Summary
이중 가닥 DNA 틈의 수리 후 병 변 해결 뿐만 아니라 휴식, 하지만 또한 그들의 해상도에 선 단지의 형성을 필요로 역동적인 과정 이다. 여기, 사용 면역 형광 검사 현미경 검사 법 과도 하 고 오래 견 딘 더블-좌초 휴식을 위한 도구로 서이 게놈 유지 관리 메커니즘을 해 부 합니다.
Abstract
더블-좌초 틈 (DSBs) DNA의 복구는 매우 조정된 과정, 형성 및 다중 단백질 수리 단지의 해상도 필요로. 이 프로세스는 협회를 홍보 하는 단백질의 무수 한와이 병 변이 단백질의 분열에 의해 통제 된다. 단백질의 광대 한 도서관의 기능 화면 수행 하는 능력에 큰 부분에 감사 합니다, 이중 가닥 DNA 틈 수리에 필요한 유전자의 큰 감사 이다. 종종 녹아웃 또는 화학 억제 물 스크린 DSB 수리에 필요한 단백질에 대 한 표식으로 증가 독성을 사용 하 여 복구 프로세스에 관련 된 단백질을 식별 합니다. 하지만 게놈 충실도 유지에 관련 된 식별 소설 세포질 단백질에 대 한 유용한 기능 분석 관심사의 단백질 지역화, 형성, 또는 수리 복합물의 해결책을 촉진 하는 여부의 결정을 필요로 합니다.
수리 단백질의 축적 면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 고유 핵 foci로 쉽게 감지 수 있습니다. 따라서, 협회 및 DNA 손상의 사이트에이 단백질의 분열 이중 가닥 DNA 틈의 유도 후 이러한 핵 foci 대표 간격으로 관찰 하 여 액세스할 수 있습니다. 이 방법은 또한 수리 결함 수리에서 불완전 지연으로 동시에 발생 하지 않습니다 경우 잘못 지역화 된 복구 요소 단백질를 식별할 수 있습니다. 이 시나리오에서는 긴-지속 이중 가닥 DNA 휴식 했다 효소에 대 한 인식 사이트 세포 게놈으로 통합 되어 셀에 드문 절단 endonuclease (예를 들어, SceI)으로 표현 하 여 설계 수 있다. 결과 병 변 특히 충실 한 수리 효소의 인식 사이트, 분열의 또 다른 라운드를 메시지를 다시 것입니다 해결 하기 어렵다. 그 결과, 수리의 속도에 차이 제거 됩니다. 수리 단지 형성 하지는 경우 지역화 장애가 되어 있다. 이 프로토콜 수리 단백질 지 방화 뿐만 아니라 복구 속도 론 변경 내용을 식별 하는 데 필요한 방법론을 설명 합니다.
Introduction
매일, 모든 세포는 인체에는 약된 10, 000으로 포 격 된다 DNA 장애1. 이 생존의 위협을 셀 뿐만 아니라 돌연변이, 발암에 대 한 위험에서 우리를 박 았 죽음. 게놈 충실도 보호 하기 위해 포유류 세포는 복잡 한 일련의 단백질 연결 및 수정 된 DNA 손상 응답 하 진화 했다. 이 응답은 여러 통로, DNA 손상 응답 (DDR)2,3로 총칭으로 구성 됩니다. DNA 병 변, 일시적으로 그리고 공간 조정에 DNA 수 선 단백질의 축적은 DDR에 의하여 이루어져 있다. DDR 자주 전파 또는 손상 된 DNA2,,45의 복제 하는 동안 발생할 수 있는 손상의 강화를 피하기 위해 세포 주기 검거를 유도 합니다. 차례 차례로, 그것은 또한 수리 완료 된 후 복구 단지를 분리 하 여 세포 주기 검거를 세포 생존에 필요한.
