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Cancer Research

इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा क्षणिक और लंबे समय से स्थायी डबल-किनारा डीएनए टूटता में निस्र्पक डीएनए की मरंमत की प्रक्रिया

Published: June 8, 2018 doi: 10.3791/57653
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Division of Biology, Kansas State University, 2Bristol Medical School, Translational Health Sciences, University of Bristol
* These authors contributed equally

Summary

डबल-किनारा डीएनए टूट जाता है की मरंमत एक गतिशील प्रक्रिया है, टूट पर मरंमत परिसरों की न केवल गठन की आवश्यकता है, लेकिन यह भी उनके समाधान के बाद घाव को संबोधित किया है । यहां, हम क्षणिक और लंबे समय से स्थाई के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग एक उपकरण के रूप में इस जीनोम रखरखाव तंत्र काटना के लिए टूट जाता है ।

Abstract

डीएनए में डबल-कतरा टूट (DSBs) की मरंमत एक उच्च समंवित प्रक्रिया है, necessitating गठन और बहु प्रोटीन मरंमत परिसरों के समाधान । इस प्रक्रिया में प्रोटीन है कि संघ और इन घावों को प्रोटीन के संबंध को बढ़ावा देने के असंख्य द्वारा विनियमित है । बड़े हिस्से में प्रोटीन का एक विशाल पुस्तकालय के कार्यात्मक स्क्रीन प्रदर्शन करने की क्षमता के लिए धंयवाद, वहां दोहरे-किनारा डीएनए तोड़ मरंमत के लिए आवश्यक जीन की एक बड़ी प्रशंसा है । अक्सर पीटा या रासायनिक अवरोधक स्क्रीन एक प्रोटीन है कि DSB मरंमत के लिए आवश्यक है के लिए एक मार्कर के रूप में वृद्धि की विषाक्तता का उपयोग करके मरंमत प्रक्रियाओं में शामिल प्रोटीन की पहचान । हालांकि उपंयास सेलुलर जीनोम की निष्ठा को बनाए रखने में शामिल प्रोटीन की पहचान के लिए उपयोगी है, कार्यात्मक विश्लेषण कि ब्याज के प्रोटीन स्थानीयकरण, गठन, या मरंमत परिसरों के समाधान को बढ़ावा देता है के निर्धारण की आवश्यकता है ।

मरंमत प्रोटीन का संचय आसानी से इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा अलग परमाणु घावों के रूप में पता लगाया जा सकता है । इस प्रकार, डीएनए के नुकसान की साइटों पर इन प्रोटीन के संघ और संघ के प्रतिनिधि अंतराल पर इन परमाणु घावों पर डबल-किनारा डीएनए टूटता के प्रेरण के बाद देख कर पहुंचा जा सकता है । इस दृष्टिकोण भी गलत-स्थानीयकृत मरंमत कारक प्रोटीन की पहचान कर सकते हैं, अगर मरंमत दोष एक साथ नहीं हो मरंमत में अपूर्ण देरी के साथ । इस परिदृश्य में, लंबे समय तक चलने डबल-किनारा डीएनए टूटता एक दुर्लभ काटने endonuclease (जैसे, मैं-SceI) कोशिकाओं में जहां कहा एंजाइम के लिए मांयता साइट सेलुलर जीनोम में एकीकृत किया गया है व्यक्त द्वारा इंजीनियर किया जा सकता है । परिणामस्वरूप घाव विशेष रूप से हल करने के लिए मुश्किल है के रूप में वफादार मरंमत है एंजाइम मांयता साइट फिर से शुरू होगा, दरार का एक और दौर का संकेत । नतीजतन, मरंमत के कैनेटीक्स में मतभेदों को समाप्त कर रहे हैं । यदि मरंमत परिसरों का गठन नहीं कर रहे हैं, स्थानीयकरण में बाधा गया है । इस प्रोटोकॉल की मरंमत कैनेटीक्स में परिवर्तन की पहचान के रूप में अच्छी तरह से प्रोटीन स्थानीयकरण की मरंमत आवश्यक पद्धति का वर्णन ।

Introduction

प्रत्येक दिन, मानव शरीर में हर कोशिका एक अनुमान के साथ बमबारी है १०,००० डीएनए घावों1। इस अस्तित्व के खतरे हमें उत्परिवर्तनों, oncogenesis के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सेल मौत के लिए जोखिम में डालता है । जीनोम निष्ठा की रक्षा के लिए, स्तनधारी कोशिकाओं को प्रोटीन संघों और संशोधनों की एक जटिल श्रृंखला के साथ डीएनए क्षति का जवाब विकसित किया है । यह प्रतिक्रिया कई रास्ते में आयोजित किया जाता है, सामूहिक रूप से डीएनए क्षति प्रतिक्रिया (DDR)2,3के रूप में जाना जाता है । इस DDR डीएनए की मरंमत प्रोटीन के संचय के होते है डीएनए घावों पर, दोनों अस्थाई और स्थानिक समंवित । DDR अक्सर प्रचार या क्षतिग्रस्त डीएनए2,4,5की प्रतिकृति के दौरान हो सकता है कि क्षति के गहनता से बचने के लिए सेल चक्र गिरफ्तारी लाती है । बारी में, यह भी सेलुलर व्यवहार्यता के लिए आवश्यक है मरम्मत के बाद मरंमत परिसरों असंबद्ध द्वारा सेल चक्र गिरफ्तारी बंद बारी करने के लिए पूरा किया गया है ।

