Summary
여기, 선물이 빛 시트 현미경을 사용 하 여 3 차원 (3D) 콜라겐 매트릭스에 포함 된 면역 세포를 시각화 하는 프로토콜. 이 프로토콜은 또한 3d에서 셀 이동 추적 하는 방법 elaborates. 다른 유형의 3D 매트릭스에 현 탁 액 셀이이 프로토콜을 사용할 수 있습니다.
Abstract
Vivo에서, 활성화, 확산, 그리고 모든 면역 세포의 기능 림프절 이나 조직에 예를 들어 3 차원 (3D) 환경에서 발생합니다. 최신, 대부분 체 외에 시스템 셀 문화 또는 coverslips와 같은 2 차원 (2D) 표면에 의존합니다. 최적의 모방 생리 조건에 생체 외에서우리는 간단한 3D 콜라겐 매트릭스를 활용합니다. 콜라겐은 세포 외 기질 (ECM)의 주요 구성 요소 중 하나입니다 그리고 3D 매트릭스 구성에 널리 사용 되 고 있다. 3D 영상에 대 한 최근에 개발한 빛 시트 현미경 기술 (단일 평면 조명 현미경이 라고도 함)는 높은 수집 속도, 큰 침투 깊이, 낮은 표백 및 photocytotoxicity 기능입니다. 또한, 빛 시트 현미경 장기 측정을 위해 특히 유리 하다. 여기 우리는 최적화 된 프로토콜 설정 하 고 인간의 면역 세포, 예를 들어 기본 인간의 세포 독성 T 세포 (CTL)을 처리 하는 방법을 설명 하 고 라이브 셀 이미징에 대 한 빛-시트 현미경과 사용에 대 한 3D 콜라겐 매트릭스에 자연 킬러 (NK) 세포와 고정된 샘플입니다. 이미지 수집 및 세포 이동의 분석을 위한 절차 되 게 됩니다. 특히 초점 중요 한 단계 및 샘플 준비 및 데이터 분석에 대 한 요소를 강조 하기 위해 제공 됩니다. 이 프로토콜은 3D 콜라겐 매트릭스에 현 탁 액 셀의 다른 종류에 대 한 고용 수 있습니다 하 고 면역 세포에 국한 되지 않습니다.
Introduction
마이그레이션에 대 한 대부분 지식 세포에서 온다 2D는 일반적으로 유리 또는 플라스틱 표면 문화/이미징의 실시는1,2,3, 실험 접시. 그러나, 생리 적인 시나리오 필요, 대부분의 경우, 3D microenvironment, 기질 (ECM) 결정적인 역할을 담당 합니다. ECM 뿐만 아니라 적절 한 세포 형태를 유지 하기 위해 3 차원 구조 에센셜을 제공 하지만 또한 생존 신호 또는 많은 셀4,5 의 최적의 기능에 대 한 방향 신호를 제공 합니다. 따라서, 3D 환경이입니다 더 나은 휴대 전화 기능 및 생리 적 컨텍스트를 반영 하는 더 나은 환경에서 동작을 식별 하는 데 필요한.
인간의 신체에서 대부분 세포 면역 세포 특히 3D 시나리오에서 그들의 기능을 발휘 한다. 예를 들어 활성화 된 T 세포 순찰 조직 대상 셀에 대 한 검색, naïve T 세포 마이그레이션 기간 동안 마이그레이션 모드와 기계는 해당 하는 extracellular 적응 그들의 동족 항 원 제시 세포에 대 한 검색에서 림프절을 통해 환경3,,67. 3D 콜라겐 젤 잘 설립 하 고 잘 특징이 3D 셀 문화 시스템8,,910로 널리 사용 되었습니다. 우리의 이전 작품에서는 기본 인간의 세포 높은 모바일 0.25% 콜라겐 기반 매트릭스11약 4.8 µ m/min의 평균 속도에 마이그레이션할. 골격의 재배치는 셀 마이그레이션12에서 핵심 역할을 한다. 세포 이동의 단일 모드에만 적용 되지 않습니다 아직 위치, microenvironment, cytokines, 혈 그라디언트, 특정 마이그레이션 동작 간에 전환할 수 및 extracellular 신호는 조정 보여주는 증거를 축적 된 여러 가지 방법 3에 철새 행동입니다.
