Summary
Reparasjon av dobbel-strand DNA bryter er en dynamisk prosess, krever ikke bare dannelsen av reparasjon komplekser pauser, men også deres oppløsning etter lesjonen er adressert. Her, bruker vi immunofluorescence mikroskopi forbigående og langvarig double-strandet pausene som et verktøy for å analysere denne genomet vedlikehold mekanismen.
Abstract
Reparasjon av double-strandet bryter (DSBs) i DNA er en svært koordinert prosess, nødvendiggjør dannelse og oppløsning av flere protein reparasjon komplekser. Denne prosessen er regulert av en myriade av proteiner som fremmer foreningen og tilknytningene til proteiner til disse lesjoner. Takk inne stor del å utføre funksjonelle skjermer av et stort bibliotek med proteiner, det er en større forståelse av genene nødvendig for dobbel-strand DNA pause reparasjon. Ofte knockout eller kjemiske hemmer skjermer identifisere proteiner involvert i reparasjon prosesser ved hjelp av økt toksisitet som en markør for et protein som er nødvendig for DSB reparasjon. Men nyttig for identifisere romanen mobilnettet proteiner involvert i vedlikehold genomet gjengivelse, krever funksjonsanalyse fastsettelse av om protein rundt fremmer lokalisering, formasjon eller oppløsning av reparasjon komplekser.
Akkumulering av reparasjon proteiner kan lett oppdaget som tydelig kjernefysiske foci av immunofluorescence mikroskopi. Dermed kan association og tilknytningene til disse proteinene på steder av DNA skade nås ved å observere disse kjernefysiske foci representant mellomrom etter induksjon av dobbel-strand DNA bryter. Denne tilnærmingen kan også identifisere mis lokaliserte reparasjon faktor proteiner, hvis reparer feil ikke forekommer samtidig med ufullstendig forsinkelser i reparasjon. I dette scenariet, kan lang-varer dobbel-strand DNA bryter bli konstruert ved å uttrykke en sjelden kutte endonuclease (f.eks, SceI) i celler der webområdet anerkjennelse for sa enzymet er blitt integrert i mobilnettet genomet. Den resulterende lesjonen er spesielt vanskelig å løse som trofast reparasjon vil gjeninnføre enzymets anerkjennelse webområdet, å spørre en annen runde cleavage. Som et resultat, elimineres forskjeller i the kinetics av reparasjon. Hvis reparer komplekser ikke er dannet, har lokalisering blitt hindret. Denne protokollen beskriver metodene må identifisere endringer i reparasjon kinetics samt reparasjon protein lokalisering.
Introduction
Hver dag, hver eneste celle i kroppen er bombardert med en anslagsvis 10.000 DNA lesjoner1. Denne eksistensiell trussel setter oss i fare for mutasjoner, oncogenesis samt celle død. For å beskytte genomet gjengivelse, pattedyrceller utviklet seg for å svare på DNA skade med en kompleks serie av protein foreninger og modifikasjoner. Dette svaret er organisert i flere veier, kollektivt kjent som DNA skade svar (DDR)2,3. DDR består av akkumulering av DNA reparasjon proteiner på DNA lesjoner, koordinert både timelig og romlig. DDR induserer ofte celle syklus arrestasjon å unngå overføring eller intensivering av skader som kan oppstå under replikering av skadet DNA2,4,5. Igjen, er det også nødvendig for mobilnettet levedyktigheten til deaktivere celle syklus arrestasjon ved å oppheve tilknytning av reparasjon komplekser etter reparasjon er fullført.
Blant de ulike typene DNA skade er DSBs den mest skadelige. Unnlatelse av å reparere DSBs kan medføre kromosom rearrangements eller store slettinger slik som tap av hele kromosom våpen. Reparasjon av DSBs er delt i to veier6,7,8. Homologe rekombinasjon (HR) krever en søster kromosom bruke som DNA mal og dermed er begrenset til sene S og G2/M faser av cellen syklus9,10. Non-homologe slutten med (NHEJ) har ikke disse restriksjonene, men kan forårsake små slettinger når du reparerer DSBs11,12.