डीएनए क्षति के विभिंन प्रकारों के अलावा, DSBs सबसे बचके हैं । DSBs की मरंमत करने में विफलता गुणसूत्र पुनर्व्यवस्था या पूरे गुणसूत्र हथियारों की हानि जैसे बड़े पैमाने पर विलोपन में परिणाम कर सकते हैं । DSBs की मरम्मत को दो मार्ग6,7,8में बांटा गया है । मुताबिक़ पुनर्संयोजन (HR) एक बहन गुणसूत्र एक डीएनए टेम्पलेट के रूप में उपयोग करने की आवश्यकता है और इस प्रकार देर एस और G2 के लिए सीमित है/ नॉन-मुताबिक़ एंड जॉइनिंग (NHEJ) के पास ये प्रतिबंध नहीं है, लेकिन DSBs11,12की मरंमत करते समय छोटे हटाए जाने के कारण हो सकते हैं ।

DSB मरंमत विशेष रूप से और सामांय में DDR जांच के सक्रिय क्षेत्र हैं । सुविधाजनक रूप से अलग रास्ते में संगठित होने के बावजूद, अतिरेक का एक बड़ा सौदा है । दरअसल, कई प्रोटीन (BRCA1, BRCA2, और उदाहरण के लिए RPA परिसर) में शामिल है कई रास्ते13,14,15,16। एक मार्ग द्वारा एक घाव की मरंमत, एक नुकसान मध्यवर्ती कि एक और मार्ग14द्वारा मरंमत की जानी चाहिए करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इन रास्ते के जुड़वां, आवश्यक समय की सटीक राशि के लिए सही जगह पर सही प्रोटीन की भर्ती के अपने जटिल कार्य के साथ संयुक्त, एक बहु स्तरीय विनियामक प्रक्रिया की आवश्यकता है ।

एक ताजा रिपोर्ट का प्रदर्शन है कि मरंमत परिसर गठन, संकल्प द्वारा DDR की जटिलताओं पर प्रकाश डाला गया, और स्थानीयकरण प्रत्येक अलग17बिगड़ा हो सकता है । निम्नलिखित प्रोटोकॉल का समग्र लक्ष्य निश्चित रूप से DSB की मरंमत करने के लिए कोशिकाओं की क्षमता काटना है । इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का प्रयोग, नुकसान की साइटों पर मरंमत प्रोटीन का संचय DSBs के प्रेरण के बाद प्रतिनिधि समय अंक में visualized किया जा सकता है ।

इस तकनीक आमतौर पर इस्तेमाल किया दृष्टिकोण के लिए कई फायदे हैं । अक्सर, मरंमत एकल समय बिंदुओं पर जांच की है और विधानसभा और मरंमत परिसरों के पृथक्करण की गतिशील प्रक्रिया का प्रतिनिधित्व करने में असमर्थ । पूर्ण समाधान करने के लिए प्रारंभिक सक्रियण से मरम्मत की पूरी रेंज अवलोकन सुनिश्चित करता है कि सुधार में देरी पूर्ण अवरोध के रूप में नहीं पहचाना गया है । इसके विपरीत, यह आश्वासन दिया है कि एक सुधार प्रतिक्रिया है कि निष्क्रिय करने में असमर्थ है की प्रेरण कहा प्रतिक्रिया सामांय या अत्यधिक सक्रियण के रूप में नहीं पहचाना है ।

देरी प्रोटीन जटिल गठन और मरंमत प्रोटीन की एमआईएस स्थानीयकरण, तथापि, स्पष्ट रूप से इस दृष्टिकोण के साथ प्रतिष्ठित नहीं हो सकता है । यह निर्धारित करने के लिए कि मरंमत प्रोटीन गलत-स्थानीयकृत बनाम अपने स्थानीयकरण में देरी, एक "लंबे समय से स्थाई" DSB सेलुलर डीएनए के एंजाइमी दरार के माध्यम से पेश किया जा सकता है । परिणामस्वरूप घाव recut हर बार यह मरंमत की है, एक अलग बड़े परमाणु मरंमत ध्यान में जिसके परिणामस्वरूप और भर्ती से लौकिक प्रतिबंध हटाने है । यह एक दुर्लभ काटने endonuclease (जैसे, मैं SceI) के उपयोग के साथ मौजूदा दृष्टिकोण को संशोधित करने के लिए एक लंबे समय तक चलने DSB प्रेरित द्वारा प्राप्त किया जा सकता है । DSBs की दीर्घायु इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा मायावी मरंमत प्रोटीन के दृश्य में सक्षम बनाता है । बढ़ी बहुतायत भी दृश्य में सुधार कर सकता है जब पता लगाने एंटीबॉडी गुणवत्ता, एक विशेषता है कि जब कम अध्ययन प्रोटीन डीएनए की मरंमत पर एक प्रभाव होने के रूप में पहचान कर रहे है उपयोगी हो सकता है में सीमा से रुकावट है ।

विशेष रूप से, हम एक मुक्त छवि प्रसंस्करण और विश्लेषण सॉफ्टवेयर (जैसे, ImageJ) के लिए स्पष्ट निर्देश प्रदान करते हैं । यह छवि विश्लेषण में एक प्रमुख वित्तीय बाधा को हटा, डीएनए क्षति की मरंमत के एक व्यापक दर्शकों के लिए पूछताछ खोलने ।

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Protocol

कृपया ध्यान दें, इस प्रोटोकॉल U2OS एक I-SceI मांयता साइट18वाले कक्षों के लिए लिखा है । कक्ष U2OS की आवश्यकता नहीं है लेकिन I-SceI साइट शामिल होना चाहिए । प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया कोशिकाओं के प्रकार पर निर्भर करता है (उदाहरणके लिए, बीज बोने की कोशिकाओं की संख्या और समय गर्मी) समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है ।