안정적으로 면역 세포 기능 및 동작을 예를 들어 마이그레이션, 돌출 형성 또는 기공을 교통 분석을 그것 큰 장점은 신속 하 고 안정적인 방식으로 상대적으로 대용량 3D 이미지를 취득할 수 있을 것입니다. 3D 영상에 대 한 최근에 개발한 빛 시트 현미경 기술 (단일 평면 조명 현미경이 라고도 함)는 만족 스러운 솔루션13,14을 제공 합니다. 이미지 수집, 동안 얇은 정적 빛 시트 샘플을 밝히는 생성 됩니다. 초점 비행기에 이렇게에서 넓은 지역 비행기에서 세포를 영향을 주지 않고 동시에 조명 될 수 있습니다. 이 기능에는 크게 감소 표백 및 photocytotoxicity 높은 수집 속도를 수 있습니다. 이 문서에서 우리 주 인간의 면역 세포 빛 시트 현미경을 사용 하 여 시각화 하는 방법 및 마이그레이션 3D 시나리오에서를 분석 하는 방법을 설명 합니다.
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Protocol
인간의 재료 (인간의 혈액 기증자 로부터 백혈구 감소 시스템 실)와 함께이 연구를 위해 실시 하는 연구 승인 지역 윤리 위원회 (16.4.2015 (84/15;에서 선언 교수 박사 Rettig Stürmer))와 해당 지침을 따릅니다.
1. 중화 콜라겐 솔루션의 준비 (500 µ L)
- 셀 문화 후드 무 균 1.5 mL 튜브에 냉장된 콜라겐 재고 솔루션 (10.4 mg/mL)의 400 µ L를 전송. 천천히의 50 µ L 냉장 10 x PBS (pH 7.0-7.3) 냉장된 콜라겐 재고 솔루션의 400 µ L 추가 합니다. 부드럽게 튜브를 타일링 하 여 솔루션을 믹스.
참고: 1 부의 모든 단계는 셀 문화 후드 행해져야 한다. - 1.1에서 콜라겐 솔루션의 500 µ L로 0.1 M NaOH의 8 µ L를 추가 합니다. pH 7.2-7.6를 조정 하려면 PH 시험 지구를 사용 하 여 (pH 범위: 6-10) 혼합물의 pH 값을 확인 하.
참고: 볼륨 콜라겐의 다른 일괄 처리에 대 한 달라질 수 있습니다. NaOH 솔루션을 공기 방울을 피하기 위해 천천히 혼합 될 수 있다. 혼합물을 콜라겐 겔 화를 피하기 위해 얼음에 보관 한다. - 추가 2 µ L 살 균 ddH2O 500 µ L. 최종 볼륨을 잘 섞어 또는 및 저장이 콜라겐 솔루션 (8.32 mg/mL) 얼음에 4 ° C에서 사용까지.
참고:이 조건 하에서 중화 콜라겐 사용할 수 있습니다 24 h. 위해 Aliquots 공기 방울을 피하기 위해 권장 하지 않습니다.
2. 샘플 준비 빛 시트 형광 현미경 검사 법 모 세관을 사용 하 여
- 앞에서 설명한 대로 붙일 원하는 기본 형광 염료15 또는 형광 단백질11 관심의 라이브 셀 라벨.
- 1 × 106 셀의 셀 문화 후드 무 균 1.5 mL 튜브에 전송 합니다. 원심 8 분 삭제에 대 한 200 x g에 튜브는 상쾌한 고 문화 매체의 200 µ L에 펠 릿을 resuspend.
참고: 5 × 106 셀/mL의 셀 밀도 인간의 면역 세포 이동, 세포 독성 T 세포 (CTL)과 자연 킬러 (NK) 세포의 시각화에 대 한 것이 좋습니다. - 1.3에서 중화 콜라겐 솔루션의 85.9 µ L를 추가 합니다. 에 세포 현 탁 액 2.2에서. 그리고 제대로 2.5 mg/mL의 콜라겐 농도 도달 하는 혼합. 후드에 얼음에 셀/콜라겐 혼합을 둡니다.
참고: 콜라겐의 원하는 농도 N mg/mL 이면 가정의 볼륨 무력화 (200 µ L 세포 현 탁 액)에 대 한 콜라겐 솔루션 = 200 × N /(8.32-N) - 다음, 모 세관에 넣고 일치 플런저 (내부 직경 ~ 1 mm) 플런저는 모 세관에서 1 m m까지. 문화 매체 (그림 1A)로 담거 서 플런저를 젖은.