DSB reparere spesielt og DDR er generelt aktive områder for undersøkelse. Til tross for organisert i beleilig atskilt veier, er det mye redundans. Faktisk er mange proteiner (BRCA1, BRCA2 og RPA komplekse for eksempel) involvert i flere veier13,14,15,16. Reparasjon av en leksjonen av en sti, kan føre til en skade mellomliggende som må repareres av en annen sti14. Intertwining av disse veiene, kombinert med deres komplekse oppgaven med å rekruttere høyre proteiner til riktig sted for den nøyaktige mengden tid nødvendig krever en fleretasjes regulatoriske prosessen.
En fersk rapport Høydepunkter vanskelighetene med DDR ved å demonstrere at reparasjon komplekse formasjon, oppløsning og lokalisering hver separat kan nedsatt17. Det overordnede målet med følgende protokollen er å dissekere definitivt evne til celler å reparere DSB. Bruker immunofluorescence mikroskopi, kan akkumulering av reparasjon proteiner ved skade visualiseres på representant tid points etter induksjon av DSBs.
Denne teknikken har flere fordeler til brukte tilnærminger. Ofte er reparasjon undersøkt på ett tidspunkt og stand til dynamisk prosess av forsamlingen og av reparasjon komplekser. Observere hele spekteret av reparasjon av første aktivering i full oppløsning sikrer at en forsinkelse i reparasjon ikke er feilidentifisert som fullstendig hemming. Omvendt, sikrer at induksjon av en reparasjon svar som ikke kan deaktivere sa svar ikke er feilidentifisert som normal eller overdreven aktivering.
Forsinket protein kompleks dannelse og MIS-lokalisering av reparasjon proteiner, men kan ikke entydig skilles med denne tilnærmingen. For å avgjøre hvis reparasjon proteiner er mis lokaliserte versus forsinket i deres lokalisering, kan et "langvarig" DSB bli introdusert gjennom enzymatisk spalting av mobilnettet DNA. Den resulterende lesjonen er snitte hver gang det er reparert, noe som resulterer i forskjellige store kjernefysiske reparasjon fokus og fjerne timelige begrensning fra rekruttering. Dette kan oppnås ved å endre den eksisterende tilnærmingen med bruk av en sjelden kutte endonuclease (f.eks, SceI) å indusere en langvarig DSB. Levetiden til DSBs muliggjør visualisering av unnvikende reparasjon proteiner ved immunofluorescence mikroskopi. Forbedret overflod kan også forbedre effekten når gjenkjenning hindret av begrensning i antistoff kvaliteten, en funksjon som kan være nyttig når mindre studert proteiner er identifisert som har innvirkning på DNA-reparasjon.
Spesielt gi vi klare instrukser for en gratis bilde behandling og analyse programvare (f.eksImageJ). Dette fjerner en stor økonomisk barriere i bildeanalyse, åpne avhør av DNA skade reparasjon for et bredere publikum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Vær oppmerksom på at denne protokollen er skrevet for U2OS celler med en-SceI anerkjennelse området18. Cellene trenger ikke være U2OS men må inneholde-SceI området. Protokollen må være justert (f.eksantall celler seeded og inkubasjon ganger) avhengig av celler som brukes.
1. definere Kinetics DSB reparasjon komplekse formasjonen
- Vokse U20S-DRGFP celler i en 10 cm vev kultur plate til 85-90% confluent.
- Fjern media og ruge ved romtemperatur (RT) i 3 mL av EDTA i 2 minutter.
- Erstatt EDTA med 1 mL av trypsin og ruge ved 37 ° C i 5 min. Kontroller at cellene er løsrevet fra overflaten av platen ved å vise under et mikroskop. Nøytralisere trypsin med 5 mL av Dulbeccos endret Eagle Medium (DMEM) med 10% fosterets bovin serum (FBS) og 1% penicillin/streptomycin.
- Bestemme konsentrasjonen av celler i denne hjuloppheng med en hemocytometer og trypan blå utelukkelse metoden.
- Frø 6 x 103 celler/godt i 200 µL av et glass-bottom 96-brønns plate. Alternativt frø 4 x 106 celler i 8 mL på 12 mm coverslips plassert i en 10 cm plate.
Merk: Hver godt eller dekkglassvæske representerer et enkelt punkt, inkludert kontrollen. - Vokse cellene overnatting på 37 ° C og 5% CO2.
- Inducing DSBs
- Erstatte media fra 96-brønns plate/10 cm parabolen med H2O2 utvannet til en konsentrasjon av 25 µM med DMEM + 10% FBS og Inkuber ved 37 ° C i 1 time.
