiegato per altri tipi di cellule in sospensione in una matrice di collagene 3D e non è limitato alle cellule immuni.
Introduction
La maggior parte delle conoscenze sulla migrazione di cellule proviene da 2D esperimenti1,2,3, che normalmente si svolgono in una superficie in vetro o in plastica di un cultura/imaging piatto. Tuttavia, uno scenario fisiologico richiede, nella maggior parte dei casi, un microambiente 3D, in cui la matrice extracellulare (ECM) svolge un ruolo determinante. ECM non solo fornisce l'essenziale struttura 3D per mantenere la morfologia cellulare corretto, ma offre anche segnali di sopravvivenza o direzionale spunti per un funzionamento ottimale di molte cellule4,5 . Pertanto, è necessario per identificare meglio le funzioni cellulari e comportamento in un ambiente che meglio riflette il contesto fisiologico un ambiente 3D.
Nel corpo umano, la maggior parte delle cellule soprattutto le cellule immuni, esercitano le loro funzioni nell'ambito di uno scenario 3D. Per esempio, cellule di T attivate pattugliano tessuti alla ricerca di cellule bersaglio, le cellule T naive migrano attraverso i linfonodi in cerca di loro cellule presentanti l'antigene cognate durante il quale le modalità di migrazione e i macchinari sono adattati ai corrispondenti extracellulare ambiente3,6,7. Il gel di collagene 3D è stato ampiamente usato come un cellulare 3D ben consolidata e ben caratterizzati cultura sistema8,9,10. Il nostro lavoro precedente dimostra che linfociti umani primari sono estremamente mobili e la migrazione a una velocità media di circa 4,8 µm/min in una matrice a base di collagene di 0,25%11. Riarrangiamento del citoscheletro svolge un ruolo chiave nella migrazione cellulare12. Raccogliendo la prova dimostra che i linfociti non si applicano solo una singola modalità di migrazione ancora possono passare di certo comportamento di migrazione a seconda della posizione, microambiente, citochine, gradienti chemiotattici e segnali extracellulari quali tune il comportamento migratorio in modi diversi 3.
Per analizzare in modo affidabile le funzioni delle cellule immuni e comportamento, ad esempio, migrazione, formazione di protrusione o trasporto vescicolare, è di grande vantaggio di essere in grado di acquisire immagini in 3D relativamente grandi volumi in modo veloce e affidabile. Per l'imaging 3D, la tecnologia sviluppata di recente la microscopia luce-foglio (noto anche come microscopia di illuminazione su un unico piano) offre una soluzione soddisfacente13,14. Durante l'acquisizione di imaging, un sottile foglio di luce statico viene generato per illuminare il campione. In questo modo, sul piano di messa a fuoco, una vasta area possa essere illuminata contemporaneamente senza intaccare le cellule fuori piano. Questa funzionalità consente una velocità di acquisizione elevata con un candeggio drasticamente ridotto e la fotocitotossicità. In questo articolo, descriviamo come visualizzare cellule immuni umane primarie utilizzando la microscopia a luce-foglio e come analizzare la migrazione in uno scenario 3D.
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Protocol
Ricerca effettuata per questo studio con il materiale umano (alloggiamenti di sistema del leucocita riduzione dai donatori di sangue umano) è autorizzata dal comitato etico locale (dichiarazione da 16.4.2015 (84/15; Prof. Dr. Rettig-Stürmer)) e segue le linee guida corrispondenti.
1. preparazione della soluzione neutralizzata collagene (500 µ l)
- Trasferire 400 µ l di soluzione di riserva refrigerata collagene (10,4 mg/mL) in una provetta sterile 1,5 mL sotto il cofano di cultura cellulare. Lentamente aggiungere 50 µ l di refrigerati 10 x PBS (pH 7,0-7,3) a 400 µ l di soluzione di riserva refrigerata collagene. Miscelare la soluzione di affiancamento delicatamente il tubo.
Nota: Tutti i passaggi nella parte 1 dovrebbero essere fatto sotto una cappa di cultura cellulare. - Aggiungere 8 µ l di 0.1 M NaOH in 500 µ l della soluzione del collagene da 1.1. per regolare il pH a 7,2-7,6. Usare le strisce reattive pH (gamma di pH: 6-10) per determinare il valore del pH della miscela.