참고:이 단계는 모 세관 셀/콜라겐 혼합으로 감소 때 기포를 방지 하기 위해 도울 수 있었다. 모 세관 및 플런저 살 균 될 필요가 없습니다. - 2.3에서 셀/콜라겐 혼합으로 모 세관을 찍어. 천천히 다시 10-20 m m (그림 1B)에 대 한 플런저를 당겨. 70% 에탄올 스프레이 나머지 콜라겐 솔루션 제거를 적신 종이 타월로 모 세관의 외부 벽을 닦으십시오.
- 5 mL 튜브의 내부 벽에 클레이 모델링 모 세관을 탑재 하 고 모 세관 (그림 1C)의 가장자리에 셀/콜라겐 혼합을 밀어.
- 5% CO2 콜라겐 합 1 h 37 ° C에서 모 세관을 유지.
- 5 mL 튜브를 배양 (약 1-2 mL)를 추가 합니다. 신중 하 게 약 3/4 매체 (그림 1D)에 걸려 콜라겐의 중간에 밖으로 생산 콜라겐 로드를 누릅니다.
- 모 세관,이, 같은 매체를 가진 교원 질 막대 equilibrate 또 다른 30 분 5% CO2 와 37 ° C에서 유지.
참고: 나중에, 콜라겐 막대 수 수 철수 모 세관 그리고 경작에 더 사용 하기 전에 추가.
3. 이미지 수집 빛 시트 현미경을 사용 하 여
- 제조업체의 지침에 따라 샘플 챔버 어셈블리입니다.
- 보육 및 현미경 시료 챔버 (라이브 셀 이미징만)에 대 한 37 ° C에가 열을 켭니다.
- 시료 챔버에서 모 세관을 놓고 이미지 수집에 대 한 관심의 영역을 찾아 샘플을 찾습니다.
- 해당 laser(s)를 활성화 합니다. 다음 설정을 설정: 레이저 전원, 노출 시간, 단계-z-스택, 시작 위치와 끝 위치 z-스택, 그리고 라이브 셀 이미징에 대 한 시간 간격의 크기.
참고: 예를 들어 그림 2 의 샘플은 몇 군데 모든 40 단계-1 µ m의 크기와 37 ℃에서 6 h s (총 두께: 538 µ m). 레이저 파워 노출 시간 30 양 x-y 방향에서 픽셀 크기의 1%는 0.23 µ m 이었다. - 이미지 수집을 시작 합니다.
4. 자동 분석 추적
- 파일 변환기를 열고, 파일 추가 (*.ims) 소프트웨어 파일 형식으로 변환할 이미지 파일 선택을 클릭 합니다. 찾아보기 를 클릭 하 고 변환 된 파일을 저장할 폴더를 선택 합니다. 모든 시작을 클릭 합니다.
- 분석 소프트웨어를 엽니다. 클릭 능가합니다. 파일 에 가십시오 오픈, 클릭 다음 이미징 파일 분석을 선택 합니다.
참고: 파일 크기가 큰 경우이 단계 시간을 걸릴 수 있습니다. 1 테라바이트 (TB) 보다 큰 파일 권장 하지 않습니다 하나의 실험에 대 한 프로세스와 같은 큰 파일은 매우 계산 용량 요구. - 새로운 관광 명소를 추가클릭 합니다. 프로세스 전체 이미지 마지막으로상자를 확인 하십시오. 다음을 클릭 합니다.
- 입력 x 좌표와 y (픽셀)에 관심 영역을 정의 하. (시간 및 z 위치) 분석 프레임 수를 입력 합니다. 다음을 클릭 합니다.
- 소스 채널의 드롭다운 목록에서 추적할 개체를 포함 하는 대상 채널을 선택 합니다. 입력 예상 xy 직경 (µ m). 다음을 클릭 합니다.
참고: 예상된 xy 직경 추적할 개체의 x-y 차원에서 평균 지름이입니다. - 품질을 클릭 합니다. 있는 셀 (개체)의 대부분은 포함 되어야 하는 임계값을 설정 합니다. 다음을 클릭 합니다.
- 원하는 알고리즘 (회귀 모션 권장)을 선택 합니다. 입력 하는 최대 거리 (20 µ m 권장)와 최대 간격 크기 (3 또는 2 권장). 프로세스 전체 이미지를 마지막으로클릭 합니다.
참고: 최대 거리 와 최대 간격 크기 트랙 휴식 두 임계값은. 좀 더 구체적으로, 두 개의 연속 프레임에서 동일한 개체 사이의 거리 최대 거리를 초과 하는 때 나중 프레임에이 개체 간주 됩니다 새 개체로. 가끔 중, 같은 개체 수 있습니다 몇 프레임 사라지고 다시 나타난다. 이 경우에, 최대 간격 크기 내에서이 개체가 다시 나타납니다 경우에 그것은 동일한 개체도 간주 될 것 이다. - 필터 형식 을 클릭 하 고 원치 않는 트랙을 제외 하는 옵션을 선택 합니다.
