Summary
Aquí, presentamos un protocolo para visualizar células inmunes embebidas en una matriz de colágeno (3D) tridimensional mediante microscopía de luz de hoja. Este protocolo también explica cómo realizar el seguimiento de la migración celular en 3D. Este protocolo puede ser empleada para otros tipos de suspensión de células en la matriz 3D.
Abstract
In vivo, la activación, proliferación y función de las células inmunes todos se producen en un entorno tridimensional (3D), por ejemplo en los ganglios linfáticos o tejidos. Hasta la fecha, la mayoría en vitro sistemas se basan en dos dimensiones (2D) las superficies, como las placas de cultivo celular o cubreobjetos. A óptimo imitan las condiciones fisiológicas en vitro, utilizamos una matriz de colágeno 3D simple. Colágeno es uno de los principales componentes de la matriz extracelular (ECM) y ha sido ampliamente utilizado para constituir matrices de 3D. Para la proyección de imagen 3D, la tecnología de microscopia de luz hoja recientemente desarrollado (también conocida como microscopía de iluminación solo plano) se presenta con alta velocidad, la profundidad de penetración grande, blanqueo bajo y fotocitotoxicidad. Además, microscopia de la hoja de luz es particularmente ventajosa para medición a largo plazo. Aquí se describe un protocolo optimizado cómo configurar y manejar las células inmunes humanas, por ejemplo primario humano los linfocitos T citotóxicos (CTL) y las células natural killer (NK) en la matriz de colágeno 3D para uso con la microscopia de luz-hoja para la proyección de imagen de células vivas y muestras fijadas. Se presentan el procedimiento de adquisición de imágenes y análisis de la migración de la célula. Especial atención se da a resaltar pasos críticos y los factores para preparación de muestras y análisis de datos. Este protocolo puede ser empleada para otros tipos de suspensión de células en una matriz de colágeno 3D y no se limita a las células inmunes.
Introduction
Más conocimiento acerca de la migración las células viene de 2D1,2,3, los experimentos que se realizan normalmente en una superficie de vidrio o plástico de una cultura/proyección de imagen de plato. Sin embargo, una situación fisiológica requiere, en la mayoría de los casos, un microambiente 3D, en el que la matriz extracelular (ECM) juega un papel decisivo. ECM no sólo proporciona lo esencial de la estructura en 3D para mantener la morfología de la célula adecuada sino también ofrece señales de supervivencia o las señales direccionales para un óptimo funcionamiento de muchas células4,5 . Por lo tanto, un entorno 3D es necesario para identificar mejor las funciones celulares y comportamiento en un entorno que mejor reflejan el contexto fisiológico.
En el cuerpo humano, la mayoría de las células especialmente las células inmunes, ejercen sus funciones bajo un escenario 3D. Por ejemplo, las células T activadas patrullan tejidos buscando las células blanco, células ingenuas T migran a través de los ganglios linfáticos en busca de sus cognadas células presentadoras de antígeno, durante la cual el modo de migración y las máquinas se adaptan a las correspondientes extracelular medio ambiente3,6,7. El gel de colágeno 3D ha sido ampliamente utilizado como un 3D bien establecidas y bien caracterizadas de la célula cultura sistema8,9,10. Nuestro trabajo previo demuestra que los linfocitos humanos primarios son muy móviles y migran a una velocidad promedio de aproximadamente 4.8 μm/min en una matriz de colágeno de 0.25%11. Reordenamiento del citoesqueleto desempeña un papel clave en la migración celular del12. La acumulación de pruebas demuestra que los linfocitos no se aplican solamente un solo modo de la migración pero pueden alternar con cierto comportamiento de migración dependiendo de la ubicación, microambiente, citoquinas, gradientes quimiotácticos, señales extracelulares que tune la comportamiento migratorio en diferentes formas 3.
