Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Ljus-ark mikroskopi för tredimensionell visualisering av mänskliga immunceller

Published: June 13, 2018 doi: 10.3791/57651

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att visualisera immunceller inbäddad i en tredimensionell (3D) kollagen matris med hjälp av ljus-ark mikroskopi. Detta protokoll utarbetar också hur spåra cellmigration i 3D. Detta protokoll kan användas för andra typer av fjädring celler i matrisen 3D.

Abstract

In vivo, aktivering, spridning och funktion av immunceller som alla förekommer i en tredimensionell (3D)-miljö, exempelvis i lymfkörtlar eller vävnader. Upp till datum, de flesta i vitro system förlitar sig på tvådimensionell (2D) ytor, såsom cellkultur plattor eller coverslips. Att optimalt härma fysiologiska förhållanden i vitroanvänder vi en enkel 3D kollagenmatrisen. Kollagen är en av de viktigaste komponenterna i extracellulär matrix (ECM) och har använts i stor utsträckning utgöra 3D matriser. För 3D imaging, är nyligen utvecklade ljus ark mikroskopi teknik (även benämnd som enda plan belysning mikroskopi) skisserat med hög förvärv hastighet, stor genomträngningsdjupet, låg blekning och fotocytotoxicitet. Ljus-ark mikroskopi är dessutom särskilt fördelaktiga för långsiktig mätning. Här beskriver vi en optimerad protokollet hur man konfigurerar och hantera mänskliga immunceller, e.g. primära mänskliga cytotoxiska T-lymfocyter (CTL) och naturliga mördarceller (NK) celler i kollagenmatrisen 3D för användning med ljus ark microscopyen för levande cell imaging och fasta prover. Förfarandet för bild förvärv och analys av cellmigration presenteras. Särskilt fokus ägnas Markera kritiska moment och faktorer för provberedning och analys av data. Detta protokoll kan användas för andra typer av fjädring celler i en 3D kollagenmatrisen och är inte begränsat till immunceller.

Introduction

Den största kunskapen om hur du migrerar celler kommer från 2D experiment1,2,3, som normalt bedrivs i en glas eller plast yta för en kultur/imaging maträtt. En fysiologisk scenario kräver dock, i de flesta fall en 3D mikromiljö, där den extracellulär matrixen (ECM) spelar en avgörande roll. ECM inte bara den 3D-strukturen är nödvändiga för att upprätthålla korrekt cellmorfologi utan erbjuder också överlevnad signaler eller riktad ledtrådar för en optimal funktion av många celler4,5 . Därför krävs en 3D-miljö bättre identifiera cellulära funktioner och beteende i en miljö som bättre återspeglar fysiologiska samband.

I den mänskliga kroppen utöva de flesta celler särskilt immunceller, sina funktioner enligt en 3D scenario. Till exempel aktiverade T-celler patrullera vävnader söker målceller, naiva T-celler vandrar genom lymfkörtlarna i sökandet efter sin cognate antigen-presenterande celler under vilken de migreringsläge och maskiner är anpassade till motsvarande extracellulära miljö3,6,7. 3D kollagen gelen har använts som en väletablerad och välkarakteriserad 3D cell kultur system8,9,10. Vårt tidigare arbete visar att primära humana lymfocyter är mycket rörliga och migrera med en medelhastighet på ca 4,8 µm/min i en 0,25% kollagenbaserade matrix11. Ombildning av cytoskelettet spelar en nyckelroll i cell migration12. Ackumulerande bevis visar att lymfocyter gäller inte bara en enda läge migrationens ännu kan växla mellan vissa migration beteende beroende på läge, närmiljön, cytokiner, kemotaktisk övertoningar, och extracellulära signaler som tune den flyttande beteende i olika sätt 3.

För att tillförlitligt analysera immunceller funktioner och beteende, exempelvis migration, utstick bildandet eller vesikulär transport, är det av stor fördel att kunna förvärva bilder i relativt stora 3D volymer i ett snabbt och tillförlitligt sätt. För 3D imaging erbjuder nyligen utvecklade ljus ark mikroskopi teknik (även benämnd som enda plan belysning mikroskopi) en tillfredsställande lösning13,14. Under imaging förvärv, genereras ett statisk ljus tunt för att belysa provet. På detta sätt, på fokus planet, kan ett stort område belysas samtidigt utan att det påverkar cellerna som off-plan. Denna funktion möjliggör en hög förvärv hastighet med en drastiskt minskad blekning och fotocytotoxicitet. I den här artikeln beskriver vi hur att visualisera primära mänskliga immunceller med ljus ark mikroskopi och analysera migration i 3D scenario.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Forskning som genomförs för denna studie med mänskliga material (leukocyt nedsättning system kammare från humant blodgivare) är godkänd av den lokala etiska kommittén (förklaring från 16.4.2015 (84/15; Prof. Dr. Rettig-Stürmer)) och följer motsvarande riktlinjer.