참고:이 단계는 선택 사항입니다. - 다음 을 클릭 한 다음 마침을 클릭 합니다.
참고:이 단계는 일 컴퓨팅 성능에 따라 시간을 걸릴 수 있습니다. - 트랙 편집 을 클릭 하 고 올바른 드리프트를 선택 합니다. (변환 드리프트 권장) 적절 한 알고리즘을 선택 합니다. 원하는 결과 데이터 집합 크기 를 선택 합니다 (새 크기와 같은 현재 크기 권장). 확인을 클릭 합니다.
참고:이 단계는만 콜라겐 이미지 중 떠내려 때 필요한. - 통계 를 클릭 하 고 구성의 표시 통계 값 목록을선택 합니다. 관심의 옵션을 수출 (예: 좌표, 속도 및 등) 확인 하십시오. 확인을 클릭 합니다.
- 파일 내보내기 모든 통계 를 클릭 하 고 파일 이름을 입력 합니다.
5. 고정 및 면역 형광 콜라겐 매트릭스 셀의 얼룩
- 화학 후드 5 mL 튜브에 4 %paraformaldehyde (PFA, PBS)의 1000 µ L를 전송 합니다.
참고: PFA 실내 온도 균형 해야 합니다. - 2.9에서 생산 콜라겐과 모 세관을 찍어. PFA 솔루션으로 (대 한 ~ 5 m m) ( 그림 1C에서 같이) 클레이 모델링 5 mL 튜브의 내부 벽에는 모 세관을 탑재.
- PFA 솔루션 (그림 1D)에 매달려 콜라겐 로드의 절반 때까지 플런저를 살짝 누릅니다. 20 분 동안 실내 온도에 튜브를 유지.
- 다시 모 세관 안에 콜라겐 막대를 플런저를 당겨. 모 세관을 꺼내와 PFA 삭제.
- 신선한 관으로 모 세관을 탑재 하 고 PBS의 1 mL를 추가 합니다. 모 세관은 PBS에 몰입은 다는 것을 확인 하십시오.
- 교원 질 막대의 절반은 솔루션에 매달려 때까지 플런저를 살짝 누릅니다. 클레이 모델링 내부 벽에는 모 세관을 탑재 합니다.
- 5 분 동안 실내 온도에 튜브를 유지.
- 5.4를 반복 합니다. -또 다른 2 시간 동안 5.7입니다.
- 다시 모 세관 안에 콜라겐 막대를 플런저를 당겨. PBS를 삭제 합니다. 차단/permeabilization 버퍼 (PBS + 1 %BSA + 0.1% 비 이온 계면 활성 제)의 1-2 mL 튜브에 전송 하 고 5.6를 반복 합니다.
참고: BSA (1%) 5% 보조 Ab에서 발생 하는 동물의 혈 청으로 교체할 수 있습니다. - 30-60 분 동안 실내 온도에 튜브를 유지.
- 다시 모 세관 안에 콜라겐 막대를 플런저를 당겨. Permeabilization 버퍼를 삭제 합니다. 차단/permeabilization 버퍼에 1 차적인 항 체의 200-500 µ L를 전송 하 고 솔루션으로 막대를 퇴 학 시켜도.
- 1 시간에 대 한 실 온에서 튜브를 유지.
- 5.4에 설명 된 대로 3 번 PBST (PBS + 0.1-% 비 이온 계면 활성 제)와 함께 교원 질 막대를 씻어. -5.8입니다.
- 실 온에서 1 h에 대 한 차단/permeabilization 버퍼에 이차 항 체에 막대를 품 어. 빛에서 그것을 유지.
- 5.4에 설명 된 대로 콜라겐 로드 3 회 PBS로 세척. -5.8입니다.
- 다시 모 세관 안에 콜라겐 막대를 플런저를 당겨. PBS 영상까지 샘플을 하십시오.
- 3에 설명 된 대로 샘플을 검사 합니다.