1. DSB मरम्मत परिसर के गठन की कैनेटीक्स को परिभाषित करना

  1. एक 10 सेमी टिशू कल्चर प्लेट पर U20S-DRGFP कोशिकाओं बढ़ 85 तक-90% धाराप्रवाह ।
  2. मीडिया निकालें और 2 मिनट के लिए EDTA के 3 मिलीलीटर में कमरे के तापमान (आरटी) में गर्मी ।
  3. trypsin के 1 मिलीलीटर के साथ EDTA बदलें और 5 मिनट के लिए ३७ ° c पर मशीन । सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को एक खुर्दबीन के नीचे देखने के द्वारा प्लेट की सतह से अलग कर रहे हैं । Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% पेनिसिलिन/streptomycin के साथ पूरक के 5 मिलीलीटर के साथ trypsin बेअसर ।
  4. hemocytometer और trypan नीले बहिष्करण विधि का उपयोग कर इस निलंबन में कक्षों की एकाग्रता का निर्धारण करें ।
  5. बीज 6 x 103 कोशिकाओं/अच्छी तरह से एक ग्लास-नीचे ९६-अच्छी थाली के २०० µ एल में । वैकल्पिक रूप से, बीज 4 x 106 कोशिकाओं में 12 मिमी coverslips पर 8 मिलीलीटर एक 10 सेमी की थाली में रखा ।
    नोट: प्रत्येक well या coverslip नियंत्रण सहित एक ही समय बिंदु का प्रतिनिधित्व करता है ।
  6. ३७ ° c और 5% CO2पर रात भर कोशिकाओं बढ़ाएँ ।
  7. उत्प्रेरण DSBs
    1. ९६ से मीडिया की जगह-अच्छी तरह से प्लेट/10 सेमी डिश एच2ओ2 के साथ DMEM + 10% FBS के साथ 25 µ मीटर की एकाग्रता के लिए पतला और 1 एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर गर्मी ।
    2. 1x पंजाब के साथ 3x कोशिकाओं को धो और ताजा DMEM के साथ प्रतिस्थापित 10% FBS और 1% पेनिसिलिन/streptomycin के साथ पूरक । 0, 1, 4, 8, 24, और ४८ एच के लिए ३७ ° c पर कोशिकाओं की मशीन । सुनिश्चित करें कि एच2ओ2 के ताजा कमजोर पड़ने प्रत्येक प्रयोग के लिए उपयोग किया जाता है ।
      नोट: एच2ओ2 एकाग्रता यहां इस्तेमाल किया पर कोशिकाओं को मारने से बचने के लिए, यह सुनिश्चित करें कि क्षति की खुराक काफी कम है ऐसी है कि कोशिकाओं के थोक apoptosis और वार्धक्य से बचना होगा । यह वसूली की प्रक्रिया का निरीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण है । यह सबसे अच्छा खुराक की एक सीमा के लिए संवेदनशीलता को मापने के द्वारा प्राप्त की है । एक MTT परख या अंय सेल व्यवहार्यता परख करने के लिए हाइड्रोजन पेरोक्साइड का ंयूनतम एकाग्रता है कि इस्तेमाल किया जा सकता है निर्धारित करते हैं ।
  8. फ़िक्सिंग और permeabilizing कक्ष
    1. 1x पंजाबियों के साथ 3 बार कोशिकाओं को धो लें । प्रत्येक समय बिंदु के लिए 10 सेमी प्लेट से एक coverslip निकालें और यह एक अच्छी तरह से फिक्सिंग के लिए एक 24 अच्छी तरह से थाली में जगह है । सुई और संदंश सावधानी से coverslip को दूर करने और coverslip सतह से कोशिकाओं scratching से बचने के लिए उपयोग करें ।
    2. 4% paraformaldehyde (पीएफए) के साथ 15 मिनट के लिए निर्धारित समय पर 1 एच के बाद ज2ओ2 एक्सपोजर और ताजा DMEM प्रतिस्थापन (0, 1, 4, 8, 24, और ४८ ज) के लिए गर्मी से कोशिकाओं को ठीक करें ।
    3. पंजाबियों के साथ फिक्स्ड coverslips 3 बार धो लें । Permeabilize ०.५% गैर ईओण के साथ कोशिकाओं 1x पंजाब में पतला डिटर्जेंट । आरटी में 15 मिनट के लिए मशीन, पंजाब के साथ 3x धोने से पहले ।
      नोट: permeabilization के बाद, coverslips का भंडारण 4 डिग्री सेल्सियस पर पंजाब में एक सप्ताह के लिए संभव है ।
  9. जटिल विज़ुअलाइज़ेशन सुधारें
    1. ब्लॉक ९६-well प्लेट/coverslips 3% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) और ०.१% गैर ईओण का एक समाधान में डिटर्जेंट (3% BSA समाधान) 1x में 1 के लिए एच. आर.
    2. प्राथमिक एंटीबॉडी कि ब्याज की मरंमत प्रोटीन लक्ष्य के साथ मशीन, 3% BSA समाधान में 1 ज के लिए आरटी में निर्माता के विनिर्देशों के अनुसार पतला, 1x पंजाबियों के साथ 3 बार धोने से पहले ।
    3. 3% BSA समाधान में निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार पतला माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ मशीन ९६-अच्छी तरह से थाली/coverslips । द्वितीयक fluorophores ओवरलैपिंग उत्तेजना या उत्सर्जन स्पेक्ट्रा नहीं है कि की पुष्टि करें ।
    4. पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को धोने के बाद 3 बार DAPI जोड़ने, 1x पंजाब में निर्माता के विनिर्देशों के अनुसार पतला और आरटी पर 5 मिनट के लिए मशीन ।
    5. माउंट coverslips बढ़ते एजेंट की एक बूंद के साथ स्लाइड पर, यकीन है कि सेल साइड नीचे चेहरे बना । coverslips ध्यान से दबाएँ और एक पोंछ के साथ किसी भी अतिरिक्त बढ़ते एजेंट सोख ।
