Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para visualizar as células imunes, incorporadas em uma matriz de colágeno (3D) tridimensionais usando microscopia de luz-folha. Este protocolo também elabora como controlar migração celular em 3D. Este protocolo pode ser empregado para outros tipos de suspensão de células na matriz 3D.
Abstract
In vivo, ativação, proliferação e função de todas as células do sistema imunológico ocorrem num ambiente tridimensional (3D), por exemplo, nos gânglios linfáticos ou tecidos. Até à data, a maioria em vitro sistemas depende de bidimensional (2D) as superfícies, tais como placas de cultura de células ou lamelas. Otimamente imitar condições fisiológicas em vitro, utilizamos uma matriz de colagénio 3D simples. Colágeno é um dos principais componentes da matriz extracelular (ECM) e tem sido amplamente utilizado para constituir as matrizes 3D. Para geração de imagens 3D, a tecnologia de microscopia de luz-folha recentemente desenvolvidos (também referida como microscopia de iluminação único plano) é caracterizada com aquisição de alta velocidade, profundidade de grande penetração, branqueamento baixa e fotocitotoxicidade. Além disso, a microscopia de luz-folha é particularmente vantajosa para medição de longo prazo. Aqui descrevemos um protocolo otimizado como configurar e manipular células do sistema imunológico humanas, por exemplo, primário humanos linfócitos T citotóxicos (CTL) e na matriz de colagénio 3D para uso com a microscopia de luz-folha para a imagem latente de célula viva células assassinas naturais (NK) e amostras fixas. O procedimento de aquisição de imagem e análise de migração celular são apresentados. Especial atenção é dada para destacar os passos críticos e factores para a preparação da amostra e análise de dados. Este protocolo pode ser empregado para outros tipos de suspensão de células em uma matriz de colagénio 3D e não está limitado às células do sistema imunológico.
Introduction
Mais conhecimento sobre a migração células vem de 2D experimentos1,2,3, que normalmente são realizados em um vidro ou superfície plástica de uma cultura/imagem prato. No entanto, um cenário fisiológico requer, na maioria dos casos, um microambiente 3D, em que a matriz extracelular (ECM) desempenha um papel decisivo. ECM não só fornece a estrutura 3D essenciais para manter a morfologia celular adequada, mas também oferece sinais de sobrevivência ou pista fiável para um óptimo funcionamento de muitas células4,5 . Portanto, um ambiente 3D é necessário para melhor identificar funções celulares e comportamento em um ambiente melhor, refletindo o contexto fisiológico.
No corpo humano, a maioria das células, especialmente células imunes, exercer as suas funções sob um cenário 3D. Por exemplo, células T ativadas patrulham tecidos procura nas células-alvo, ingênuo T células migram através dos gânglios linfáticos em busca de suas células apresentadoras cognatas durante o qual o modo de migração e máquinas são adaptados para o correspondente extracelular ambiente3,6,7. O gel de colágeno 3D tem sido amplamente utilizado como um sistema celular 3D bem estabelecido e bem caracterizadas de cultura8,9,10. Nosso trabalho anterior mostra que os linfócitos humanos primários são altamente móveis e migram a uma velocidade média de cerca de 4,8 µm/min em uma matriz baseada em colágeno de 0,25%11. Rearranjo do citoesqueleto desempenha um papel fundamental na migração celular12. Acumular evidências mostra que os linfócitos não se aplicam apenas um único modo de migração, no entanto, podem alternar entre um determinado comportamento de migração, dependendo do microambiente, citocinas, localização, gradientes Quimiotáticos e extracelular sinaliza qual música o comportamento migratório em maneiras diferentes de 3.