- Vask cellene 3 x 1 x PBS og erstatte med fersk DMEM supplert med 10% FBS og 1% penicillin/streptomycin. Inkuber cellene på 37 ° C for 0, 1, 4, 8, 24 og 48 h. Kontroller at fersk fortynninger av H2O2 brukes for hvert eksperiment.
Merk: For å unngå å drepe celler på H2O2 konsentrasjonen her, kontroller at dosen av skader er lav nok slik at mesteparten av celler vil unngå apoptose og senescence. Det er viktig å observere gjenopprettingsprosessen. Dette er best oppnås ved å måle følsomhet for doser. Utføre en MTT-analysen eller andre cellen levedyktighet analysen å bestemme minimal konsentrasjonen av hydrogen peroxide som kan brukes.
- Feste og permeabilizing celler
- Vask cellene 3 ganger med 1 x PBS. Fjerne en dekkglassvæske fra 10 cm plate for hver tidspunkt og sted den inne en enkelt brønn av en 24-vel plate for å fikse. Bruk p og tang nøye fjerne dekkglassvæske og unngå riper celler av dekkglassvæske overflaten.
- Fastsette cellene av rugende i 15 min med 4% paraformaldehyde (PFA) på angitt ganger etter 1t H2O2 og frisk DMEM utskifting (0, 1, 4, 8, 24 og 48 h).
- Vask det faste coverslips 3 ganger med PBS. Permeabilize cellene med 0,5% ikke-ioniske vaskemiddel fortynnet i 1 x PBS. Inkuber i 15 min på RT, før vask 3 x med PBS.
Merk: Etter permeabilization, lagring av coverslips er mulig i PBS på 4 ° C i minst en uke.
- Reparere komplekse visualisering
- Blokkere 96-brønns plate/coverslips i 3% bovin serum albumin (BSA) og 0,1% ikke-ioniske vaskemiddel fortynnet i 1 x PBS (3% BSA løsning) 1t på RT.
- Inkuber med primære antistoffer som målretter reparasjon protein av interesse, fortynnet i henhold til produsentens spesifikasjoner i 3% BSA løsning 1 h på RT, før vask 3 ganger med 1 x PBS.
- Inkuber 96-brønns plate/coverslips med sekundær antistoff fortynnet i henhold til produsentens protokollen i 3% BSA løsning. Bekreft at de sekundære fluorophores ikke har overlappende eksitasjon eller utslipp spectra.
- Etter vask cellene med PBS 3 ganger legger DAPI, fortynnet i henhold til produsentens spesifikasjoner i 1 x PBS og ruge på RT i 5 min.
- Montere coverslips på lysbilder med et fall montering agent, gjør at celle-side ansikter ned. Trykk på coverslips nøye og suge opp noen overflødig montering agent med en tørke.
- Seal coverslips med hurtigtørkende gjennomsiktig neglelakk og sikre et komplett kvalitetsstempel dekkglassvæske lysbilde.
- Ta AC confocal mikroskop-bildene ved å fokusere på DAPI kanalen, før andre kanaler (med signaler fra DNA reparasjon genet av interesse) for å unngå presenterer skjevheter i eksperimentet.
- Alternativt kan bilder skaffes ved å ta Z-deler av ønsket område og kondenserende bildet til et enkelt fly å visualisere alle detectable foci.
Merk: Hvis DSB oppløsning eller protein av interesse ikke er observert på tidspunkt valgt, bestemmer når DSBs løse ved å velge en rekke tidspunkt først (0 – 48 h etter DSB induksjon). Tid interessepunkter vil variere etter metoden for DSB induksjon og reparasjon protein av interesse.
- Bruk gratisprogrammet ImageJ for å definere kjerner i immunofluorescence mikroskopi bilder.
Merk: For å åpne mikroskop bilder, Bio-formater plugin må være installert i ImageJ.- Åpne AC confocal (.czi eller TIF) ved å dra bildefilen til vinduet ImageJ eller velge "Bio-formater importør" fra "Plugin" verktøylinjen i ImageJ.
Merk: Vinduet "Bio-formater Import alternativet" vises. - Velg «Del opp kanaler"dele bildet inn i grunnleggende DAPI og fluorescerende bilder i vinduet"Bio-formater Import alternativet".