DNA 손상의 다양 한 종류 중에서 DSBs는 가장 해로운. DSBs 복구 실패 염색체 재배열 또는 전체 염색체 팔의 손실과 같은 대규모 삭제 될 수 있습니다. DSBs 수리 두 경로6,,78으로 분할 된다. 동종 재결합 (HR) 필요 자매 염색체 DNA 템플렛으로 사용 하 여 따라서 늦은 S와 G2/M 단계의 세포 주기9,10로 제한 됩니다. 비 동종 끝 결합 (NHEJ) 이러한 제한에는 없습니다 하지만 DSBs11,12복구 때 작은 삭제를 발생할 수 있습니다.
DSB 특히 수리와 DDR 일반적 조사의 활성 영역이 있습니다. 편리 하 게 분리 된 경로에 조직 되 고에 불구 하 고 중복의 큰 거래가 이다. 실제로, 많은 단백질 (BRCA1, BRCA2, 그리고 예를 들어 복잡 한 RPA) 여러 경로13,14,,1516에서 포함 된다. 한 통로 의해 병 변의 수리는 다른 통로14에 의해 복구 해야 하는 중간 손상으로 이어질 수 있습니다. 필요한 시간의 정확한 금액에 대 한 올바른 위치에 올바른 단백질 보충의 그들의 복잡 한 작업을 함께 이러한 통로의 하나는 다중 계층 규제 프로세스를 필요 합니다.
최근 보고서는 수리 복잡 한 형성, 해상도 및 지역화 각각 별도로 수 장애인된17으로 DDR의 복잡 한을 강조 한다. 다음과 같은 프로토콜의 전반적인 목표는 DSB를 복구 하는 세포의 능력이 결정적으로 부. 면역 형광 검사 현미경 검사 법을 사용 하 여, 손상의 사이트에서 수리 단백질의 축적 DSBs의 유도 따라 대표적인 시간 지점에서 구상 될 수 있다.
이 기술은 일반적으로 사용 되는 방법에 몇 가지 장점이 있습니다. 자주, 수리 한 번 포인트에서 조사 하 고 어셈블리의 동적 과정과 수리 단지의 분리를 나타내는 능력입니다. 전체 해상도로 초기 활성화에서 복구의 전체 범위를 관찰 하면 수리에서 지연 완전 한 금지로 오인 하지. 반대로, 그것은 했다 응답을 비활성화 수 있는 수리 응답의 감 응 작용 정상 또는 과도 한 정품 인증으로 오인 하지 보장 합니다.
그러나 지연된 단백질 복잡 한 형성 및 복구 단백질의 잘못 지역화, 수 없습니다 명확 하 게 구별 될이 방식으로. 확인 하려면 복구 단백질 대 잘못 지역화 된 그들의 지 방화에 지연, "오랫동안" DSB 세포질 DNA의 효소 분열을 통해 도입 수 있습니다. 결과 병 변 수리는, 뚜렷한 큰 핵 수리 초점 고 모집에서 시간 제한을 제거 때마다 recut 이다. 이 드문 절단 endonuclease (예를 들어, SceI) 오랫동안 DSB를 유발을 사용 하 여 기존 접근 방식을 수정 하 여 구현할 수 있습니다. DSBs의 장 수는 면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 애매 수리 단백질의 시각화 수 있습니다. 또한 향상 된 풍부는 탐지 항 체 품질, 덜 공부 단백질 DNA 복구에 영향을 미치고로 식별 하는 경우 도움이 될 수 있는 기능에에서 제한에 의해 방해 된다 때 시각화를 향상 수 있습니다.
특히, 우리는 무료 이미지 처리 및 분석 소프트웨어 (예를 들어, ImageJ)에 대 한 명시적인 지침을 제공합니다. 이미지 분석, DNA 손상 복구를 심문을 열고 주요 금융 장벽을 제거 합니다.
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Protocol
제발 참고,이 프로토콜은 작성 된-SceI 인식 사이트18를 포함 하는 U2OS 세포. 셀은 U2OS 필요가 없습니다 하지만-SceI 사이트를 포함 해야 합니다. 프로토콜 조정 (예를 들어, 셀 시드 및 보육 시간) 되도록 할 수 있습니다 사용 하는 세포의 종류에 따라.
1. 정의 DSB 수리 복잡 한 대형의 활동
- Confluent 85-90%까지 10cm 조직 문화 접시에 U20S DRGFP 세포를 성장 한다.