1. beredning av neutraliserat kollagen lösning (500 µL)

  1. Överföra 400 µL av kylda kollagen stamlösning (10,4 mg/mL) till en steril 1,5 mL tub under cell kultur huven. Tillsätt långsamt 50 µL av kylt 10 x PBS (pH 7,0-7,3) till 400 µL av kylda kollagen stamlösning. Blanda lösningen genom att försiktigt plattsättning röret.
    Obs: Alla steg i Del1 bör ske under en cell kultur huva.
  2. Tillsätt 8 µL 0,1 M NaOH i 500 µL av kollagen lösningen från 1.1. för att justera pH-värdet till 7,2-7,6. Använda teststickor pH (pH-intervall: 6-10) att bestämma pH av blandningen.
    Obs: Volymer kan variera för olika partier av kollagen. NaOH-lösning har blandas långsamt för att undvika luftbubblor. Blandningen bör hållas på is för att undvika kollagen gelation.
  3. Lägg till 2 µL sterilt ddH2O göra den slutliga volymen till 500 µL. Blanda väl och förvara detta kollagen lösning (8.32 mg/mL) på is eller vid 4 ° C tills vidare användning.
    Obs: Under detta tillstånd, neutraliserat kollagen kan användas för 24 h. alikvoter inte rekommenderas att undvika luftbubblor.

2. provberedning för ljus ark fluorescensmikroskopi med kapillärer

  1. Fluorescently etikett intresse med önskad primära fluorescerande färger15 eller fluorescerande proteiner11 levande celler som tidigare beskrivits.
  2. Över 1 × 10-6 i celler till en steril 1,5 mL tub under en cell kultur huv. Centrifugera röret vid 200 x g i 8 min. Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i 200 µL av odlingsmedium.
    Obs: Cell densiteten av 5 × 106 celler/mL rekommenderas för visualisering av mänskliga immunceller migration, särskilt för cytotoxiska T-lymfocyter (CTL) och naturliga mördarceller (NK).
  3. Lägga till 85,9 µL neutraliserat kollagen lösning från 1.3. i cellsuspensionen från 2,2. och blanda ordentligt för att nå en kollagen koncentration av 2,5 mg/mL. Lämna cellen/kollagen mixen på is i huven.
    Obs: Antar att önskad koncentration av kollagen är N mg/mL, volymen av neutraliserat kollagen lösning (för 200 µL cellsuspension) = 200 × N /(8.32-N)
  4. Nästa, lägga matchande kolven in i kapillären (inre diameter ~ 1 mm) tills kolven är 1 mm ur kapillären. Våt kolven genom doppning i odlingsmedium (figur 1A).
    Obs: Detta steg kunde hjälpa för att förhindra luftbubblor när kapillären doppas i cell/kollagen mixen. Kapillären och kolven behöver inte vara sterila.
  5. Doppa kapillären i cell/kollagen mixen från 2.3. Dra försiktigt i kolven tillbaka för 10-20 mm (figur 1B). Torka den yttre väggen i kapillären med pappershandduk fuktad med 70% etanol spray för att ta bort den återstående kollagen-lösningen.
  6. Montera kapillären med modellera på den inre väggen av en 5 mL tub och driva cellen/kollagen mixen till kanten av kapillären (figur 1 c).
  7. Hålla kapillären vid 37 ° C med 5% CO2 för 1 h för kollagen polymerisation.
  8. Lägga till odlingsmediet (cirka 1-2 mL) i en 5 mL tub. Tryck försiktigt polymeriserat kollagen staven ut i medellång till cirka 3/4 av kollagen hängande i mediet (figur 1 d).
  9. Hålla kapillären, såhär, vid 37 ° C med 5% CO2 för en annan 30 min temperera kollagen stången med medlet.
    Obs: Efteråt, kollagen staven kan dras tillbaka in i kapillär och odlade ytterligare innan ytterligare användning.

