Summary
Reparation af dobbelt-strenget DNA pauser er en dynamisk proces, der kræver ikke kun dannelsen af reparation komplekser på pauserne, men også deres beslutning efter læsionen er behandlet. Her bruger vi immunofluorescens mikroskopi for forbigående og langvarig dobbelt-strenget pauser som et redskab til at dissekere denne genom vedligeholdelse mekanisme.
Abstract
Reparation af dobbelt-strenget pauser (DSBs) i DNA er en meget koordineret proces, nødvendiggør dannelse og opløsning af multi protein reparation komplekser. Denne proces er reguleret af et utal af proteiner, der fremmer foreningen og afstandtagen af proteiner til disse læsioner. Tak for en stor del at evnen til at udføre funktionelle skærme af et stort bibliotek af proteiner, der er en større forståelse af generne, der nødvendige for dobbelt-strenget DNA pause reparation. Ofte knockout eller kemiske hæmmer skærme identificere proteiner involveret i reparationsprocesser ved hjælp af øget toksicitet som markør for et protein, der er nødvendige for DSB reparation. Selv om nyttige til at identificere roman cellulære proteiner involveret i at opretholde genom troskab, kræver funktionel analyse bestemmelse af om protein af interesse fremmer lokalisering, stiftelse eller opløsning af reparation komplekser.
Ophobning af reparation proteiner kan opdages let som særskilte nukleare foci af immunofluorescens mikroskopi. Således kan foreningen og afstandtagen af disse proteiner på lokaliteter af DNA-skader tilgås ved at observere disse nukleare foci repræsentative mellemrum efter induktion af dobbelt-strenget DNA pauser. Denne tilgang kan også identificere mis lokaliserede reparation faktor proteiner, hvis reparation fejl ikke forekommer samtidig med ufuldstændige forsinkelser i reparation. I dette scenario, kan langvarig dobbelt-strenget DNA pauser være manipuleret ved at udtrykke en sjælden skæring liv1975 (fx, SceI) i celler hvor webstedet anerkendelse for det pågældende enzym har været integreret i det cellulære genom. Den resulterende læsion er særligt svært at løse som trofaste reparation vil genindføre enzymets genkendelsessekvens, at spørge en anden runde af kavalergang. Som et resultat, er forskelle i kinetik af reparation elimineret. Hvis reparation komplekser ikke er dannet, har lokalisering været hæmmet. Denne protokol beskriver den metode, der er nødvendige for at identificere ændringer i reparation kinetik samt reparation protein lokalisering.
Introduction
Hver dag, hver celle i den menneskelige krop er bombarderet med en anslået 10,000 DNA læsioner1. Denne eksistentielle trussel sætter os på risikoen for mutationer, oncogenesis samt celle død. For at beskytte genom troskab, pattedyrceller har udviklet sig til at reagere på DNA skader med en kompleks række protein foreninger og ændringer. Dette svar er organiseret i flere veje, kollektivt kendt som DNA skader svar (DDR)2,3. DDR består af ophobning af DNA reparation proteiner på DNA læsioner, koordineret både tidsmæssigt og rumligt. DDR inducerer ofte celle cyklus anholdelse til undgå spredning eller intensivering af skader, der kan opstå under replikering af beskadigede DNA2,4,5. Til gengæld er det også nødvendigt for cellulære levedygtighed at slukke celle cyklus anholdelse af adskille reparation komplekser efter reparation er afsluttet.
Blandt de forskellige typer af DNA-skader er DSBs de mest skadelige. Manglende evne til at reparere DSBs kan resultere i kromosom rearrangementer eller store sletninger som tabet af hele kromosom våben. Reparation af DSBs er opdelt i to veje6,7,8. Homologe rekombination (HR) kræver en søster kromosom til brug som en DNA-skabelon og er således begrænset til sene S og G2/M faser i cellecyklus9,10. Ikke-homologe ende sammenføjning (NHEJ) har ikke disse restriktioner, men kan forårsage små sletninger, når reparation af DSBs11,12.
DSB reparere specifikt og DDR er generelt aktive områder af undersøgelsen. På trods af at være organiseret i bekvemt adskilt stier, er der en stor del af redundans. Faktisk, mange proteiner (BRCA1, BRCA2, og den komplekse for eksempel RPA) er involveret i flere veje13,14,15,16. Reparation af en læsion af en vej, kan føre til en mellemliggende skader, der skal repareres af en anden vej14. Sammenblanding af disse veje, kombineret med deres komplekse opgave at rekruttere de rigtige proteiner til det rette sted for det nøjagtige beløb af tid, kræver en multi-differentieret reguleringsproces.