    6. तेजी से सुखाने पारदर्शी नेल पॉलिश के साथ coverslips सील और स्लाइड के साथ coverslip की एक पूरी मुहर सुनिश्चित करें ।
    7. DAPI चैनल पर ध्यान केंद्रित करके फोकल माइक्रोस्कोप छवियों ले लो, अन्य चैनलों से पहले (ब्याज की डीएनए की मरंमत जीन से संकेतों के साथ) प्रयोग में पूर्वाग्रह शुरू करने से बचने के लिए ।
    8. वैकल्पिक रूप से, छवियों को जेड लेने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, वांछित क्षेत्र के वर्गों और सभी जासूसी घावों कल्पना करने के लिए एक एकल विमान में छवि संघनित्र ।
      नोट: DSB संकल्प या प्रोटीन ब्याज का चुना समय बिंदुओं पर नहीं मनाया जाता है, तो निर्धारित समय अंक की एक विस्तृत श्रृंखला का चयन करके DSBs संकल्प जब (0 – 48 एच पोस्ट DSB प्रेरण). ब्याज की समय अंक DSB प्रेरण की विधि और ब्याज की मरंमत प्रोटीन के द्वारा भिंन होगा ।
  10. इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी छवियों में नाभिक को परिभाषित करने के लिए मुफ्त ImageJ सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें ।
    नोट: माइक्रोस्कोप छवियों को खोलने के लिए, जैव स्वरूपों प्लगइन ImageJ में स्थापित किया जाना चाहिए.
    1. ImageJ विंडो में छवि फ़ाइल खींचकर, या ImageJ में "प्लगइन" उपकरण पट्टी से "जैव-स्वरूपों आयातक" का चयन करके, फोकल छवियां (. czi या. tif) खोलें ।
      नोट: "जैव-स्वरूप आयात विकल्प" विंडो दिखाई देगा ।
    2. "विभाजन चैनल" का चयन करें "जैव प्रारूपों आयात विकल्प" विंडो के भीतर गठित DAPI और फ्लोरोसेंट छवियों में छवि विभाजित करने के लिए ।
    3. ड्रॉप-डाउन मेनू से "रंग विकल्प" में "रंगीन" का चयन करें । चुनें "ठीक है" DAPI और हिस्टोन H2AX (H2AX) छवियों को अलग खिड़कियों के रूप में खोलने के लिए और DAPI छवि का चयन करें ।
    4. नाभिक का चयन करने के लिए "छवि" उपकरण पट्टी और "थ्रेशोल्ड समायोजित करें" विकल्प चुनें.
      नोट: एक "थ्रेशोल्ड" विंडो दिखाई देगा.
    5. सही करने के लिए पूरी तरह से "दहलीज" खिड़की के नीचे पट्टी फिसलने से छवि दहलीज समायोजित करें । ऊपरी पट्टी को समायोजित करें जब तक कि नाभिक पूरी तरह से अलग रूपरेखा के साथ लाल दिखाई देते हैं, और पृष्ठभूमि काले । लागू करेंका चयन न करें । "सीमा समायोजित करें" विंडो को बंद कर ।
    6. "विश्लेषण" उपकरण पट्टी और "विश्लेषण कण" विकल्प का चयन करें । देखो एक "विश्लेषण कणों" खिड़की स्क्रीन पर दिखाई दे रहा है ।
    7. इनपुट एक नाभिक के ंयूनतम आकार ।
      नोट: आकार के नीचे के कणों को नाभिक के रूप में गिना नहीं जाएगा ।
    8. "दिखाएं" ड्रॉपडाउन मेनू से, "रूपरेखाएं" का चयन करें । "प्रबंधक में जोड़ें" विकल्प का चयन करें । "ROI प्रबंधक" विंडो खोलने के लिए "ठीक" पर क्लिक करें.
      नोट: नाभिक की रूपरेखाएं एक अलग विंडो में दिखाई देंगी ।
    9. नाभिक है कि "रॉय प्रबंधक" खिड़की से चुना जा सकता है के लिए संख्या निरुपित ।
  11. इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी छवियों में H2AX घावों यों तो ImageJ का प्रयोग करें ।
    1. "H2AX" घावों विंडो का चयन करें (फ्लोरोसेंट संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ दाग) । फिर, "प्रक्रिया" उपकरण पट्टी का चयन करें और नाभिक के भीतर घावों को खोजने के लिए "find Maxima" चुनें ।
      नोट: एक "Find Maxima" विंडो खुलेगा ।
    2. "आउटपुट प्रकार" ड्रॉपडाउन मेनू से "एकल अंक" विकल्प चुनें और maxima/घावों की कल्पना करने के लिए "पूर्वावलोकन पॉइंट चयन" का चयन करें । छवि (चित्रा 1) के प्रतिदीप्ति तीव्रता के आधार पर एक "शोर सहिष्णुता" मूल्य इनपुट. छोटे काले डॉट्स के साथ एक सफेद खिड़की के प्रकटन के लिए जांच करें ।
      नोट: इन डॉट्स का प्रतिनिधित्व H2AX घावों/maxima कि पता लगाया गया है । शोर सहिष्णुता मूल्य विश्लेषण किया जा रहा सभी छवियों के लिए निरंतर बनाए रखा जाना चाहिए. एक कम/उच्च शोर सहिष्णुता नाभिक के भीतर भी कई/कुछ maxima (घावों) को दर्शाती है और इस नाभिक के भीतर घावों का एक सटीक प्रतिनिधित्व नहीं होगा ।
    3. उस नाभिक का चयन करें जिसके लिए H2AX घावों को "ROI प्रबंधक" विंडो से quantified किया जाना चाहिए. "सभी दिखाएं" विकल्प की जांच करके सभी नाभिक का चयन करें ।
    4. चयनित नाभिक के भीतर maxima/घावों की संख्या को मापने के लिए "उपाय" का चयन करें ।
      नोट: maxima/घावों की संख्या २५५ के गुणकों के रूप में दिखाई देते हैं, यानी, एक अधिकतम २५५ के एक "RawIntDen" (एकीकृत घनत्व) पढ़ने है ।
    5. "RawIntDen" मानों की प्रतिलिपि बनाएं और उंहें डेटा विश्लेषण के लिए सॉफ़्टवेयर में चिपकाएं ।