Nota: I volumi possono variare per diversi lotti di collagene. Soluzione di NaOH dev'essere mescolato lentamente per evitare bolle d'aria. La miscela dovrebbe essere tenuta sul ghiaccio per evitare la gelificazione del collagene. - Aggiungere 2 µ l di ddH sterile2O per rendere il volume finale di 500 µ l. mescolare bene e conservare questa soluzione di collagene (8,32 mg/mL) in ghiaccio o a 4 ° C fino all'utilizzo ulteriore.
Nota: In questa condizione, neutralizzate collagene possono essere utilizzata per 24 h. aliquote non sono consigliate per evitare bolle d'aria.
2. preparazione dei campioni per microscopia a fluorescenza di luce-foglio utilizzando capillari
- Etichetta fluorescente cellule vive di interesse con le tinture fluorescenti primario desiderato15 o proteine fluorescenti11 come descritto in precedenza.
- Trasferimento 1 × 106 delle cellule in una provetta sterile mL 1,5 sotto una cappa di cultura cellulare. Centrifugare la provetta a 200 x g per 8 min. scartare il supernatante e risospendere il pellet in 200 µ l di terreno di coltura.
Nota: La densità delle cellule di 5 × 106 cellule/mL è consigliata per la visualizzazione di migrazione delle cellule immuni umane, soprattutto per i linfociti T citotossici (CTL) e cellule natural killer (NK). - Aggiungere 85,9 µ l di soluzione di collagene neutralizzati da 1,3. nella sospensione delle cellule da 2,2. e mescolare bene per raggiungere una concentrazione di collagene di 2,5 mg/mL. Lasciare il mix di cella/collagene su ghiaccio nella cappa.
Nota: Supponiamo che la concentrazione di collagene sia N mg/mL, il volume di neutralizzato soluzione di collagene (per sospensione di cellule di 200 µ l) = 200 × N /(8.32-N) - Successivamente, inserire lo stantuffo corrispondente nel capillare (diametro interno ~ 1 mm) fino a quando lo stantuffo è 1 mm fuori del capillare. Bagnato lo stantuffo immergendo in terreno di coltura (Figura 1A).
Nota: Questo passaggio potrebbe contribuire a evitare bolle d'aria quando il capillare è tuffato nel mix delle cellule/collagene. Il capillare e lo stantuffo non devono essere sterili. - Immergere il capillare nel mix delle cellule/collagene da 2,3. Tirare lentamente lo stantuffo per 10-20 mm (Figura 1B). Pulire la parete esterna del capillare con un tovagliolo di carta inumidito con spray di etanolo 70% per rimuovere la soluzione rimanente di collagene.
- Montare il capillare con argilla di modellistica sulla parete interna di un tubo di 5ml e spingere il mix di cella/collagene verso il bordo del capillare (Figura 1).
- Tenere il vaso capillare a 37 ° C con 5% CO2 per 1 h per la polimerizzazione di collagene.
- Aggiungere il terreno di coltura (circa 1-2 mL) in una provetta da 5 mL. Premere delicatamente l'asta di collagene polimerizzato fuori nel mezzo per circa 3/4 del collagene appeso nel mezzo (Figura 1).
- Tenere il vaso capillare, come questo, a 37 ° C con 5% CO2 per altri 30 min equilibrare l'asta di collagene con il mezzo.
Nota: In seguito, l'asta di collagene può essere tirato indietro nel capillare e coltivate ulteriore prima dell'ulteriore uso.
3. acquisizione immagini utilizzando la microscopia a luce-foglio
- Assemblea camera del campione secondo le istruzioni del fabbricante.
- Accendere il microscopio per riscaldare la camera del campione a 37 ° C (per live cell imaging solo) e l'incubazione.
- Posizionare il capillare nel pozzetto di misurazione e individuare l'esempio per trovare l'area di interesse per acquisizione di immagini.
- Attivare il corrispondente laser(s). Impostare le seguenti impostazioni: laser di potenza, tempo di esposizione, passo-dimensione della posizione z-stack, inizio e fine di z-stack e l'intervallo di tempo per l'imaging di cellule vive.
Nota: ad esempio, nell'esempio in Figura 2 era imaged ogni 40 s per 6 h a 37 ° C con una dimensione di passo di 1 µm (spessore totale: 538 µm). La potenza del laser era 1% con un tempo di esposizione di 30 ms la dimensione in pixel in direzione x-y è 0,23 µm. - Avviare l'acquisizione dell'immagine.