En nylig rapport fremhæver snørklede af DDR ved at demonstrere at reparation kompleks dannelse, opløsning og lokalisering kan hver separat være nedsat17. Det overordnede mål med følgende protokol er at endeligt dissekere celler evne til at reparere DSB. Bruger immunofluorescens mikroskopi, kan ophobning af reparation proteiner på steder, hvor skaden visualiseres på repræsentative tid points efter induktion af DSBs.
Denne teknik har flere fordele til almindeligt anvendte metoder. Ofte, er reparation undersøgt på enkelt tidspunkter og ikke i stand til at repræsentere den dynamiske proces forsamlingsfrihed og dissociation af reparation komplekser. Observere hele spektret af reparation fra den første aktivering af den fulde opløsning sikrer, at en forsinkelse i reparation ikke fejlidentificerede som fuldstændig hæmning. Omvendt, det forsikrer, at induktion af en reparation svar, der ikke er i stand til at inaktivere disse svar ikke er fejlidentificerede som normalitet eller overdreven aktivering.
Forsinket protein kompleks dannelse og mis lokaliseringen af reparation proteiner, men kan ikke utvetydigt skelnes med denne tilgang. For at afgøre, om reparation proteiner er mis lokaliserede versus forsinket i deres lokalisering, kan en "langtidsholdbare" DSB indføres gennem enzymatisk kløvningen af cellulære DNA. Den resulterende læsion er recut hver gang det er repareret, hvilket resulterer i en særskilt store nukleare reparation fokus og fjerner den tidsmæssige begrænsning af rekruttering. Dette kan opnås ved at ændre den eksisterende metode med brug af sjældne skæring liv1975 (fx, SceI) til at fremkalde en langvarig DSB. Levetiden af DSBs giver mulighed for visualisering af undvigende reparation proteiner ved immunfluorescens mikroskopi. Den forbedrede overflod kunne også forbedre visualisering, når påvisning hindres af begrænsning i antistof kvalitet, en funktion, der kunne være nyttige, når mindre studerede proteiner er identificeret som havende en indvirkning på DNA reparation.
Især, leverer vi udtrykkelige instruktioner for en gratis billede behandling og analyse-software (fxImageJ). Dette fjerner en væsentlig økonomisk barriere i billedanalyse, åbne afhøring af DNA skade reparation til et bredere publikum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk venligst, at denne protokol er skrevet til U2OS celler, der indeholder en-SceI anerkendelse websted18. Cellerne behøver ikke være U2OS men skal indeholde-SceI site. Protokollen skal være justeret (f.eks.antal celler seedede og inkuberingstider) afhængigt af celler, der bruges.
1. definere kinetik af DSB reparation kompleks dannelse
- Vokse U20S-DRGFP celler på en 10 cm vævskultur plade indtil 85 – 90% sammenflydende.
- Fjern mediet og inkuberes ved stuetemperatur (RT) i 3 mL af EDTA i 2 min.
- Erstatte EDTA med 1 mL trypsin og inkuberes ved 37 ° C i 5 min. sikre at cellerne er løsrevet fra overfladen af pladen ved at se under et mikroskop. Neutralisere trypsin med 5 mL af Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM) suppleret med 10% føtal bovint serum (FBS) og 1% penicillin/streptomycin.
- Bestemme koncentrationen af celler i denne suspension ved hjælp af en hemocytometer og trypan blå udstødelse metode.
- Seed 6 x 103 celler/brønd i 200 µL af en glas-bund 96-brønd plade. Alternativt, frø 4 x 106 celler i 8 mL på 12 mm coverslips anbringes i en 10 cm plade.
Bemærk: Hver brønd eller coverslip repræsenterer en enkelt tidspunkt, herunder kontrol. - Vokse celler natten over ved 37 ° C og 5% CO2.
- Inducerende DSBs
- Udskift mediet fra 96-brønd plade/10 cm parabol med H2O2 fortyndet til en koncentration på 25 µM med DMEM + 10% FBS og inkuberes ved 37 ° C i 1 time.
