Summary
Reparatie van dubbele streng DNA pauzes is een dynamisch proces, waarbij niet alleen de vorming van reparatie complexen in de pauzes, maar ook hun resolutie na de laesie is gericht. Hier, gebruiken we immunofluorescentie microscopie voor voorbijgaande en langdurige double-stranded pauzes als een instrument om te ontleden dit genoom onderhoud mechanisme.
Abstract
De reparatie van double-stranded pauzes (DSBs) in het DNA is een sterk gecoördineerde proces, waardoor de vorming en de resolutie van multi eiwit reparatie complexen. Dit proces wordt gereguleerd door een groot aantal proteïnen ter bevordering van de vereniging en scheiding van proteïnen om deze letsels. Bedankt voor een groot deel de mogelijkheid tot het uitvoeren van functionele screens van een enorme bibliotheek van eiwitten, er is een grotere waardering van de genen nodig voor de dubbel-streng DNA breuk reparatie. Vaak afvalrace of chemische remmer schermen identificeren eiwitten die betrokken zijn in de reparatie processen met behulp van verhoogde toxiciteit als een marker voor een eiwit dat is vereist voor DSB reparatie. Hoewel nuttig voor herkenbare roman cellulaire eiwitten die betrokken zijn bij het handhaven van genoom trouw, vereist functionele analyse de vaststelling van of de proteïne van belang lokalisatie, vorming of resolutie van reparatie complexen bevordert.
De ophoping van eiwitten van de reparatie kan gemakkelijk worden gedetecteerd als verschillende nucleaire foci door immunofluorescentie microscopie. Dus, vereniging en scheiding van deze proteïnen bij plaatsen van DNA-beschadiging toegankelijk zijn door het observeren van deze nucleaire foci representatieve tussenpozen na de inductie van dubbele streng DNA pauzes. Deze benadering kan ook mis gelokaliseerde reparatie factor eiwitten, worden geïdentificeerd als reparatie gebreken niet gelijktijdig met onvolledige vertragingen in reparatie voorkomen. In dit scenario kunnen langdurige dubbel-streng DNA breekt in cellen waar de site van de erkenning voor de genoemde enzym is geïntegreerd in het cellulaire genoom met het uitspreken van een zeldzame snijden endonuclease (b.v., SceI) worden ontworpen. De resulterende laesie is vooral moeilijk op te lossen als trouwe reparatie zal opnieuw van het enzym erkenning site, waarin wordt gevraagd een andere ronde van decollete. Dientengevolge, worden verschillen in de kinetiek van de reparatie opgeheven. Als reparatie complexen worden niet gevormd, heeft lokalisatie gehinderd. Dit protocol beschrijft de methodologie die nodig zijn ter specificatie van de veranderingen in de kinetiek van de reparatie, alsmede reparatie eiwit lokalisatie.
Introduction
Elke dag, elke cel in het menselijk lichaam wordt gebombardeerd met een geschatte 10.000 DNA laesies1. Deze existentiële bedreiging brengt ons in gevaar voor mutaties, oncogenese evenals cel dood. Ter bescherming van genoom trouw, cellen van zoogdieren geëvolueerd om te reageren op de DNA-beschadiging met een complexe reeks van eiwit verenigingen en wijzigingen. Deze reactie is ingedeeld in meerdere paden, gezamenlijk bekend als de DNA schade reactie (DDR)2,3. De DDR bestaat uit de accumulatie van DNA reparatie eiwitten op DNA laesies, zowel stoffelijk als ruimtelijk gecoördineerd. DDR induceert vaak celcyclus arrestatie om de propagatie of de intensivering van de schade die tijdens de replicatie van beschadigde DNA2,-4,5 optreden kante vermijden. Op zijn beurt, is het ook noodzakelijk voor de cellulaire levensvatbaarheid voor zwenking vandoor celcyclus arrestatie door distantieer reparatie complexen nadat reparatie is voltooid.
De verschillende soorten DNA-beschadiging behoren DSBs tot de meest schadelijke. Falen om te herstellen van de DSBs kan leiden tot chromosoom herschikkingen of grootschalige verwijderingen zoals het verlies van gehele chromosoom wapens. De reparatie van de DSBs is verdeeld in twee trajecten6,-7,8. Homologe recombinatie (HR) vereist een zus chromosoom te gebruiken als een sjabloon DNA en dus is beperkt tot laat S en G2/M fasen van de celcyclus9,10. Non-homologe einde deelname aan (NHEJ) beschikt niet over deze beperkingen maar kleine verwijderingen kan veroorzaken wanneer DSBs11,12te herstellen.