Para analizar con fiabilidad las funciones inmunes celulares y comportamiento, por ejemplo, migración, formación de las protuberancia o transporte vesicular, es de gran ventaja ser capaz de adquirir imágenes en volúmenes relativamente grandes de 3D de manera rápida y confiable. Para la proyección de imagen 3D, la tecnología de microscopia de luz hoja recientemente desarrollado (también conocida como microscopía de iluminación solo plano) ofrece una solución satisfactoria13,14. Durante la adquisición de imágenes, se genera una hoja fina de luz estática para iluminar la muestra. De esta manera, en el plano de enfoque, un área grande se puede iluminar al mismo tiempo sin afectar las células off-plane. Esto permite una alta velocidad con un blanqueo drásticamente reducida y la fotocitotoxicidad. En este papel, describimos cómo visualizar las células inmunes humanas primarias mediante microscopía de luz de hoja y cómo analizar la migración en un escenario 3D.
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Protocol
Investigación realizada para este estudio con el material humano (cámaras sistema reducción de leucocitos de donantes de sangre humana) está autorizado por el Comité de ética local (declaración de 16.4.2015 (84/15; Prof. Dr. Rettig-Stürmer)) y sigue las pautas correspondientes.
1. preparación de solución de colágeno neutralizado (500 μl)
- Transfiera 400 μL de solución stock de colágeno refrigerado (10,4 mg/mL) a un tubo de 1,5 mL estéril debajo de la campana de la cultura de célula. Lentamente, añada 50 μl de frío 10 x PBS (pH 7.0-7.3) a 400 μL de solución stock de colágeno refrigerados. Mezcle la solución por mosaico suavemente el tubo.
Nota: Todas las medidas en la parte 1 deben realizarse bajo una campana de cultivo celular. - Añadir 8 μl de 0,1 M NaOH en 500 μl de la solución de colágeno de 1.1. para ajustar el pH a 7.2-7.6. Utilizar tiras reactivas de pH (rango de pH: 6-10) para determinar el valor de pH de la mezcla.
Nota: Los volúmenes pueden variar para diferentes lotes de colágeno. Solución de NaOH tiene que mezclarse lentamente para evitar burbujas de aire. La mezcla debe mantenerse en hielo para evitar la gelificación de colágeno. - Añadir 2 μl de ddH estéril2O para hacer el volumen final de 500 μl. Mezcle bien y almacene esta solución de colágeno (8,32 mg/mL) en hielo o a 4 ° C hasta su uso posterior.
Nota: En esta condición, neutralizado colágeno puede utilizarse para h. 24 alícuotas no se recomiendan para evitar burbujas de aire.
2. preparación para microscopía de fluorescencia de luz-hoja con capilares
- Etiqueta fluorescente las células vivas de interés con los tintes fluorescentes primaria deseada15 o proteínas fluorescentes11 como se describió anteriormente.
- Transferencia de 1 × 106 de células en un tubo de 1,5 mL estéril bajo una campana de cultivo celular. Centrifugar el tubo a 200 x g por 8 min descartar el sobrenadante y resuspender el pellet en 200 μL de medio de cultivo.
Nota: La densidad celular de 5 x 106 células/mL se recomienda para la visualización de la migración de células inmunes humanas, especialmente de los linfocitos T citotóxicos (CTL) y las células asesinas naturales (NK). - Añadir 85,9 μl de solución de colágeno neutralizado de 1.3. en la suspensión celular de 2.2. y mezclar correctamente para llegar a una concentración de 2,5 mg/mL de colágeno. Dejar la mezcla de colágeno de la célula en el hielo en la campana.
Nota: Suponga que la concentración de colágeno es N mg/mL, el volumen de neutralizado solución de colágeno (para la suspensión de la célula de 200 μL) = 200 × N /(8.32-N) - A continuación, poner el pistón correspondiente en el capilar (diámetro interior ~ 1 mm) hasta que el émbolo es de 1 mm en el tubo capilar. Moje el émbolo por inmersión en medio de cultivo (figura 1A).
Nota: Este paso puede ayudar a prevenir las burbujas de aire cuando el tubo capilar se sumerge en la mezcla de colágeno de la célula. El capilar y el buzo no debe de ser estéril. - Sumerja el capilar en la mezcla de colágeno de la célula de 2.3. Tire lentamente del émbolo hacia atrás para 10-20 mm (figura 1B). Limpie la pared exterior del tubo capilar con una toalla de papel humedecida con rocío de etanol 70% para eliminar la solución restante de colágeno.