- Vaske cellerne 3 x med 1 x PBS og erstatte med frisk DMEM suppleret med 10% FBS og 1% penicillin/streptomycin. Inkuber cellerne ved 37 ° C til 0, 1, 4, 8, 24, og 48 h. sikre at frisk fortyndinger af H2O2 er anvendt til hvert eksperiment.
Bemærk: For at undgå drab celler på H2O2 koncentration anvendt her, sikre, at dosis af skader er lav nok sådan, at hovedparten af celler vil undgå apoptose og ældning. Det er afgørende at observere opsving oparbejde. Dette opnås bedst ved at måle følsomhed over for en række doser. Udføre en MTT assay eller andre celle levedygtighed assay til at bestemme den minimale koncentration af brintoverilte, der kan bruges.
- Fastsættelse og permeabilizing celler
- Vaske cellerne 3 gange med 1 x PBS. Fjerne en coverslip fra 10 cm plade for hvert tidspunkt og placere den i et enkelt godt af en 24-godt plade for fastsættelse. Brug nålen og pincet til at Fjern forsigtigt coverslip og undgå ridser celler fra coverslip overflade.
- Fix celler ved inkubation i 15 min. med 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) på udpeget gange efter 1 h H2O2 eksponering og friske DMEM udskiftning (0, 1, 4, 8, 24 og 48 h).
- Vaske den faste coverslips 3 gange med PBS. Permeabilize celler med 0,5% nonionisk detergent fortyndet i 1 x PBS. Inkuber i 15 min. ved RT, før vask 3 x med PBS.
Bemærk: Efter permeabilization, oplagring af coverslips er muligt i PBS ved 4 ° C i mindst en uge.
- Reparation komplekse visualisering
- Blokere 96-brønd plade/coverslips i en opløsning af 3% bovint serumalbumin (BSA) og 0,1% nonionisk detergent fortyndet i 1 x PBS (3% BSA løsning) i 1 time på RT.
- Inkuber med primære antistoffer, der er målrettet reparation protein af interesse, fortyndet ifølge producentens specifikationer i 3% BSA løsning for 1 h i RT, før vask 3 gange med 1 x PBS.
- Inkuber 96-brønd plade/coverslips med sekundær antistof fortyndes efter producentens protokol i 3% BSA løsning. Bekræfte, at de sekundære fluorophores ikke har overlappende excitation eller emission spektre.
- Efter vask celler med PBS 3 gange tilføje DAPI, fortyndet ifølge producentens specifikationer i 1 x PBS og inkuberes ved RT i 5 min.
- Montere coverslips på dias med en dråbe af montering agent, og sørg for celle-side ansigter ned. Tryk på coverslips omhyggeligt og opsuge eventuelle overskydende montering agent med en serviet.
- Forsegl coverslips med hurtig tørring gennemsigtig neglelak og sikre en komplet tætning af coverslip med diaset.
- Tage Konfokal mikroskop billeder ved at fokusere på DAPI kanal, før andre kanaler (med signaler fra DNA reparation gen af interesse) for at undgå at indføre bias i eksperimentet.
- Alternativt, billeder kan erhverves ved at tage Z-sektioner for den ønskede region og kondenserende billedet ind i et enkelt fly til at visualisere alle påviselige foci.
Bemærk: Hvis DSB opløsning eller protein af interesse ikke er observeret på tidspunkter, der er valgt, bestemmer hvornår DSBs løse ved at vælge en bred vifte af tiden point i første omgang (0 – 48 h post DSB induktion). Tid interessepunkter varierer efter metoden for DSB induktion og reparation protein af interesse.
- Brug gratis ImageJ software til at definere kerner i immunofluorescens mikroskopi billeder.
Bemærk: For at åbne mikroskop billeder, Bio-formater plugin skal være installeret i ImageJ.- Åbn de Konfokal billeder (.czi eller .tif) ved at trække billedfilen i vinduet ImageJ, eller ved at vælge "Bio-formater importør" fra værktøjslinjen "Plugin" i ImageJ.
Bemærk: "Bio-formater Import Option" vindue vises. - Vælg "Split kanaler" opdele billedet i konstitutiv DAPI og fluorescerende billeder i vinduet "Bio-formater Import Option".
- Vælg "Kolorit" i"farve" fra drop-down menuen. Vælg "OK" for at åbne DAPI og Histon H2AX (H2AX) billeder som separate windows og vælge DAPI billede.