DSB herstellen specifiek en de DDR in het algemeen zijn actieve gebieden van onderzoek. Ondanks het in gunstig gescheiden trajecten wordt georganiseerd, is er een grote hoeveelheid redundantie. Inderdaad, veel eiwitten (BRCA1 BRCA2 en de RPA complexe bijvoorbeeld) zijn betrokken bij meerdere trajecten13,14,15,16. De reparatie van een laesie door één traject, kan leiden tot een tussentijdse schade die moet worden hersteld door een ander traject14. De verwevenheid van deze trajecten, gecombineerd met hun complexe taak van het werven van de juiste eiwitten op de juiste plaats voor de nauwkeurige hoeveelheid tijd die nodig is, vereist een multi-tiered regelgevingsproces.
Een recent rapport benadrukt de fijne kneepjes van de DDR door aan te tonen dat reparatie complexvorming, resolutie en lokalisatie elk afzonderlijk verminderde17 kunnen. Het algemene doel van het volgende protocol is definitief het ontleden van het vermogen van de cellen te herstellen van DSB. Met behulp van immunofluorescentie microscopie, kan accumulatie van reparatie eiwitten op de sites van de schade worden gevisualiseerd op de representatieve tijdstippen na de inductie van DSBs.
Deze techniek heeft meerdere voordelen voor veelgebruikte benaderingen. Reparatie is vaak onderzocht op keer punten en niet in staat om het dynamische proces van vergadering en dissociatie van reparatie complexen te vertegenwoordigen. Observatie van het volledige scala van reparatie van de eerste activering naar de volledige resolutie zorgt ervoor dat een vertraging in de reparatie niet als volledige remming onrechte is. Omgekeerd, het verzekert dat de inductie van een reparatie-antwoord dat niet inactivering van genoemde reactie niet als de normale of de overmatige activatie onrechte is.
Vertraagde eiwit complexvorming en de mis lokalisatie van reparatie eiwitten, echter, kunnen niet worden ondubbelzinnig onderscheiden met deze aanpak. Om te bepalen of reparatie eiwitten mis gelokaliseerde versus vertraagd in hun lokalisatie, kan een "long-lasting" DSB worden ingevoerd via enzymatische splitsing van cellulaire DNA. De resulterende laesie is telkens die het product gerepareerd wordt, wat resulteert in een duidelijke grote nucleaire reparatie focus en het verwijderen van de wereldlijke beperking van aanwerving wegging. Dit kan worden bereikt door aanpassing van de bestaande aanpak met het gebruik van een zeldzame snijden endonuclease (b.v., SceI) voor het opwekken van een langdurige DSB. De levensduur van DSBs maakt de visualisatie van de ongrijpbare reparatie eiwitten door immunofluorescentie microscopie. De verbeterde overvloed kan ook de visualisatie verbeteren wanneer detectie wordt belemmerd door de beperking van de antilichaam-kwaliteit, een functie die nuttig zijn kan wanneer de mindere bestudeerde eiwitten zijn geïdentificeerd als die van invloed zijn op DNA-herstel.
Wij bieden met name expliciete instructies voor een gratis image verwerking en analyse software (bijvoorbeeldImageJ). Hiermee verwijdert u een grote financiële belemmering in beeldanalyse, openen de ondervraging van DNA-herstel van de schade aan een breder publiek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Houd er rekening mee dat dit protocol is geschreven voor U2OS cellen met een ik-SceI erkenning site18. De cellen hoeven niet U2OS te worden maar de ik-SceI site moeten bevatten. Het protocol moet mogelijk worden aangepast (bijvoorbeeldaantal cellen zaadjes en incubatie tijden) afhankelijk van het type cellen die worden gebruikt.
1. de definitie van de kinetiek van DSB reparatie complexvorming
- U20S-DRGFP cellen op een 10 cm weefselkweek plaat tot en met 85-90% confluente groeien.