2. एक लंबे समय तक चलने वाले दोहरे कतरा डीएनए तोड़ने के लिए स्थानीयकरण का विश्लेषण

  1. बीज कोशिकाओं पर ९६-well प्लेट्स/coverslips के रूप में १.१ और १.२ वर्गों में वर्णित है ।
  2. डबल-कतरा डीएनए टूटता है की प्रेरण
    1. Transfect I-SceI अभिव्यक्ति वेक्टर के साथ एक लिपिड-आधारित अभिकर्मक एजेंट का उपयोग कर निर्माता के विनिर्देशों के अनुसार कोशिकाओं । endonuclease अभिव्यक्ति को अधिकतम करने के लिए अभिकर्मक के बाद 24-72 ज रुको । यदि अभिकर्मक एक विलक्षण बड़े परमाणु γ-H2AX फोकस के साथ कोशिकाओं का पता लगाने से सफल रहा था निर्धारित करते हैं ।
  3. छवियों का अधिग्रहण
    1. फिक्स, permeabilize, ब्लॉक, और धो ९६-well थाली/coverslips के रूप में धारा १.८ में वर्णित है ।
    2. सह γ के खिलाफ एक एंटीबॉडी-H2AX और ब्याज की मरंमत प्रोटीन के साथ कोशिकाओं की गर्मी (यहां, RAD51 के खिलाफ एक प्राथमिक एंटीबॉडी इस्तेमाल किया गया था) 3% BSA समाधान में निर्माता विनिर्देशों के अनुसार पतला ।
    3. ९६-अच्छी प्लेट धोने/coverslips 3 बार 1x पंजाबियों के साथ । 3% BSA समाधान में निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार पतला माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ मशीन ९६-अच्छी तरह से थाली/coverslips । द्वितीयक fluorophores ओवरलैपिंग उत्तेजना या उत्सर्जन स्पेक्ट्रा नहीं है कि की पुष्टि करें ।
    4. उन कक्षों की पहचान करें जिनमें बड़े परमाणु γ-H2AX फ़ोकस हैं । केवल पूर्वाग्रह से बचने के लिए इन कोशिकाओं की तस्वीरें ले लो ।
  4. लंबे समय से स्थाई I-SceI प्रेरित घावों का विश्लेषण
    1. बड़े γ-H2AX घावों और ब्याज की मरंमत प्रोटीन के सह स्थानीय घावों है कि कोशिकाओं की संख्या दोनों की गिनती से, लंबे समय से स्थायी घावों का विश्लेषण करें ।

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Representative Results

चित्रा 1 ImageJ का उपयोग ठहराव maxima/घावों के लिए सही शोर भेदभाव के चयन को दर्शाया गया है । DAPI की मर्ज की गई छवियां और ब्याज की मरंमत प्रोटीन बाएं पैनल पर हैं । चित्र 1a ९० का एक शोर भेदभाव दिखाता है और घावों की सही संख्या को चिह्नित करता है । किनारे पर नाभिक (एक गुलाबी तीर के साथ चित्रित) और नाभिक के बाहर घावों (एक पीले तीर के साथ चित्रित) ठहराव के दौरान गिना नहीं कर रहे हैं । चित्रा 1b ५० की कम शोर सहिष्णुता को दर्शाया गया है । कई maxima नाभिक के बाहर और नाभिक के भीतर की पहचान कर रहे हैं । चित्रा 1C २२० के एक उच्च शोर सहिष्णुता से पता चलता है । केवल एक ही फ़ोकस (एक सफ़ेद तीर) का पता लगाया गया । पाठक की भावना की पेशकश करने के लिए "सकारात्मक" और "नकारात्मक" परिणाम, हम भी चित्र 2में प्रतिनिधि परिणाम संकलित किया है । विशेष रूप से, चित्रा 2a एक γ-H2AX ध्यान (हरे) और ब्याज की मरंमत प्रोटीन (लाल) के बीच सह स्थानीयकरण दर्शाया गया है । इसी तरह, एक untransfected सेल इस पैनल के ऊपरी बाएँ में दिखाया गया है और एक गैर परमाणु के साथ एक सेल (झूठी) γ-H2AX ध्यान ऊपरी दाएँ में दिखाया गया है. कृपया ध्यान दें डीएनए क्षति मशीनरी के साथ micronuclei सहयोगी इन गैर परमाणु घावों की संभावना एक स्रोत है19। चित्रा बी - चित्रा 2a से दो सही-अधिकांश कोशिकाओं की एक उच्च वृद्धि प्रदान करता है कि वे कैसे आंतरिक और नाभिक के लिए बाहरी, क्रमशः निर्धारित किया गया में स्पष्टता प्रदान करने के लिए । एक परमाणु γ का एक उदाहरण-मरंमत प्रोटीन के सह स्थानीयकरण के बिना H2AX ध्यान केंद्रित चित्रा 2cमें दिखाया गया है । इस प्रोटोकॉल का एक योजनाबद्ध चित्र 3 में प्रदान की जाती है कि निस्र्पक डीएनए की मरंमत के लिए इस दृष्टिकोण संक्षेप ।