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Representative Results
T 세포 마이그레이션 중 돌출 형성 걸 의존 하는 매우 역동적인 프로세스입니다. 기본 인간 CTL의 돌출 형성을 시각화 하려면 우리는 뚜렷이11전에 설명한 대로 CTL에 말라 골격을 mEGFP 융합 단백질 페. Transfection, 후에 1 일 셀 콜라겐 매트릭스에 포함 했다. 이미지 스택 인수 했다 모든 40 단계-빛-시트 현미경을 사용 하 여 37 ° C에서 1 µ m의 크기와 함께 s. 같이 그림 2A 에 보충 영화 1, 마이그레이션 중 인간의 CTL 양식 주요 돌출 레몬 모양 좋은 스핀 들 모양의 구조에 의해 드리워진. 실험 같이, 뿐만 아니라 하나의 단일 셀은 몇 군데 있지만 큰 볼륨 (538 µ m3x 450 x 450)에서 (그림 2B). 따라서, 광학 품질과 해상도 그림과 가져온 낮은 배율 목표 (20 X 1.0 / DIC 마주 IR). 따라서, 해상도 높은 나 목표와 더 향상 될 수 있습니다.
영화 1과 그림 2 에 표시 된 실험에서 Ctl 프로토콜 4 부에에서 설명 된 대로 자동으로 추적 했다. CTL의 궤도 그림 2B에서 묘사 된다. 이동의 2 개의 매개 변수를 분석 했다: 속도 및 지 속성. 지 속성 나눈 총 트랙 길이으로 정의 됩니다. CTL의 이동성은 매우 다양 한 차원에서 분석 보여줍니다: 된 속도 범위에서 0.01-0.19 µ m/s는 거의 20-fold 차이와 지 속성 범위 0-0.7 (그림 2C). 그것은 쥐에서 vivo에서 중간 마이그레이션 평균 속도의 T 세포는 4 µ m/분16보고 되었다. 최근, 우리는이 문서에 설명 된 방법을 사용 하 여 4-5 µ m/min11 에 CTL의 평균 속도 결정 했습니다. 이러한 결과 그 빛 시트 현미경은 셀 동작, 예를 들어 셀 마이그레이션 및 세포 세포 상호 작용을 시각화 하는 강력한 도구를 보여 줍니다. Vivo에서, 많은 요인 및 마이그레이션에 영향을 미칠 수 있는 수용 성 요소를 포함 하 여 복잡 한 구성의 비 균질 ECM T 셀 동작을 수정 합니다.
콜라겐 매트릭스의 응용 프로그램 라이브 셀에 국한 되지 않습니다. 고정 및 immunostaining 행렬에서 수행할 수 있습니다. 그림 3 에서는 perforin1는 내 생에 3D 콜라겐 젤 고정된 샘플의 예 (PFN1) 말라 얼룩이 있었다. 샘플은 조명 한 측면에서 (싱글 사이드 조명) 또는 양쪽 (듀얼 사이드 조명)에서. 우리는 다른 z 위치에 셀은 스테인드 균등 하 게, 우리의 프로토콜에 설명 된 절차 콜라겐 젤에 항 체의 만족 스러운 침투를 달성 나타내는 관찰 합니다. 더 중요 한 것은, 고정 CTL에서와 같이 동일한 형태 전시 후 라이브 셀 이미징 (비교 그림 3 , 그림 2B), 그 또한 형태는 잘 유지이 프로토콜에 의해 나타내는. 또한, 조명 한 쪽 또는 양쪽 모두에서 초점면에서 이미지의 품질에 큰 차이 만들지 않는다. 적은 지역 듀얼 사이드 조명에 비해 단일 측면 조명 모드 레이저에 노출 되는 고려 하 고, 단일 측면 조명 더 좋습니다.