4. automated Tracking Analysis
- Aprire il convertitore di file, fare clic su Aggiungi file per scegliere i file immagini da convertire nel formato di file di software (*.ims). Fare clic su Sfoglia e selezionare una cartella in cui salvare i file convertiti. Fare clic su Avvia tutti.
- Aprire il software di analisi. Fare clic su sorpassare. Andare su File e fare clic su Apri, quindi scegliere il file di imaging per essere analizzati.
Nota: Se la dimensione del file è grande questo passaggio potrebbe richiedere tempo. File più grandi di 1 Terabyte (TB) non sono consigliati per un singolo esperimento come il processo di tali file di grandi dimensioni sono capacità computazionale altamente esigenti. - Fare clic su Aggiungi nuovo spot. Selezionare la casella di Immagine intero processo infine. Fare clic su Avanti.
- Immettere le coordinate x e y (in pixel) per definire l'area di interesse. Immettere il numero di fotogrammi (tempo e posizione z) per analizzare. Fare clic su Avanti.
- Selezionare il canale di destinazione, che contiene gli oggetti da rilevare, nell'elenco a discesa del Canale sorgente. Immettere stimato xy diametro (in µm). Fare clic su Avanti.
Nota: Diametro stimato xy è il diametro medio della dimensione di x-y di oggetti da rilevare. - Fare clic su qualità. Impostare una soglia, in cui la maggior parte delle cellule (oggetti) devono essere inclusa. Fare clic su Avanti.
- Scegliere l'algoritmo desiderato (Autoregressive Motion è consigliato). Immettere la distanza massima (20 µm è consigliato) e la dimensione di max divario (consigliato 3 o 2). Fare clic su processo intero immagine infine.
Nota: Distanza massima e la dimensione massima del divario sono due soglie di rompere le tracce. Più specificamente, in due fotogrammi consecutivi quando la distanza tra lo stesso oggetto supera la distanza di Max, questo oggetto nel frame successivo verrà considerato come un nuovo oggetto. A volte durante l'acquisizione, lo stesso oggetto può scomparire per pochi fotogrammi e mostrare di nuovo. In questo caso, solo quando questo oggetto riapparirà all'interno della dimensione massima di gap, si considererà come lo stesso oggetto. - Fare clic sul Tipo di filtro e scegliere l'opzione per escludere tracce indesiderate.
Nota: Questo passaggio è facoltativo. - Fare clic su Avanti e quindi fare clic su fine.
Nota: Questo passaggio può richiedere ore fino a giorni a seconda della potenza di calcolo. - Fare clic su Modifica tracce e scegliere la Corretta Drift. Selezionare l'algoritmo appropriato (Drift traslazionale è consigliato). Selezionare la desiderata Dimensione del set di dati di risultato (Nuova dimensione uguale alla dimensione corrente è consigliato). Fare clic su OK.
Nota: Questo passaggio è solo necessario quando il collagene andato alla deriva durante l'acquisizione di immagini. - Fare clic su statistiche e scegliere Configurare elenco di valori statistiche visibili. Controllare le opzioni di interesse per essere esportato (ad es. coordinate, velocità e così via). Fare clic su OK.
- Fare clic su Esporta tutte le statistiche al File e immettere il nome del file.
5. fissazione e immunofluorescenza colorazione delle cellule in matrici di collagene
- Trasferire 1.000 µ l di paraformaldeide al 4% (PFA, in PBS) in una provetta da 5 mL sotto una cappa chimica.
Nota: PFA dovrebbe essere equilibrato a temperatura ambiente. - Immergere il capillare con collagene polimerizzato da 2,9. nella soluzione di PFA (per ~ 5 mm) e montare il capillare sulla parete interna del tubo 5ml con argilla di modellistica (come mostrato nella Figura 1).
- Premere delicatamente lo stantuffo fino a metà dell'asta del collagene è appeso nella soluzione PFA (Figura 1). Tenere il tubo a temperatura ambiente per 20 min.
- Tirare indietro lo stantuffo per ottenere l'asta di collagene all'interno del capillare. Prendete il capillare e scartare PFA.
- Montare il capillare in una nuova provetta e aggiungere 1 mL di PBS. Assicurarsi che il capillare è immerso in PBS.