Para confiantemente analisar funções de células imunes e comportamento, por exemplo, migração, formação de protrusão ou transporte vesicular, é de grande vantagem para ser capaz de adquirir imagens em relativamente grandes volumes 3D de forma rápida e confiável. Para geração de imagens 3D, a tecnologia de microscopia de luz-folha recentemente desenvolvidos (também referida como microscopia de iluminação único avião) oferece uma solução satisfatória13,14. Durante a aquisição de imagem, uma folha fina de luz estática é gerada para iluminar a amostra. Desta forma, sobre o plano de foco, uma grande área pode ser iluminada simultaneamente sem afetar as células do avião. Esta característica permite uma velocidade de aquisição elevado com um branqueamento e fotocitotoxicidade drasticamente reduzida. Neste artigo, descrevemos como Visualizar células do sistema imunológico humanas primárias usando microscopia de luz-folha e como analisar a migração em um cenário 3D.
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Protocol
Pesquisa realizada para este estudo com o material humano (câmaras de sistema de redução de leucócitos de doadores de sangue humano) está autorizada pelo Comitê de ética local (declaração de 16.4.2015 (84/15; Prof Dr. Rettig-Stürmer)) e segue as diretrizes correspondentes.
1. preparação da solução neutralizada de colágeno (500 µ l)
- Transferi 400 µ l de solução colágeno refrigerados (10,4 mg/mL) para um tubo estéril 1,5 mL sob o capô de cultura de células. Lentamente, adicione 50 µ l de refrigerados 10 x PBS (pH 7.0-7.3) a 400 µ l de solução-mãe de colágeno refrigerados. Misture a solução por telha suavemente o tubo.
Nota: Todos os passos na parte 1 devem ser feitos sob uma capa de cultura celular. - Adicione 8 µ l de 0.1 M NaOH em 500 µ l da solução de colágeno de 1.1. para ajustar o pH entre 7,2-7,6. Use tiras de teste de pH (faixa de pH: 6-10) para determinar o valor de pH da mistura.
Nota: Os Volumes podem variar para diferentes lotes de colágeno. Solução de NaOH deve ser misturado lentamente para evitar bolhas de ar. A mistura deve ser mantida no gelo para evitar gelificação de colágeno. - Adicionar 2 µ l de DDQ estéril2O tornar-se o volume final de 500 µ l. Misture bem e armazenar esta solução de colágeno (8,32 mg/mL) no gelo ou a 4 ° C até utilização posterior.
Nota: Sob esta condição, neutralizado colágeno pode ser usado por 24 h. alíquotas não são recomendadas para evitar bolhas de ar.
2. amostra preparação para microscopia de fluorescência de luz-folha usando capilares
- Etiqueta fluorescente as células vivas de interesse com os corantes fluorescentes primário desejado15 ou proteínas fluorescentes11 conforme descrito anteriormente.
- Transferência de 1 × 106 células para um tubo estéril 1,5 mL sob uma capa de cultura celular. Centrifugar o tubo a x 200 g por 8 min. descartar o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 200 µ l de meio de cultura.
Nota: Recomenda-se a densidade celular de 5 × 106 células/mL para visualização da migração de células imunes humanas, especialmente de linfócitos T citotóxicos (CTL) e células assassinas naturais (NK). - Adicione 85,9 µ l da solução neutralizada colágeno 1,3. para a suspensão de células de 2.2. e misturar corretamente para chegar a uma concentração de colágeno de 2,5 mg/mL. Deixe a mistura de célula/colágeno no gelo no capô.
Nota: Suponha que a concentração desejada de colágeno é N mg/mL, o volume de neutralizado solução de colágeno (para suspensão de células 200 µ l) = 200 × N /(8.32-N) - Em seguida, coloque o êmbolo correspondente em capilar (diâmetro ~ 1 mm) até que o êmbolo 1 mm fora do capilar. Molhe o êmbolo mergulhando no meio de cultura (figura 1A).
Nota: Este passo poderia ajudar a evitar bolhas de ar quando o capilar é mergulhado na mistura de célula/colágeno. O capilar e o êmbolo não tem que ser estéril. - Mergulhe o capilar na célula/colágeno mistura de 2.3. Puxe lentamente o êmbolo volta para 10-20 mm (figura 1B). Limpe a parede exterior do capilar com uma toalha de papel umedecida com spray de etanol 70% para remover a solução restante do colágeno.