- Verwijder het medium en Incubeer bij kamertemperatuur (RT) in 3 mL EDTA gedurende 2 minuten.
- EDTA vervangen door 1 mL trypsine en Incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten ervoor zorgen dat de cellen worden losgemaakt van het oppervlak van de plaat door bekijken onder een microscoop. Neutraliseer trypsine met 5 mL van de Dulbecco bewerkt Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine.
- Bepaal de concentratie van cellen in deze schorsing met behulp van een hemocytometer en de trypan blauwe uitsluiting methode.
- Zaad 6 x 103 cellen per putje in 200 µL van een glazen-bodem 96-wells-plaat. Als alternatief, zaad 4 x 106 cellen in 8 mL op 12 mm coverslips geplaatst in een bord van 10 cm.
Opmerking: Elke goed of het dekglaasje aan vertegenwoordigt een enkel tijdstip, met inbegrip van het besturingselement. - Groeien de cellen 's nachts bij 37 ° C en 5% CO2.
- Inducerende DSBs
- Vervangen van de media van de 96-wells-plaat/10 cm schotel met H2O2 verdund tot een concentratie van 25 µM met DMEM + 10% FBS en Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur.
- Wassen van de cellen 3 x met 1 x PBS en vervangen door verse DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline/streptomycine. Incubeer de cellen bij 37 ° C voor 0, 1, 4, 8, 24 en 48 h. Zorg ervoor dat verse verdunningen van H2O2 worden gebruikt voor elk experiment.
Opmerking: Om te voorkomen doden van cellen op de H2O2 gebruikte concentratie hier, er zorg voor dat de dosis van schade laag is genoeg zodat het grootste deel van de cellen apoptosis en senescentie zal voorkomen. Het is cruciaal voor het observeren van het herstelproces. Dit wordt het best bereikt door het meten van de gevoeligheid aan een aantal doses. Voer een bepaling MTT of andere cel levensvatbaarheid test om te bepalen van de minimale concentratie van waterstofperoxide die kunnen worden gebruikt.
- Vaststelling en permeabilizing cellen
- Wassen van de cellen 3 keer met 1 x PBS. Verwijder een dekglaasje aan van de 10 cm plaat voor elk punt van tijd en plaats het in een enkel putje van een 24-well plaat voor de vaststelling van. Gebruik de naald en pincet om Verwijder voorzichtig het dekglaasje aan en het vermijden van cellen uit het dekglaasje aan oppervlak krassen.
- Fix de cellen door incubatie gedurende 15 minuten met 4% paraformaldehyde (PFA) in tijden na 1 h H2O2 blootstelling en verse DMEM vervanging (0, 1, 4, 8, 24 en 48 uur aangewezen).
- Wassen van de vaste coverslips 3 keer met PBS. Permeabilize de cellen met de niet-ionogene wasmiddel 0,5% verdund in 1 x PBS. Incubeer gedurende 15 minuten op RT, voor het wassen van 3 x met PBS.
Opmerking: Na permeabilization, opslag van coverslips is mogelijk in PBS bij 4 ° C voor ten minste een week.
- Reparatie complexe visualisatie
- Blokkeren van de 96-wells-plaat/coverslips in een oplossing van 3% bovien serumalbumine (BSA) en niet-ionogene wasmiddel 0,1% verdund in 1 x PBS (3% BSA oplossing) gedurende 1 uur op RT.
- Incubeer met primaire antilichamen die gericht zijn op de reparatie proteïne van belang, volgens de specificaties van de fabrikant in 3% BSA oplossing voor 1 h op RT, vóór het 3 keer wassen met PBS 1 x verdund.
- Incubeer de 96-wells-plaat/coverslips met secundair antilichaam verdund volgens de fabrikant protocol in 3% BSA oplossing. Bevestigen dat de secundaire fluorophores geen overlappende excitatie of emissie spectra.
- Na het wassen van de cellen met PBS 3 keer Voeg DAPI, volgens de specificaties van de fabrikant in 1 x PBS is verdund en Incubeer bij RT gedurende 5 min.
- Monteer de coverslips op dia's met een daling van de agent van de montage, om ervoor te zorgen de gezichten van de cel-zijde naar beneden. Druk op de coverslips zorgvuldig en geniet van enige overtollige montage-agent met een doekje.