- Monte el tubo capilar con plastilina en la pared interior de un tubo de 5 mL y empuje la mezcla de colágeno de la célula hacia el borde del tubo capilar (figura 1).
- Mantenga el tubo capilar a 37 ° C con 5% CO2 para 1 h para la polimerización de colágeno.
- Añadir el medio de cultivo (aproximadamente 1-2 mL) a un tubo de 5 mL. Presione con cuidado la varilla de colágeno polimerizado por en medio y alrededor de 3/4 del colágeno en el medio (figura 1).
- Mantenga el tubo capilar, así, a 37 ° C con 5% CO2 para otro 30 min para equilibrar la barra del colágeno con el medio.
Nota: Luego, la barra de colágeno puede ser jalada hacia atrás a capilar y culta más antes de seguir usándolo.
3. imagen adquisición mediante microscopía de luz hoja
- Conjunto de la cámara de la muestra según las instrucciones del fabricante.
- Encienda la incubación y el microscopio para calentar la cámara de la muestra a 37 ° C (para celular directo imágenes solamente).
- Coloque el capilar en el compartimiento de muestra y localizar la muestra para encontrar el área de interés para adquisición de imágenes.
- Activar el oambos correspondiente. Establecer los siguientes ajustes: láser de potencia, tiempo de exposición, tamaño de paso de la posición z-stack, el inicio y el final de z-stack y el intervalo de tiempo para la proyección de imagen de células vivas.
Nota: por ejemplo, la muestra en la figura 2 era reflejada cada 40 s por 6 h a 37 ° C con un tamaño de paso de 1 μm (grueso total: 538 μm). La energía del laser fue 1% con un tiempo de exposición de la Sra. 30 el tamaño del pixel en dirección x-y es 0.23 μm. - Iniciar la adquisición de la imagen.
4. automatizado de análisis de seguimiento
- Abrir el convertidor de archivo, haga clic en Agregar archivos para seleccionar los archivos imagen que se convertirá en el formato de archivo de software (*.ims). Haga clic en examinar y seleccione una carpeta para guardar los archivos convertidos. Haga clic en Inicio todos.
- Abra el software de análisis. Haga clic en superar. Ir a archivo y haga clic en abrir, luego seleccionar el archivo imagen a ser analizada.
Nota: Si el tamaño del archivo es grande este paso puede tomar tiempo. Archivos mayores de 1 Terabyte (TB) no se recomiendan para un experimento simple como el proceso de archivos tan grandes son capacidad computacional altamente exigentes. - Haga clic en agregar nuevos puntos. Marque la casilla Proceso toda imagen finalmente. Haga clic en siguiente.
- Introduzca las coordenadas x e y (en píxeles) para definir la región de interés. Introduzca el número de marcos de tiempo y posición z para analizar. Haga clic en siguiente.
- Seleccione el canal de destino, que contiene los objetos a ser seguido, en la lista desplegable de Canales de origen. Ingrese Estimado xy diámetro (en μm). Haga clic en siguiente.
Nota: Estimado xy el diámetro es el diámetro promedio en la dimensión de x-y de los objetos para ser rastreados. - Haga clic en calidad. Definir un umbral, en el que debe incluirse la mayoría de las células (objetos). Haga clic en siguiente.
- Elija el algoritmo deseado (se recomiendaMovimiento autorregresivo ). Introduzca la distancia máxima (se recomienda20 μm ) y el tamaño máximo vacío (se recomienda 3 o 2). Haga clic en todo el proceso de la imagen finalmente.
Nota: Distancia de Max y Max brecha tamaño son dos umbrales para romper las pistas. Más concretamente, en dos cuadros continuos cuando la distancia entre el objeto mismo supera la distancia máxima, este objeto en el fotograma más adelante se considerará como un nuevo objeto. A veces durante la adquisición, el mismo objeto puede desaparecer por unos marcos y apareces otra vez. En este caso, solamente cuando este objeto vuelve a aparecer en el tamaño máximo del espacio, se considerará como el mismo objeto. - Tipo de filtro , haga clic en y elija la opción de excluir pistas no deseadas.