- Montar o capilar com argila de modelagem na parede interna de um tubo de 5 mL e empurrar o mix de célula/colágeno para a borda do capilar (Figura 1).
- Manter o capilar a 37 ° C com 5% de CO2 por 1h para polimerização do colágeno.
- Adicione o meio de cultura (cerca de 1-2 mL) para um tubo de 5 mL. Empurre com cuidado a haste de colágeno polimerizado para fora no meio de cerca de 3/4 do colágeno pendurado no meio (Figura 1).
- Manter o capilar, assim, a 37 ° C com 5% de CO2 por mais 30 min equilibrar a haste de colágeno com o meio.
Nota: Depois disso, a haste de colágeno pode ser puxada para trás no capilar e culta mais antes de nova utilização.
3. imagem aquisição usando microscopia de luz-folha
- Montagem da câmara de amostra de acordo com as instruções do fabricante.
- Ligue a incubação e o microscópio para aquecer a câmara de amostra a 37 ° C (para célula viva de imagens apenas).
- Colocar o capilar na câmara de amostra e localize a amostra para encontrar a área de interesse para aquisição de imagens.
- Ative o correspondente laser(s). Defina as seguintes configurações: poder, tempo de exposição, passo-tamanho da posição z-pilha, o começo e o fim da z-pilha e o intervalo de tempo para a imagem latente de célula viva de laser.
Nota: por exemplo, o exemplo na Figura 2 foi fotografado cada 40 s para 6 h a 37 ° C, com um tamanho de passo de 1 µm (total espessura: 538 µm). A potência do laser foi 1% com um tempo de exposição de 30 ms. O tamanho do pixel na direção de x-y é 0,23 µm. - Inicie a aquisição de imagem.
4. automatizado de análise de rastreamento
- Abra o conversor de arquivo, clique em Add Files para escolher o arquivo de imagem (s) a ser convertido para o formato de arquivo de software (*.ims). Clique em procurar e selecione uma pasta para salvar o arquivo convertido (s). Clique em Iniciar todos.
- Abra o software de análise. Clique em superar. Vá ao menu arquivo e clique Opene, em seguida, escolher o arquivo de imagem para ser analisado.
Nota: Se o tamanho do arquivo é grande esta etapa pode levar tempo. Arquivos maiores do que 1 Terabyte (TB) não são recomendados para uma única experiência como o processo são de tais arquivos de grandes capacidade computacional altamente exigente. - Clique em Adicionar novos Spots. Marque a caixa de Processo toda imagem finalmente. Clique em seguinte.
- Digite as coordenadas x e y (em pixel) para definir a região de interesse. Digite o número de quadros (z-posição e tempo) para analisar. Clique em seguinte.
- Seleccione o canal de destino, que contém os objetos a serem controladas, na lista suspensa de Canal de origem. Entra estimado xy diâmetro (µm). Clique em seguinte.
Nota: O diâmetro estimado xy é o diâmetro médio na dimensão x-y de objetos a serem controladas. - Clique em qualidade. Defina um limite, em que a maioria das células (objetos) deve ser incluída. Clique em seguinte.
- Escolha o algoritmo desejado (Autoregressive movimento é recomendado). Insira a distância máxima (recomenda-se20 µm ) e o tamanho máximo de abertura (3 ou 2 é recomendado). Clique em todo o processo de imagem finalmente.
Nota: Max distância e tamanho de abertura Max são dois limiares para quebrar faixas. Mais especificamente, em dois quadros contínuos quando a distância entre o objeto mesmo excede a distância de Max, este objeto no quadro posterior será considerado como um novo objeto. Às vezes durante a aquisição, o mesmo objeto pode desaparecer por alguns quadros e aparece outra vez. Neste caso, somente quando este objeto reaparece dentro o tamanho máximo de lacuna, será considerado como o mesmo objeto. - Clique em Tipo de filtro e escolha a opção Excluir faixas indesejadas.