- Vælg værktøjslinjen "Billede" og "Justere tærskel" valgmulighed hen til sluttet kerner.
Bemærk: Et "Threshold" vindue vises. - Justere billedet tærskel ved at skubbe den nederste linje i vinduet "Threshold" helt til højre. Justere den øverste bjælke, indtil kerner vises helt rødt med forskellige dispositioner og baggrund sort. Vælg ikke anvendelse. Luk vinduet "Justere tærskel".
- Vælg "Analyze" værktøjslinje og "Analysere partikler" valgmulighed. Se en "Analysere partikler" vindue vises på skærmen.
- Input minimumsstørrelsen for en kerne.
Bemærk: Partikler under størrelse indtastet vil ikke blive talt som kerner. - "Vis" dropdown menuen, Vælg "Konturerne". Vælg indstillingen "Tilføj til Manager". Klik på "OK" for at åbne et vindue i "ROI Manager".
Bemærk: Konturer af cellekerner vil vises i et separat vindue. - Tildele numre til de kerner, der kan vælges fra vinduet "ROI Manager".
- Åbn de Konfokal billeder (.czi eller .tif) ved at trække billedfilen i vinduet ImageJ, eller ved at vælge "Bio-formater importør" fra værktøjslinjen "Plugin" i ImageJ.
- Brug ImageJ at kvantificere H2AX foci i immunofluorescens mikroskopi billeder.
- Vælg "H2AX" foci vindue (farves med fluorescently konjugeret sekundær antistof). Derefter markere værktøjslinjen "Processen" og vælg "Find Maxima" at finde foci i atomkerner.
Bemærk: Et "Finde Maxima" vindue vil åbne. - Vælg den "Single point" i rullemenuen "Output Type" og "Preview punkt valg" til at visualisere maxima/foci. Input en "støj" toleranceværdi afhængigt af fluorescens-intensiteten af billedet (figur 1). Check for udseendet af et hvidt vindue med små sorte prikker.
Bemærk: Disse prikker repræsenterer de H2AX foci/maxima, der er blevet opdaget. Toleranceværdi støj skal holdes konstant for alle billeder er analyseret. En lav/høj støj tolerance vil skildre alt for mange/få maxima (foci) i kernen og vil ikke være en nøjagtig repræsentation af foci i kernen. - Vælg de kerner, hvortil H2AX foci skal kvantificeres fra vinduet "ROI Manager". Vælg alle kerner ved at kontrollere indstillingen "Vis alle".
- Vælg "Foranstaltning" til at måle antallet af maxima/foci inden for de valgte kerner.
Bemærk: Antallet af maxima/foci vises som multipla af 255, dvs, en maksimal har en "RawIntDen" (integreret tæthed) læsning af 255. - Kopier "RawIntDen" værdier og indsætte dem i softwaren for dataanalyser.
- Vælg "H2AX" foci vindue (farves med fluorescently konjugeret sekundær antistof). Derefter markere værktøjslinjen "Processen" og vælg "Find Maxima" at finde foci i atomkerner.
2. analysere lokalisering til en langvarig dobbelt-strenget DNA pause
- Frø celler på 96-brønd plader/coverslips som beskrevet i afsnit 1.1 og 1.2.
-
Induktion af dobbelt-strenget DNA pauser
- Transfect celler med-SceI udtryk vektor ved hjælp af et lipid-baserede Transfektion reagens ifølge producentens specifikationer. Vent 24-72 h efter Transfektion at maksimere liv1975 udtryk. Bestemme, hvis Transfektion lykkedes ved at finde celler med ental store nukleare γ-H2AX fokus.
-
Erhvervelse af billeder
- Fix, permeabilize, blok, og vaske 96-brønd plade/coverslips som beskrevet i afsnit 1.8.
- Co Inkuber celler med et antistof mod γ-H2AX og reparation protein af interesse (her, en primær antistof mod RAD51 blev brugt) fortyndet ifølge producentens specifikationer i 3% BSA løsning.
- Vask 96-brønd plade/coverslips 3 gange med 1 x PBS. Inkuber 96-brønd plade/coverslips med sekundær antistof fortyndes efter producentens protokol i 3% BSA løsning. Bekræfte, at de sekundære fluorophores ikke har overlappende excitation eller emission spektre.