Nota: Este paso es opcional. - Haga clic en siguiente y haga clic en Finalizar.
Nota: Este paso puede tardar horas hasta días dependiendo el rendimiento informático. - Haga clic en Editar pistas y elija Deriva correcta. Seleccionar el algoritmo adecuado (se recomiendaDeriva traslacional ). Seleccione el deseado Tamaño de conjunto de datos de resultados (Nuevo tamaño igual al tamaño actual se recomienda). Haga clic en Aceptar.
Nota: Este paso sólo es necesario cuando el colágeno se desvió durante la adquisición de la imagen. - Haga clic en estadísticas y elija Configurar lista de estadísticas valores visibles. Compruebe las opciones de interés para ser exportaron (por ejemplo, coordenadas, velocidad y así sucesivamente). Haga clic en Aceptar.
- Haga clic en Todas las estadísticas de exportación a archivo e introduzca el nombre de archivo.
5. fijación y la inmunofluorescencia, tinción de células en Matrices de colágeno
- Transferencia 1.000 μl de paraformaldehído al 4% (PFA, en PBS) en un tubo de 5 mL bajo una campana química.
Nota: PFA debe ser equilibrado a temperatura ambiente. - Sumerja el capilar con colágeno polimerizado de 2.9. en la solución de la PFA (para ~ 5 m m) y Monte el tubo capilar en la pared interna del tubo de 5 mL con plastilina (como se muestra en la figura 1).
- Presione el émbolo suavemente hasta la mitad de la varilla de colágeno está colgando en la solución de la PFA (figura 1). Mantenga el tubo a temperatura ambiente durante 20 minutos.
- Tire hacia atrás el émbolo para conseguir la barra de colágeno dentro del tubo capilar. Sacar el tubo capilar y deseche PFA.
- Montar el tubo capilar en un tubo nuevo y añadir 1 mL de PBS. Asegúrese de que el tubo capilar se sumerge en el PBS.
- Presione el émbolo suavemente hasta la mitad de la varilla de colágeno está colgando en la solución. Monte el tubo capilar en la pared interior con plastilina.
- Mantenga el tubo a temperatura ambiente durante 5 minutos.
- Repita el 5.4. -5.7 por otro 2 veces.
- Tire hacia atrás el émbolo para conseguir la barra de colágeno dentro del tubo capilar. Descartar el PBS. Transferencia de 1-2 mL de tampón de bloqueo/permeabilización (PBS + BSA de 1% + 0.1% de tensioactivo no iónico) en el tubo y repetir 5.6.
Nota: La BSA (1%) puede ser sustituida por 5% de suero de los animales en que AB secundario creció. - Mantenga el tubo a temperatura ambiente durante 30-60 min.
- Tire hacia atrás el émbolo para conseguir la barra de colágeno dentro del tubo capilar. Deseche el buffer de permeabilización. Transfiera 200-500 μl del anticuerpo primario en buffer de bloqueo/permeabilización y expulsa la varilla en la solución.
- Mantenga el tubo a temperatura ambiente durante 1 h.
- Lave la varilla del colágeno 3 veces con SAFT (PBS + 0.1-% de tensioactivo no iónico) como descrito en 5.4. -5.8.
- Incubar la varilla en el anticuerpo secundario en tampón de bloqueo/permeabilización durante 1 h a temperatura ambiente. Impedir que la luz.
- Lave la varilla del colágeno 3 veces con PBS descrito en 5.4. -5.8.
- Tire hacia atrás el émbolo para conseguir la barra de colágeno dentro del tubo capilar. Mantenga las muestras en PBS hasta que la proyección de imagen.
- Análisis de las muestras como se describe en 3.