Nota: Este passo é opcional. - Clique em seguinte e clique em terminar.
Nota: Este passo pode demorar horas até dias, dependendo do desempenho computacional. - Clique em Editar faixas e escolha Correta de Drift. Selecione o algoritmo apropriado (Drift translacional é recomendado). Selecione o desejado Resultado Dataset tamanho (Novo tamanho igual ao tamanho atual é recomendado). Clique Okey.
Nota: Esta etapa só é necessária quando o colágeno à deriva durante a aquisição de imagens. - Clique em estatísticas e escolha Configurar lista de estatísticas valores visíveis. Verifique as opções de interesse para ser exportado (por exemplo, coordenadas, velocidade e assim por diante). Clique Okey.
- Clique em Exportar todas as estatísticas de arquivo e digite o nome do arquivo.
5. fixação e imunofluorescência coloração de células em matrizes de colágeno
- Transferi 1.000 µ l de paraformaldeído 4% (PFA, em PBS) para um tubo de 5 mL sob uma capa de química.
Nota: PFA deve ser equilibrado à temperatura ambiente. - Mergulhe o capilar com colágeno polimerizado de 2,9. em solução PFA (por ~ 5 mm) e montar o capilar na parede interna do tubo 5 mL com argila de modelagem (como mostrado na Figura 1).
- Pressione o êmbolo cuidadosamente até metade da haste de colágeno está pendurado na solução de PFA (Figura 1). Mantenha o tubo em temperatura ambiente por 20 min.
- Puxe o êmbolo para pega a vara de colágeno dentro do capilar. Retire o capilar e descartar PFA.
- Montar o capilar em um tubo de fresco e adicione 1 mL de PBS. Certifique-se de que o capilar é imerso na PBS.
- Pressione o êmbolo cuidadosamente até metade da haste de colágeno está pendurado na solução. Monte o capilar na parede interna com argila de modelagem.
- Mantenha o tubo em temperatura ambiente por 5 min.
- Repita 5.4. -5,7 por outro 2 vezes.
- Puxe o êmbolo para pega a vara de colágeno dentro do capilar. Descarte a PBS. Transferir 1-2 mL de tampão de bloqueio/permeabilização (PBS + 1% de BSA + 0,1% de tensoativo não-iônico) no tubo e repetir 5.6.
Nota: A BSA (1%) pode ser substituída por 5% de soro do animal em que o secundário Ab foi criado. - Mantenha o tubo em temperatura ambiente por 30-60 min.
- Puxe o êmbolo para pega a vara de colágeno dentro do capilar. Descarte o buffer de permeabilização. Transferência de 200-500 µ l do anticorpo primário no buffer de bloqueio/permeabilizacao e expele a vara na solução.
- Mantenha o tubo à temperatura ambiente durante 1 h.
- Lave a haste de colágeno 3 vezes com PBST (PBS + - 0,1% de surfactante não-iônico) conforme descrito no ponto 5.4. -5.8.
- Incube a haste no anticorpo secundário no buffer de bloqueio/permeabilização por 1h à temperatura ambiente. Mantê-lo de luz.
- Lave a haste de colágeno 3 vezes com PBS, conforme descrito no ponto 5.4. -5.8.
- Puxe o êmbolo para pega a vara de colágeno dentro do capilar. Mantenha as amostras em PBS até imagens.
- Analisar as amostras conforme descrito em 3.
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Representative Results
Formação de protrusão durante a migração de células T é um processo altamente dinâmico, que é dependente de actina. Para visualizar a formação de protrusão de CTL humana primária, nós transfectadas transitoriamente uma proteína mEGFP fundido para rotular o citoesqueleto de actina no CTL conforme descrito antes das11. Um dia depois de transfeccao, as células foram incorporadas na matriz de colágeno. Pilhas de imagem foram adquiridas todos os 40 s com um tamanho de passo de 1 µm a 37 ° C, utilizando microscopia de luz-folha. Como mostrado na Figura 2A e 1 complementar do filme, durante a migração, forma humana CTL as grandes saliências em forma de limão, orlada por estruturas do eixo fina. O experimento mostrado aqui, não apenas uma única célula foi fotografada, mas um grande volume (450 x 450 x 538 µm3) (Figura 2B). Assim, a qualidade óptica e resolução mostrados aqui foram obtidos com um objectivo de baixa ampliação (20 X / 1.0 DIC VIS IR). Portanto, a resolução pode ser melhorada com objetivos mais elevados de at.