- Identificere celler, der har en stor nukleare γ-H2AX fokus. Kun tage billeder af disse celler til at undgå bias.
-
Analyse af langvarig jeg-SceI induceret foci
- Analysere langvarig foci manuelt, ved at tælle antallet af celler, der har store γ-H2AX foci og co lokaliserede foci af reparation protein af interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser valget af den korrekte støj forskelsbehandling for maxima/foci kvantificering ved hjælp af ImageJ. De flettede billeder af DAPI og reparation protein af interesse er på panelet til venstre. Figur 1A viser en støj forskelsbehandling af 90 og markerer det korrekte antal foci. Kerner på kanten (afbildet med en pink pil) og foci kerner (afbildet med en gul pil) tælles ikke under kvantificering. Figur 1B viser en støjsvag tolerance på 50. Talrige maxima er identificeret uden for kernen og i kernen. Figur 1 c viser en høj støj tolerance på 220. Kun en enkelt fokus (en hvid pil) blev fundet. For at give læseren en følelse af "positive" og "negativt", har vi også samlet repræsentative resultater i figur 2. Specifikt, skildrer figur 2A Co lokalisering mellem γ-H2AX fokus (grøn) og en reparation protein af interesse (rød). Ligeledes en untransfected celle er vist i det øverste venstre hjørne af dette panel og en celle med en ikke-nukleare (falske) γ-H2AX fokus er vist i øverst højre. Bemærk mikronukleus knyttes DNA skader maskiner er en sandsynlig kilde til disse ikke-nukleare foci19. Figur 2B giver en højere forstørrelse af de to yderste højre celler fra figur 2A til at skabe klarhed i hvordan de var besluttede på at være indvendige og udvendige til kernen, henholdsvis. Et eksempel på en nuklear γ-H2AX fokus uden Co lokalisering af en reparation protein er vist i figur 2 c. En skematisk af denne protokol tilbydes i figur 3 , der opsummerer denne tilgang til at karakterisere DNA reparation.
Figur 1 : Repræsentant analyse af dobbelt-strenget DNA pause reparation kinetik. Repræsentative billeder af γ-H2AX foci kvantificering ved hjælp af ImageJ (med Bio-formater plugin) software. De venstre paneler er sammensatte billeder af cellekerner (40 X forstørrelse), farves blå for DAPI og grøn for γ-H2AX. Center paneler viser reference un-analyseret kerner med γ-H2AX foci/maxima. (A) højre panel viser maxima/foci registrering med en støj tolerance på 90 og repræsentant for den faktiske estimering af antallet af poler i kernen. (B) højre panel viser maxima kvantificering med en lav støj tolerance (50). Maxima/foci kan opdages uden for kernen (gul pil), mens størstedelen af maxima som ligger i kernen er uspecifikke baggrund signaler. (C) højre panel viser maxima kvantificering med høj støj tolerance (220). Kun en fælles maksimale/fokus (hvid pil) opdages i kernen og er ikke repræsentativ for foci i kernen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Repræsentant jeg-SceI induceret dobbelt-strenget DNA pauser. Repræsentative billeder af kerner fra celler dyrkes på coverslips (40 X forstørrelse). Cellekerner farves blå. En reparation protein (RAD51) er farvet røde og γ-H2AX er farvet grønne. (A) tre paneler viser de samme tre celler. Til venstre de fleste panel, kerner er synlige. I det midterste panel, er farvning for RAD51 vist. På det højre panel, er γ-H2AX farvning vist. Kernen i øverste højre hjørne viser ikke nogen tegn på SceI induceret DSBs. Kernen i centrum (pink pil) repræsenterer en rigtigt positiv begivenhed, da det har både en stor γ-H2AX nukleare fokus og co lokaliserede RAD51 nukleare fokus. Kernen i højre side har en falsk store γ-H2AX fokus, da det er extranuclear. Foci uden for kernen bør ikke anvendes til co lokalisering analyse. (B) Dette er en højere forstørrelse af det flettede billede i del A (center og rette de fleste celler). Store nukleare gul fokus der angiver overlapning af RAD51 og H2AX signal er angivet ved