- 미디어를 제거 하 고 2 분에 대 한 EDTA의 3 mL에서 실 온 (RT)에서 품 어.
- 트립 신 1 mL를 EDTA를 대체 하 고 5 분 확인 셀에서 현미경으로 접시의 표면에서 분리는 37 ° C에서 품 어. 5 mL의 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 페니실린/스 보충 된 트립 신을 무력화.
- 이 정지는 hemocytometer trypan 블루 제외 메서드를 사용 하 여 셀의 농도 결정 합니다.
- 시드 6 x 103 유리 하단 96 잘 접시 200 µ L에 셀/잘. 또는, 12 m m coverslips에 8 mL에 씨앗 4 x 106 전지 10 cm 접시에 배치합니다.
참고: 각 잘 또는 coverslip 컨트롤을 포함 하 여 한 번 포인트를 나타냅니다. - 37 ° C, 5% CO2에서 하룻밤 세포 성장.
- 유도 하는 DSBs
- H2O2 DMEM + 10%와 25 µ M의 농도를 희석 96 잘 접시/10 cm 접시에서 미디어 바꿉니다 FBS와 1 시간 동안 37 ° C에서 품 어.
- 워시 PBS x 1 3 x와 신선한 DMEM 바꿀 보충 10 %FBS 1% 페니실린/스 셀. 0, 1, 4, 8, 24, 37 ° C에서 48 h. 확인 H2O2 의 신선한 희석 각 실험을 위해 사용 되는 셀을 품 어.
참고: 여기에 사용 된 H2O2 농도에서 세포를 죽이 피하기 위해, 충분히 apoptosis와 노화 세포의 대량 피할 것 이다 그런 손상의 복용량 낮은 인지 확인 합니다. 복구 프로세스를 관찰 하는 것이 중요 하다입니다. 이 최고의 복용량의 범위에 감도 측정 하 여 이루어집니다. MTT 분석 결과 또는 사용할 수 있는 과산화 수소의 최소 농도 결정 하기 위해 다른 세포 생존 능력 분석 실험을 수행 합니다.
- 담합 및 셀 permeabilizing
- 3 번 1 x PBS로 세포 세척. coverslip 각 시간 지점에 대 한 10 cm 접시에서 제거 하 고 해결을 위한 24-잘 접시의 단일 우물에. 바늘과 포 셉을 사용 하 여 조심 스럽게 제거 하는 coverslip 고 coverslip 표면에서 세포를 긁힘 방지.
- H2O2 노출 및 신선한 DMEM 교체 (0, 1, 4, 8, 24, 및 48 h)의 1 시간 후에 시간을 지정 하는 셀에 4 %paraformaldehyde (PFA)와 15 분 동안 배양 하 여 수정.
- 고정된 coverslips PBS로 3 회 세척. 1 x PBS에 희석 0.5% 비 이온 세제로 세포를 permeabilize. PBS 가진 3 배를 세척 하기 전에 RT에서 15 분 동안 품 어.
참고: 후에 permeabilization, coverslips의 저장 가능 하다 PBS에 4 ° C에서 적어도 일주일 동안.
- 복잡 한 시각화를 복구
- 3% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)과 0.1% 비 이온 세제 1 x PBS에 희석의 솔루션에 96 잘 접시/coverslips 차단 (3 %BSA 솔루션) 실시간에서 1 h
- 관심, RT에서 1 h 3 %BSA 솔루션에서 제조업체의 사양에 따라 1 x PBS로 3 회 세척 하기 전에 희석의 수리 단백질을 대상으로 1 차 항 체로 품 어.
- 이차 항 체 3 %BSA 솔루션에서 제조 업체의 프로토콜에 따라 희석 된 96 잘 접시/coverslips를 품 어. 확인 하는 보조 fluorophores 겹치는 구동 또는 없는 방출 스펙트럼.
- 셀 PBS 3 시간을 세척 후 추가 DAPI, 1 x PBS에 제조업체의 사양에 따라 희석 하 고 5 분 RT에서 품 어.