3. bild förvärv med ljus ark mikroskopi

  1. Montering i provkammaren enligt tillverkarens anvisning.
  2. Slå på ruvning och mikroskopet att värma provkammaren till 37 ° C (för levande cell imaging endast).
  3. Placera kapillären i provkammaren och leta upp provet för att hitta området av intresse för bild förvärv.
  4. Aktivera den motsvarande laser(s). Ange följande inställningar: laser power, exponeringstid, steg-storleken på z-stack, start och slut position i z-stacken och tidsintervallet för levande cell imaging.
    Obs: till exempel provet i figur 2 fotograferades varje 40 s för 6 h vid 37 ° C med en steg-storlek 1 µm (total tjocklek: 538 µm). Laser kraften var 1% med en exponeringstid på 30 ms. pixelstorlek på x-y-riktningen är 0,23 µm.
  5. Börja bild förvärv.

4. automatisk spårning analys

  1. Öppna den fil converter, klicka på Lägg till filer Välj imaging filerna konverteras till formatet programvara (*.ims). Klicka på Bläddra och välj en mapp att spara de konvertera filerna. Klicka på starta alla.
  2. Öppna programvaran för analys. Klicka på överträffa. Gå till filen och klicka på Öppnaoch välj imaging filen ska analyseras.
    Obs: Om filstorleken är stor här steget kan ta tid. Filer större än 1 Terabyte (TB) rekommenderas inte för en enda experiment som processen sådana stora filer är mycket beräkningsmässig kapacitet krävande.
  3. Klicka på Lägg till nya ställen. Markera rutan Process hela bilden slutligen. Klicka på Nästa.
  4. Ange koordinater för x och y (i pixel) att definiera regionen av intresse. Ange antalet ramar (tid och z-position) för att analysera. Klicka på Nästa.
  5. Välj målet kanalen, som innehåller de objekt som ska spåras, i listrutan med Källkanalen. Ange Beräknad xy Diameter (i µm). Klicka på Nästa.
    Obs: Uppskattade xy diameter är den genomsnittliga diametern i x-y-dimensionen av objekt som ska spåras.
  6. Klicka på kvalitet. Ange ett tröskelvärde, där de flesta av cellerna (objekt) bör inkluderas. Klicka på Nästa.
  7. Välja önskad algoritmen (Vektorautoregressiv Motion rekommenderas). Ange max avståndet (20 µm rekommenderas) och max gap storlek (3 eller 2 rekommenderas). Klicka på Process hela bilden slutligen.
    Obs: Max avstånd och Max gap storlek är två trösklar att bryta spår. Mer specifikt, i två sammanhängande bildrutor kommer när avståndet mellan samma objekt överskrider Max avstånd, detta objekt i senare ramen att betraktas som ett nytt objekt. Ibland under förvärvet, kan samma objekt försvinner för ett par bildrutor och dyker upp igen. I det här fallet endast när detta objekt igen inom Max gap storleken, kommer det att betraktas som samma objekt.
  8. Klicka på Filtertyp och väljer att utesluta oönskade spår.
    Obs: Detta steg är valfritt.
  9. Klicka på Nästa och klicka sedan på Slutför.
    Obs: Det här steget kan ta timmar till dagar beroende på datorprestanda.
  10. Klicka på Redigera spår och välj Korrekt Drift. Välj lämplig algoritmen (Translationell Drift rekommenderas). Välj önskad Datamängd storlek (Ny storlek motsvarar nuvarande storlek rekommenderas). Klicka på OK.
    Obs: Detta steg är endast krävs när kollagen drev under bild förvärv.
  11. Klicka på statistik och välj Konfigurera av synlig statistik listvärden. Kontrollera de alternativ av intresse som ska exporteras (t.ex. koordinater, hastighet och så vidare). Klicka på OK.
  12. Klicka på Exportera All statistik till fil och ange filnamnet.