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Representative Results
Formación saliente durante la migración de la célula de T es un proceso altamente dinámico, que es dependiente de actina. Para visualizar la formación saliente del CTL humana primaria, nos transfectadas transitoriamente una proteína mEGFP fundido para etiquetar el citoesqueleto de actina en CTL como se describe antes del11. Un día después de la transfección, las células fueron embebidas en la matriz de colágeno. Pilas de imágenes fueron adquiridas cada 40 s con un tamaño de paso de 1 μm a 37 ° C mediante microscopía de luz de hoja. Como se muestra en la figura 2A y adicional 1 de la película, durante la migración, forma humana del CTL salientes principales en forma de limón, rodeadas de fina del huso-como las estructuras. En el experimento que se muestra aquí, no sólo una sola celda era reflejada pero un volumen grande (450 x 450 x 538 μm3) (figura 2B). Así, la calidad óptica y la resolución se muestra a continuación se obtuvieron con un objetivo de bajo aumento (20 X / 1,0 DIC VIS IR). Por lo tanto, la resolución puede mejorarse aún más con los más altos objetivos de NA.
En el experimento que se muestra en la figura 2 y la 1 de la película, CTLs fueron seguidos automáticamente como se describe en el protocolo parte 4. Las trayectorias de CTL se representan en la figura 2B. Se analizaron dos parámetros de migración: la velocidad y persistencia. Persistencia se define como el desplazamiento dividido por la longitud total de la pista. El análisis muestra que la movilidad de los CTL es muy diversa en 3D: las velocidades van desde 0.01 0.19 μm/s con una diferencia de casi 20-fold y las gamas de la persistencia de 0 - 0.7 (figura 2). Fue divulgado en ratones que en vivo migración intersticial promedio de la velocidad de las células T era 4 μm/min16. Recientemente, hemos determinado la velocidad media de CTL para ser 4-5 μm/min11 usando los métodos descritos en este documento. Estos resultados demuestran que eso microscopia de luz de hoja es una potente herramienta para visualizar el comportamiento de la célula, por ejemplo, migración celular y la interacción de la célula. In vivo, muchos factores y una ECM no homogéneo de la composición compleja incluyendo factores solubles que pueden afectar la migración modifica el comportamiento de la célula de T.
Aplicación de una matriz de colágeno no se limita a vivir células. Fijación y el immunostaining pueden realizarse también en la matriz. La figura 3 muestra un ejemplo de muestras fijadas en gel de colágeno 3D, en que perforin1 endógenos (PFN1) y actina fueron manchados. La muestra fue iluminada o de un solo lado (solo iluminación lateral) o de ambos lados (iluminación lateral doble). Observamos que las células en diferentes posiciones de z se tiñen uniformemente, lo que indica que los procedimientos descritos en nuestro protocolo de logran la penetración satisfactoria de anticuerpos en geles de colágeno. Lo más importante, después de fijación CTL exhibió la misma morfología como en vivo la proyección de imagen de la célula (Comparar figura 3 y figura 2B), lo que indica que también la morfología se mantiene bien por este protocolo. Además, la iluminación del solo lado o de ambos lados no hace una diferencia significativa en la calidad de las imágenes en el plano focal. Teniendo en cuenta que menos superficie se expone al laser con el modo de iluminación de una cara en comparación con iluminación de doble lado, iluminación de una cara más se recomienda.