- 아래 셀 쪽 얼굴 확인 하 장착 에이전트의 드롭 슬라이드에 coverslips를 탑재 합니다. coverslips를 신중 하 게 누르고 닦기와 어떤 초과 설치 에이전트를 흡수.
- 투명 매니큐어 빠른 건조와 coverslips를 밀봉 하 고 슬라이드 coverslip의 완전 한 도장 합니다.
- 실험으로 편견을 소개 하는 피하기 위해 DAPI 채널 (관심사의 DNA 복구 유전자에서 신호)와 다른 채널 앞에 초점을 맞춤 으로써 confocal 현미경 이미지를 가져가 라.
- 또는, 이미지 Z-섹션의 원하는 영역을 복용 하 고 모든 감지 foci 시각화 하는 단일 평면에 이미지를 응축 하 여 취득 될 수 있다.
참고: DSB 해상도 또는 관심사의 단백질은 시간 포인트 선택에 나타나지 않으면, 결정 DSBs 처음 시간 포인트의 넓은 범위를 선택 하 여 해결 하는 경우 (0-48 h 후 DSB 유도). 관심의 시간 포인트 DSB 유도 방법 및 관심사의 수리 단백질에 의해 달라 집니다.
- ImageJ는 무료 소프트웨어를 사용 하 여 면역 형광 현미경 이미지에 핵을 정의.
참고: 현미경 이미지를 열려면 바이오 포맷 플러그인 ImageJ에 설치 되어야 합니다.- ImageJ의 "플러그인" 도구 모음에서 confocal 이미지 (.czi 또는.tif) ImageJ 창에 이미지 파일을 드래그 하거나 "바이오 형식 가져오기"를 선택 하 여 엽니다.
참고: "바이오 형식 가져오기 옵션" 창이 나타납니다. - "분할 채널" 제정 DAPI와 "바이오 형식 가져오기 옵션" 창에서 형광 이미지 이미지 분할을 선택 합니다.
- 드롭 다운 메뉴에서 "색상 옵션"에서 "Colorized"를 선택 합니다. DAPI와 히스톤 H2AX를 엽니다 "확인"을 선택 합니다 (H2AX)로 windows를 별도 영상과 DAPI 이미지를 선택 하십시오.
- "이미지" 도구 모음 및 핵을 선택 하는 "조정 임계값" 옵션을 선택 합니다.
참고: "임계값" 창이 나타납니다. - 오른쪽에 "임계값" 윈도우의 하단 표시줄을 완전히 밀어 이미지 임계값을 조정 합니다. 핵 뚜렷한 윤곽선과 배경 블랙 완전 빨간색 표시 될 때까지 가기 막대를 조정 합니다. 선택 하지 않으면 적용. "임계값 조정" 창을 닫습니다.
- "분석" 도구 모음 및 "입자 분석" 옵션을 선택 합니다. 화면에 나타나는 "입자 분석" 창을 참조 하십시오.
- 핵의 최소 크기를 입력 합니다.
참고: 입력 크기 아래 입자 핵으로 계산 하지 않습니다. - "보기" 드롭다운 메뉴에서 "설명"을 선택 합니다. "관리자 추가" 옵션을 선택 합니다. "ROI 관리자" 창을 엽니다 "확인"을 클릭 합니다.
참고: 핵의 윤곽선은 별도 창에 표시 됩니다. - "ROI 관리자" 창에서 선택할 수 있는 핵에 번호를 할당 합니다.
- ImageJ의 "플러그인" 도구 모음에서 confocal 이미지 (.czi 또는.tif) ImageJ 창에 이미지 파일을 드래그 하거나 "바이오 형식 가져오기"를 선택 하 여 엽니다.
- ImageJ를 사용 하 여 면역 형광 현미경 이미지에 H2AX foci 계량.
- "H2AX" foci 창 (물 붙일 활용 된 이차 항 체)를 선택 합니다. 다음, "프로세스" 도구 모음을 선택 하 고 "맥시 마 찾기"는 핵 내에서 포커스를 찾을 수를 선택 합니다.