No experimento mostrado na Figura 2 e 1 filme, listas de certificados confiáveis foram rastreadas automaticamente conforme descrito no protocolo parte 4. As trajetórias de CTL são representadas na Figura 2B. Analisaram-se dois parâmetros de migração: velocidade e persistência. Persistência é definida como o deslocamento dividido pelo comprimento total da pista. A análise mostra que a mobilidade do CTL é muito diversificada em 3D: as velocidades variam de 0,01-0,19 µm/s com uma diferença de quase 20-fold e os intervalos de persistência de 0 - 0,7 (Figura 2). Foi relatado em camundongos que na vivo intersticial média velocidade de migração das células T foi 4 µm/min16. Recentemente, nós determinamos a velocidade média de CTL ser 4-5 µm/min11 usando os métodos descritos neste artigo. Estes resultados demonstram que a microscopia de luz-folha é uma poderosa ferramenta para visualizar o comportamento da célula, por exemplo, a migração celular e a interação célula-célula. In vivo, muitos fatores e um ECM não homogéneo da composição complexa incluindo fatores solúveis que podem afetar a migração irão modificar o comportamento de células T.
Aplicação de uma matriz de colagénio não está limitada a células vivas. Fixação e imunocoloração também podem ser realizadas na matriz. A Figura 3 mostra um exemplo de amostras fixas em gel de colágeno 3D, no qual perforin1 endógeno (PFN1) e actina estavam manchadas. A amostra foi iluminada a partir de um único lado (única iluminação lateral) ou de ambos os lados (iluminação de lado duplo). Observamos que as células em diferentes posições-z uniformemente estão manchadas, indicando que os procedimentos descritos em nosso protocolo alcançar penetração satisfatória de anticorpos em gel de colágeno. Mais importante ainda, após fixação CTL demonstraram a mesma morfologia como em viver a imagem latente da pilha (compare Figura 3 e Figura 2B), indicando que também a morfologia está bem conservada pelo presente protocolo. Além disso, iluminação de lado único ou de ambos os lados não faz uma diferença significativa na qualidade das imagens no plano focal. Considerando que menos área é exposta ao laser com o modo de iluminação de lado único em comparação com a iluminação de lado duplo, iluminação de lado único é mais recomendada.
Figura 1: ilustração de manipulação capilares durante a preparação da amostra. (A) colocar a haste capilar e como molhar o êmbolo com meio de cultura. (B) puxe a mistura de célula/colágeno na capilar. (C) montar capilares usando argila de modelagem. O pistão e a haste de colágeno são retratados nas caixas de cinza e vermelhas, respectivamente. (D) lidar com haste de colágeno de equilíbrio com o meio de cultura ou de imunocoloração. O pistão e a haste de colágeno são retratados nas caixas de cinza e vermelhas, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: rastreamento primário humano CTL em colágeno 3D e visualização dinâmica de actínio. (A) projeção de intensidade máxima de actina no CTL humano primário. Actina foi rotulada na CTL como descrito anteriormente,11. Dia um post transfecção de células foram incorporadas na matriz de colagénio de 0,5%. Uma célula representativa é mostrada. Barras de escala são 5 µm. actina bem estruturas na borda de protrusão destacam-se pela seta. (B) as trajetórias de CTL para 6 h. As trajetórias automatedly são controladas pelo software (código de cores: azul = start, vermelho = fim da faixa, 450 × 450 × 538 µm3 volume). Barra de escala é 50 µm. (C) quantificação de velocidade e persistência. Um ponto representa uma célula. Resultados são apresentados como média ± SEM de 4 doadores. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imunocoloração de profilin1 endógeno (PFN1) e actina em CD8+ T células incorporados na matriz de colagénio 3D. CD8 humano primário+ T células foram incorporadas em 0,25% de colágeno. Após a fixação do PFA a amostra estava manchada usando anti-PFN1 (laranja) e a faloidina (roxo) e visualizadas por microscopia de luz-folha em um tamanho de passo de 1 µm para um volume total de 440 x 440 x 1.000 µm3. A amostra foi iluminada a partir de um único lado (única iluminação lateral) ou de ambos os lados (iluminação de lado duplo). Projeções de intensidade máxima (MIP) da reconstrução 3D são mostradas. As barras de escala são 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Filme 1: geração de saliências durante a migração de células T. O celular mostrado no filme foi tirado o volume mostrado na Figura 2A. As células foram incorporadas em uma matriz de colagénio (0,5%). Foram adquiridas imagens cada 40 s para 6 h a 37 ° C, utilizando microscopia de luz-folha. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
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Discussion
A maioria em vitro ensaios é realizada em uma superfície 2D, por exemplo em placas de cultura de células, pratos de Petri ou em lamelas, Considerando que na vivo as células, especialmente células imunitárias, principalmente um microambiente 3D a experiência. Emergentes a evidência mostra que os padrões de migração das células imunitárias diferem entre 2D e 3D de cenários17. Além disso, os perfis de expressão de células tumorais também são diferentes em 2D e 3D-cultivadas tecidos18,19,20. Portanto, para melhor simular as condições fisiológicas em vitro, é de uma grande vantagem para realizar experiências em um contexto 3D, por exemplo em matrizes de colágeno 3D. As abordagens recentemente desenvolvidas, em particular, a microscopia de fluorescência de luz-folha, permite experiências reprodutíveis e confiáveis sistemas de matrizes 3D sob condições ambientais controladas.
Em contraste com um convencional-varredura a laser confocal da microscopia que ilumina a sonda inteira, com microscopia de luz-folha, apenas uma folha fina de luz laser é gerada para iluminar as amostras. A câmera de deteção é perpendicular ao plano de iluminação. Devido a essa técnica, apenas a seção no plano focal é exposta ao laser. Portanto, foto-branqueamento e fototoxicidade podem ser minimizados. Além disso, em relação ao ponto de varredura, microscopia, a taxa de aquisição é drasticamente melhorada com microscopia de luz-folha (100 - 1,000-fold mais rápido) e a relação sinal-ruído é também melhorou. Combinado com a câmara de incubação da microscopia de luz-folha de instalação usada neste trabalho este microscópio é uma poderosa opção para aquisição de imagens de grandes volumes 3D com branqueamento minimizado e foto-danos durante longos períodos de tempo (vários dias) sob condições da incubadora.
Para a preparação da amostra com a matriz de colagénio 3D, o seu ponto mais crítico é para evitar bolhas de ar. Dada a sua alta viscosidade, quando as bolhas de ar são introduzidas para a solução de colágeno é muito difícil removê-lo da solução. A presença de bolhas de ar pode induzir a heterogeneidade da polimerização da matriz de colagénio; Além disso, ele pode bloquear o caminho da luz, o que diminuiria a qualidade das imagens. Portanto, quando transferir ou misturar a solução de colágeno deve Pipetar muito suavemente e não expelir a última gota na ponta da pipeta. Além disso, o colágeno começa a polimerizar-se lentamente à temperatura ambiente. Assim, para evitar a polimerização antes de misturar a solução bem, os tubos contendo colágeno devem ser sempre mantidos no gelo.