Figure 1
चित्रा 1 : डबल-कतरा डीएनए तोड़ मरंमत कैनेटीक्स के प्रतिनिधि विश्लेषण । γ के प्रतिनिधि छवियां-H2AX घावों ठहराव ImageJ (जैव प्रारूपों प्लगइन के साथ) सॉफ्टवेयर का उपयोग कर । बाएं पैनलों नाभिक की समग्र छवियों (40X इज़ाफ़ा), DAPI और हरे रंग के लिए γ-H2AX के लिए दाग नीला कर रहे हैं । केंद्र पैनलों दिखाएं संदर्भ संयुक्त राष्ट्र विश्लेषण γ-H2AX घावों के साथ नाभिक/maxima । (क) सही पैनल ९० की एक शोर सहनशीलता के साथ maxima/घावों का पता लगाने से पता चलता है और नाभिक के भीतर घावों की संख्या के वास्तविक आकलन के प्रतिनिधि है । (ख) सही पैनल एक कम शोर सहनशीलता (५०) के साथ maxima ठहराव दिखाता है । Maxima/घावों नाभिक के बाहर पता लगाया जा सकता है (पीला तीर), जबकि नाभिक के भीतर स्थित Maxima के बहुमत गैर विशिष्ट पृष्ठभूमि संकेत कर रहे हैं । (ग) सही पैनल उच्च शोर सहनशीलता (२२०) के साथ maxima ठहराव दिखाता है । केवल एक ही अधिकतम/ध्यान (सफेद तीर) नाभिक के भीतर का पता चला है और नाभिक के भीतर घावों का प्रतिनिधि नहीं है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : प्रतिनिधि I-SceI प्रेरित डबल-कतरा डीएनए टूटता है । coverslips (40X आवर्धन) पर उगाई गई कोशिकाओं से नाभिक की प्रतिनिधि छवियां । नाभिक के दाग नीले हैं । एक मरम्मत प्रोटीन (RAD51) दाग लाल और γ-H2AX दाग हरा है । (क) तीन पैनलों में वही तीन कोशिकाएँ दिखाई पड़ती हैं. बाएं अधिकांश पैनल में नाभिक दिखाई दे रहे हैं । मध्य पैनल में, RAD51 के लिए दाग दिखाया गया है । दाएं फलक पर, γ-H2AX धुंधला दिखाई दे रहा है । ऊपरी दाएं कोने में नाभिक I-SceI प्रेरित DSBs के किसी भी संकेत नहीं दिखाता है । केंद्र में नाभिक (गुलाबी तीर) एक सच्चे सकारात्मक घटना का प्रतिनिधित्व करता है के रूप में यह दोनों एक बड़े γ-H2AX परमाणु फोकस और एक सह स्थानीय RAD51 परमाणु फोकस है । दाईं ओर नाभिक एक झूठी बड़ी γ-H2AX फोकस के रूप में यह extranuclear है । नाभिक के बाहर घावों सह स्थानीयकरण विश्लेषण के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए । (B) यह भाग a में मर्ज की गई छवि का उच्च आवर्धन है (केंद्र और सही अधिकांश कक्ष) । बड़े परमाणु पीली RAD51 और H2AX संकेत के ओवरलैप का संकेत ध्यान गुलाबी तीर से चिह्नित है । (ग) एक परमाणु γ की प्रतिनिधि छवि-H2AX ब्याज की डीएनए की मरंमत प्रोटीन का सह दाग के बिना ध्यान केंद्रित । (क) और (ख) में एक सफेद तीर के साथ ध्यान चिह्नित के विपरीत, पीले तीर ठेठ परिणाम दिखाता है जब मरंमत प्रोटीन नुकसान की साइटों के लिए स्थानीयकरण से रोका जाता है । स्केल बार = 15 µm. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : दोहरे-किनारा डीएनए तोड़ मरंमत का विश्लेषण करने के लिए प्रोटोकॉल का दृश्य चित्रण । (1) coverslips/ग्लास नीचे प्लेटों पर कोशिकाओं बोने के लिए प्रोटोकॉल कदम १.१ का प्रतिनिधित्व । (2) हाइड्रोजन पेरोक्साइड के साथ इलाज के द्वारा डबल-किनारा टूटता के प्रेरण के चित्रण (सही) या transfecting द्वारा लंबे समय से स्थाई डबल-किनारा टूटता उत्प्रेरण-SceI के 3 µ जी । (3) प्रोटोकॉल कदम १.४ का प्रतिनिधित्व दोहरे-किनारा टूटता के दृश्य के लिए 1.5.3 करने के लिए । (4a) DAPI (नीला) और γ-H2AX घावों (हरा) के साथ दाग सेल की फोकल माइक्रोस्कोपी का प्रतिनिधित्व छवि । (4b) एकवचन बड़े γ-H2AX घावों की छवि (green) फिर से नाभिक दाग DAPI (नीला) । (5) ImageJ (प्रोटोकॉल चरण 1.10.1 – 1.11.5) का उपयोग करके γ-H2AX घावों के विश्लेषण का चित्रण । (5b) बड़े लंबे समय से स्थाई γ-H2AX घावों की मैनुअल गिनती का चित्रण (प्रोटोकॉल कदम २.४) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