- Premere delicatamente lo stantuffo fino a metà dell'asta del collagene è appeso nella soluzione. Montare il capillare sulla parete interna con argilla di modellistica.
- Tenere il tubo a temperatura ambiente per 5 min.
- Ripetere 5.4. -5.7 per altre 2 volte.
- Tirare indietro lo stantuffo per ottenere l'asta di collagene all'interno del capillare. Scartare il PBS. Trasferire 1-2 mL di tampone di blocco/permeabilizzazione (PBS + BSA 1% e 0,1% tensioattivi non ionici) nella provetta e ripetere 5.6.
Nota: La BSA (1%) può essere sostituita dal 5% siero dell'animale in che l'Ab secondario è stata sollevata. - Tenere il tubo a temperatura ambiente per 30-60 min.
- Tirare indietro lo stantuffo per ottenere l'asta di collagene all'interno del capillare. Scartare il buffer di permeabilizzazione. Trasferire 200-500 µ l di anticorpo primario nel buffer blocco/permeabilizzazione ed espelle l'asta nella soluzione.
- Tenere il tubo a temperatura ambiente per 1 h.
- Lavare l'asta di collagene 3 volte con PBST (PBS + 0.1-% tensioattivi non ionici) come descritto al punto 5.4. -5.8.
- Incubare la verga in anticorpo secondario nel buffer blocco/permeabilizzazione per 1 h a temperatura ambiente. Mantenerlo dalla luce.
- Lavare l'asta di collagene 3 volte con PBS come descritto al punto 5.4. -5.8.
- Tirare indietro lo stantuffo per ottenere l'asta di collagene all'interno del capillare. Conservare i campioni in PBS fino imaging.
- Acquisire i campioni come descritto in 3.
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Representative Results
Formazione di protrusione durante la migrazione delle cellule T è un processo altamente dinamico, che è dipendente di actina. Per visualizzare la formazione di protrusione di CTL umano primario, transfected transitoriamente una proteina mEGFP fusa per etichettare il citoscheletro di actina in CTL come descritto prima delle11. Un giorno dopo trasfezione, le cellule sono state incorporate nella matrice di collagene. Serie di immagini sono state acquisite ogni 40 s con una dimensione di passo di 1 µm a 37 ° C, utilizzando la microscopia a luce-foglio. Come mostrato in Figura 2A e complementare Movie 1, durante la migrazione, forma umana di CTL sporgenze principali a forma di limone, orlata da una raffinata dell'alberino-come le strutture. Nell'esperimento mostrato qui, non solo una singola cella era imaged ma un grande volume (450 x 450 x 538 µm3) (Figura 2B). Così, la qualità ottica e la risoluzione mostrata qui sono state ottenute con un obiettivo di ingrandimento basso (20 X / 1.0 DIC VIS IR). Di conseguenza, la risoluzione potrebbe essere ulteriormente migliorata con più alti obiettivi di NA.
Nell'esperimento mostrato in Figura 2 e Movie 1, CTL sono stati monitorati automaticamente come descritto nel protocollo parte 4. Le traiettorie di CTL sono raffigurate nella Figura 2B. Sono stati analizzati due parametri di migrazione: velocità e persistenza. Persistenza è definito come la cilindrata divisa per la lunghezza totale dei binari. L'analisi dimostra che la mobilità di CTL è molto diversificata in 3D: le velocità vanno da 0,01-0,19 µm/s con una differenza di quasi 20 volte e le gamme di persistenza da 0 - 0.7 (Figura 2). È stato riferito in topi che in vivo velocità media di migrazione interstiziale delle cellule T era 4 µm/min16. Recentemente, abbiamo determinato la velocità media del CTL di essere 4-5 µm/min11 utilizzando i metodi descritti in questa carta. Questi risultati dimostrano che quello microscopia luce-foglio è un potente strumento per visualizzare il comportamento delle cellule, per esempio, la migrazione cellulare e l'interazione cellula-cellula. In vivo, molti fattori e un ECM non omogenea della complessa composizione tra cui fattori solubili che possono influenzare la migrazione verrà modificato il comportamento delle cellule T.