den lyserøde pil. (C) en repræsentativt billede af nukleare γ-H2AX fokus uden Co farvning af DNA reparation protein af interesse. I modsætning til det fokus, der er angivet med en hvid pil i (A) og (B), illustrerer den gule pil typiske resultater når reparation proteiner forhindres lokalisering til websteder af skader. Skalalinjen = 15 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Visuel afbildning af protokollen til at analysere dobbelt-strenget DNA pause reparation. (1) repræsentation af protokollen trin 1.1 for såning celler på coverslips/glas bund plader. (2) illustration af induktion af dobbelt-strenget pauser ved behandling med hydrogenperoxid (til højre) eller inducerende langvarig dobbelt-strenget pauser af transfecting 3 µg SceI. (3) repræsentation af protokollen trin 1.4 til 1.5.3 til visualisering af dobbelt-strenget pauser. (4a) billede repræsenterer Konfokal mikroskopi af celle farves med DAPI (blå) og γ-H2AX foci (grøn). (4b) billede af ental store γ-H2AX foci (grøn) igen kerner pletten DAPI (blå). (5a) skildring af analysen af γ-H2AX foci bruger ImageJ (protokol trin 1.10.1–1.11.5). (5b) skildring af manuel optælling af store varig γ-H2AX foci (protokol trin 2.4). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Analyse af DNA skade reparation i almindelighed og reparation af dobbelt-strenget DNA pauser er specifikt et aktivt område for forskning, fordi dens konsekvenser span tumordannelse til grundlæggende biologi6,20. Dette manuskript detaljer en tilgang, der præcist dissekerer bidrag af RAD51 og γ-H2AX proteiner til løsning af DSBs gennem HR. ser frem, denne metode kan bruges til at belyse yderligere funktioner i reparation proteiner på DSBs14. Sammenligning af reparation kinetik og rekruttering af reparation maskiner til jeg-SceI induceret DSBs mellem kontrol celler og celler med protein af interesse slået ud, vil definere bidrag af at protein til rekruttering, lokalisering, og opløsning af reparation faktorer til DSBs.
Visualisere reparation kinetik har flere fordele sammenlignet med almindeligt anvendte metoder. Ofte, undersøges reparation på én gang punkter, som er i stand til at repræsentere den dynamiske proces forsamlingsfrihed og dissociation af reparation komplekser. Observere hele spektret af reparation fra første aktivering til fuld opløsning sikrer, at en forsinkelse i reparation ikke fejlidentificerede som fuldstændig hæmning. Omvendt, det forsikrer at induktion af en reparation svar uden evnen til at inaktivere at svar ikke fejlidentificerede som normale eller overdreven aktivering. Disse er i høj grad ændringer i anvendelsen af et etableret tilgang, men brugen af en sjælden skæring liv1975 til at fremkalde en langvarig DSB er et nyt værktøj. Det giver mulighed for investigator til at bestemme utvetydigt, hvis lokalisering af en reparation protein hæmmes i stedet for sin ansættelse bliver forsinket en kort periode indgåelse af eksperimentet. SceI induceret DSB kan vare i dage og teoretisk så længe enzymet er udtrykt (bør cellen forblive levedygtige). Kinetik af DSB reparation kan også iagttages via levende celle billeddannelse. Men selv om levende celle imaging giver mulighed for påvisning af reparation begivenheder i realtid, dens anvendelse er forstyrret ved kravet om, at proteiner være markeret med et fluorophore som normal god landbrugspraksis. Sådanne genetisk manipulation har potentiale til at ændre protein funktion og repræsenterer en yderligere tekniske barriere.
Billedanalyse via ImageJ software kan være besværlige at mestre. Den trinvis instruktion til reparation fokus anerkendelse og kvantificering ved hjælp af denne software er fastsat i håb om at fjerne denne hindring for andre grupper. Dette kunne føre til øget udnyttelse af den magtfulde software og fjerne cost dyrere programmer i en tid med faldende puljer af føderale tilskud.