그림 1: 샘플 준비 하는 동안 모세를 처리 그림. (A)는 모 세관 및 문화 매체와 플런저를 젖은 방법으로 플런저를 넣어. (B)는 모 세관에 셀/콜라겐 혼합 당겨. (C) 모 세관 모델링 점토를 사용 하 여 탑재 합니다. 플런저와 콜라겐 막대 각각 회색과 빨간색 상자에 그려져 있습니다. (D) 콜라겐 로드 문화 매체와 평형 또는 immunostaining에 대 한 처리 합니다. 플런저와 콜라겐 막대 각각 회색과 빨간색 상자에 그려져 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 3D 콜라겐에서 주 인간의 CTL 추적 및 시각화 말라 역학. (A) 최대 강도 투영 기본 인간의 CTL에 걸. 말라는 CTL에 앞에서 설명한11로 분류 됐다. 하루에 한 게시 transfection 셀 0.5% 콜라겐 매트릭스에 포함 했다. 한 대표적인 셀에 표시 됩니다. 스케일 바는 5 µ m. 좋은 걸 구조 돌출 가장자리에 화살촉에 의해 강조 표시 됩니다. (B) 6 h에 대 한 CTL의 궤적. 소프트웨어는 궤도 추적 automatedly (컬러 코드: 블루 = 시작, 빨간 트랙, 450 × 450 × 538 µ m3 볼륨의 끝 =). 눈금 막대는 50 µ m. (C) 속도 및 지 속성의 정량화. 한 점 한 셀을 나타냅니다. 결과 4 기증자 로부터 ± sem의 의미 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
내 인 성 profilin1의 그림 3: Immunostaining (PFN1)와 CD8에 말라+ T 3D 콜라겐 매트릭스에 포함 된 셀. 기본 인간 CD8+ T 세포 0.25% 콜라겐에 포함 했다. PFA 고정 후 샘플 안티-PFN1 (오렌지) 및 phalloidin (자주색)를 사용 하 여 및 빛 시트 현미경 단계-1000 µ m3x 440 x 440의 전체 볼륨에 대 한 1 µ m의 크기에 의해 시각 얼룩 했다. 샘플은 조명 한 측면에서 (싱글 사이드 조명) 또는 양쪽 (듀얼 사이드 조명)에서. 3D 재구성에서 최대 강도 예측 (MIP) 표시 됩니다. 눈금 막대는 50 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
영화 1: T 세포 마이그레이션 중 돌출의 세대. 영화 에서처럼 셀 그림 2A에 표시 된 볼륨에서 찍은. 셀은 콜라겐 매트릭스 (0.5%)에 포함 했다. 이미지 인수 했다 모든 40 빛 시트 현미경을 사용 하 여 37 ℃에서 6 h s. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)
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Discussion
대부분 체 외에서 분석 vivo에서 세포, 면역 세포 특히 주로 3D microenvironment을 경험 하는 반면 2D 표면, 세포 배양 배지, 페 트리 접시 또는 coverslips, 예를에 밖으로 수행 됩니다. 증거를 신흥 면역 세포의 이동 패턴 2D 및 3D 시나리오17사이 다 보여줍니다. 또한, 종양 세포의 식을 프로필은 2D 및 3D 교양 조직18,,1920에서 다른도. 따라서, 최고의 시뮬레이션 시험관에생리 적 조건, 예를 들면 3D 콜라겐 매트릭스에서에서 3D 맥락에서 실험을 수행 하는 큰 장점은의입니다. 새로 개발된 된 접근, 특히 빛 시트 형광 현미경 검사 법, 제어 환경 조건 하에서 3 차원 매트릭스 시스템에서 안정적이 고 재현 실험을 수 있습니다.
기존의 레이저 검사 confocal 현미경 검사 법 조명 빛 시트 현미경으로 전체 프로브는 달리 레이저 빛의 단지 얇은 시트 샘플을 밝히는 생성 됩니다. 탐지 카메라 조명 평면에 수직입니다. 때문에이 기술만 초점면에서 섹션 레이저에 노출 됩니다. 따라서, 사진 표백 및 phototoxicity을 최소화할 수 있습니다. 또한, 지점 검색에 비해 현미경 검사 법, 획득 율은 크게 빛 시트 현미경 검사 법 (100-1,000-fold 빠른) 향상 및 신호 대 잡음 비율 ameliorated 또한. 사용 빛 시트 현미경의 인큐베이션 챔버와 함께 결합이 종이에이 현미경 최소화 표백으로 대용량 3D 이미지 수집을 위한 강력한 옵션 되며 사진-피해 연장 기간 (몇 일)에서 인큐베이터 조건입니다.
3D 콜라겐 매트릭스와 샘플 준비, 가장 중요 한 지점은 공기 방울을 피하기 위해입니다. 그것의 높은 점도 감안할 때 기포는 콜라겐 솔루션 소개 그것 솔루션에서 제거 하는 데 매우 어렵다입니다. 공기 방울의 존재 중 콜라겐 매트릭스;의 합이 일으킬 수 있다 또한, 그것은 이미지의 품질을 축소, 빛의 경로 차단할 수 있습니다. 따라서 때 전송 또는 혼합 콜라겐 솔루션 하나 매우 부드럽게 플라스틱 해야 및 피 펫 팁에서 마지막 한 방울을 추방 하지 않습니다. 또한, 콜라겐 실 온에서 천천히 유해 하기 시작 합니다. 따라서, 솔루션을 잘 혼합 하기 전에 중 합을 방지 하려면 콜라겐-포함 된 튜브 항상 지켜져야 한다 얼음에.