- Zegel van de coverslips met doorzichtige nagellak sneldrogende en zorgen voor een volledige afdichting van het dekglaasje aan met de dia.
- Neem de beelden van de confocal microscoop door te focussen op de DAPI kanaal, voordat andere kanalen (met signalen van DNA reparatie gen van belang) om te voorkomen dat de invoering van bias in het experiment.
- U kunt ook kunnen afbeeldingen worden verkregen door Z-profielen van het gewenste gebied en de afbeelding in een enkel vliegtuig te visualiseren van alle detecteerbare foci condenserend.
Opmerking: Als DSB resolutie of proteïne van belang is niet-naleving op gekozen tijdstippen bepalen wanneer DSBs oplossen door het selecteren van een breed scala aan tijdstippen aanvankelijk (0 – 48 h post DSB inductie). De tijdstippen van belang zal afhankelijk van de methode van DSB inductie en de reparatie-proteïne van belang.
- Gratis ImageJ software gebruiken voor het definiëren van de kernen in de beelden van de microscopie immunofluorescentie.
Opmerking: Microscoop om afbeeldingen te openen, de Bio-formaten-plugin moet worden geïnstalleerd in ImageJ.- Open de confocal afbeeldingen (.czi of .tif) door het afbeeldingsbestand naar de ImageJ venster te slepen, of door het selecteren van "Bio-formaten importeur" met de "Plugin" werkbalk in ImageJ.
Opmerking: De "Bio-formaten importoptie" venster zal verschijnen. - Selecteer "Kanalen splitsen" te splitsen van de afbeelding in constitutieve DAPI en fluorescerende beelden binnen de "Bio-formaten importoptie" venster.
- Selecteer "Koloriet" in "kleuropties' in het drop-down menu. Selecteer "OK" om te openen de DAPI en Histone H2AX (H2AX) afbeeldingen als scheiden van windows en kies de DAPI-afbeelding.
- Selecteer de werkbalk "Afbeeldingen" en "Drempel aanpassen" optie om te selecteren van de kernen.
Opmerking: Een "Drempel" venster zal verschijnen. - De drempel van de afbeelding aanpassen door te schuiven van de onderste balk van het venster "Drempel" volledig naar rechts. Pas de bovenste balk totdat de kernen volledig rood met duidelijke contouren, en de zwarte achtergrond worden. Schakel niet van toepassing. Sluit het venster "Drempel aanpassen".
- Selecteer de werkbalk "Analyseren" en "Analyseren Particles" optie. Zie een "Analyseren Particles" venster verschijnen op het scherm.
- Ingang van de minimumgrootte van een kern.
Opmerking: Deeltjes onder de grootte ingevoerd zullen niet worden meegeteld als kernen. - Selecteer in het dropdown menu van "Tonen", "Omtrekken". Selecteer de optie "Toevoegen aan Manager". Klik op "OK" om een ' ROI Manager '-venster te openen.
Opmerking: De contouren van de kernen zal verschijnen in een apart venster. - Het toewijzen van nummers aan de kernen die geselecteerd kunnen worden uit het venster ' ROI Manager '.
- Open de confocal afbeeldingen (.czi of .tif) door het afbeeldingsbestand naar de ImageJ venster te slepen, of door het selecteren van "Bio-formaten importeur" met de "Plugin" werkbalk in ImageJ.
- Gebruik ImageJ te kwantificeren H2AX foci in immunofluorescentie microscopie beelden.
- Selecteer de "H2AX" foci venster (gekleurd met fluorescently geconjugeerd secundair antilichaam). Dan, selecteer de werkbalk die "Proces" en kies "Maxima vinden" om te vinden de foci binnen de kernen.
Opmerking: Een "Vinden Maxima" venster wordt geopend. - Kies de optie "Single Points" in het "Output Type" dropdown menu en selecteer "Preview puntselectie" te visualiseren de maxima/foci. Invoergegevens naar de waarde van een "Lawaai tolerantie" afhankelijk van de intensiteit van de fluorescentie van de afbeelding (afbeelding 1). Controleer of het uiterlijk van een wit venster met kleine zwarte stippen.