5. fixering och immunofluorescens färgning av celler i kollagen matriser

  1. Över 1000 µL av 4% PARAFORMALDEHYD (PFA, i PBS) i en 5 mL tub under en kemisk huva.
    Obs: PFA bör balanseras till rumstemperatur.
  2. Doppa kapillären med polymeriserat kollagen från 2,9. i PFA-lösning (för ~ 5 mm) och montera kapillären på den inre väggen av 5 mL röret med modellera (som visas i figur 1 c).
  3. Tryck på kolven försiktigt tills hälften av kollagen stången hänger i PFA lösningen (figur 1 d). Förvara tuben i rumstemperatur i 20 min.
  4. Dra tillbaka kolven för att få kollagen staven inuti kapillären. Ta ut kapillären och kassera PFA.
  5. Montera kapillären till en färsk rör och tillsätt 1 mL PBS. Kontrollera att kapillären är nedsänkt i PBS.
  6. Tryck på kolven försiktigt tills hälften av kollagen stången hänger i lösningen. Montera kapillären på innervägg med modellera.
  7. Förvara tuben i rumstemperatur i 5 min.
  8. Upprepa 5.4. -5.7 för en annan 2 gånger.
  9. Dra tillbaka kolven för att få kollagen staven inuti kapillären. Kassera PBS. Överför 1-2 mL blockering/permeabilisering buffert (PBS + 1-% BSA + 0,1% icke-jonisk tensid) i röret och upprepa 5.6.
    Obs: BSA (1%) kan ersättas med 5% serum av djuret de sekundära Ab växte upp i.
  10. Förvara tuben i rumstemperatur i 30-60 min.
  11. Dra tillbaka kolven för att få kollagen staven inuti kapillären. Kassera permeabilisering bufferten. Överföra 200-500 µL av den primära antikroppen blockerar/permeabilisering buffert och förvisar staven i lösningen.
  12. Förvara tuben i rumstemperatur för 1 h.
  13. Tvätta kollagen stången 3 gånger med PBST (PBS + 0,1-% icke-jonisk tensid) som beskrivs i 5.4. -5.8.
  14. Inkubera staven i sekundär antikropp i blockering/permeabilisering buffert för 1 h i rumstemperatur. Hålla den från ljus.
  15. Tvätta kollagen stången 3 gånger med PBS som beskrivs i 5.4. -5.8.
  16. Dra tillbaka kolven för att få kollagen staven inuti kapillären. Håll proverna i PBS till imaging.
  17. Skanna proverna som beskrivs i 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Utstick bildandet under T-cellmigration är en mycket dynamisk process, som är aktin beroende. För att visualisera utstick bildandet av primära mänskliga CTL, transfekterade vi normalnivå ett mEGFP smält protein etikettera aktin cytoskelettet i CTL som beskrivs innan11. En dag efter transfection, bäddades cellerna i kollagenmatrisen. Bildstaplar förvärvades varje 40 s med en steg-storlek 1 µm vid 37 ° C med hjälp av ljus-ark mikroskopi. Som visas i figur 2A och kompletterande film 1, under migreringen, mänsklig CTL form citron-formade stora utskjutande, kantad av fina spindel-liknande strukturer. I experimentet visas här, inte bara en enda cell fotograferades men en stor volym (450 x 450 x 538 µm3) (figur 2B). Således, optisk kvalitet och upplösning visas här erhölls med låg förstoring mål (20 X / 1.0 DIC VIS IR). Därför skulle resolutionen kunna förbättras ytterligare med högre NA mål.

I experimentet visas i figur 2 och film 1, spårades automatiskt CTL som beskrivs i protokollet del 4. Trajectoriesen av CTL avbildas i figur 2B. Två parametrar migrationens analyserades: hastighet och uthållighet. Persistens definieras som förskjutningen dividerat med total spårlängd. Analysen visar att rörligheten för CTL är mycket varierande i 3D: hastigheterna sträcker sig från 0,01-0,19 µm/s med en nästan 20-fold skillnad och persistens spänner från 0 - 0,7 (figur 2 c). Det rapporterades i möss att i vivo interstitiell migration genomsnittliga hastighet av T-celler var 4 µm/min16. Vi nyligen, har fastställt den genomsnittliga hastigheten av CTL vara 4-5 µm/min11 använda metoderna som beskrivs i detta dokument. Dessa resultat visar att ljus ark mikroskopi är ett kraftfullt verktyg för att visualisera cell beteende, till exempel cellmigration och cell-cell interaktioner. In vivo, många faktorer och en inhomogen ECM av den komplexa sammansättningen inklusive lösliga faktorer som kan påverka migration kommer att ändra T cell beteende.