하나의 큰 도전 우리가 빛 시트 현미경 채용에서 만나는 데이터 처리입니다. 빛-시트 현미경 검사 법에 의해 생성 된 데이터 도달할 수 있다 쉽게 500 기가바이트 또는 심지어 몇 테라 바이트의 크기 특히 장기 실험에 대 한. 이러한 데이터를 분석 하려면 높은 계산 용량 작업 역 여 주까지 때로는 몇 일 걸립니다. 때문에 분석 된 이미지 크기가 원본 데이터 보다 작은 스토리지의 용량 신속 하 게 빛 시트 현미경의 응용 프로그램에 대 한 제한 요소를 될 수 있습니다. 따라서 추적 실험 또는 복잡 한 이미지 분석 필요 하다 그것은 좋습니다 당 실험 합리적인 시간 프레임에서 사용할 수 있는 처리 장치에 의해 처리할 수 있는 값을 파일 크기를 제한 하려면.
여기에 도입 된 빛 시트 형광 현미경 검사 법 신중 하 게 처리 되지 않은 경우 결과 영향을 미칠 수 있습니다 몇 가지 기능을가지고. 모세 혈관의 활용 샘플의 배리어 프리 조명에 대 한 특히 유리 하다. 교원 질 막대는 매체에 걸려 있다, 이후 그것은 콜라겐 막대 중 이미지, 특히 장기 측정에 대 한 품으로 발생할 수 있습니다. 이 드리프트는 결과의 오해를 피하기 위해 해결 될 수 있다. 물론, 있다 다른 빛 시트 현미경 설정을 상용 시장에는 샘플을 탑재 하는 모 세관을 필요 하지 않습니다. 또한, 빛 시트 현미경 검사 법, 검사 confocal 현미경 phototoxicity 크게 감소 하고있다, 기존 라인에 비해 사실 외와 phototoxicity 장기 이미징21에 대 한 우려가 여전히 남아 있습니다.
빛-시트 현미경 검사 법, 떨어져 다른 접근 중 주로 적용 되며 confocal 현미경 검사 법, 넓은 분야 형광 현미경 검사 법, multiphoton 현미경 3 차원 형광 영상에 대 한 설립 있다. 침투 깊이 점에서 confocal 및 넓은 필드 형광 현미경 검사 법 일반적으로 100 nm22제한 비슷한 범위에 거짓말. 때문에 더 긴 파장의 빛 다중 광자 현미경 검사 법에 대 한 활용, 0.5-1 m m23의 범위에 그것의 침투 깊이 향상 수 있습니다. 비교, 빛 시트 현미경의 광학 단면에 의해 생성 된 다차원 이미지의 크기는 몇 밀리미터24까지 될 수 있습니다. 가로 해상도 측면에서 우아하게 수행된 실험 그 빛 시트 현미경 제공 더 나은 3 차원 공간 해상도 큰 공초점 형광 현미경 검사 법에 비해25샘플 보여 줍니다. 두 광자 기술에 더 정상적인 하나의 광자 빛 시트 현미경 검사 법에 비해 침투 깊이 향상 하 고 포인트 검색 2 광자 현미경 보다 10 배 빠른 빛 시트 현미경 결합 하고있다 최근에,26.
난이 문서에 사용 된 소 콜라겐 외 셀에 대 한 마이크로-아키텍처를 제공 하는 3D 매트릭스 고려는 엑스트라 세포 매트릭스 (ECM) 마우스 육 종 세포, agarose, 합성 hydrogels에서 파생 또는 기타 같은 다른 많은 옵션 생체 고분자 재료입니다. 마우스 육 ECM 콜라겐 IV, laminin 뿐만 아니라 수많은 성장 인자를 포함 하 여 단백질 혼합물 이다. 합성 물질, 생물 학적 소프트웨어 (콜라겐과 마우스 육 ECM), 한 손으로 비교 제시 더 순수 관련 컨텍스트; 하지만 다른 한편으로, 품질 및 구성 생물 학적 소프트웨어 다를 수 있습니다 일괄 처리와 회사 사이. 반면, 합성 물질의 재현성은 더 보장 된다. 놀랍게도, 생 화 학적 및 기계적 특성의 미세 조정, 원하는 수정, 뿐만 아니라 허용 됩니다 합성 재료, 하지만 생물 학적 소프트웨어10,27.