- Velg "Colorized" i "Alternativer" fra det miste-ned menyen. Velg "OK" for å åpne DAPI og Histone H2AX (H2AX) bilder som skiller windows og velg DAPI bildet.
- Velg "bildeverktøylinjen" og "Justere terskelen" valgmuligheten å velge kjerner.
Merk: En "Terskelen"-vinduet vises. - Justere bildet terskelen ved å skyve den nederste linjen i vinduet "Terskelen" helt til høyre. Juster den øverste linjen til kjerner vises helt rød med forskjellige disposisjoner og svart bakgrunn. IKKE Velg Bruk. Lukk vinduet "Justere terskelen".
- Velg "Analysere" verktøylinjen og "Analysere partikler" alternativet. Se en "Analysere partikler" vindu vises på skjermen.
- Angi den minste størrelsen på en kjerne.
Merk: Partikler under størrelsen angitt vil ikke telles som kjerner. - Fra rullegardinmenyen "Show", velg "Omriss". Velg "Legg til Manager". Klikk "OK" for å åpne en "Avkastningen Manager"-vinduet.
Merk: Konturene av kjerner vises i et eget vindu. - Tilordne numre til kjerner som kan velges fra vinduet "Avkastningen Manager".
- Åpne AC confocal (.czi eller TIF) ved å dra bildefilen til vinduet ImageJ eller velge "Bio-formater importør" fra "Plugin" verktøylinjen i ImageJ.
- Bruk ImageJ for å kvantifisere H2AX foci immunofluorescence mikroskopi bilder.
- Merk av "H2AX" foci vindu (farget med fluorescently konjugert sekundære antistoff). Deretter merker verktøylinjen "Prosess" og velge "Finn Maxima" å finne på bildet i kjerner.
Merk: En "Finn Maxima" vindu åpnes. - Velge alternativet "Ett poeng" fra rullegardinmenyen "Utdatatype" og velg "Forhåndsvisning valg av punkt" visualisere maxima/fokuspunktene. Angi en "støy" toleranseverdi avhengig av fluorescens intensiteten av bildet (figur 1). Kontrollere utseendet på et hvitt vindu med små svarte prikker.
Merk: Disse prikkene representerer H2AX foci/maxima som ble funnet. Verdien for toleranse støy må opprettholdes konstant for alle bildene blir analysert. En lav/høy støy toleranse vil skildre for mange/få maxima (fokus) i kjernen og kan ikke en nøyaktig gjengivelse av fokus i kjernen. - Velg kjerner som må H2AX foci kvantifiseres fra vinduet "Avkastningen Manager". Velg alle kjerner ved å merke alternativet "Vis alle".
- Velg "Tiltak" for å måle antall maxima/foci innenfor valgte kjerner.
Merk: Antall maxima/foci vises som multiplum av 255, i.e., en maksimal har en "RawIntDen" (integrert tetthet) lesning av 255. - Kopierer verdiene som "RawIntDen" og lime dem inn i programvaren for dataanalyse.
- Merk av "H2AX" foci vindu (farget med fluorescently konjugert sekundære antistoff). Deretter merker verktøylinjen "Prosess" og velge "Finn Maxima" å finne på bildet i kjerner.
2. analysering lokaliseringen å en lang-varer dobbel-strand DNA pause
- Frø celler i 96-brønnen plater/coverslips som beskrevet i avsnitt 1.1 og 1.2.
-
Induksjon av dobbel-strand DNA bryter
- Transfect celler med jeg-SceI uttrykk vektoren bruker en lipid-baserte transfection reagens i henhold til produsentens spesifikasjoner. Vente 24-72 h etter hva å maksimere endonuclease uttrykket. Bestemme om hva var vellykket ved å finne celler med entall store kjernefysiske γ-H2AX fokus.
-
Oppkjøpet av bilder
- Fastsette, permeabilize, blokkere og vaske 96-brønns plate/coverslips som beskrevet i delen 1.8.
- Co ruge celler med et antistoff mot γ-H2AX og reparasjon protein av interesse (her en primær antistoff mot RAD51 ble brukt) fortynnet i henhold til produsentens spesifikasjoner i 3% BSA løsning.
- Vask 96-brønns plate/coverslips 3 ganger med 1 x PBS. Inkuber 96-brønns plate/coverslips med sekundær antistoff fortynnet i henhold til produsentens protokollen i 3% BSA løsning. Bekreft at de sekundære fluorophores ikke har overlappende eksitasjon eller utslipp spectra.