참고: "맥시 마 찾기" 창이 열립니다. - "출력 형식" 드롭 다운 메뉴에서 "단일 포인트" 옵션을 선택 하 고 "미리 보기 위치 선택"을 선택 맥시 마/foci 시각화. "잡음" 허용치 이미지 (그림 1)의 형광 강도 따라 입력 합니다. 작은 검은 점 들과 흰색 창의 모양을 확인 합니다.
참고:이 점을 고 H2AX foci/맥시 마 검색 된 나타냅니다. 소음 허용 오차 값 분석 되 고 모든 이미지에 대 한 상수 유지 되어야 합니다. 낮은/높은 소음 허용 오차는 핵 내에서 너무 많은/몇 맥시 마 (포커스)를 묘사 하 고 핵 내의 foci의 정확한 표현 되지 않습니다. - 핵을 H2AX foci 해야 합니다 측정할 수에 대 한 "투자 수익 관리자" 창에서 선택 합니다. "모두 표시" 옵션을 선택 하 여 모든 핵을 선택 합니다.
- 맥시 마/foci 선택한 핵 내에서 수를 측정 하는 "측정"을 선택 합니다.
참고: 맥시 마/foci 수 255, 즉의 배수로 표시, 하나의 최대 255의 "RawIntDen" (통합된 밀도) 읽기. - "RawIntDen" 값을 복사 하 고 데이터 분석을 위한 소프트웨어에 붙여 넣어.
- "H2AX" foci 창 (물 붙일 활용 된 이차 항 체)를 선택 합니다. 다음, "프로세스" 도구 모음을 선택 하 고 "맥시 마 찾기"는 핵 내에서 포커스를 찾을 수를 선택 합니다.
2. 오랫동안 이중 가닥 DNA 틈에 지역화 분석
- 96 잘 접시/coverslips 설명 섹션 1.1와 1.2에 시드 셀.
-
이중 가닥 DNA 틈의 유도
- 제조업체의 사양에 따라 지질에 기초를 둔 transfection 시 약을 사용 하 여-SceI 식 벡터와 셀 transfect. Transfection endonuclease 식 최대화 하기 후 24-72 h를 기다립니다. 단 수 큰 핵 γ-H2AX 초점 세포를 찾아 transfection는 성공 했는지 확인 합니다.
-
이미지의 획득
- 수정, permeabilize, 차단, 그리고 1.8 섹션에 설명 된 대로 96 잘 접시/coverslips 세척.
- 공동 γ H2AX와 관심의 수리 단백질에 대 한 항 체와 세포를 품 어 (여기, RAD51에 대 한 1 차적인 항 체 사용) 3 %BSA 솔루션에서 제조업체의 사양에 따라 희석.
- 96 잘 접시/coverslips 1 x PBS로 3 회 세척. 이차 항 체 3 %BSA 솔루션에서 제조 업체의 프로토콜에 따라 희석 된 96 잘 접시/coverslips를 품 어. 확인 하는 보조 fluorophores 겹치는 구동 또는 없는 방출 스펙트럼.
- 큰 핵 γ H2AX 포커스가 있는 셀을 식별 합니다. 만을 편견을 피하기 위해 이러한 셀의 사진을 찍을.
-
오랫동안 SceI의 분석 유도 포커스
- 큰 γ-H2AX foci 및 관심사의 수리 단백질의 공동 화 된 foci 있는 셀 개수를 계산 하 여 오랫동안 포커스를 수동으로 분석.