Tillämpningen av en kollagenmatrisen begränsas inte till levande celler. Fixering och immunfärgning kan också utföras i matrisen. Figur 3 visar ett exempel på fasta prover i 3D kollagen gel, i vilken endogen perforin1 (PFN1) och aktin var målat. Provet var upplyst antingen från en enda sida (enda sida belysning) eller från båda sidor (Dual side belysning). Vi observerar att färgas jämnt celler vid olika z-positioner, vilket indikerar att procedurerna som beskrivs i vårt protokoll uppnå tillfredsställande penetration av antikroppar i kollagen geler. Viktigare, efter fixering CTL uppvisade samma morfologi som i levande cell imaging (jämför figur 3 och figur 2B), som anger att också morfologi är väl underhållen av detta protokoll. Belysning från enstaka sida eller från båda sidor gör dessutom inte en signifikant skillnad i kvaliteten på bilder på fokalplanet. Med tanke på att mindre område utsätts för lasern med funktionsläget av enkelsidigt belysning jämfört med dubbla sida belysning, rekommenderas enkelsidigt belysning mer.

Figure 1
Figur 1: Illustration av hantera kapillärer vid provberedning. (A) Placera kolven i kapillären och hur våt kolvstången med odlingssubstratet. (B) dra cellen/kollagen blandningen i kapillären. (C) montera kapillärer använder modellering lera. Kolven och kollagen staven avbildas i grå och röda rutor, respektive. (D) hantera kollagen spö för Jämviktstiden med odlingssubstratet eller för immunfärgning. Kolven och kollagen staven avbildas i grå och röda rutor, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: spårning primära mänskliga CTL i 3D kollagen och visualisera aktin dynamics. (A) maximalt intensitet projektion av aktin i primära mänskliga CTL. Aktin var märkt i CTL som tidigare beskrivits11. Dag ett post transfection celler var inbäddad i 0,5% kollagen matris. En representativ cell visas. Skala barer är 5 µm. fina aktin strukturer på utstick kanten markeras av pilspetsen. (B) banor av CTL för 6 h. Trajectoriesen är automatedly spåras av programvaran (färgkod: blå = start, röd = slutet av spåret, 450 × 450 × 538 µm3 volym). Skalstapeln är 50 µm. (C) kvantifiering av hastighet och uthållighet. En prick representerar en cell. Resultaten redovisas som menar ± SEM från 4 givare. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Immunfärgning av endogena profilin1 (PFN1) och aktin i CD8+ T celler inbäddade i den 3D kollagenmatrisen. Primära mänskliga CD8+ T celler var inbäddade i 0,25% kollagen. Efter PFA fixering var provet färgas med anti-PFN1 (orange) och phalloidin (lila) och visualiseras av ljus ark mikroskopi på en steg-storlek 1 µm för en total volym på 440 x 440 x 1000 µm3. Provet var upplyst antingen från en enda sida (enda sida belysning) eller från båda sidor (Dual side belysning). Maximal intensitet prognoser (MIP) från 3D rekonstruktion visas. Skala barerna är 50 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Movie 1
Film 1: generering av utskjutande delar under T-cellmigration. Cellen visas i filmen togs från den volym som visas i figur 2A. Cellerna var inbäddade i en kollagenmatrisen (0,5%). Bilder förvärvades varje 40 s för 6 h vid 37 ° C med hjälp av ljus-ark mikroskopi. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De flesta i vitro analyser utförs på en 2D yta, till exempel i cellkultur plattor, petriskålar eller på coverslips, medan i vivo celler, särskilt immunceller, uppleva mestadels en 3D mikromiljö. Nya bevis visar att migrationsmönster av immunceller skiljer sig mellan 2D och 3D scenarier17. Dessutom skiljer också uttrycket profiler av tumörceller i 2D - och 3D-odlade vävnader18,19,20. Därför, bästa simulera den fysiologiska förhållanden i vitro, är det en stor fördel att utföra experiment i en 3D sammanhang, till exempel i 3D kollagen matriser. De nyutvecklade metoderna, i synnerhet ljus-ark fluorescensmikroskopi, möjliggör tillförlitliga och reproducerbara experiment i 3D matrix system under kontrollerade miljöförhållanden.