- Identifisere celler som har store kjernefysiske γ-H2AX fokus. Ta bilder av disse cellene å unngå bias.
-
Analyse av langvarig jeg-SceI indusert foci
- Analysere langvarig fokuspunktene manuelt, ved å telle både antall celler som har store γ-H2AX foci og samlokalisert foci av reparasjon protein av interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser valg av riktig diskriminering for maxima/foci kvantifisering bruker ImageJ. Flettede bilder av DAPI og reparasjon protein av interesse er på venstre side. Figur 1A viser en støy diskriminering av 90 og markerer riktig antall foci. Kjerner på kanten (avbildet med en rosa pilen) og foci utenfor kjerner (avbildet med en gul pil) telles ikke under kvantifiseringen. Figur 1B viser en lav støy toleranse på 50. Mange maxima identifiseres utenfor kjernen og kjernen. Figur 1 c viser en høy støy toleranse 220. Bare en enkelt fokus (en hvit pil) ble oppdaget. For å gi leseren en følelse av "positiv" og "negative" resultater, har vi også samlet representant resultater i figur 2. Spesielt viser figur 2A co lokalisering mellom γ-H2AX fokus (grønn) og en reparasjon protein av interesse (rød). Tilsvarende en untransfected celle vises øverst til venstre i panelet og en celle med en ikke-kjernefysisk (USANN) γ-H2AX fokus vises øverst til høyre. Vennligst merk mikronuklei knytte DNA skade maskiner er en sannsynlig kilde til disse ikke-nukleære foci19. Figur 2B gir en høyere forstørrelse av de to høyre cellene fra figur 2A å bringe klarhet i hvordan de var fast bestemt på å være interiør og eksteriør til kjernen, henholdsvis. Et eksempel på en kjernefysisk γ-H2AX fokus uten co lokalisering av en reparasjon protein er vist i figur 2C. En skjematisk av denne protokollen tilbys i Figur 3 som oppsummerer denne tilnærmingen å karakterisere DNA-reparasjon.
Figur 1 : Representant analyse av dobbel-strand DNA pause reparasjon kinetics. Representant bilder av γ-H2AX foci kvantifisering bruker ImageJ (med Bio-formater plugin) programvare. Venstre panelene er sammensatte bilder av kjerner (40 X forstørrelse), farget blå for DAPI og grønn for γ-H2AX. Center paneler Vis referanse un analysert kjerner med γ-H2AX foci/maxima. (A) på høyre side viser maxima/foci oppdagelsen med en støy toleranse 90 og er representant for faktiske estimering av antallet foci i kjernen. (B) retten panelet viser maxima kvantifisering med en lav støy toleranse (50). Maxima/foci kan oppdages utenfor kjernen (gul pil), mens flertallet av maxima ligger kjernen er ikke-spesifikke bakgrunnen signaler. (C) høyre panelet viser maxima kvantifisering med høy støy toleranse (220). Bare en enkelt maksimum/fokus (hvit pil) oppdages i kjernen og er ikke representative for fokuspunktene i kjernen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Representant jeg-SceI indusert dobbel-strand DNA bryter. Representant bilder av kjerner fra celler dyrket på coverslips (40 X forstørrelse). Kjerner er farget blå. En reparasjon protein (RAD51) er farget rødt og γ-H2AX er farget grønn. (A) tre paneler Vis de samme tre celler. Venstre mest panel, kjerner er synlige. I midtre panelet vises flekker for RAD51. I den høyre ruten vises γ-H2AX flekker. Kjernen i øvre høyre hjørne viser ikke noe tegn til SceI indusert DSBs. Kjernen i midten (rosa pilen) representerer en sann positiv hendelse som har både store γ-H2AX kjernefysiske fokus og samlokalisert RAD51 kjernefysiske fokus. Kjernen på høyre side har en falsk store γ-H2AX fokus som det er extranuclear. Foci utenfor kjernen bør ikke brukes for co lokalisering analyse. (B) Dette er en høyere forstørrelsen av det sammenslåtte bildet i del A (senter og høyre de fleste celler). Store kjernefysiske gul fokus indikerer overlapping av RAD51 og H2AX signal er merket med rosa pilen. (C) en representativt bilde av kjernefysiske γ-H2AX fokus uten co farging av DNA reparasjon protein av interesse. I motsetning til fokus merket med en hvit pil i (A) og (B), viser den gule pilen typiske resultater når reparasjon proteiner hindres lokalisere områder av skade. Skala bar = 15 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Visuell fremstilling av protokollen for å analysere dobbel-strand DNA pause reparasjon. (1) representasjon av protokollen trinnene 1.1 for såing celler til coverslips/glass bunnplater. (2) illustrasjon av induksjon av dobbel-strand bryter av behandling med hydrogen peroxide (høyre) eller inducing lang-varer dobbel-strand bryter av transfecting 3 µg av SceI. (3) representasjon av protokollen trinnene 1.4 til 1.5.3 for visualisering av dobbel-strand bryter. (4a) bildet representerer AC confocal mikroskopi cellen farget med DAPI (blå) og γ-H2AX foci (grønn). (4b) bilde av entall store γ-H2AX foci (grønn) igjen kjerner flekken DAPI (blå). (5a) skildring av analyse av γ-H2AX foci bruker ImageJ (protokollen trinn 1.10.1–1.11.5). (5b) skildring av manuell antall store langvarig γ-H2AX foci (protokollen trinn 2.4). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Analyse av DNA skade reparasjon generelt og reparasjon av double-strandet DNA bryter er spesielt et aktivt område av forskning fordi dens konsekvenser span tumorigenesis til grunnleggende biologi6,20. Dette manuskriptet detaljer en tilnærming som nøyaktig dissekerer bidrag av RAD51 og den ble-H2AX proteiner til løsning av DSBs gjennom HR. gleder, denne metoden kan brukes til å belyse tilleggsfunksjoner reparasjon proteiner DSBs14. Sammenligning av reparasjon kinetics og rekruttering av reparasjon maskiner til jeg-SceI indusert DSBs mellom kontroll celler og celler med protein rundt slått ut, vil definere bidrag som protein til rekruttering, lokalisering, og oppløsning reparasjon faktorer til DSBs.
Visualisere reparasjon kinetics har flere fordeler sammenlignet med vanlige tilnærminger. Ofte er reparasjon undersøkt på ett tidspunkt, som er i stand til dynamisk prosess av forsamlingen og av reparasjon komplekser. Observere hele spekteret av reparasjon fra første aktivering full oppløsning sikrer at en forsinkelse i reparasjon ikke er feilidentifisert som fullstendig hemming. Omvendt, sikrer at induksjon av en reparasjon svar uten mulighet for å deaktivere at svaret ikke er feilidentifisert som normal eller overdreven aktivering. Dette er hovedsakelig endringer i anvendelsen av etablerte tilnærming, men bruk av en sjelden kutte endonuclease å indusere en langvarig DSB er en roman verktøyet. Den lar etterforskeren å entydig bestemme om lokalisering av en reparasjon protein er hemmet i stedet for sin rekruttering er forsinket en kort periode utover avslutningen av eksperimentet. SceI indusert DSB kan vare i dager og teoretisk som enzymet uttrykkes (bør cellen være levedyktig). The kinetics av DSB reparasjon kan også observeres via levende celle bildebehandling. Men selv om levende celle imaging oppdages reparasjonshendelser i sanntid, anvendelsen er hindret av kravet om at proteiner være merket med et fluorophore som GFP. Slike genetisk manipulasjon kan endre protein funksjon og representerer en ytterligere tekniske barriere.
Bildeanalyse via ImageJ programvare kan være tungvint å mestre. Det trinnvise instruksjon for reparasjon fokus anerkjennelse og kvantifisering bruk av denne programvaren er gitt i håp om å fjerne denne hinder for andre grupper. Dette kan føre til økt utnyttelse av kraftig programvare og eliminere kostnaden for dyrere programmer samtidig av krymping av føderale gi støtte.
I prinsippet bør varigheten av disse DSBs aktivere visualisering av unnvikende reparasjon proteiner ved immunofluorescence mikroskopi. Dette kan være tilfelle for proteiner som er vanskelig å vise fordi de ikke akkumuleres i høy nok konsentrasjon å bli oppdaget, f.eks, for jeg-SceI indusert DSB resultatene i større enn typiske opphopning av reparasjon proteiner på lesjonen. Forbedret overflod kunne også forbedre effekten når gjenkjenning er hindret av en begrensning i antistoff kvalitet; en funksjon som kan være spesielt nyttig når mindre studert proteiner er identifisert som har betydning for DNA reparasjon. Hittil har denne tilnærmingen er verifisert 4 DNA-reparasjon proteiner, nemlig RAD51, RPA70, BRCA1 og BRCA2 (data ikke vist, figur 2og referanse17)
Endelig er det endringer som kan gjøres til denne protokollen å utvide typene DNA skade som kan bli avhørt og mobilnettet miljøer. Den mest åpenbare endringen ville være endre kilden eller type indusert DNA skade. Beviset på prinsippet for med UVB, ioniserende stråling eller radiomimetics (phleomycin, bleomycin og etoposide) å studere the kinetics av DNA-reparasjon er allerede publisert18,19,23,24 , 25. med liten endring, denne tilnærmingen kan også belyse reparasjon protein svar fra NHEJ til DSBs eventuelt Britton et al. Beskriv en pre utvinning teknikk som kunne brukes26. Videre er det homing skår endonucleases (-HmuI eller BasI) som har stor anerkjennelse webområder, lik-SceI27. Skille dem fra SceI, føre disse enzymene singel-strand DNA bryter (SSBs). Innføre webområdet anerkjennelse for disse enzymene i en celle linje ville tillate analyse av SSB reparasjon som paralleller protokollen beskrevet i dette manuskriptet for avhør langvarig DSBs. spesielt, prosessen med å integrere-SceI anerkjennelse nettstedet og bekrefte innføring av nettstedet kan være arbeidskrevende. Heldigvis har fremskritt i genomet redigering teknologi (for eksempel SKARPERE/Cas9 systemer) lettet denne byrden28. Det er også et felt på aktiv forskning som har lykkes i engineering homing endonucleases å kutte på en ønsket genomisk plassering, som tyder på at i fremtiden, disse tekniske fremskritt og bruk av CRISPR/Cas9 kan føre dette kloning trinnet skal unnværlig28,29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Joel Sanneman og Dr. Philine Wangemann av AC Confocal mikroskopi kjernen, finansiert av den Kansas State University universitet av Veterinary medisin, for deres støtte til innsatsen for å utvikle denne teknikken. pCBASceI var en gave fra Maria Jasin (Addgene plasmider # 26477) 30. U2OS DR-GFP celler var en slags gave Maria Jasin18.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mm Coverslips | VWR | 89015-725 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| 24-well plate | VWR | 82050-892 | |
| 96-well glass bottom plate | Cellvis | P96-1.5H-N | |
| Anti-H2AX Alexa488 | EMD Millipore | 05-636-AF488 | |
| Anti-Rad51 (D4B10) | Cell Signaling Technology | 8875S | |
| Bio-formats plugin for ImageJ | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher Scientific | 12100046 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 89510-194 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG Alexa594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | |
| Hydrogen Peroxide | sigma-Aldrich | 216763-100ML | |
| ImageJ Software | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| I-SceI Expression Vector | Addgene | 26477 | |
| Nail Polish- Insta Dri | Sally and Hansen | Clearly Quick (103) | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Bio Basic | PD8117 | |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049-500ML | |
| TurboFect Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | R0531 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 |
References
- Lindahl, T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).
- Branzei, D., Foiani, M. Regulation of DNA repair throughout the cell cycle. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 297-308 (2008).
- Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Mol Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
- Auclair, Y., Rouget, R., Drobetsky, E. A. ATR kinase as master regulator of nucleotide excision repair during S phase of the cell cycle. Cell Cycle. 8 (12), 1865-1871 (2009).
- Awasthi, P., Foiani, M., Kumar, A. ATM and ATR signaling at a glance. J Cell Sci. 128 (23), 4255-4262 (2015).
- Ceccaldi, R., Rondinelli, B., D'Andrea, A. D. Repair Pathway Choices and Consequences at the Double-Strand Break. Trends Cell Biol. 26 (1), 52-64 (2016).
- Chapman, J. R., Taylor, M. R. G., Boulton, S. J. Playing the End Game: DNA Double-Strand Break Repair Pathway Choice. Mol Cell. 47 (4), 497-510 (2012).
- Daley, J. M., Sung, P. 53BP1, BRCA1, and the Choice between Recombination and End Joining at DNA Double-Strand Breaks. Mol Cell Biol. 34 (8), 1380-1388 (2014).
- Hartlerode, A., Odate, S., Shim, I., Brown, J., Scully, R. Cell Cycle-Dependent Induction of Homologous Recombination by a Tightly Regulated I-SceI Fusion Protein. PLOS ONE. 6 (3), e16501 (2011).
- Brandsma, I., Gent, D. C. Pathway choice in DNA double strand break repair: observations of a balancing act. Genome Integr. 3, 9 (2012).
- Davis, A. J., Chen, D. J. DNA double strand break repair via non-homologous end-joining. Transl Cancer Res. 2 (3), 130-143 (2013).
- Reid, D. A., et al. Organization and dynamics of the nonhomologous end-joining machinery during DNA double-strand break repair. Proc Natl Acad Sci. 112 (20), E2575-E2584 (2015).
- Chen, J. J., Silver, D., Cantor, S., Livingston, D. M., Scully, R. BRCA1, BRCA2, and Rad51 Operate in a Common DNA Damage Response Pathway. Cancer Res. 59 (7 Supplement), 1752s-1756s (1999).
- D'Andrea, A. D. BRCA1: A Missing Link in the Fanconi Anemia/BRCA Pathway. Cancer Discov. 3 (4), 376-378 (2013).
- Gudmundsdottir, K., Ashworth, A. The roles of BRCA1 and BRCA2 and associated proteins in the maintenance of genomic stability. Oncogene. 25 (43), 5864-5874 (2006).
- Liu, S., et al. Distinct roles for DNA-PK, ATM and ATR in RPA phosphorylation and checkpoint activation in response to replication stress. Nucleic Acids Res. 40 (21), 10780-10794 (2012).
- Wallace, N. A., Khanal, S., Robinson, K. L., Wendel, S. O., Messer, J. J., Galloway, D. A. High Risk Alpha Papillomavirus Oncogenes Impair the Homologous Recombination Pathway. J Virol. , (2017).
- Pierce, A. J., Johnson, R. D., Thompson, L. H., Jasin, M. XRCC3 promotes homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells. Genes Dev. 13 (20), 2633-2638 (1999).
- Luzhna, L., Kathiria, P., Kovalchuk, O. Micronuclei in genotoxicity assessment: from genetics to epigenetics and beyond. Front Genet. 4, (2013).
- Jasin, M. Homologous repair of DNA damage and tumorigenesis: the BRCA connection. Oncogene. 21 (58), 8981-8993 (2002).
- Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. β-HPV 5 and 8 E6 Disrupt Homology Dependent Double Strand Break Repair by Attenuating BRCA1 and BRCA2 Expression and Foci Formation. PLOS Pathog. 11 (3), e1004687 (2015).
- Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. HPV 5 and 8 E6 Abrogate ATR Activity Resulting in Increased Persistence of UVB Induced DNA Damage. PLoS Pathog. 8 (7), (2012).
- Mah, L. J., Vasireddy, R. S., Tang, M. M., Georgiadis, G. T., El-Osta, A., Karagiannis, T. C. Quantification of γH2AX Foci in Response to Ionising Radiation. J Vis Exp. (38), e1957 (2010).
- Popp, H. D., Brendel, S., Hofmann, W. K., Fabarius, A. Immunofluorescence Microscopy of γH2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks. J Vis Exp. (129), e56617 (2017).
- Burma, S., Chen, B. P., Murphy, M., Kurimasa, A., Chen, D. J. ATM Phosphorylates Histone H2AX in Response to DNA Double-strand Breaks. J Biol Chem. 276 (45), 42462-42467 (2001).
- Britton, S., Coates, J., Jackson, S. P. A new method for high-resolution imaging of Ku foci to decipher mechanisms of DNA double-strand break repair. J Cell Biol. 202 (3), 579-595 (2013).
- Landthaler, M., Shen, B. W., Stoddard, B. L., Shub, D. A. I-BasI and I-HmuI: two phage intron-encoded endonucleases with homologous DNA recognition sequences but distinct DNA specificities. J Mol Biol. 358 (4), 1137-1151 (2006).
- Lackner, D. H., et al. A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging. Nat Commun. 6, 10237 (2015).
- Chan, S. H., Stoddard, B. L., Xu, S. Y. Natural and engineered nicking endonucleases--from cleavage mechanism to engineering of strand-specificity. Nucleic Acids Res. 39 (1), 1-18 (2011).