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Representative Results
그림 1 은 맥시 마/foci 정량화 ImageJ를 사용 하 여에 대 한 올바른 잡음 차별의 선택을 묘사 한다. DAPI의 병합 된 이미지 및 복구 단백질의 왼쪽된 패널에 있습니다. 그림 1A 90의 잡음 차별 보여준다 고 foci의 정확한 수를 표시 합니다. 핵 가장자리 (분홍색 화살표 표시)와 포커스 (노란색 화살표가 그려져) 핵 외부에 정량화 하는 동안 포함 되지 않습니다. 그림 1B 50의 저 잡음 내성 묘사. 수많은 맥시 마 핵 외부와 핵 내에서 식별 됩니다. 그림 1 c 220의 높은 소음 허용 오차를 보여 줍니다. 오직 하나의 초점 (흰색 화살표) 검색 되었습니다. 독자 "긍정적인"와 "부정적인" 결과 제공, 우리는 또한 그림 2에 대표적인 결과를 컴파일합니다. 특히, 그림 2A γ H2AX 초점 (녹색)과 관심 (빨간색)의 수리 단백질 사이 공동 지역화를 보여 줍니다. 마찬가지로, untransfected 셀이이 패널의 왼쪽 상단에 표시 되 고 비 핵 (false) γ-H2AX 초점 셀 오른쪽 상단에 표시 됩니다. 참고는 micronuclei 연결 DNA 손상 기계 장치는 이러한 비 핵 foci19의 가능성이 소스 하시기 바랍니다. 그림 2B 는 어떻게 그들이 했다 결정 실내와 외부 핵, 각각에 대 한 설명을 제공 하기 위해 그림 2A 에서 두 개의 가장 오른쪽 셀의 높은 확대를 제공 합니다. 수리의 공동 지역화 없이 핵 γ-H2AX 초점의 예는 그림 2C에 표시 됩니다. 이 프로토콜의 회로도 DNA 복구 특징을이 이렇게 요약 하는 그림 3 에서 제공 됩니다.
그림 1 : 이중 가닥 DNA 틈 복구 활동의 대표적인 분석. ImageJ (와 함께 바이오 포맷 플러그인) 소프트웨어를 사용 하 여 γ H2AX foci 정량화의 대표 이미지. 왼쪽된 패널은 핵 (40 X 확대), DAPI 및 γ-H2AX 녹색 푸른 스테인드의 합성 이미지입니다. 센터 패널에서 γ H2AX foci/맥시 마와 유엔 분석 핵 참조를 표시합니다. (A) 오른쪽 패널 맥시 마/foci 탐지 90의 소음 허용 오차를 표시 및 핵 내의 foci의 수의 실제 추정의 대표. (B) 오른쪽 패널 맥시 마 부 량 한 저 잡음 내성 (50)와 함께 표시 됩니다. 맥시 마/foci 핵 (노란색 화살표) 밖에 서 검출 될 수 있다, 대다수는 맥시 마의 내에 있는 핵은 일반적인 배경 신호. (C) 오른쪽 패널은 높은 소음 허용 오차 (220) 맥시 마 정량화를 보여줍니다. 만 단일 최대/초점 (흰색 화살표)는 핵 내에서 감지 되 고 핵 내의 foci의 대표 되지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 대표 나-SceI 유발 이중 가닥 DNA 틈. Coverslips (40 X 확대)에 성장 하는 세포에서 핵의 대표 이미지. 핵은 파란 얼룩이 진다. 수리 단백질 (RAD51) 레드 스테인드은 고 γ H2AX 녹색 얼룩이 있다. (A) 3 패널 표시 같은 3 셀. 왼쪽에 대부분 패널, 핵을 볼 수 있습니다. 중간 패널에 표시 됩니다 RAD51에 얼룩. 오른쪽 패널에 표시 됩니다 γ H2AX 얼룩. 오른쪽 상단 모서리에 핵-SceI의 어떤 표시 든 지 유도 DSBs 표시 되지 않습니다. 그것이 큰 γ-H2AX 핵 초점 및 공동 지역화 RAD51 핵 초점 (분홍색 화살표) 센터에서 핵 진정한 긍정적인 이벤트를 나타냅니다. 오른쪽에 핵 extranuclear는 false 큰 γ H2AX 초점을 했다. 