Opmerking: Deze punten vertegenwoordigen de H2AX foci/maxima die zijn gevonden. De ruis tolerantiewaarde moet constant voor alle afbeeldingen wordt geanalyseerd worden gehandhaafd. Een lage/hoge ruis-tolerantie zal te veel/weinig maxima (foci) binnen de kern zal afschilderen en niet een accurate weergave van de foci in de kern. - Selecteer de kernen waarvoor H2AX foci moeten worden gekwantificeerd voor vanuit het venster 'ROI Manager'. Selecteer alle de kernen door het controleren van de optie "show all".
- Selecteer "Maatregel" om het aantal maxima/foci binnen de geselecteerde kernen te meten.
Opmerking: Het aantal maxima/foci worden weergegeven als veelvouden van 255, dat wil zeggen, een maximale heeft een "RawIntDen" (geïntegreerde dichtheid) lezing van 255. - Kopieer de waarden van de "RawIntDen" en plak ze in software voor gegevensanalyse.
- Selecteer de "H2AX" foci venster (gekleurd met fluorescently geconjugeerd secundair antilichaam). Dan, selecteer de werkbalk die "Proces" en kies "Maxima vinden" om te vinden de foci binnen de kernen.
2. het analyseren van Localization voor een langdurige Double-streng DNA breuk
- Zaad-cellen in 96-wells-platen/coverslips zoals beschreven in de punten 1.1 en 1.2.
-
Inductie van dubbele streng DNA breekt
- Transfect cellen met de ik-SceI expressie vector met behulp van een lipide gebaseerde transfectiereagens volgens specificaties van de fabrikant. Wacht 24-72 uur na de Transfectie te maximaliseren van de expressie van de endonuclease. Bepalen of de transfectie geslaagd is door het vinden van cellen met een enkelvoud grote nucleaire γ-H2AX focus.
-
Overname van afbeeldingen
- Repareren, permeabilize, blokkeren en wassen van de 96-wells-plaat/coverslips zoals beschreven in paragraaf 1.8.
- Co Incubeer cellen met een antilichaam tegen γ-H2AX en het reparatie-proteïne van belang (hier, een primair antilichaam tegen RAD51 werd gebruikt) volgens de specificaties van de fabrikant in 3% BSA oplossing verdund.
- Wassen van de 96-wells-plaat/coverslips 3 keer met 1 x PBS. Incubeer de 96-wells-plaat/coverslips met secundair antilichaam verdund volgens de fabrikant protocol in 3% BSA oplossing. Bevestigen dat de secundaire fluorophores geen overlappende excitatie of emissie spectra.
- Identificeren van cellen die toegespitst op het grote nucleaire γ-H2AX zijn. Alleen neem foto's van deze cellen om te voorkomen dat vooringenomenheid.
-
Analyse van langdurige SceI geïnduceerde foci
- De langdurige foci handmatig, analyseren door het tellen van zowel het aantal cellen dat de grote γ-H2AX foci en co gelokaliseerde foci van de reparatie-proteïne van belang hebben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont de selectie van de juiste geluid-discriminatie voor maxima/foci kwantificering met behulp van ImageJ. De samengevoegde afbeeldingen van DAPI en de reparatie-proteïne van belang zijn op het linker paneel. Figuur 1A blijkt een lawaai discriminatie van 90 en markeert het juiste aantal foci. Kernen aan de rand (afgebeeld met een roze pijl) en foci buiten de kernen (afgebeeld met een gele pijl) worden niet meegeteld bij de kwantificering. Figuur 1B beeldt een laag geluidsniveau tolerantie van 50. Talrijke maxima worden aangeduid buiten de kern en binnen de kern. Figuur 1 c toont een hoge ruis-tolerantie van 220. Alleen een interne focus (een witte pijl) werd ontdekt. Te bieden de lezer een gevoel van "positieve" en "negatieve" resultaten, hebben we ook samengesteld representatieve resultaten in Figuur 2. Figuur 2A toont specifiek, co lokalisatie tussen een γ-H2AX focus (groen) en een reparatie proteïne van belang (rood). Ook een untransfected cel wordt weergegeven in de linker bovenhoek van dit paneel en een cel met een niet-nucleaire (valse) γ-H2AX focus wordt weergegeven in de bovenste rechts. Opmerking de micronuclei koppelen aan DNA schade machines zijn gelieve een waarschijnlijke bron van deze niet-nucleaire foci19. Figuur 2B biedt een hogere vergroting van de twee meest rechtse cellen van figuur 2A tot duidelijkheid in het hoe zij vastbesloten waren te zijn interieur en exterieur de kern, respectievelijk. Een voorbeeld van een nucleaire γ-H2AX focus zonder co lokalisatie van een reparatie-eiwit is weergegeven in figuur 2C. Een schematische voorstelling van dit protocol wordt gegeven in Figuur 3 geeft een overzicht van deze aanpak te karakteriseren DNA herstellen.