Um grande desafio que nos deparamos em empregando microscopia de luz-folha é a manipulação de dados. Os dados gerados pela microscopia de luz-folha podem facilmente alcançar o tamanho de 500 gigabytes ou até mesmo de vários terabytes, em particular para experiências a longo prazo. Para analisar esses dados leva vários dias, às vezes até uma semana por uma estação de trabalho com capacidade de cálculo de alta. Desde que o tamanho das imagens analisadas não é menor do que os dados originais a capacidade de armazenamento pode rapidamente tornar-se um fator limitante para a aplicação da microscopia de luz-folha. Portanto, para experimentos de acompanhamento ou se é necessária análise de imagem complexa é altamente recomendável para limitar o tamanho de arquivo por experiência de valores que podem ser tratadas em um prazo razoável, as unidades de processamento disponível.
Microscopia de fluorescência de luz-folha introduzida aqui tem algumas características, que podem afetar os resultados, se não tratada com cuidado. A utilização de capilares é particularmente vantajosa para uma iluminação sem barreiras das amostras. Uma vez que a haste de colágeno está pendurado no meio, pode acontecer que a haste de colágeno deriva durante a aquisição de imagens, especialmente para medições de longo prazo. Este desvio tem que ser corrigida para evitar interpretações erradas dos resultados. Claro, existem outras configurações de microscopia de luz-folha comercialmente disponíveis no mercado, que não exigem capilares para montar as amostras. Além disso, com a microscopia de luz-folha, além do fato de que, em comparação à linha convencional, digitalização fototoxicidade microscopia confocal foi substancialmente reduzida, fototoxicidade continua a ser uma preocupação para a longo prazo de imagens21.
Para além de microscopia de luz-folha, existem outras abordagens estabelecidas para a imagem latente 3D fluorescência, entre os quais a maioria aplicada é microscopia confocal, microscopia de fluorescência de campo amplo e microscopia do multiphoton. Em termos de profundidade de penetração, microscopia de fluorescência confocal e campo amplo mentir na faixa semelhante, normalmente limitada a 100 nm22. Devido a luz de comprimento de onda mais utilizada para multi fotão microscopia, sua profundidade de penetração pode ser reforçada ao intervalo de 0,5 - 1 mm.23. Em comparação, o tamanho de imagens multi-dimensionais gerada pelo seccionamento óptico de microscopia de luz-folha pode ser até vários milímetros24. Em termos de resolução lateral, um experimento elegantemente realizado mostra que a microscopia de luz-folha fornece uma melhor tridimensional resolução espacial comparada à microscopia de fluorescência confocal em grandes amostras de25. Recentemente, microscopia de luz-folha foi combinada com a técnica de dois fotões, que mais melhora a profundidade de penetração em relação ao normal uma microscopia de luz-folha de fóton e é dez vezes mais rápido que a verificação de ponto dois fotões microscopia26.
Considerando a matriz 3D que fornece a microarquitetura para as células, além de colágeno bovino que usei neste trabalho, existem muitas outras opções, tais como a matriz extracelular (ECM) derivada de células de sarcoma de rato, agarose, hidrogel sintético ou outro materiais poliméricos biocompatíveis. Sarcoma de rato ECM é uma mistura de proteína, incluindo colágeno IV, laminina, bem como inúmeros fatores de crescimento. Comparar com os materiais sintéticos, ECMs biológicas (colágeno e mouse sarcoma ECM), por um lado, apresentar um contexto mais fisiologicamente relevante; Mas por outro lado, a qualidade e composição biológicas ECMs podem variar entre lotes e empresas. Em contraste, a reprodutibilidade dos materiais sintéticos é mais garantida. Notavelmente, ajuste fino de propriedades bioquímicas e mecânicas, bem como as modificações desejadas, é permitido para materiais sintéticos, mas não para biológica ECMs10,27.