Applicazione di una matrice di collagene non è limitata a cellule vive. Fissazione e immunostaining può essere eseguite anche nella matrice. La figura 3 Mostra un esempio di campioni fissati in gel di collagene 3D, in cui perforin1 endogeno (PFN1) e actina erano macchiate. Il campione è stato illuminato da un solo lato (singola illuminazione laterale) o da entrambi i lati (illuminazione laterale doppio). Osserviamo che le cellule alle posizioni differenti z uniformemente sono macchiate, che indica che le procedure descritte nel nostro protocollo ottenere una soddisfacente penetrazione degli anticorpi in gel di collagene. Ancora più importante, dopo fissazione CTL ha esibito la stessa morfologia come in cella immagini dal vivo (confronta Figura 3 e Figura 2B), che indica che anche la morfologia è ben mantenuta dal presente protocollo. Inoltre, illuminazione da singolo lato o da entrambi i lati non fa una differenza significativa nella qualità delle immagini al piano focale. Considera che meno zona è esposta al laser con la modalità di illuminazione singola laterale rispetto al dual laterale di illuminazione, illuminazione laterale singolo è più consigliabile.
Figura 1: illustrazione di gestire i capillari durante la preparazione del campione. (A) inserire lo stantuffo nel capillare e come bagnato lo stantuffo con il terreno di coltura. (B) tirare il mix di cella/collagene in capillare. (C) montare capillari utilizzando argilla di modellistica. Lo stantuffo e l'asta di collagene sono raffigurati nelle caselle grigie e rossi, rispettivamente. (D) gestire asta di collagene di equilibramento con terreno di coltura o per immunostaining. Lo stantuffo e l'asta di collagene sono raffigurati nelle caselle grigie e rossi, rispettivamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: rilevamento CTL primaria umana in collagene 3D e la visualizzazione dinamica dell'actina. (A) proiezione di intensità massima di actina in CTL umano primario. L'actina è stato etichettato in CTL come descritto in precedenza11. Primo giorno post transfezione di cellule sono state incorporate nella matrice di collagene di 0,5%. Viene visualizzata la finestra di una cella rappresentativa. Barre della scala sono 5 strutture µm. actina bene al bordo di sporgenza sono evidenziate dalla punta della freccia. (B) traiettorie di CTL per 6 h. Le traiettorie automatedly vengono rilevate dal software (codice colore: blu = start, rosso = fine della pista, 450 × 450 × 538 µm3 volume). La barra della scala è di 50 µm (C) quantificazione della velocità e della persistenza. Un punto rappresenta una cella. Risultati sono riportati come media ± SEM da 4 donatori. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Immunostaining di profilin1 endogeni (PFN1) e actina in CD8+ T cellule incorporati nella matrice collagene 3D. CD8 umano primario+ T cellule sono state incorporate nel collagene di 0,25%. Dopo la fissazione di PFA il campione era macchiato usando anti-PFN1 (arancione) e falloidina (viola) e visualizzate da microscopia di luce-foglio a una dimensione di passo di 1 µm per un volume totale di 440 x 440 x 1.000 µm3. Il campione è stato illuminato da un solo lato (singola illuminazione laterale) o da entrambi i lati (illuminazione laterale doppio). Proiezioni di massima intensità (MIP) da ricostruzione 3D sono mostrate. Le barre di scala sono 50 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Movie 1: generazione di sporgenze durante la migrazione delle cellule di T. La cella mostrata nel film è stato tratto dal volume illustrato nella Figura 2A. Le cellule sono state incorporate in una matrice di collagene (0,5%). Le immagini sono state acquisite ogni 40 s per 6 h a 37 ° C, utilizzando la microscopia a luce-foglio. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)
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Discussion
La maggior parte in vitro le analisi sono effettuata su una superficie 2D, ad esempio in piastre di coltura cellulare, capsule di Petri o sulle lamelle, considerando che in vivo le cellule, soprattutto le cellule immuni, esperienza principalmente un microambiente 3D. La prova emergente indica che modelli di migrazione delle cellule immuni differiscono tra 2D e 3D scenari17. Inoltre, i profili di espressione delle cellule del tumore sono differenti in 2D e 3D-in coltura di tessuti18,19,20. Pertanto, per meglio simulare le condizioni fisiologiche in vitro, è un grande vantaggio per effettuare esperimenti in un contesto 3D, per esempio in matrici di collagene 3D. Gli approcci di nuova concezione, in particolare, la microscopia di fluorescenza di luce-foglio, permette esperimenti affidabili e riproducibili in matrix 3D sistemi in condizioni ambientali controllate.