요약 하자면,이 문서에서 우리 빛 시트 형광 현미경 검사 법, 및 시각화 하 고 분석 하는 CTL 마이그레이션 3D 콜라겐 매트릭스에 기본 인간의 CTL을 포함 하는 방법을 사용 하 여 세포 생물학 실험에 대 한 3D 콜라겐 매트릭스를 생성 하는 프로토콜 설명. 우리는 샘플 준비, 이미지 수집 및 분석에 핵심 포인트를 강조 했다. 우리의 결과 보여준다 잘 말라 구조 및 높은 동적 돌출 형성 좋은 spatiotemporal 해상도 빛 시트 현미경에 의해 구상 될 수 있다. 또한, 여기에 설명 된 분석 프로토콜 우리가 안정적으로 추적 하는 객관적이 고 자동화 된 방식으로 셀 수 있습니다. 이 방법은 특히 인간의 면역 연구에 대 한 유리한 쥐로 되며 인간 많은 면역 기능과 치료28반응성에서 실질적으로 다르다.
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Disclosures
저자는 금융 또는 상업적 충돌의 관심을 선언합니다.
Acknowledgments
우리 임상 Hemostaseology 연구소 및 수혈 의학 기증자 혈액;를 제공 하기 위한 감사 합니다. 카르멘 Hässig 및 우수한 기술 지원에 대 한 코 라 호자. 우리 LifeAct mEGFP 구조를 생성 하기 위한 수정된 pMAX 벡터에 대 한 옌스 Rettig (자를란트 대학), 롤랜드 Wedlich-용 병 (뮌스터 대학) 원래 LifeAct-루비 구문 및 기독교 고물 (자를란트 대학) 감사 합니다. 이 프로젝트는 Sonderforschungsbereich 1027 (B.Q. 프로젝트 A2)와 894 (수소 프로젝트 a 1)에 의해 투자 되었다. 빛-시트 현미경 DFG에 의해 투자 되었다 (GZ: INST 256/4 19-1 FUGG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibricol, bovine collagen solution | Advanced Biomatrix | #5133-20ML | Collagen matrix |
| 0.5 M NaOH Solution | Merck | 1091381000 | for neutralizing Fibricol solution |
| Ultra-Low melting agarose | Affymetrix | 32821-10GM | Sample preparation in low c[Col] |
| Dynabeads Untouched Human CD8 T Cells Kit | Thermo Fisher | 11348D | Isolation of primary human CD8+ T cells from PBMC |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation | Thermo Fisher | 11132D | Activation of CTL populations |
| Human recombinant interleukin-2 | Thermo Fisher | PHC0023 | Stimulation of cultured CTL |
| P3 Primary solution kit | Lonza | V4XP-30XX | Transfection |
| α-PFN1 antibody, rabbit, IgG | Abcam | ab124904 | IF |
| Alexa Fluor 633 Phalloidin | Thermo Fisher | A22284 | IF |
| CellMask Orange Plasma membrane Stain | Thermo Fisher | C10045 | Fluorescent cell label |
| Tween 20 | Sigma | P1379-250mL | IF |
| Triton X-100 | Eurobio | 018774 | IF |
| DPBS Dulbecco's phopsphate buffered saline | Thermo Fisher | 14190250 | IF |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9418-100G | IF |
| Goat α Rabbit 568, IgG, rabbit | Thermo Fisher | A-11011 | IF |
| Lightsheet Z.1 (Light-sheet microscopy) | Zeiss | N.A. | |
| Cell culture hood | Thermo Fisher | HeraSafe KS | |
| Cell culture incubator HERACell 150i | Thermo Fisher | N.A. | |
| Centrifuge 5418 and 5452 | Eppendorf | N.A. | |
| Pippettes | Eppendorf | 3123000039, 3123000020, 3123000063 | |
| Pippette tips | VWR | 89079-444, 89079-436, 89079-452 | |
| 15 mL tubes | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Capillaries 50 µL | VWR (Brand) | 613-3373 | Zeiss LSFM sample preparation |
| Plunger for capillaries | VWR (Brand) | BRND701934 | "Stamps with Teflon tip" LSFM sample preparation |
| MColorPhast pH stips | Merck | 1095430001 | to test pH of neutralized Fibricol |
| BD Plastipak 1mL syringes | BD | Z230723 ALDRICH | Alternative sample preparation |
| Modeling clay (Hasbro Play-Doh A5417EU7) | Play-Doh | N.A. | |
| Imaris file converter | Bitplane | available at http://www.bitplane.com | Convert imaging files to Imaris file format |
| Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage) | Bitplane | available at http://www.bitplane.com | Analysis of 3D and 4D imaging data |
References
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