Figura 1: ilustración del manejo de los tubos capilares durante la preparación de la muestra. (A) Coloque el émbolo en el tubo capilar y cómo mojar el émbolo con el medio de cultivo. (B) tire de la mezcla de colágeno de la célula en el capilar. (C) montaje capilares utilizando arcilla de modelado. El émbolo y el vástago de colágeno se representan en cuadros gris y rojo, respectivamente. (D) maneje barra de colágeno para conseguir el equilibrio con el medio de cultivo o para la inmunotinción. El émbolo y el vástago de colágeno se representan en cuadros gris y rojo, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: principal humano CTL en colágeno 3D de seguimiento y visualización dinámica de la actina. (A) proyección de intensidad máxima de la actina en CTL humana primaria. Actina fue etiquetada en CTL como se describió anteriormente11. Primer día post transfección de células fueron incrustadas en la matriz de colágeno 0,5%. Se muestra una célula representativa. Barras de escala son 5 μm. estructuras finas de actina en el borde del saliente se destacan por la punta de flecha. (B) trayectorias de CTL para 6 h. Las trayectorias se realiza automatizadamente el seguimiento por el software (código de Color: azul = Inicio, rojo = final de la pista, 450 × 450 × 538 μm3 volumen). Es la barra de escala 50 μm. (C) la cuantificación de la velocidad y persistencia. Un punto representa una célula. Resultados se muestran como media ± SEM de 4 donantes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Inmunotinción de profilin1 endógenos (PFN1) y actina en CD8+ T células incrustadas en la matriz de colágeno 3D. Primario CD8 humano+ T las células fueron encajadas en 0.25% de colágeno. Después de la fijación de la PFA fue manchada la muestra utilizando anti-PFN1 (naranja) y phalloidin (púrpura) y visualizado por microscopía de luz de hoja en un tamaño de paso de 1 μm para un volumen total de 440 x 440 x 1.000 μm3. La muestra fue iluminada o de un solo lado (solo iluminación lateral) o de ambos lados (iluminación lateral doble). Se muestran las proyecciones de máxima intensidad (MIP) de reconstrucción 3D. Son las barras de escala 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Película 1: generación de salientes durante la migración de la célula de T. La celda que se muestra en la película fue tomada del volumen que se muestra en la figura 2A. Las células fueron embebidas en una matriz de colágeno (0.5%). Se adquirieron imágenes cada 40 s por 6 h a 37 ° C mediante microscopía de luz de hoja. Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)
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Discussion
Mayoría en vitro ensayos se llevan a cabo sobre una superficie 2D, por ejemplo en las placas de cultivo celular, platos de Petri o en cubreobjetos, mientras que en vivo las células, especialmente las células inmunes, sobre todo un microambiente 3D la experiencia. Emergentes de la evidencia muestran que los patrones de migración de células inmunes diferencian entre 2D y 3D escenarios17. Por otra parte, los perfiles de expresión de las células tumorales también son diferentes en 2D-3D-cultiva y tejidos18,19,20. Por lo tanto, para simular mejor las condiciones fisiológicas en vitro, es una gran ventaja para llevar a cabo experimentos en un contexto 3D, por ejemplo en matrices de colágeno 3D. Los enfoques recientemente desarrollados, en particular, la microscopía de fluorescencia de luz-hoja, permite experimentos fiables y reproducibles en los sistemas de 3D de la matriz bajo condiciones ambientales controladas.
En contraste con una microscopia confocal convencional escaneo láser que ilumina la punta de prueba entera, con microscopía de luz de hoja, se genera sólo una fina lámina de luz láser para iluminar las muestras. La cámara de detección es perpendicular al plano de iluminación. Debido a esta técnica, sólo la sección en el plano focal está expuesta al láser. Por lo tanto, pueden minimizarse la foto-blanqueo y fototoxicidad. Además, en comparación con el análisis de punto de la microscopia, la tasa de adquisición es drásticamente mejorada con microscopía de luz de hoja (100 - 1,000-fold más rápido) y también se mejoró la relación señal a ruido. Combinado con la cámara de incubación de la instalación de microscopía de luz de hoja utilizado en este trabajo este microscopio es una potente opción para adquisición de imágenes de grandes volúmenes 3D con blanqueo minimizado y foto daño durante largos períodos de tiempo (varios días) bajo condiciones de la incubadora.
Para la preparación de la muestra con la matriz de colágeno 3D, el punto más crítico es evitar las burbujas de aire. Dada su alta viscosidad, cuando se introducen burbujas de aire a la solución de colágeno es muy difícil de eliminar de la solución. La presencia de burbujas de aire puede inducir la heterogeneidad de la polimerización de la matriz de colágeno; Además, puede bloquear el camino de la luz, lo que disminuiría la calidad de las imágenes. Por lo tanto, cuando la transferencia o mezclar la solución de colágeno uno debe pipetear muy suavemente y no expulsar la última gota en la punta de la pipeta. Además, colágeno comienza a polimerizar a temperatura ambiente lentamente. Por lo tanto, para evitar la polimerización antes de mezclar bien la solución, los tubos que contienen colágeno deben ser siempre en hielo.