Till skillnad från en konventionell laserskanning konfokalmikroskopi som lyser upp hela sonden, med ljus ark mikroskopi, genereras endast ett tunt lager av laserljus för att belysa prover. Upptäckt kameran är vinkelrät mot det reflekterande planet. På grund av denna teknik utsätts endast i avsnittet fokalplanet för laser. Därför, Foto-blekning och fototoxicitet kan minimeras. Dessutom jämfört med punkt-scanning mikroskopi, andelen förvärv är drastiskt ökat med ljus ark mikroskopi (100 - 1.000-faldig snabbare) och signal-brus-förhållandet är också förbättras. Kombinerat med inkubation kammaren av ljus ark mikroskopi installationen används i denna uppsats här mikroskopet är ett kraftfullt alternativ för bild förvärv av stora 3D volymer med minimerade blekning och foto-skador över längre perioder (flera dagar) under inkubator villkor.

För provberedning med 3D kollagen matris är den mest kritiska punkten att undvika luftbubblor. Med tanke på dess höga viskositet, när luftbubblor introduceras till kollagen lösning är det mycket svårt att ta bort den från lösningen. Förekomsten av luftbubblor kan inducera heterogenitet polymerisation av kollagen matris; det dessutom kan blockera vägen för ljus, vilket skulle minska kvaliteten på bilder. Därför, när överföring eller blanda kollagen lösningen en måste Pipettera mycket försiktigt och inte utvisa den sista droppen i pipettspetsen. Dessutom börjar kollagen att polymerisera långsamt i rumstemperatur. Således, för att förhindra polymerisation innan blanda lösningen väl, kollagen-innehållande rören bör alltid hållas på is.

En stor utmaning vi möter i anställa ljus ark mikroskopi är datahantering. De data som genereras av ljus ark mikroskopi kan enkelt nå storleken på 500 gigabyte eller ännu flera terabyte, särskilt för långsiktiga experiment. Tar flera dagar, ibland upp till en vecka av ett arbete-stationen med hög beräkningskapacitet för att analysera dessa data. Eftersom storleken på analyserade bilder inte är mindre än den ursprungliga datan kan kapaciteten för lagring snabbt bli en begränsande faktor för tillämpningen av ljus ark mikroskopi. Därför, för spårning experiment eller om komplex bildanalys behövs det rekommenderas starkt att begränsa filstorleken per experiment till värden som kan hanteras i en rimlig tidsram av tillgängliga bearbetning enheter.

Ljus-ark fluorescensmikroskopi introducerade här har några funktioner, vilket kan påverka resultatet om inte hanteras försiktigt. Utnyttjandet av kapillärer är särskilt fördelaktig för en barriär-fri belysning av proverna. Eftersom kollagen stången hänger i mediet, kan det hända att kollagen staven drivor under bild förvärv, särskilt för långsiktiga mätningar. Denna tendens måste korrigeras för att undvika feltolkningar av resultaten. Naturligtvis finns det andra ljuset ark mikroskopi uppställningar kommersiellt tillgängliga på marknaden, som inte kräver kapillärerna att montera proverna. Dessutom ljus ark microscopyen, förutom det faktum att jämfört med konventionella linjen skanning konfokalmikroskopi fototoxicitet har minskat väsentligt, fototoxicitet är fortfarande ett bekymmer för långsiktiga imaging21.

Förutom ljus ark mikroskopi finns det andra metoder som fastställts för 3D fluorescens bildtagning, bland vilka de mest tillämpade är konfokalmikroskopi, wide-fältet fluorescensmikroskopi och multiphoton mikroskopi. När det gäller genomträngningsdjupet, confocal och wide-field fluorescensmikroskopi ligga i intervallet liknande, normalt begränsad till 100 nm22. På grund av längre våglängd ljuset utnyttjas för flera foton mikroskopi, kan dess inträngningsdjup förbättras till spänna av 0,5 - 1 mm23. I jämförelse, kan storleken på multi-dimensionella bilder som genereras av optisk snittning av ljus ark mikroskopi vara upp till flera millimeter24. När det gäller laterala upplösning visar ett elegant utfört experiment att ljus ark mikroskopi ger en bättre tredimensionell rumslig upplösning jämfört med confocal fluorescensmikroskopi i stora prover25. Nyligen, ljus ark mikroskopi har kombinerats med två-photon teknik, vilket ytterligare förbättrar genomträngningsdjupet jämfört med normala en photon light ark mikroskopi och är tio gånger snabbare än punkt-scanning två-foton mikroskopi26.