핵의 외부 foci 공동 지역화 분석에 사용할 수 없습니다. (B)이 부품 A에에서 병합 된 이미지 (가운데 및 오른쪽 대부분 셀) 높은 확대 이다. RAD51 고 H2AX 신호의 중첩을 나타내는 큰 핵 노란색 초점 분홍색 화살표로 표시 됩니다. (C) 공동 관심사의 DNA 수 선 단백질의 얼룩 없이 핵 γ-H2AX 초점의 대표 이미지. 초점에 있는 흰색 화살표 (A) 및 (B) 표시, 달리 노란색 화살표 복구 단백질 손상의 사이트 지역화에서 하지 때 전형적인 결과를 보여 줍니다. 눈금 막대 = 15 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 이중 가닥 DNA 틈 수리 분석을 위한 프로토콜의 시각적 묘사. (1) 프로토콜의 표현 단계 1.1 셀 coverslips/유리에 뿌리기 위해 접시 바닥. (2) 이중 가닥의 유도의 그림 나누기 과산화 수소 (오른쪽)와 치료 또는 긴-지속 이중 가닥 나누기-SceI의 transfecting 3 µ g에 의해 유도. (3) 더블-스트랜드 나누기의 시각화에 대 한 프로토콜 단계 1.4 1.5.3의 표현. (4a) 셀의 confocal 현미경 검사 법을 대표 하는 이미지 스테인드 DAPI (파란색)와 γ H2AX foci (녹색). (4b) 단 수 큰 γ H2AX foci (녹색) 다시의 이미지 핵 얼룩 DAPI (파란색). (5a) γ H2AX foci ImageJ (프로토콜 단계 1.10.1–1.11.5)를 사용 하 여 분석의 묘사. (5b) 큰 오랫동안 γ H2AX foci (프로토콜 단계 2.4)의 수동 카운트의 묘사. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
DNA의 분석 손상 수리 일반적 이며 이중 가닥 DNA 틈의 수리 구체적으로 연구의 활성 영역 그 결과 기본적인 생물학6,20tumorigenesis 범위 때문에. 이 원고 세부 사항 정확 하 게 dissects 시간 기대,이 방법을 통해 DSBs 해상도 RAD51 및 γ-H2AX 단백질의 기여 하는 방식 명료 DSBs14수리 단백질의 추가 기능을 사용할 수 있습니다. 복구 활동의 비교와, 기 절 하는 관심사의 단백질으로 수리 기계 제어 셀과 셀 간의 난-SceI 유도 DSBs의 채용 모집, 지역화에 그 단백질의 기여를 정의 하 고 해상도 DSBs 수리 요인입니다.
시각화 복구 활동 일반적으로 사용 되는 접근에 몇몇 이점이 있다. 자주, 수리는 어셈블리의 동적 과정과 수리 단지의 분리를 나타내는 수 단일 시간 지점에서 조사 이다. 전체 해상도로 초기 활성화에서 복구의 전체 범위를 관찰 하면 수리에서 지연 완전 한 금지로 오인 하지. 반대로, 그것은 응답 정상 또는 과도 한 정품 인증으로 오인 하지 비활성화 수 없이 복구 응답의 그의 유도 보장 합니다. 이러한 설립의 응용 프로그램에서 크게 변화 하지만 오랫동안 DSB를 유발 하는 희귀 절단 endonuclease의 사용은 새로운 도구. 그것은 명확 하 게 수리 단백질의 지 방화는 실험의 결론을 넘어 시간의 짧은 기간 지연 되 고 그것의 채용 대신 저해입니다 경우 확인 하려면 조사 수 있습니다. 효소는 표현으로-SceI DSB 수 일 동안 지속 하 고 이론적으로 유도 (셀 있어야 가능한). DSB 수리의 활동 또한 라이브 셀 이미징 통해 관찰할 수 있습니다. 그러나, 비록 라이브 셀 이미징 실시간으로 수리 이벤트의 수, 응용 프로그램 단백질 GFP 같이 fluorophore 태그로 될 요구에 의해 방해 된다. 이러한 유전자 조작 단백질의 기능을 변경할 수 있으며 추가 기술 장벽을 나타냅니다.
ImageJ 소프트웨어 이미지 분석 마스터 하는 성가신 될 수 있습니다. 다른 그룹에 대 한이 장애물을 제거 하는 희망 수리 초점 인식 하 고이 소프트웨어를 사용 하 여 정량화에 대 한 단계별 지침은 제공 됩니다. 이 강력한 소프트웨어의 증가 활용으로 이어질 수 있고 연방 보조금 지원의 풀 축소의 한 번에 더 비싼 프로그램의 비용을 제거.