सामांय में डीएनए क्षति की मरंमत और दोहरे-असहाय डीएनए टूट की मरंमत के विश्लेषण विशेष रूप से अनुसंधान के एक सक्रिय क्षेत्र है, क्योंकि इसके परिणामों के बुनियादी जीवविज्ञान6,20तक tumorigenesis अवधि । यह पांडुलिपि विवरण एक दृष्टिकोण है कि मानव संसाधन के माध्यम से DSBs के समाधान के लिए RAD51 और γ-H2AX प्रोटीन के योगदान को सही ढंग से विदारक है । आगे की खोज, इस विधि स्पष्ट14में मरंमत प्रोटीन के अतिरिक्त कार्य DSBs के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । मरंमत कैनेटीक्स और मैं के लिए मरंमत मशीनरी की भर्ती की तुलना-SceI प्रेरित DSBs नियंत्रण कोशिकाओं और कोशिकाओं के बीच ब्याज की प्रोटीन के साथ बाहर खटखटाया, भर्ती, स्थानीयकरण के लिए है कि प्रोटीन के योगदान को परिभाषित करेगा, और DSBs करने के लिए मरंमत कारकों का समाधान ।

visualizing मरंमत कैनेटीक्स आमतौर पर इस्तेमाल किया दृष्टिकोण पर कई फायदे हैं । अक्सर, मरंमत एक समय बिंदुओं पर जांच की है, जो विधानसभा और मरंमत परिसरों के पृथक्करण की गतिशील प्रक्रिया का प्रतिनिधित्व करने में असमर्थ है । पूर्ण समाधान करने के लिए प्रारंभिक सक्रियण से मरम्मत की पूरी रेंज अवलोकन सुनिश्चित करता है कि मरंमत में एक देरी पूर्ण अवरोध के रूप में नहीं पहचाना है । इसके विपरीत, यह कि प्रतिक्रिया को निष्क्रिय करने की क्षमता के बिना एक मरंमत प्रतिक्रिया की प्रेरण आश्वासन दिया है कि सामांय या अत्यधिक सक्रियण के रूप में नहीं पहचाना है । ये एक स्थापित दृष्टिकोण के आवेदन में काफी हद तक परिवर्तन कर रहे हैं, लेकिन एक दुर्लभ काटने endonuclease के उपयोग के लिए एक लंबे समय से स्थाई DSB प्रेरित एक उपंयास उपकरण है । यह जांचकर्ता को स्पष्ट रूप से अगर एक मरंमत प्रोटीन के स्थानीयकरण के बजाय अपनी भर्ती के प्रयोग के समापन से परे समय की एक छोटी अवधि में देरी किया जा रहा है बाधा निर्धारित करने की अनुमति देता है । मैं-SceI प्रेरित DSB दिनों के लिए पिछले कर सकते है और सैद्धांतिक रूप में जब तक एंजाइम व्यक्त किया है (सेल व्यवहार्य रहना चाहिए) । DSB मरंमत के कैनेटीक्स भी लाइव सेल इमेजिंग के माध्यम से मनाया जा सकता है । हालांकि, हालांकि लाइव सेल इमेजिंग वास्तविक समय में मरंमत की घटनाओं का पता लगाने की अनुमति देता है, अपने आवेदन की आवश्यकता है कि प्रोटीन GFP जैसे एक fluorophore के साथ टैग किया जा द्वारा बाधा है । इस तरह के आनुवंशिक हेरफेर करने के लिए प्रोटीन समारोह में परिवर्तन की क्षमता है और एक अतिरिक्त तकनीकी बाधा का प्रतिनिधित्व करता है ।

ImageJ सॉफ्टवेयर के माध्यम से छवि विश्लेषण मास्टर करने के लिए बोझिल हो सकता है । इस सॉफ्टवेयर का उपयोग कर सुधार फोकस मान्यता और ठहराव के लिए कदम दर कदम अनुदेश अन्य समूहों के लिए इस बाधा को हटाने की उम्मीद में प्रदान की जाती है । यह शक्तिशाली सॉफ्टवेयर के उपयोग में वृद्धि के लिए नेतृत्व और संघीय अनुदान के समर्थन के पूल सिकुड़ने के एक समय में और अधिक महंगी कार्यक्रमों की लागत को खत्म कर सकता है ।

सिद्धांत रूप में, इन DSBs की अवधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा मायावी मरंमत प्रोटीन के दृश्य को सक्षम करना चाहिए । यह प्रोटीन है कि देखने के लिए मुश्किल है क्योंकि वे एक उच्च पर्याप्त एकाग्रता में जमा नहीं कर रहे है का पता लगाया जा करने के लिए मामला हो सकता है, उदाहरणके लिए, I-SceI की हठ की मरंमत प्रोटीन की विशिष्ट संचय से अधिक में DSB परिणाम प्रेरित घाव । बढ़ी हुई बहुतायत भी जब पता लगाने एंटीबॉडी गुणवत्ता में एक सीमा से रुकावट है विज़ुअलाइज़ेशन में सुधार कर सकते हैं; एक विशेषता है कि विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है जब कम अध्ययन प्रोटीन डीएनए की मरंमत पर एक प्रभाव होने के रूप में पहचान कर रहे हैं । तिथि करने के लिए, इस दृष्टिकोण 4 डीएनए मरंमत प्रोटीन, अर्थात् RAD51, RPA70, BRCA1, और BRCA2 के लिए सत्यापित किया गया है (डेटा नहीं दिखाया गया है, चित्रा 2, और संदर्भ17)