In contrasto con un convenzionale scansione laser confocale che illumina la sonda intera, con microscopia a luce-foglio viene generato solo un sottile foglio di luce laser per illuminare i campioni. La fotocamera di rilevamento è perpendicolare al piano di illuminante. Grazie a questa tecnica, solo la sezione al piano focale è esposta al laser. Di conseguenza, può essere minimizzati foto-candeggio e fototossicità. Inoltre, rispetto al punto di scansione microscopia, il tasso di acquisizione è drasticamente migliorato con microscopia di luce-foglio (100 - 1.000 più veloce) ed il rapporto segnale-rumore è anche migliorato. Combinato con la camera di incubazione di microscopia luce-foglio di installazione utilizzato in questa carta questo microscopio è una potente opzione per acquisizione di immagini di grandi volumi 3D con candeggio ridotta a icona e foto-danno su lunghi periodi di tempo (alcuni giorni) sotto condizioni di incubatrice.
Per la preparazione del campione con la matrice di collagene 3D, il punto più critico è per evitare bolle d'aria. Data la sua elevata viscosità, quando bolle d'aria sono introdotte per la soluzione di collagene è molto difficile da rimuovere dalla soluzione. La presenza di bolle d'aria possa indurre eterogeneità della polimerizzazione della matrice di collagene; Inoltre, può bloccare il percorso della luce, che diminuirebbe la qualità delle immagini. Di conseguenza, quando il trasferimento o miscelare la soluzione di collagene uno deve dispensare molto delicatamente e non espellere l'ultima goccia nella punta della pipetta. Inoltre, il collagene inizia a polimerizzare lentamente a temperatura ambiente. Così, per evitare la polimerizzazione prima di mescolare bene la soluzione, i tubi contenenti collagene devono essere sempre su ghiaccio.
Una grande sfida che incontriamo nell'impiegare la microscopia luce-foglio è la gestione dei dati. I dati generati da microscopia luce-foglio possono facilmente raggiungere le dimensioni di 500 gigabyte o anche diversi terabyte, in particolare per gli esperimenti a lungo termine. Per analizzare questi dati richiede diversi giorni, a volte fino a una settimana da una stazione di lavoro con capacità di calcolo elevata. Poiché le dimensioni delle immagini analizzate non sono più piccola rispetto ai dati originali la capacità di archiviazione può diventare rapidamente un fattore limitante per l'applicazione di microscopia luce-foglio. Pertanto, per esperimenti di rilevamento o se è necessaria un'analisi complessa immagine altamente si consiglia di limitare la dimensione di file per ogni esperimento di valori che possono essere gestiti in un ragionevole lasso di tempo dalle unità di elaborazione disponibili.
Microscopia di fluorescenza di luce-foglio introdotta qui ha alcune caratteristiche, che possono alterare i risultati se non maneggiati con cura. L'utilizzo dei capillari è particolarmente vantaggioso per un'illuminazione di barriera-libero dei campioni. Poiché l'asta di collagene è appeso nel mezzo, può accadere che l'asta di collagene derive durante l'acquisizione di immagini, soprattutto per misurazioni a lungo termine. Questa deriva deve essere corretto per evitare errori di interpretazione dei risultati. Naturalmente, ci sono altre configurazioni di luce-foglio microscopia commercialmente disponibili sul mercato, che non richiedono i capillari per montare i campioni. Inoltre, con la microscopia di luce-foglio, oltre al fatto che, rispetto alla linea convenzionale scansione fototossicità di microscopia confocale è stato ridotto sostanzialmente, fototossicità rimane ancora una preoccupazione per imaging a lungo termine21.
Oltre alla microscopia luce-foglio, ci sono altri approcci stabiliti per l'imaging di fluorescenza 3D, tra cui principalmente applicata è microscopia confocale, microscopia a fluorescenza grandangolari e microscopia multifotonica. In termini di profondità di penetrazione, microscopia a fluorescenza confocale e grandangolari si trovano nella gamma simile, di norma limitata a 100 nm22. A causa di più luce di lunghezza d'onda utilizzata per multi-fotone microscopia, relativa profondità di penetrazione può essere migliorata per l'intervallo di 0,5 - 1 mm23. In confronto, le dimensioni delle immagini multi-dimensionale generato dalla divisione ottica della microscopia luce-foglio possono essere fino a parecchi millimetri24. In termini di risoluzione laterale, un esperimento elegantemente eseguito Mostra che quello microscopia luce-foglio fornisce una migliore risoluzione spaziale tridimensionale rispetto alla microscopia a fluorescenza confocale in grandi campioni25. Recentemente, la microscopia luce-foglio è stata combinata con tecnica a due fotoni, che ulteriormente migliora la profondità di penetrazione rispetto alla normale microscopia a luce-foglio un fotone ed è dieci volte più veloce di microscopia del due-fotone di punto26.