Un gran desafío que nos encontramos en el empleo de microscopía de luz de hoja es manejo de datos. Los datos generados por microscopia de luz de hoja pueden llegar fácilmente el tamaño de 500 gigabytes o incluso de varios terabytes, en particular para los experimentos a largo plazo. Para analizar estos datos lleva varios días, a veces hasta una semana por una estación de trabajo con capacidad de cálculo alta. Puesto que el tamaño de las imágenes analizadas no es menor que los datos originales de la capacidad de almacenamiento puede convertirse rápidamente en un factor limitante para la aplicación de la microscopía de luz de hoja. Por lo tanto, para experimentos de seguimiento o si es necesario el análisis de imágenes complejas se recomienda limitar el tamaño del archivo por el experimento a valores que pueden ser manejados en un plazo razonable por las unidades de proceso disponibles.
Microscopía de fluorescencia de luz hoja introducida aquí tiene algunas características, que pueden afectar los resultados si no se manejan con cuidado. La utilización de capilares es particularmente ventajosa para una iluminación libre de obstáculos de las muestras. Desde la barra de colágeno está colgando en el medio, puede suceder que se desplaza la varilla de colágeno durante la adquisición de la imagen, especialmente para mediciones a largo plazo. Esta deriva tiene que ser corregido para evitar la interpretación de los resultados. Por supuesto, hay otras configuraciones de microscopia de luz de hoja comercialmente disponibles en el mercado, que no requieren de tubos capilares para montar las muestras. Además, con la microscopía de luz-hoja, además del hecho de que en comparación con la línea convencional de fototoxicidad de microscopia confocal de la exploración ha sido reducido sustancialmente, fototoxicidad todavía sigue siendo una preocupación para la proyección de imagen a largo plazo21.
Aparte de microscopia de luz de hoja, hay otros métodos para la proyección de imagen de fluorescencia 3D, entre los cuales en su mayoría aplicada es microscopía multifotón, microscopía confocal y microscopía de fluorescencia de campo amplio. En cuanto a la profundidad de la penetración, microscopía de fluorescencia confocal y amplio campo mienten en la gama similar, normalmente limitada a 100 nm22. Debido a la luz de longitud de onda más utilizada para múltiples fotones microscopía, su profundidad de penetración puede ser mejorado a la gama de 0.5 - 1 mm23. En comparación, el tamaño de imágenes multidimensionales generados por seccionamiento óptico de la microscopía de luz de hoja puede ser hasta varios milímetros24. En cuanto a la resolución lateral, un experimento realizado con elegancia muestra que eso microscopia de luz hoja proporciona una resolución espacial mejor tridimensional en comparación con la microscopía de fluorescencia confocal en grandes muestras de25. Recientemente, microscopía de luz de hoja se ha combinado con la técnica de dos fotones, que además mejora la profundidad de penetración en comparación con microscopia de luz-hoja de fotón uno normal y es diez veces más rápido que la microscopía de dos fotones de punto26.
Teniendo en cuenta la matriz 3D que proporciona la arquitectura de micro para las células, además de colágeno bovino que usé en este papel, hay muchas otras opciones, como la matriz extracelular (ECM) derivada de células de sarcoma de ratón, agarosa, hidrogel sintético u otro materiales poliméricos biocompatibles. Sarcoma de ratón ECM es una mezcla de proteínas como colágeno IV, laminina, y numerosos factores de crecimiento. En comparación con los materiales sintéticos, biológico ECMs (colágeno y ratón sarcoma ECM), por un lado, presentar un contexto más fisiológico relevante; pero por otro lado, la calidad y composición biológico ECMs puede variar entre lotes y empresas. Por el contrario, más se garantiza la reproducibilidad de los materiales sintéticos. Notable, ajuste de características bioquímicas y mecánicas, así como modificaciones deseadas, se permite para materiales sintéticos, pero no para biológicos ECMs10,27.