अंत में, वहां संशोधनों कि इस प्रोटोकॉल के लिए किया जा सकता है डीएनए क्षति के प्रकार है कि पूछताछ की जा सकती है और साथ ही सेलुलर वातावरण का विस्तार कर रहे हैं । सबसे स्पष्ट संशोधन स्रोत या प्रेरित डीएनए क्षति के प्रकार बदल जाएगा । UVB का उपयोग करने के लिए सिद्धांत का सबूत, विकिरण, या radiomimetics (phleomycin, ब्लीयामीसिन, और etoposide) डीएनए की मरंमत के कैनेटीक्स अध्ययन करने के लिए पहले से ही प्रकाशित किया गया है18,19,23,24 , 25. मामूली संशोधन के साथ, इस दृष्टिकोण भी DSBs को NHEJ द्वारा स्पष्ट मरंमत प्रोटीन प्रतिक्रिया कर सकते हैं । वैकल्पिक रूप से, Britton एट अल । एक पूर्व निष्कर्षण तकनीक है कि26का इस्तेमाल किया जा सकता है का वर्णन । इसके अलावा, वहां होमिंग निक endonucleases (i-HmuI या i-बसि) है कि व्यापक मांयता साइटों, मैं-SceI27के समान है । उंहें मैं-SceI से अलग, इन एंजाइमों के कारण एकल-किनारा डीएनए टूट जाता है (एसएसबी) । एक सेल लाइन में इन एंजाइमों के लिए मांयता साइट का परिचय एसएसबी की मरंमत का विश्लेषण है कि समानताएं लंबे समय तक चलने DSBs पूछताछ के लिए इस पांडुलिपि में वर्णित प्रोटोकॉल की अनुमति होगी । विशेष रूप से, I-SceI मांयता को एकीकृत करने की प्रक्रिया साइट और साइट की शुरूआत की पुष्टि श्रमसाध्य जा सकता है । सौभाग्य से जीनोम संपादन प्रौद्योगिकी (जैसे खस्ता/Cas9 सिस्टम में अग्रिम) इस बोझ28को कम कर दिया है । वहां भी सक्रिय अनुसंधान का एक क्षेत्र है कि इंजीनियरिंग होमिंग endonucleases में सफल रहा है एक वांछित जीनोमिक स्थान पर कटौती है, जो पता चलता है कि भविष्य में, इन इंजीनियरिंग प्रगति और CRISPR/Cas9 के उपयोग के लिए इस क्लोनिंग कदम का नेतृत्व कर सकते है औषधालय२८,२९.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम योएल Sanneman और डॉ Philine Wangemann फोकल माइक्रोस्कोपी कोर, पशु चिकित्सा के कैनसस राज्य विश्वविद्यालय कॉलेज द्वारा वित्त पोषित के लिए, इस तकनीक को विकसित करने के प्रयासों के उनके समर्थन के लिए धंयवाद । pCBASceI मारिया जसीन (Addgene प्लाज्मिड # 26477) 30 से एक उपहार था । U2OS डॉ-GFP कोशिकाओं मारिया जसीन18से एक तरह का उपहार थे ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12 mm Coverslips VWR 89015-725
16% Paraformaldehyde (PFA) ThermoFisher Scientific 28908
24-well plate VWR 82050-892
96-well glass bottom plate Cellvis P96-1.5H-N
Anti-H2AX Alexa488 EMD Millipore 05-636-AF488
Anti-Rad51 (D4B10)  Cell Signaling Technology 8875S
Bio-formats plugin for ImageJ National Institute of Health (NIH)  https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html
Bovine Serum Albumin (BSA) VWR 97061-416
DAPI ThermoFisher Scientific D1306
DMEM, High Glucose ThermoFisher Scientific 12100046
EDTA Invitrogen 15576-028
Fetal Bovine Serum (FBS) VWR 89510-194
Goat Anti-Rabbit IgG Alexa594 ThermoFisher Scientific  A-11012 
Hydrogen Peroxide sigma-Aldrich 216763-100ML
ImageJ Software National Institute of Health (NIH)  https://imagej.nih.gov/ij/
I-SceI Expression Vector Addgene 26477
Nail Polish- Insta Dri Sally and Hansen Clearly Quick (103)
Phosphate Buffered Saline (PBS) Bio Basic PD8117
ProLong Gold Antifade Reagent Life Technologies P36930
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-100ML
Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich T4049-500ML
TurboFect Transfection Reagent ThermoFisher Scientific R0531
Tween-20 Fisher Scientific BP337-500

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक १३६ इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी डीएनए मरंमत डबल-किनारा टूटता है मरंमत कैनेटीक्स मुताबिक़ पुनर्संयोजन गैर मुताबिक़ अंत में शामिल होने H2AX
इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा क्षणिक और लंबे समय से स्थायी डबल-किनारा डीएनए टूटता में निस्र्पक डीएनए की मरंमत की प्रक्रिया
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Murthy, V., Dacus, D., Gamez, M., Hu, C., Wendel, S. O., Snow, J., Kahn, A., Walterhouse, S. H., Wallace, N. A. Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (136), e57653, doi:10.3791/57653 (2018).

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