Med tanke på 3D matrix som ger micro-arkitekturen för celler, förutom bovint kollagen som jag använde i detta papper, finns det många andra alternativ, såsom extra-cellulära matrix (ECM) härrör från mus sarkom celler, agaros, syntetiska hydrogels eller andra biokompatibla polymera material. Mus sarkom ECM är en protein blandning inklusive kollagen IV, laminin, liksom många tillväxtfaktorer. Jämför till syntetiska material, biologiska ECMs (kollagen och mus sarkom ECM), å ena sidan presentera ett mer fysiologiskt relevanta sammanhang. men däremot, kvalitet och sammansättning biologiska ECMs kan variera mellan partier och företag. Reproducerbarheten av syntetiska material är däremot mer garanterad. Anmärkningsvärt, finjustering av biokemiska och mekaniska egenskaper, samt önskade ändringar, tillåts för syntetiska material, men inte för biologiska ECMs10,27.

Sammanfattningsvis, i denna uppsats beskrev vi ett protokoll för att konstruera 3D kollagenmatrisen för Cellbiologi experiment med ljus ark fluorescensmikroskopi, och hur till bädda in primära mänskliga CTL i 3D collagen matrix att visualisera och analysera CTL migration. Vi belyst de viktigaste punkterna i provberedning, bild förvärv och analysen. Våra resultat visar att bildandet av högdynamiska utbuktningar och fina aktin strukturer kan visualiseras med hjälp av ljus-ark mikroskopi med en bra spatiotemporal upplösning. Dessutom analys-protokollet som beskrivs här ger oss möjlighet att på ett tillförlitligt sätt spåra celler på ett objektivt och automatiserat sätt. Denna metod kommer att vara särskilt fördelaktigt för mänskliga immunologisk forskning som möss och människor skiljer sig avsevärt i många immunfunktionerna och reaktivitet till terapier28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar någon ekonomisk eller kommersiell intressekonflikt.

Acknowledgments

Vi tackar Institutet för klinisk hemostas och transfusionsmedicin för att tillhandahålla givarens blod; Carmen Hässig och Cora Hoxha utmärkt teknisk hjälp. Vi tackar Jens Rettig (Saarland University) för den modifierade pMAX vektorn, Roland Wedlich-Söldner (universitetet i Münster) för den ursprungliga LifeAct-Ruby-bygga och Christian Junker (Saarland University) för att generera den LifeAct-mEGFP konstruktion. Detta projekt har finansierats av Sonderforschungsbereich 1027 (projektet A2 till B.Q.) och 894 (projektet A1 till M.H.). Mikroskopet ljus ark finansierades av DFG (GZ: INST 256/4 19-1 FUGG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fibricol, bovine collagen solution Advanced Biomatrix  #5133-20ML Collagen matrix
0.5 M NaOH Solution Merck 1091381000 for neutralizing Fibricol solution
Ultra-Low melting agarose Affymetrix 32821-10GM Sample preparation in low c[Col]
Dynabeads Untouched Human CD8 T Cells Kit Thermo Fisher 11348D Isolation of primary human CD8+ T cells from PBMC
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation Thermo Fisher 11132D Activation of CTL populations
Human recombinant interleukin-2 Thermo Fisher PHC0023 Stimulation of cultured CTL
P3 Primary solution kit Lonza V4XP-30XX Transfection
α-PFN1 antibody, rabbit, IgG Abcam ab124904 IF
Alexa Fluor 633 Phalloidin Thermo Fisher A22284 IF
CellMask Orange Plasma membrane Stain Thermo Fisher C10045 Fluorescent cell label
Tween 20 Sigma P1379-250mL IF
Triton X-100 Eurobio 018774 IF
DPBS Dulbecco's phopsphate buffered saline Thermo Fisher 14190250 IF
Bovine serum albumin Sigma A9418-100G IF
Goat α Rabbit 568, IgG, rabbit Thermo Fisher A-11011 IF
Lightsheet Z.1 (Light-sheet microscopy) Zeiss N.A.
Cell culture hood Thermo Fisher HeraSafe KS
Cell culture incubator HERACell 150i  Thermo Fisher N.A.
Centrifuge 5418 and 5452 Eppendorf N.A.
Pippettes Eppendorf 3123000039, 3123000020, 3123000063
Pippette tips VWR 89079-444, 89079-436, 89079-452 
15 mL tubes Sarstedt  62.554.002
Capillaries 50 µL VWR (Brand) 613-3373 Zeiss LSFM sample preparation
Plunger for capillaries VWR (Brand) BRND701934 "Stamps with Teflon tip" LSFM sample preparation
MColorPhast pH stips Merck 1095430001 to test pH of neutralized Fibricol
BD Plastipak 1mL syringes BD Z230723 ALDRICH Alternative sample preparation
Modeling clay (Hasbro Play-Doh A5417EU7) Play-Doh N.A.
Imaris file converter Bitplane available at http://www.bitplane.com  Convert imaging files to Imaris file format
Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage) Bitplane available at http://www.bitplane.com  Analysis of 3D and 4D imaging data