I princippet bør varigheden af disse DSBs aktiver visualisering af undvigende reparation proteiner ved immunfluorescens mikroskopi. Dette kunne være tilfældet for proteiner, der er vanskeligt at se, fordi de ikke ophobes i en høj nok koncentration til at blive opdaget, fx, persistens af jeg-SceI induceret DSB resulterer i en større end typiske ophobning af reparation proteiner på læsion. Den forbedrede overflod kunne også forbedre visualiseringen, når påvisning hæmmes af en begrænsning i antistof kvalitet; en funktion, der kunne være særligt nyttig, når mindre studerede proteiner er identificeret som havende en indvirkning på DNA reparation. Til dato, denne tilgang er blevet bekræftet for 4 DNA reparere proteiner, nemlig RAD51, RPA70, BRCA1 og BRCA2 (data ikke vist, figur 2og reference17)
Endelig er der ændringer, der kunne gøres til denne protokol til at udvide typerne af DNA-skader, der kan blive forhørt samt de cellulære miljøer. Den mest iøjnefaldende ændring ville være skiftende kilde eller type af inducerede DNA-skader. Bevis af princippet for brug af UVB, ioniserende stråling, eller radiomimetics (phleomycin, bleomycin og etoposide) til at studere kinetik af DNA reparation er allerede blevet offentliggjort18,19,23,24 , 25. med mindre ændring, denne tilgang kan også belyse reparation protein svar af NHEJ på DSBs. Alternativt Britton et al. beskrive en før udvinding teknik, der kunne være brugt26. Yderligere, der er homing nicking endonucleases (-HmuI eller BasI), der har omfattende anerkendelse lokaliteter, svarende til-SceI27. Skelne dem fra SceI, forårsager disse enzymer enkelt-strenget DNA pauser (SSBs). At indføre webstedet anerkendelse for disse enzymer i en cellelinje ville tillade analyse af SSB reparation, der løber parallelt med den protokol, der er beskrevet i dette manuskript til spørgekriterierne langvarig DSBs. navnlig, processen med at integrere-SceI anerkendelse websted og kontrollere indførelsen af webstedet kan være besværligt. Heldigvis har fremskridt inden for genom-redigering teknologi (f.eks skarpere/Cas9 systemer) lettet denne byrde28. Der er også et felt for aktiv forskning, der har formået at engineering homing endonucleases at skære på en ønskede genomisk placering, hvilket tyder på, at i fremtiden, disse tekniske fremskridt og brug af CRISPR/Cas9 kan føre denne kloning skridt til at være undværes28,29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Joel Sanneman og Dr. Philine Wangemann af Konfokal mikroskopi kernen, finansieret af den Kansas State University College of Veterinary Medicine, for deres støtte til bestræbelserne på at udvikle denne teknik. pCBASceI var en gave fra Maria Jasin (Addgene plasmid # 26477) 30. U2OS DR-NGL celler var en slags gave fra Maria Jasin18.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mm Coverslips | VWR | 89015-725 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| 24-well plate | VWR | 82050-892 | |
| 96-well glass bottom plate | Cellvis | P96-1.5H-N | |
| Anti-H2AX Alexa488 | EMD Millipore | 05-636-AF488 | |
| Anti-Rad51 (D4B10) | Cell Signaling Technology | 8875S | |
| Bio-formats plugin for ImageJ | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher Scientific | 12100046 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 89510-194 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG Alexa594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | |
| Hydrogen Peroxide | sigma-Aldrich | 216763-100ML | |
| ImageJ Software | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| I-SceI Expression Vector | Addgene | 26477 | |
| Nail Polish- Insta Dri | Sally and Hansen | Clearly Quick (103) | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Bio Basic | PD8117 | |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049-500ML | |
| TurboFect Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | R0531 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 |
References
- Lindahl, T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).
- Branzei, D., Foiani, M. Regulation of DNA repair throughout the cell cycle. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 297-308 (2008).
- Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Mol Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
- Auclair, Y., Rouget, R., Drobetsky, E. A. ATR kinase as master regulator of nucleotide excision repair during S phase of the cell cycle. Cell Cycle. 8 (12), 1865-1871 (2009).
- Awasthi, P., Foiani, M., Kumar, A. ATM and ATR signaling at a glance. J Cell Sci. 128 (23), 4255-4262 (2015).
- Ceccaldi, R., Rondinelli, B., D'Andrea, A. D. Repair Pathway Choices and Consequences at the Double-Strand Break. Trends Cell Biol. 26 (1), 52-64 (2016).
- Chapman, J. R., Taylor, M. R. G., Boulton, S. J. Playing the End Game: DNA Double-Strand Break Repair Pathway Choice. Mol Cell. 47 (4), 497-510 (2012).
- Daley, J. M., Sung, P. 53BP1, BRCA1, and the Choice between Recombination and End Joining at DNA Double-Strand Breaks. Mol Cell Biol. 34 (8), 1380-1388 (2014).