Considerando matrix 3D che fornisce la micro-architettura per cellule, oltre a collagene bovino che ho usato in questa carta, ci sono molte altre opzioni, come ad esempio la matrice extracellulare (ECM) derivata da cellule di sarcoma di topo, agarosio, idrogel sintetico o altre materiali polimerici biocompatibili. Mouse il sarcoma ECM è una miscela di proteine tra cui collagene IV, laminina, nonché numerosi fattori di crescita. Confronta con i materiali sintetici, ECMs biologici (collagene e mouse sarcoma ECM), da un lato, presentano un contesto più fisiologicamente rilevante; ma d'altra parte, la qualità e la composizione biologica ECMs possono variare tra lotti e aziende. Al contrario, più è garantita la riproducibilità dei materiali sintetici. Notevolmente, messa a punto delle proprietà biochimiche e meccaniche, così come le modifiche desiderate, è consentito per materiali sintetici, ma non per biologico ECMs10,27.
In sintesi, in questo articolo abbiamo descritto un protocollo per costruire la matrice di collagene 3D per esperimenti di biologia delle cellule mediante microscopia a fluorescenza di luce-foglio e come incorporare CTL umano primario nella matrice collagene 3D per visualizzare e analizzare la migrazione di CTL. Abbiamo evidenziato i punti chiave nell'acquisizione di immagini, preparazione del campione e l'analisi. I nostri risultati indicano che formazione di protrusioni altamente dinamici e actina bene strutture possa essere visualizzate da microscopia di luce-foglio con una buona risoluzione spazio-temporale. Inoltre, il protocollo di analisi descritto qui ci permette di tenere traccia in modo affidabile le cellule in modo obiettivo e automatizzato. Questo metodo sarà particolarmente vantaggioso per le ricerche immunologiche umane come topi e gli esseri umani differiscono sostanzialmente in molte funzioni immunologiche e reattività a terapie28.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi finanziario o commercio.
Acknowledgments
Ringraziamo l'Istituto di clinica Hemostaseology e medicina trasfusionale per la fornitura di sangue del donatore; Carmen Hässig e Cora Hoxha per l'eccellente assistenza tecnica. Ringraziamo Jens Rettig (Saarland University) per il vettore di pMAX modificate, Roland Wedlich-Soldner (Università di Muenster) per il costrutto originale LifeAct-Ruby e Christian Junker (Saarland University) per generare il costrutto LifeAct-mEGFP. Questo progetto è stato finanziato da 1027 Sonderforschungsbereich (progetto A2 a B.Q.) e 894 (progetto A1 a M.H.). Il microscopio di luce-foglio è stato finanziato dalla DFG (GZ: FUGG 19-1 INST 256/4).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibricol, bovine collagen solution | Advanced Biomatrix | #5133-20ML | Collagen matrix |
| 0.5 M NaOH Solution | Merck | 1091381000 | for neutralizing Fibricol solution |
| Ultra-Low melting agarose | Affymetrix | 32821-10GM | Sample preparation in low c[Col] |
| Dynabeads Untouched Human CD8 T Cells Kit | Thermo Fisher | 11348D | Isolation of primary human CD8+ T cells from PBMC |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation | Thermo Fisher | 11132D | Activation of CTL populations |
| Human recombinant interleukin-2 | Thermo Fisher | PHC0023 | Stimulation of cultured CTL |
| P3 Primary solution kit | Lonza | V4XP-30XX | Transfection |
| α-PFN1 antibody, rabbit, IgG | Abcam | ab124904 | IF |
| Alexa Fluor 633 Phalloidin | Thermo Fisher | A22284 | IF |
| CellMask Orange Plasma membrane Stain | Thermo Fisher | C10045 | Fluorescent cell label |
| Tween 20 | Sigma | P1379-250mL | IF |
| Triton X-100 | Eurobio | 018774 | IF |
| DPBS Dulbecco's phopsphate buffered saline | Thermo Fisher | 14190250 | IF |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9418-100G | IF |
| Goat α Rabbit 568, IgG, rabbit | Thermo Fisher | A-11011 | IF |
| Lightsheet Z.1 (Light-sheet microscopy) | Zeiss | N.A. | |
| Cell culture hood | Thermo Fisher | HeraSafe KS | |