원칙적으로, 이러한 DSBs 기간 면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 애매 수리 단백질의 시각화를 사용 해야 합니다. 충분 한 농도 감지를, 예를 들어, 큰에 나-SceI 유도 DSB 결과의 지 속성 높은 축적 하지 않는다 때문에 보기 어려운 단백질에 대 한 케이스 수에 수리 단백질의 전형적인 축적 보다 병 변입니다. 향상 된 풍부한 수 향상 시각화 탐지 항 체 품질; 제한에 의해 방해 하는 경우 덜 공부 단백질 DNA에 영향을 미치고로 식별 됩니다 때 특히 유용할 수 있는 기능을 복구. 날짜 하려면,이 이렇게 확인 되었습니다 4에 대 한 DNA 단백질, 즉 RAD51, RPA70, BRCA1 및 BRCA2 복구 (데이터 표시 되지, 그림 2및 참조17)
마지막으로,이 프로토콜에 셀룰러 환경 뿐만 아니라 심문 수 있는 DNA 손상의 형식을 확장을 만들 수 있는 수정이 있다. 가장 확실 한 수정 소스 또는 유도 DNA 손상의 종류 변경 될 것 이다. UVB, 전리 방사선, 또는 radiomimetics (phleomycin, bleomycin와 etoposide) DNA 수리의 활동 공부를 사용 하 여에 대 한 원리의 증명은 이미 게시18,19,,2324 , 25. 약간의 수정이 접근 수 있습니다 또한 명료 수리 단백질 응답 NHEJ DSBs. 또는, Britton 외. 사용된26수 사전 추출 기법을 설명 합니다. 또한, 거기는 귀환 nicking 광범위 한 인식 사이트, 유사-SceI27endonucleases (-HmuI 또는 BasI). SceI에서 그들을 구별,이 효소는 단일 가닥 DNA 틈 (SSBs) 발생. 이 효소는 셀 라인으로 오랫동안 DSBs. 특히, 질문에 대 한이 원고에 설명 된 프로토콜을 평행선 SSB 수리의 분석 수에 대 한 인식 사이트 소개-SceI 인식 통합의 과정 사이트 및 사이트의 소개를 확인은 힘 드는 수 있습니다. 다행히도 게놈 편집 기술 (예: CRISPER/Cas9 시스템)에 발전이 부담28완화 했습니다. 또한 원하는 genomic 위치를 제안 하는 미래에, 이러한 공학 발전에 잘라 엔지니어링 귀환 endonucleases에 성공 활성 연구 분야와 CRISPR/Cas9를 사용 하 여가 복제 단계 수를 끌 수 있습니다. 불가결28,29
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 조 엘 Sanneman와 박사 Philine Wangemann에 의해 캔자스 주립 대학 대학의 수의학,이 기술을 개발 하기 위해 노력에의 그들의 지원에 대 한 자금 Confocal 현미경 코어의 감사 합니다. pCBASceI 마리아 Jasin (Addgene 플라스 미드 # 26477)에서 선물 했다 30. U2OS 박사-GFP 셀 마리아 Jasin18종류 선물 했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mm Coverslips | VWR | 89015-725 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| 24-well plate | VWR | 82050-892 | |
| 96-well glass bottom plate | Cellvis | P96-1.5H-N | |
| Anti-H2AX Alexa488 | EMD Millipore | 05-636-AF488 | |
| Anti-Rad51 (D4B10) | Cell Signaling Technology | 8875S | |
| Bio-formats plugin for ImageJ | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher Scientific | 12100046 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 89510-194 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG Alexa594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | |
| Hydrogen Peroxide | sigma-Aldrich | 216763-100ML | |
| ImageJ Software | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| I-SceI Expression Vector | Addgene | 26477 | |
| Nail Polish- Insta Dri | Sally and Hansen | Clearly Quick (103) | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Bio Basic | PD8117 | |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049-500ML | |
| TurboFect Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | R0531 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 |
References
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