- Hartlerode, A., Odate, S., Shim, I., Brown, J., Scully, R. Cell Cycle-Dependent Induction of Homologous Recombination by a Tightly Regulated I-SceI Fusion Protein. PLOS ONE. 6 (3), e16501 (2011).
- Brandsma, I., Gent, D. C. Pathway choice in DNA double strand break repair: observations of a balancing act. Genome Integr. 3, 9 (2012).
- Davis, A. J., Chen, D. J. DNA double strand break repair via non-homologous end-joining. Transl Cancer Res. 2 (3), 130-143 (2013).
- Reid, D. A., et al. Organization and dynamics of the nonhomologous end-joining machinery during DNA double-strand break repair. Proc Natl Acad Sci. 112 (20), E2575-E2584 (2015).
- Chen, J. J., Silver, D., Cantor, S., Livingston, D. M., Scully, R. BRCA1, BRCA2, and Rad51 Operate in a Common DNA Damage Response Pathway. Cancer Res. 59 (7 Supplement), 1752s-1756s (1999).
- D'Andrea, A. D. BRCA1: A Missing Link in the Fanconi Anemia/BRCA Pathway. Cancer Discov. 3 (4), 376-378 (2013).
- Gudmundsdottir, K., Ashworth, A. The roles of BRCA1 and BRCA2 and associated proteins in the maintenance of genomic stability. Oncogene. 25 (43), 5864-5874 (2006).
- Liu, S., et al. Distinct roles for DNA-PK, ATM and ATR in RPA phosphorylation and checkpoint activation in response to replication stress. Nucleic Acids Res. 40 (21), 10780-10794 (2012).
- Wallace, N. A., Khanal, S., Robinson, K. L., Wendel, S. O., Messer, J. J., Galloway, D. A. High Risk Alpha Papillomavirus Oncogenes Impair the Homologous Recombination Pathway. J Virol. , (2017).
- Pierce, A. J., Johnson, R. D., Thompson, L. H., Jasin, M. XRCC3 promotes homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells. Genes Dev. 13 (20), 2633-2638 (1999).
- Luzhna, L., Kathiria, P., Kovalchuk, O. Micronuclei in genotoxicity assessment: from genetics to epigenetics and beyond. Front Genet. 4, (2013).
- Jasin, M. Homologous repair of DNA damage and tumorigenesis: the BRCA connection. Oncogene. 21 (58), 8981-8993 (2002).
- Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. β-HPV 5 and 8 E6 Disrupt Homology Dependent Double Strand Break Repair by Attenuating BRCA1 and BRCA2 Expression and Foci Formation. PLOS Pathog. 11 (3), e1004687 (2015).
- Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. HPV 5 and 8 E6 Abrogate ATR Activity Resulting in Increased Persistence of UVB Induced DNA Damage. PLoS Pathog. 8 (7), (2012).
- Mah, L. J., Vasireddy, R. S., Tang, M. M., Georgiadis, G. T., El-Osta, A., Karagiannis, T. C. Quantification of γH2AX Foci in Response to Ionising Radiation. J Vis Exp. (38), e1957 (2010).
- Popp, H. D., Brendel, S., Hofmann, W. K., Fabarius, A. Immunofluorescence Microscopy of γH2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks. J Vis Exp. (129), e56617 (2017).
- Burma, S., Chen, B. P., Murphy, M., Kurimasa, A., Chen, D. J. ATM Phosphorylates Histone H2AX in Response to DNA Double-strand Breaks. J Biol Chem. 276 (45), 42462-42467 (2001).
- Britton, S., Coates, J., Jackson, S. P. A new method for high-resolution imaging of Ku foci to decipher mechanisms of DNA double-strand break repair. J Cell Biol. 202 (3), 579-595 (2013).
- Landthaler, M., Shen, B. W., Stoddard, B. L., Shub, D. A. I-BasI and I-HmuI: two phage intron-encoded endonucleases with homologous DNA recognition sequences but distinct DNA specificities. J Mol Biol. 358 (4), 1137-1151 (2006).
- Lackner, D. H., et al. A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging. Nat Commun. 6, 10237 (2015).
- Chan, S. H., Stoddard, B. L., Xu, S. Y. Natural and engineered nicking endonucleases--from cleavage mechanism to engineering of strand-specificity. Nucleic Acids Res. 39 (1), 1-18 (2011).