| Cell culture incubator HERACell 150i | Thermo Fisher | N.A. | |
| Centrifuge 5418 and 5452 | Eppendorf | N.A. | |
| Pippettes | Eppendorf | 3123000039, 3123000020, 3123000063 | |
| Pippette tips | VWR | 89079-444, 89079-436, 89079-452 | |
| 15 mL tubes | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Capillaries 50 µL | VWR (Brand) | 613-3373 | Zeiss LSFM sample preparation |
| Plunger for capillaries | VWR (Brand) | BRND701934 | "Stamps with Teflon tip" LSFM sample preparation |
| MColorPhast pH stips | Merck | 1095430001 | to test pH of neutralized Fibricol |
| BD Plastipak 1mL syringes | BD | Z230723 ALDRICH | Alternative sample preparation |
| Modeling clay (Hasbro Play-Doh A5417EU7) | Play-Doh | N.A. | |
| Imaris file converter | Bitplane | available at http://www.bitplane.com | Convert imaging files to Imaris file format |
| Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage) | Bitplane | available at http://www.bitplane.com | Analysis of 3D and 4D imaging data |
References
- Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration. Med Res Rev. 27 (2), 149-176 (2007).
- Doyle, A. D., Petrie, R. J., Kutys, M. L., Yamada, K. M. Dimensions in cell migration. Curr Opin Cell Biol. 25 (5), 642-649 (2013).
- Krummel, M. F., Bartumeus, F., Gerard, A. T cell migration, search strategies and mechanisms. Nat Rev Immunol. 16 (3), 193-201 (2016).
- Entschladen, F., et al. Analysis methods of human cell migration. Exp Cell Res. 307 (2), 418-426 (2005).
- Meredith, J. E., Fazeli, B., Schwartz, M. A. The extracellular matrix as a cell survival factor. Mol Biol Cell. 4 (9), 953-961 (1993).
- Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model. J Cell Biol. 188 (1), 11-19 (2010).
- Ridley, A. J., et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 647-664 (2014).
- Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Solomon, F. D. 3D cell culture systems: advantages and applications. J Cell Physiol. 230 (1), 16-26 (2015).
- Fang, Y., Eglen, R. M. Three-Dimensional Cell Cultures in Drug Discovery and Development. SLAS Discov. 22 (5), 456-472 (2017).
- Schoppmeyer, R., et al. Human profilin 1 is a negative regulator of CTL mediated cell-killing and migration. Eur J Immunol. 47 (9), 1562-1572 (2017).
- Mogilner, A., Oster, G. Cell motility driven by actin polymerization. Biophys J. 71 (6), 3030-3045 (1996).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. J Histochem Cytochem. 59 (2), 129-138 (2011).
- Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
- Zhou, X., et al. Bystander cells enhance NK cytotoxic efficiency by reducing search time. Sci Rep. 7, 44357 (2017).
- Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
- Petrie, R. J., Yamada, K. M. At the leading edge of three-dimensional cell migration. J Cell Sci. 125 (Pt 24), 5917-5926 (2012).
- Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer). Oncol Rep. 33 (4), 1837-1843 (2015).
- Lee, J. M., et al. A three-dimensional microenvironment alters protein expression and chemosensitivity of epithelial ovarian cancer cells in vitro. Lab Invest. 93 (5), 528-542 (2013).
- Luca, A. C., et al. Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines. PLoS One. 8 (3), e59689 (2013).
- Jemielita, M., Taormina, M. J., Delaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques. J Biophotonics. 6 (11-12), 920-928 (2013).
- Graf, B. W., Boppart, S. A. Imaging and analysis of three-dimensional cell culture models. Methods Mol Biol. 591, 211-227 (2010).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Verveer, P. J., et al. High-resolution three-dimensional imaging of large specimens with light sheet-based microscopy. Nat Methods. 4 (4), 311-313 (2007).
- Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nat Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
- Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. Methods Mol Biol. 695, 1-15 (2011).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).