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration. Med Res Rev. 27 (2), 149-176 (2007).
  2. Doyle, A. D., Petrie, R. J., Kutys, M. L., Yamada, K. M. Dimensions in cell migration. Curr Opin Cell Biol. 25 (5), 642-649 (2013).
  3. Krummel, M. F., Bartumeus, F., Gerard, A. T cell migration, search strategies and mechanisms. Nat Rev Immunol. 16 (3), 193-201 (2016).
  4. Entschladen, F., et al. Analysis methods of human cell migration. Exp Cell Res. 307 (2), 418-426 (2005).
  5. Meredith, J. E., Fazeli, B., Schwartz, M. A. The extracellular matrix as a cell survival factor. Mol Biol Cell. 4 (9), 953-961 (1993).
  6. Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model. J Cell Biol. 188 (1), 11-19 (2010).
  7. Ridley, A. J., et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).
  8. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 647-664 (2014).
  9. Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Solomon, F. D. 3D cell culture systems: advantages and applications. J Cell Physiol. 230 (1), 16-26 (2015).
  10. Fang, Y., Eglen, R. M. Three-Dimensional Cell Cultures in Drug Discovery and Development. SLAS Discov. 22 (5), 456-472 (2017).
  11. Schoppmeyer, R., et al. Human profilin 1 is a negative regulator of CTL mediated cell-killing and migration. Eur J Immunol. 47 (9), 1562-1572 (2017).
  12. Mogilner, A., Oster, G. Cell motility driven by actin polymerization. Biophys J. 71 (6), 3030-3045 (1996).
  13. Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. J Histochem Cytochem. 59 (2), 129-138 (2011).
  14. Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
  15. Zhou, X., et al. Bystander cells enhance NK cytotoxic efficiency by reducing search time. Sci Rep. 7, 44357 (2017).
  16. Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
  17. Petrie, R. J., Yamada, K. M. At the leading edge of three-dimensional cell migration. J Cell Sci. 125 (Pt 24), 5917-5926 (2012).
  18. Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer). Oncol Rep. 33 (4), 1837-1843 (2015).
  19. Lee, J. M., et al. A three-dimensional microenvironment alters protein expression and chemosensitivity of epithelial ovarian cancer cells in vitro. Lab Invest. 93 (5), 528-542 (2013).
  20. Luca, A. C., et al. Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines. PLoS One. 8 (3), e59689 (2013).
  21. Jemielita, M., Taormina, M. J., Delaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques. J Biophotonics. 6 (11-12), 920-928 (2013).
  22. Graf, B. W., Boppart, S. A. Imaging and analysis of three-dimensional cell culture models. Methods Mol Biol. 591, 211-227 (2010).
  23. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  24. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
  25. Verveer, P. J., et al. High-resolution three-dimensional imaging of large specimens with light sheet-based microscopy. Nat Methods. 4 (4), 311-313 (2007).
  26. Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nat Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
  27. Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. Methods Mol Biol. 695, 1-15 (2011).
  28. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).

Tags

Immunologi och infektion fråga 136 ljus ark mikroskopi enda plan belysning mikroskopi mänskliga immuna celler naturliga mördarceller cytotoxiska T-lymfocyter cell tracking 3D imaging levande cell imaging cell fixering i kollagen
Ljus-ark mikroskopi för tredimensionell visualisering av mänskliga immunceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schoppmeyer, R., Zhao, R., Hoth, M., More

Schoppmeyer, R., Zhao, R., Hoth, M., Qu, B. Light-sheet Microscopy for Three-dimensional Visualization of Human Immune Cells. J. Vis. Exp. (136), e57651, doi:10.3791/57651 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter