Summary
Reparation av dubbel-strand DNA raster är en dynamisk process som kräver inte bara bildandet av reparation komplex på rasterna, men också deras upplösning efter lesionen är riktat. Här, använder vi immunofluorescens mikroskopi för övergående och långvarig dubbelsträngat pauser som ett verktyg för att dissekera denna genomet underhåll mekanism.
Abstract
Reparation av dubbelsträngat raster (DSBs) i DNA är en starkt samordnad process, vilket nödvändiggör den bildande och upplösning av flera protein reparation komplex. Denna process regleras av en myriad av proteiner som främjar föreningen och disassociation av proteiner till dessa lesioner. Tack till stor del på förmågan att utföra funktionella skärmar av ett stort bibliotek med proteiner, det finns en större uppskattning av generna som behövs för dubbel-strand DNA paus reparation. Ofta knockout eller kemiska hämmare skärmar identifiera proteiner involverade i reparationsprocesser med ökad toxicitet som markör för ett protein som krävs för DSB reparation. Även användbar för identifierande roman cellulära proteiner involverade i att bibehålla genomet trohet, kräver funktionell analys vid fastställandet av huruvida proteinet av intresse främjar lokalisering, bildande eller upplösning av reparation komplex.
Ansamling av reparation proteiner kan upptäckas lätt som distinkta nukleära foci av immunofluorescens mikroskopi. Således, association och disassociation av dessa proteiner på platser i DNA-skador kan nås genom att observera dessa kärnvapen foci representativa mellanrum efter induktion av dubbel-strand DNA raster. Detta synsätt kan också identifiera mis lokaliserade reparation faktor proteiner, om reparera defekter inte förekommer samtidigt med ofullständig förseningar i reparation. I det här fallet kan långvarig dubbel-strand DNA raster vara konstruerad genom att uttrycka en sällsynt skärande Amiiiiin (t.ex., jag-SceI) i celler där webbplatsen erkännande för nämnda enzymet har integrerats i det cellulära genomet. Den resulterande lesionen är särskilt svårt att lösa som trogen reparation kommer att återinföra enzymets erkännande webbplats, föranledde ytterligare en runda av klyvning. Därmed elimineras skillnader i kinetik för reparation. Om reparation komplex inte bildas, har lokalisering hindrats. Det här protokollet beskriver metoden som är nödvändiga för att identifiera ändringar i reparation kinetik samt reparation protein lokalisering.
Introduction
Varje dag, varje cell i människokroppen bombarderas med en uppskattad 10,000 DNA lesioner1. Denna existentiella hot placerar oss i riskzonen för mutationer, Onkogenes samt cell death. För att skydda genomet trohet, har däggdjursceller utvecklats för att svara på DNA-skador med en komplex serie av protein föreningar och ändringar. Detta svar är uppdelad i flera vägar, kollektivt kallas DNA skador svar (DDR)2,3. DDR består av ansamling av DNA reparation proteiner vid DNA lesioner, samordnas både tidsmässigt och rumsligt. DDR inducerar ofta cellcykelarrest att undvika förökning eller intensifiering av skador som kan uppstå vid replikering av skadade DNA2,4,5. I sin tur, är det också nödvändigt för cellernas livskraft att stänga av cellcykelarrest genom frikoppla reparation komplex efter reparation har slutförts.
Bland de olika typerna av DNA-skador är DSBs den mest skadliga. Att reparera DSBs kan leda kromosom omflyttningar eller storskaliga borttagningar såsom förlust av hela kromosomen vapen. Reparation av DSBs är uppdelad i två vägar6,7,8. Homolog rekombination (HR) kräver en syster kromosom att använda som en DNA mall och därmed begränsas till sena S och G2/M faser av cellcykeln9,10. Icke-homolog slutet att gå (NHEJ) har inte dessa begränsningar men kan orsaka små borttagningar vid reparation DSBs11,12.
DSB reparerar specifikt och DDR är i allmänhet aktiva områden för utredning. Trots att vara organiserade i bekvämt åtskilda vägar, finns det en hel del redundans. Faktiskt, många proteiner (BRCA1, BRCA2 och den komplexa till exempel RPA) är involverade i flera vägar13,14,15,16. Reparation av en lesion av en väg, kan leda till en mellanliggande skada som måste repareras av en annan väg14. Sammanflätning av dessa vägar, kombinerat med deras komplexa uppgiften att rekrytera rätt proteinerna till rätt plats för den exakta mängden tid som behövs, kräver en flerskiktade regleringsprocess.
En färsk rapport belyser krångligheter av DDR av visar att reparera komplexa bildande, upplösning och lokalisering kan varje separat vara nedsatt17. Det övergripande målet för följande protokoll är att slutgiltigt dissekera cellernas förmåga att reparera DSB. Med hjälp av immunofluorescens mikroskopi, kan ansamling av reparation proteiner på platser av skador visualiseras på representativa punkter efter induktion av DSBs.
Denna teknik har flera fördelar med att vanliga metoder. Reparation är ofta undersökta enda tidpunkter och oförmögna att representera den dynamiska processen för församlingen och dissociation av reparation komplex. Att observera hela skalan av reparation från den första aktiveringen till full upplösning garanterar att reparationer fördröjs inte är felidentifierad som komplett hämning. Däremot garanterar det att induktion av reparation svar som inte kan inaktivera nämnda svar inte är felidentifierad som normal eller överdriven aktivering.
Fördröjd protein komplex bildandet och mis localizationen av reparation proteiner, dock kan inte entydigt skiljas med detta synsätt. För att avgöra om reparation proteiner är mis lokaliserade kontra fördröjd i deras localization, kan en ”long-lasting” DSB införas genom enzymatisk klyvning av cellulära DNA. Den resulterande lesionen är recut varje gång det repareras, vilket resulterar i en distinkt stora nukleära reparation fokus och ta bort den tidsmässiga begränsningen från rekrytering. Detta kan uppnås genom att ändra den befintliga metoden med användning av en sällsynt skärande Amiiiiin (t.ex., jag-SceI) att inducera en långvarig DSB. Livslängden av DSBs möjliggör visualisering av svårfångade reparation proteiner genom immunofluorescens mikroskopi. Det förbättra överflödet skulle också kunna förbättra visualisering när detektion hindras av begränsning i antikropp kvalitet, en funktion som kan vara användbar när mindre studerade proteiner är identifierade som inverkar på DNA-reparation.
Särskilt, ge vi explicita instruktioner för en gratis bild bearbetning och analys programvara (t.ex., ImageJ). Detta tar bort ett betydande ekonomiskt hinder i bildanalys, ingående förhör av DNA skada reparation till en bredare publik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Observera att detta protokoll är skriven för U2OS celler som innehåller en jag-SceI erkännande plats18. Cellerna behöver inte vara U2OS men måste innehålla webbplatsen jag-SceI. Protokollet kan behöva vara justerade (t.ex., antal celler seedade och inkubationstider) beroende på vilken typ av celler som används.
1. definiera kineticsen av DSB reparation komplexa bildande
- Odla U20S-DRGFP cellerna på en 10 cm vävnadsodling platta tills 85 – 90% konfluenta.
- Ta bort materialet och inkubera vid rumstemperatur (RT) i 3 mL av EDTA i 2 min.
- Ersätta EDTA med 1 mL av trypsin och inkubera vid 37 ° C i 5 min. se till att cellerna är fristående från ytan av plattan vid visning under ett mikroskop. Neutralisera trypsin med 5 mL av Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM) kompletteras med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin/streptomycin.
- Bestämma koncentrationen av celler i denna suspension med hjälp av en hemocytometer och metoden trypan blå utslagning.
- Utsäde 6 x 103 celler per brunn i 200 µL av en glas-bottenplatta med 96 brunnar. Alternativt, utsäde 4 x 106 celler i 8 mL på 12 mm coverslips placeras i en 10 cm platta.
Notera: Täckglas eller varje brunn representerar en enda tidpunkt, inklusive kontroll. - Odla cellerna över natten vid 37 ° C och 5% CO2.
- Inducerande DSBs
- Ersätta media från 96 brunnar plattan/10 cm skålen med H2O2 spätt till en koncentration av 25 µM med DMEM + 10% FBS och inkubera vid 37 ° C i 1 h.
- Tvätta cellerna 3 x med 1 x PBS och Ersätt med färska DMEM kompletteras med 10% FBS och 1% penicillin/streptomycin. Inkubera cellerna vid 37 ° C för 0, 1, 4, 8, 24 och 48 h. se till att färskt utspädningar av H2O2 används för varje experiment.
Anmärkning: För att undvika döda celler i H2O2 koncentration används här, se till att dosen av skador är låg nog sådan att huvuddelen av celler kommer att undvika apoptos och åldras på hösten. Det är viktigt att observera återhämtningsprocessen. Detta uppnås bäst genom att mäta känslighet för en serie doser. Utföra en MTT assay eller andra cell lönsamhet analysen att bestämma den minsta koncentrationen av väteperoxid som kan användas.
- Fastställande och permeabilizing celler
- Tvätta cellerna 3 gånger med 1 x PBS. Ta bort ett täckglas från 10 cm plattan för varje tidpunkt och placera den i en enda väl 24-well platta för fastställande. Använd nål och pincett för att ta försiktigt bort täckglaset och undvika repor celler täckglas yta.
- Fix cellerna genom inkubation under 15 minuter med 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) på designerat gånger efter 1 h H2O2 exponering och färska DMEM replacement (0, 1, 4, 8, 24 och 48 timmar).
- Tvätta den fasta coverslips 3 gånger med PBS. Permeabilize cellerna med 0,5% icke-joniskt rengöringsmedel utspätt i 1 x PBS. Inkubera i 15 min på RT, innan du tvättar 3 x med PBS.
Observera: Efter permeabilisering, lagring av coverslips är möjligt i PBS vid 4 ° C i minst en vecka.
- Reparera komplexa visualisering
- Blockera den 96 brunnar plattan/coverslips i en lösning av 3% bovint serumalbumin (BSA) och 0,1% icke-joniskt rengöringsmedel utspätt i 1 x PBS (3% BSA lösning) för 1 h på RT.
- Inkubera med primära antikroppar som är riktade till proteinet reparation av intresse, efter utspädning enligt tillverkarens specifikationer i 3% BSA lösning för 1 h på RT, innan du tvättar 3 gånger med 1 x PBS.
- Inkubera i 96 brunnar plattan/coverslips med sekundära antikroppar efter utspädning enligt tillverkarens protokollet i lösning 3% BSA. Bekräfta att de sekundära fluorophores inte har överlappande excitation eller utsläpp spectra.
- Lägg till DAPI, efter utspädning enligt tillverkarens specifikationer i 1 x PBS efter tvätta cellerna med PBS 3 gånger och inkubera vid RT i 5 min.
- Montera coverslips på bilder med en droppe av montering ombud, att se till att de cell-sidoytor ner. Tryck coverslips försiktigt och insup varje överskjutande montering agent med en torka.
- Försegla av coverslips med snabbtorkande transparent nagellack och säkerställa en fullständig tätning av täckglaset med bilden.
- Ta de confocal mikroskopbilder genom att fokusera på kanalen DAPI, innan andra kanaler (med signaler från DNA reparation gen av intresse) för att undvika att införa bias i experimentet.
- Alternativt, bilder kan förvärvas genom att Z-sektioner av önskad region och kondenserande bilden till en enda plan att visualisera alla detekterbara foci.
Obs: Om DSB upplösning eller protein av intresse inte beaktas vid tidpunkter som valt, avgöra när DSBs lösa genom att välja en rad olika tidpunkter initialt (0 – 48 h efter DSB induktion). Punkter av intresse varierar beroende på metoden för DSB induktion och proteinet reparation av intresse.
- Använd gratis ImageJ programvara för att definiera atomkärnor i immunofluorescens mikroskopi bilder.
Obs: Om du vill öppna mikroskopbilder, Bio-format plugin måste installeras i ImageJ.- Öppna de confocal bilderna (.czi eller .tif) genom att dra bildfilen till fönstret ImageJ eller genom att välja ”Bio-format importör” från verktygsfältet ”Plugin” i ImageJ.
Obs: ”Bio-format Import alternativet” fönster visas. - Välj ”Split kanaler” att dela upp bilden i konstituerande DAPI och fluorescerande bilder i fönstret ”Bio-format Import alternativet”.
- Välj ”Colorized” i ”färgalternativ” från droppa-ned menyn. Välj ”OK” för att öppna DAPI och Histon H2AX (H2AX) bilder som separata windows och välja DAPI bilden.
- Välj verktygsfältet ”bild” och ”justera tröskeln” alternativet att välja atomkärnor.
Obs: Ett ”tröskelvärde”-fönster visas. - Justera tröskeln för bilden genom att dra i nedre fältet i fönstret ”tröskelvärde” helt till höger. Justera den övre menyraden tills kärnorna visas helt röda med distinkta konturer och bakgrunden svart. Välj inte tillämpas. Stäng fönstret ”Justera tröskeln”.
- Välj ”analysera” verktygsfält och ”analysera partiklar” alternativet. Se en ”analysera partiklar” fönster som visas på skärmen.
- Ange den minsta storleken för en kärna.
Obs: Partiklar under den storleken som matas in kommer inte räknas som kärnor. - Välj menyn ”Visa”, ”konturer”. Välj alternativet ”Lägg till Manager”. Klicka på ”OK” för att öppna ett fönster med ”ROI Manager”.
Obs: Konturerna av atomkärnor visas i ett separat fönster. - Tilldela nummer till kärnor som kan väljas från fönstret ”ROI Manager”.
- Öppna de confocal bilderna (.czi eller .tif) genom att dra bildfilen till fönstret ImageJ eller genom att välja ”Bio-format importör” från verktygsfältet ”Plugin” i ImageJ.
- Använd ImageJ för att kvantifiera H2AX foci i immunofluorescens mikroskopi bilder.
- Välj fönstret ”H2AX” foci (färgas med fluorescently konjugerad sekundär antikropp). Välj sedan verktygsfältet ”Process” och ”hitta Maxima” för att hitta foci inom atomkärnor.
Obs: Ett ”hitta Maxima” fönster kommer att öppnas. - Välj alternativet ”Single Points” i ”Output typ.” rullgardinsmenyn och välj ”Preview val av” att visualisera de maxima/foci. Ange ett värde för ”buller tolerans” beroende på fluorescensintensiteten hos bilden (figur 1). Kontrollera utseendet på ett vitt fönster med små svarta prickar.
Obs: Dessa prickar representerar de H2AX foci/maxima som har upptäckts. Buller toleransvärdet måste hållas konstant för alla bilder som analyseras. Ett lågt/högt brus tolerans kommer att skildra för många/för få maxima (foci) inom kärnan och kommer inte att vara en korrekt representation av foci inom kärnan. - Välj atomkärnor som H2AX foci måste kvantifieras för från fönstret ”ROI Manager”. Välj alla atomkärnor genom att markera alternativet ”Visa alla”.
- Välj ”åtgärd” för att mäta antalet maxima/foci inom den valda kärnan.
Anmärkning: Antalet maxima/foci visas som multipler av 255, dvs, en maximal har en ”RawIntDen” (integrerad täthet) läsning av 255. - Kopiera ”RawIntDen” värdena och klistra in dem i programvara för analys av data.
- Välj fönstret ”H2AX” foci (färgas med fluorescently konjugerad sekundär antikropp). Välj sedan verktygsfältet ”Process” och ”hitta Maxima” för att hitta foci inom atomkärnor.
2. analysera lokalisering till en långvarig dubbel-strand DNA paus
- Utsäde celler på 96 brunnar plattor/coverslips som beskrivs i avsnitten 1.1 och 1.2.
-
Induktion av dubbel-strand DNA bryter
- Transfect celler med jag-SceI uttryck vektorn med ett lipid-baserade transfection reagens enligt tillverkarens specifikationer. Vänta 24-72 h efter transfection att maximera Amiiiiin uttrycket. Avgöra om transfection lyckades genom att söka efter celler med singular stora nukleära γ-H2AX fokus.
-
Förvärv av bilder
- Fixa, permeabilize, blockera och tvätta den 96 brunnar plattan/coverslips som beskrivs i avsnitt 1.8.
- Co Inkubera cellerna med en antikropp mot γ-H2AX och proteinet reparation av intresse (här, en primär antikropp mot RAD51 användes) efter utspädning enligt tillverkarens specifikationer i lösning 3% BSA.
- Tvätta de 96 brunnar plattan/coverslips 3 gånger med 1 x PBS. Inkubera i 96 brunnar plattan/coverslips med sekundära antikroppar efter utspädning enligt tillverkarens protokollet i lösning 3% BSA. Bekräfta att de sekundära fluorophores inte har överlappande excitation eller utsläpp spectra.
- Identifiera celler som har stora nukleära γ-H2AX fokus. Bara ta bilder av dessa celler för att undvika bias.
-
Analys av långvarig jag-SceI inducerad foci
- Analysera de långvariga foci manuellt, genom att räkna antalet celler som har stora γ-H2AX foci och samtidig lokaliserade foci av proteinet reparation av intresse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 illustrerar valet av den rätta buller diskrimineringen för maxima/foci kvantifiering med ImageJ. De sammanslagna bilderna av DAPI och proteinet reparation av intresse är i den vänstra panelen. Figur 1A visar en buller diskriminering av 90 och markerar rätt antal foci. Atomkärnor på kanten (avbildad med en rosa pil) och foci utanför atomkärnor (avbildad med en gul pil) räknas inte under kvantifiering. Figur 1B skildrar en låg buller tolerans av 50. Många maxima identifieras utanför kärnan och inom kärnan. Figur 1 c visar en hög buller tolerans på 220. Endast en enda fokus (vit pil) upptäcktes. För att erbjuda läsaren en känsla av ”positiva” och ”negativa” resultat, har vi också sammanställt representativa resultat i figur 2. Specifikt, skildrar figur 2A samtidig lokalisering mellan γ-H2AX fokus (grön) och en reparation protein av intresse (röd). Likaså en untransfected cell visas i övre vänstra delen av denna panel och en cell med icke-nukleära (false) γ-H2AX fokus visas i övre högra. Vänligen observera mikrokärnor associera med DNA skador maskiner är en trolig källa av dessa icke-nukleära foci19. Figur 2B ger en högre förstoring av två rätt-mest cellerna från figur 2A – ge klarhet i hur de var fast beslutna att vara interiör och exteriör till kärnan, respektive. Ett exempel på en nukleär γ-H2AX fokus utan samtidig lokalisering av ett protein som reparation visas i figur 2 c. En schematisk bild av detta protokoll finns i figur 3 som sammanfattar detta tillvägagångssätt att karaktärisera DNA reparation.
Figur 1 : Representativ analys av dubbel-strand DNA paus reparation kinetik. Representativa bilder av γ-H2AX foci kvantifiering med ImageJ (med Bio-format plugin) programvara. Vänstra panelerna är sammansatta bilder av atomkärnor (40 X förstoring), färgas blå för DAPI och grön för γ-H2AX. Center paneler Visa referens un-analyserade atomkärnor med γ-H2AX foci/maxima. (A) den högra panelen visar maxima/foci upptäckt med en buller tolerans på 90 och är representativ för den faktiska uppskattningen av antalet foci inom kärnan. (B), högra panelen visar maxima kvantifiering med en låg ljudnivå tolerans (50). Maxima/foci kan upptäckas utanför kärnan (gul pil), medan majoriteten av maxima ligger inom kärnan är icke-specifika bakgrund signaler. (C), högra panelen visar maxima kvantifiering med högt buller tolerans (220). Endast en enda maximal/fokus (vit pil) upptäcks inom kärnan och är inte representativt för foci inom kärnan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Representativa jag-SceI inducerad dubbel-strand DNA raster. Representativa bilder av kärnor från celler som odlas på coverslips (40 X förstoring). Atomkärnor färgas blå. En reparation protein (RAD51) är målat rött och γ-H2AX är färgas grönt. (A) tre paneler Visa samma tre celler. Till vänster de flesta panel, kärnor är synliga. I panelen mellersta visas färgning för RAD51. På den högra panelen visas γ-H2AX färgning. Kärnan i det övre högra hörnet visar inte några tecken på jag-SceI inducerad DSBs. Kärnan i stadens (rosa pil) representerar en sann positiv händelse har både en stora γ-H2AX nukleära fokus och samtidig lokaliserade RAD51 nukleära fokus. Kärnan på höger sida har en falsk stora γ-H2AX fokus eftersom det är extranuclear. Foci utanför kärnan bör inte användas för samtidig lokalisering analys. (B) Detta är en högre förstoring av sammanslagna bilden i del A (center och rätt de flesta celler). Stora nukleära gul fokus som anger överlappning av RAD51 och H2AX signal betecknas med den rosa pilen. (C), en representativ bild av en nukleär γ-H2AX fokus utan samtidig färgning av proteinet DNA reparation av intresse. Till skillnad från fokus markeras med en vit pil i (A) och (B), illustrerar den gula pilen typiska resultat när reparation proteiner är förhindrade att lokalisera till platser i skador. Skalstapeln = 15 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3 : Visuell skildring av protokollet för att analysera dubbel-strand DNA paus reparation. (1), representation av protokollet steg 1,1 för sådd celler på coverslips/glas bottenplåt. (2), illustration av induktion av dubbel-strand raster genom att behandla med väteperoxid (höger) eller inducera långvariga dubbel-strand raster av transfecting 3 µg av jag-SceI. (3) representation av protokollstegen 1,4 till 1.5.3 för visualisering av dubbel-strand breaks. (4a) bild som representerar konfokalmikroskopi av cellen färgas med DAPI (blå) och γ-H2AX foci (grön). (4b), bilden av singular stora γ-H2AX foci (grön) igen atomkärnor fläcken DAPI (blå). (5a) skildring av analysen av γ-H2AX foci med ImageJ (protokoll steg 1.10.1–1.11.5). (5b) skildring av manuell räkning av stora långvarig γ-H2AX foci (protokoll steg 2,4). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Analys av DNA skada reparation i allmänhet och reparation av dubbelsträngat DNA raster är specifikt ett aktivt område av forskning eftersom dess konsekvenser span uppkomst till grundläggande biologi6,20. Detta manuskript Detaljer ett förhållningssätt som exakt dissekerar bidrag av RAD51 och γ-H2AX proteiner till resolution av DSBs genom HR. ser fram, denna metod kan användas för att belysa ytterligare funktioner för reparation proteiner DSBs14. Jämförelse av reparation kinetik och rekrytering av reparation maskiner till jag-SceI inducerad DSBs mellan kontroll och celler med proteinet av intresse utslagen, skulle definiera det proteinet bidrag till rekrytering, lokalisering, och resolution av reparation faktorer att DSBs.
Visualisera reparation kinetik har flera fördelar jämfört med vanliga metoder. Ofta, utreds reparation vid samma tidpunkter, som är oförmögna att representera den dynamiska processen för församlingen och dissociation av reparation komplex. Att observera hela skalan av reparation från första aktiveringen till full upplösning garanterar att reparationer fördröjs inte är felidentifierad som komplett hämning. Omvänt, det säkerställer att induktion av ett reparation svar utan förmågan att inaktivera att svar inte är felidentifierad som normal eller överdriven aktivering. Dessa är i stort sett förändringar i tillämpningen av ett etablerat synsätt, men användningen av en sällsynt skärande Amiiiiin att inducera en långvarig DSB är ett nytt verktyg. Det gör det möjligt för utredaren att entydigt avgöra om lokaliseringen av en reparation protein hämmas i stället för dess rekrytering försenas en kort tid bortom ingåendet av experimentet. Jag-SceI inducerad DSB kan pågå i dagar och teoretiskt så länge enzymet uttrycks (bör cellen förbli lönsamt). Kinetiken för DSB reparation kan också observeras via levande cell imaging. Men även om levande cell imaging tillåter identifiering av reparation händelser i realtid, dess tillämpning hindras av kravet att proteiner taggas med en fluorophore såsom god Jordbrukarsed. Sådan genmanipulation har potential att ändra proteinfunktion och utgör en ytterligare tekniska hinder.
Bildanalys via ImageJ programvara kan vara besvärliga att bemästra. Den stegvisa instruktionen för reparation fokus erkännande och kvantifiering som använder denna programvara tillhandahålls i hopp om att avlägsna detta hinder för andra grupper. Detta kunde leda till ökat utnyttjande av den kraftfulla programvaran och eliminera kostnaden för dyrare program vid en tidpunkt av krympande pooler av federal bevilja stöd.
I princip bör varaktigheten av dessa DSBs aktivera visualisering av svårfångade reparation proteiner genom immunofluorescens mikroskopi. Detta kan vara fallet för proteiner som är svåra att se eftersom de inte ackumuleras i en hög nog koncentration att upptäckas, t.ex., varaktigheten av jag-SceI inducerad DSB resultaten i ett större än typiska ackumulationen av reparation proteiner vid lesionen. Det förbättra överflödet skulle också kunna förbättra visualisering när detektion hindras av en begränsning i antikropp kvalitet; en funktion som skulle vara särskilt användbar när mindre studerade proteiner är identifierade som inverkar på DNA reparation. Hittills har detta synsätt verifierats för 4 DNA reparation proteiner, nämligen RAD51, RPA70, BRCA1 och BRCA2 (data som inte visas, figur 2och referens17)
Slutligen finns det ändringar som kan göras till detta protokoll att utöka typerna av DNA-skador som kan förhöras samt de cellulära miljöerna. Den tydligaste ändringen skulle förändras den källa eller typ av inducerad DNA-skador. Motståndskraftigt av principen för UVB, joniserande strålning eller radiomimetics (phleomycin, bleomycin och etoposid) att studera kinetiken för DNA-reparation har redan publicerade18,19,23,24 , 25. med smärre ändring av denna strategi kan också belysa reparation protein svar av NHEJ på DSBs. Alternativt Britton et al. beskriva en pre utvinning teknik som kan vara används26. Ytterligare, det är homing Hack endonucleases (jag-HmuI eller jag-BasI) som har omfattande erkännande platser, liknande till jag-SceI27. Dessa enzymer skilja dem från jag-SceI, och orsaka singel-strand DNA avbrott (SSBs). Att införa webbplatsen erkännande för dessa enzymer i en cell fodrar skulle möjliggör analys av SSB-reparation som paralleller det protokoll som beskrivs i detta manuskript för förhör långvarig DSBs. noterbart integrationsprocess-SceI erkännande webbplats och verifiera införandet av webbplatsen kan vara mödosam. Lyckligtvis har framsteg i genomet redigering teknik (exempelvis SKARPARE/Cas9-system) lättat denna börda28. Det är också en aktiv forskningsfält som har lyckats engineering målsökande endonucleases att skära på en önskad genomisk plats, vilket tyder på att i framtiden, dessa tekniska framsteg och användningen av CRISPR/Cas9 kan leda detta kloning steg vara dispensable28,29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Joel Sanneman och Dr Philine Wangemann Confocal Microscopy kärna, finansierat av den Kansas State University College av Veterinary Medicin, för deras stöd för arbetet med att utveckla denna teknik. pCBASceI var en gåva från Maria Jasin (Addgene plasmid # 26477) 30. U2OS DR-GFP celler var en slags gåva från Maria Jasin18.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mm Coverslips | VWR | 89015-725 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| 24-well plate | VWR | 82050-892 | |
| 96-well glass bottom plate | Cellvis | P96-1.5H-N | |
| Anti-H2AX Alexa488 | EMD Millipore | 05-636-AF488 | |
| Anti-Rad51 (D4B10) | Cell Signaling Technology | 8875S | |
| Bio-formats plugin for ImageJ | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher Scientific | 12100046 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 89510-194 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG Alexa594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | |
| Hydrogen Peroxide | sigma-Aldrich | 216763-100ML | |
| ImageJ Software | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| I-SceI Expression Vector | Addgene | 26477 | |
| Nail Polish- Insta Dri | Sally and Hansen | Clearly Quick (103) | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Bio Basic | PD8117 | |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049-500ML | |
| TurboFect Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | R0531 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 |
References
- Lindahl, T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).
- Branzei, D., Foiani, M. Regulation of DNA repair throughout the cell cycle. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 297-308 (2008).
- Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Mol Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
- Auclair, Y., Rouget, R., Drobetsky, E. A. ATR kinase as master regulator of nucleotide excision repair during S phase of the cell cycle. Cell Cycle. 8 (12), 1865-1871 (2009).
- Awasthi, P., Foiani, M., Kumar, A. ATM and ATR signaling at a glance. J Cell Sci. 128 (23), 4255-4262 (2015).
- Ceccaldi, R., Rondinelli, B., D'Andrea, A. D. Repair Pathway Choices and Consequences at the Double-Strand Break. Trends Cell Biol. 26 (1), 52-64 (2016).
- Chapman, J. R., Taylor, M. R. G., Boulton, S. J. Playing the End Game: DNA Double-Strand Break Repair Pathway Choice. Mol Cell. 47 (4), 497-510 (2012).
- Daley, J. M., Sung, P. 53BP1, BRCA1, and the Choice between Recombination and End Joining at DNA Double-Strand Breaks. Mol Cell Biol. 34 (8), 1380-1388 (2014).
- Hartlerode, A., Odate, S., Shim, I., Brown, J., Scully, R. Cell Cycle-Dependent Induction of Homologous Recombination by a Tightly Regulated I-SceI Fusion Protein. PLOS ONE. 6 (3), e16501 (2011).
- Brandsma, I., Gent, D. C. Pathway choice in DNA double strand break repair: observations of a balancing act. Genome Integr. 3, 9 (2012).
- Davis, A. J., Chen, D. J. DNA double strand break repair via non-homologous end-joining. Transl Cancer Res. 2 (3), 130-143 (2013).
- Reid, D. A., et al. Organization and dynamics of the nonhomologous end-joining machinery during DNA double-strand break repair. Proc Natl Acad Sci. 112 (20), E2575-E2584 (2015).
- Chen, J. J., Silver, D., Cantor, S., Livingston, D. M., Scully, R. BRCA1, BRCA2, and Rad51 Operate in a Common DNA Damage Response Pathway. Cancer Res. 59 (7 Supplement), 1752s-1756s (1999).
- D'Andrea, A. D. BRCA1: A Missing Link in the Fanconi Anemia/BRCA Pathway. Cancer Discov. 3 (4), 376-378 (2013).
- Gudmundsdottir, K., Ashworth, A. The roles of BRCA1 and BRCA2 and associated proteins in the maintenance of genomic stability. Oncogene. 25 (43), 5864-5874 (2006).
- Liu, S., et al. Distinct roles for DNA-PK, ATM and ATR in RPA phosphorylation and checkpoint activation in response to replication stress. Nucleic Acids Res. 40 (21), 10780-10794 (2012).
- Wallace, N. A., Khanal, S., Robinson, K. L., Wendel, S. O., Messer, J. J., Galloway, D. A. High Risk Alpha Papillomavirus Oncogenes Impair the Homologous Recombination Pathway. J Virol. , (2017).
- Pierce, A. J., Johnson, R. D., Thompson, L. H., Jasin, M. XRCC3 promotes homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells. Genes Dev. 13 (20), 2633-2638 (1999).
- Luzhna, L., Kathiria, P., Kovalchuk, O. Micronuclei in genotoxicity assessment: from genetics to epigenetics and beyond. Front Genet. 4, (2013).
- Jasin, M. Homologous repair of DNA damage and tumorigenesis: the BRCA connection. Oncogene. 21 (58), 8981-8993 (2002).
- Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. β-HPV 5 and 8 E6 Disrupt Homology Dependent Double Strand Break Repair by Attenuating BRCA1 and BRCA2 Expression and Foci Formation. PLOS Pathog. 11 (3), e1004687 (2015).
- Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. HPV 5 and 8 E6 Abrogate ATR Activity Resulting in Increased Persistence of UVB Induced DNA Damage. PLoS Pathog. 8 (7), (2012).
- Mah, L. J., Vasireddy, R. S., Tang, M. M., Georgiadis, G. T., El-Osta, A., Karagiannis, T. C. Quantification of γH2AX Foci in Response to Ionising Radiation. J Vis Exp. (38), e1957 (2010).
- Popp, H. D., Brendel, S., Hofmann, W. K., Fabarius, A. Immunofluorescence Microscopy of γH2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks. J Vis Exp. (129), e56617 (2017).
- Burma, S., Chen, B. P., Murphy, M., Kurimasa, A., Chen, D. J. ATM Phosphorylates Histone H2AX in Response to DNA Double-strand Breaks. J Biol Chem. 276 (45), 42462-42467 (2001).
- Britton, S., Coates, J., Jackson, S. P. A new method for high-resolution imaging of Ku foci to decipher mechanisms of DNA double-strand break repair. J Cell Biol. 202 (3), 579-595 (2013).
- Landthaler, M., Shen, B. W., Stoddard, B. L., Shub, D. A. I-BasI and I-HmuI: two phage intron-encoded endonucleases with homologous DNA recognition sequences but distinct DNA specificities. J Mol Biol. 358 (4), 1137-1151 (2006).
- Lackner, D. H., et al. A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging. Nat Commun. 6, 10237 (2015).
- Chan, S. H., Stoddard, B. L., Xu, S. Y. Natural and engineered nicking endonucleases--from cleavage mechanism to engineering of strand-specificity. Nucleic Acids Res. 39 (1), 1-18 (2011).