Em resumo, neste trabalho, descrevemos um protocolo para construir a matriz de colagénio 3D para experiências de biologia de pilha usando microscopia de fluorescência de luz-folha e como incorporar CTL humana primária na matriz de colagénio 3D para visualizar e analisar a migração do CTL. Destacámos os pontos-chave na preparação da amostra, a análise e aquisição de imagem. Nossos resultados mostram que formação de saliências altamente dinâmicas e bem actina estruturas pode ser visualizada por microscopia de luz-folha com uma boa resolução spatiotemporal. Além disso, o protocolo de análise descrito aqui nos permite controlar confiantemente células de forma automatizada e objetivo. Este método será especialmente vantajoso para pesquisa imunológica humana como ratos e os seres humanos diferem substancialmente em muitas funções imunológicas e reatividade a terapias28.
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Disclosures
Os autores não declaram nenhum conflito de interesses financeiro ou comercial.
Acknowledgments
Agradecemos o Instituto de Hemostaseology clínica e medicina transfusional para o fornecimento de sangue de doadores; Carmen Hässig e Cora Hoxha para ajuda técnica excelente. Agradecemos a Jens Rettig (Universidade de Saarland) para o vetor modificado pMAX, Roland Wedlich-Söldner (Universidade de Muenster) para a construção de LifeAct-Ruby original e Christian Junker (Universidade de Saarland) para gerar a construção de LifeAct-mEGFP. Este projecto foi financiado pelo Sonderforschungsbereich 1027 (projeto A2 para B.Q.) e 894 (projeto A1 para MH). O microscópio de luz-folha foi financiado pelo DFG (GZ: INST 256/4 19-1 FUGG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibricol, bovine collagen solution | Advanced Biomatrix | #5133-20ML | Collagen matrix |
| 0.5 M NaOH Solution | Merck | 1091381000 | for neutralizing Fibricol solution |
| Ultra-Low melting agarose | Affymetrix | 32821-10GM | Sample preparation in low c[Col] |
| Dynabeads Untouched Human CD8 T Cells Kit | Thermo Fisher | 11348D | Isolation of primary human CD8+ T cells from PBMC |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation | Thermo Fisher | 11132D | Activation of CTL populations |
| Human recombinant interleukin-2 | Thermo Fisher | PHC0023 | Stimulation of cultured CTL |
| P3 Primary solution kit | Lonza | V4XP-30XX | Transfection |
| α-PFN1 antibody, rabbit, IgG | Abcam | ab124904 | IF |
| Alexa Fluor 633 Phalloidin | Thermo Fisher | A22284 | IF |
| CellMask Orange Plasma membrane Stain | Thermo Fisher | C10045 | Fluorescent cell label |
| Tween 20 | Sigma | P1379-250mL | IF |
| Triton X-100 | Eurobio | 018774 | IF |
| DPBS Dulbecco's phopsphate buffered saline | Thermo Fisher | 14190250 | IF |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9418-100G | IF |
| Goat α Rabbit 568, IgG, rabbit | Thermo Fisher | A-11011 | IF |
| Lightsheet Z.1 (Light-sheet microscopy) | Zeiss | N.A. | |
| Cell culture hood | Thermo Fisher | HeraSafe KS | |
| Cell culture incubator HERACell 150i | Thermo Fisher | N.A. | |
| Centrifuge 5418 and 5452 | Eppendorf | N.A. | |
| Pippettes | Eppendorf | 3123000039, 3123000020, 3123000063 | |
| Pippette tips | VWR | 89079-444, 89079-436, 89079-452 | |
| 15 mL tubes | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Capillaries 50 µL | VWR (Brand) | 613-3373 | Zeiss LSFM sample preparation |
| Plunger for capillaries | VWR (Brand) | BRND701934 | "Stamps with Teflon tip" LSFM sample preparation |
| MColorPhast pH stips | Merck | 1095430001 | to test pH of neutralized Fibricol |
| BD Plastipak 1mL syringes | BD | Z230723 ALDRICH | Alternative sample preparation |
| Modeling clay (Hasbro Play-Doh A5417EU7) | Play-Doh | N.A. | |
| Imaris file converter | Bitplane | available at http://www.bitplane.com | Convert imaging files to Imaris file format |
| Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage) | Bitplane | available at http://www.bitplane.com | Analysis of 3D and 4D imaging data |
References
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