En Resumen, en este trabajo describe un protocolo para construir la matriz de colágeno 3D para experimentos de Biología de la célula mediante microscopía de fluorescencia de la hoja de luz y cómo incrustar CTL humano principal en la matriz de colágeno 3D para visualizar y analizar la migración de CTL. Destacamos los puntos clave en la preparación de muestras, adquisición de imágenes y el análisis. Nuestros resultados muestran que la formación de protuberancias muy dinámicas y estructuras de actina finos puede ser visualizada por microscopia de luz de hoja con una buena resolución espaciotemporal. Por otra parte, el protocolo de análisis aquí descrito nos permite seguir confiablemente las células de una manera objetiva y automatizada. Este método será especialmente ventajoso para la investigación inmunológica humana como los ratones y los seres humanos difieren sustancialmente en muchas funciones inmunológicas y la reactividad a terapias28.
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Disclosures
Los autores no declaran conflicto de intereses financiero o comercial.
Acknowledgments
Agradecemos al Instituto de Hemostaseology clínica y medicina de la transfusión para proporcionar sangre dispensadora de aceite; Carmen Hässig y Cora Hoxha excelente ayuda técnica. Agradecemos a Jens Rettig (Universidad de Saarland) para el vector modificado pMAX, Roland Wedlich-Söldner (Universidad de la Münster) para la construcción original de la LifeAct-Ruby y Christian Junker (Universidad de Saarland) para generar la construcción de LifeAct-mEGFP. Este proyecto fue financiado por Sonderforschungsbereich 1027 (proyecto A2 B.Q.) y 894 (proyecto A1 M.H.). El microscopio de luz de hoja fue financiado por DFG (GZ: INST 256/4 19 1 FUGG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibricol, bovine collagen solution | Advanced Biomatrix | #5133-20ML | Collagen matrix |
| 0.5 M NaOH Solution | Merck | 1091381000 | for neutralizing Fibricol solution |
| Ultra-Low melting agarose | Affymetrix | 32821-10GM | Sample preparation in low c[Col] |
| Dynabeads Untouched Human CD8 T Cells Kit | Thermo Fisher | 11348D | Isolation of primary human CD8+ T cells from PBMC |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation | Thermo Fisher | 11132D | Activation of CTL populations |
| Human recombinant interleukin-2 | Thermo Fisher | PHC0023 | Stimulation of cultured CTL |
| P3 Primary solution kit | Lonza | V4XP-30XX | Transfection |
| α-PFN1 antibody, rabbit, IgG | Abcam | ab124904 | IF |
| Alexa Fluor 633 Phalloidin | Thermo Fisher | A22284 | IF |
| CellMask Orange Plasma membrane Stain | Thermo Fisher | C10045 | Fluorescent cell label |
| Tween 20 | Sigma | P1379-250mL | IF |
| Triton X-100 | Eurobio | 018774 | IF |
| DPBS Dulbecco's phopsphate buffered saline | Thermo Fisher | 14190250 | IF |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9418-100G | IF |
| Goat α Rabbit 568, IgG, rabbit | Thermo Fisher | A-11011 | IF |
| Lightsheet Z.1 (Light-sheet microscopy) | Zeiss | N.A. | |
| Cell culture hood | Thermo Fisher | HeraSafe KS | |
| Cell culture incubator HERACell 150i | Thermo Fisher | N.A. | |
| Centrifuge 5418 and 5452 | Eppendorf | N.A. | |
| Pippettes | Eppendorf | 3123000039, 3123000020, 3123000063 | |
| Pippette tips | VWR | 89079-444, 89079-436, 89079-452 | |
| 15 mL tubes | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Capillaries 50 µL | VWR (Brand) | 613-3373 | Zeiss LSFM sample preparation |
| Plunger for capillaries | VWR (Brand) | BRND701934 | "Stamps with Teflon tip" LSFM sample preparation |
| MColorPhast pH stips | Merck | 1095430001 | to test pH of neutralized Fibricol |
| BD Plastipak 1mL syringes | BD | Z230723 ALDRICH | Alternative sample preparation |
| Modeling clay (Hasbro Play-Doh A5417EU7) | Play-Doh | N.A. | |
| Imaris file converter | Bitplane | available at http://www.bitplane.com | Convert imaging files to Imaris file format |
| Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage) | Bitplane | available at http://www.bitplane.com | Analysis of 3D and 4D imaging data |
References
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