Figuur 1 : Representatieve analyse van dubbel-streng DNA breuk reparatie kinetiek. Representatieve beelden van γ-H2AX foci kwantificering softwarematig ImageJ (met Bio-formaten plugin). De linker panelen zijn samengestelde afbeeldingen van kernen (40 X vergroting), blauw gekleurd voor DAPI en groen voor γ-H2AX. Centrum panelen Toon referentie un-geanalyseerde kernen met γ-H2AX foci/maxima. (A) het juiste paneel toont maxima/foci detectie met een tolerantie van de ruis van 90 en is representatief voor de werkelijke schatting van het aantal foci in de kern. (B) het recht paneel toont maxima kwantificering met een laag geluidsniveau tolerantie (50). Maxima/foci kan worden gevonden buiten de kern (gele pijl), terwijl de meerderheid van de maxima gelegen in de kern zijn niet-specifieke achtergrond signalen. (C) het recht paneel toont maxima kwantificering met hoge ruis tolerantie (220). Slechts een enkele maximaal/focus (witte pijl) wordt gedetecteerd binnen de kern en is niet representatief voor de foci in de kern. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Representatief ik-SceI geïnduceerde dubbele streng DNA einden. Representatieve beelden van kernen van cellen die zijn geteeld op coverslips (40 X vergroting). Kernen zijn blauw gekleurd. Een reparatie-eiwit (RAD51) is rood gekleurd en γ-H2AX is groen gekleurd. (A) de drie panelen Toon de dezelfde drie cellen. In de linker meeste deelvenster kernen zijn zichtbaar. In het middelste deelvenster wordt kleuring voor RAD51 weergegeven. Op het juiste paneel, wordt γ-H2AX kleuring weergegeven. De kern in de rechter bovenhoek toont geen dat enkel teken van SceI geïnduceerde DSBs. De kern in het centrum (roze pijl) vertegenwoordigt een ware positieve gebeurtenis, aangezien er zowel een grote γ-H2AX nucleaire focus en een co gelokaliseerde RAD51 nucleaire focus. De kern aan de rechterkant heeft een valse grote γ-H2AX focus, want het is extranuclear. Foci buiten de kern moeten niet worden gebruikt voor co lokalisatie analyse. (B) Dit is een hogere vergroting van de samengevoegde afbeelding in deel A (midden en rechts de meeste cellen). De grote nucleaire gele focus die aangeeft overlapping van RAD51 en H2AX signaal wordt aangeduid met de roze pijl. (C) A representatief beeld van een nucleaire γ-H2AX focus zonder co kleuring van het DNA-reparatie eiwit van belang. In tegenstelling tot de focus aangeduid met een witte pijl in (A) en (B), illustreert de gele pijl typische resultaten wanneer reparatie eiwitten zijn verhinderd lokaliseren naar sites van schade. Schaal bar = 15 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Visuele voorstelling van protocol voor het analyseren van de dubbel-streng DNA breuk reparatie. (1) vertegenwoordiging van protocol stappen 1.1 voor het zaaien van de cellen op coverslips/glas onderste platen. (2) afbeelding van de inductie van dubbel-strand einden door behandelen met waterstofperoxide (rechts) of langdurige dubbel-strand einden inducerende door transfecting 3 µg SceI. (3) vertegenwoordiging van protocol stappen, 1.4 tot en met 1.5.3 voor visualisatie van dubbel-strand einden. (4a) afbeelding van confocale microscopie van cel gekleurd met DAPI (blauw) en γ-H2AX foci (groen). (4b) beeld van enkelvoud grote γ-H2AX foci (groen) opnieuw kernen vlek DAPI (blauw). (5a) afbeelding van de analyse van de γ-H2AX foci ImageJ (protocol stappen 1.10.1–1.11.5) gebruiken. (5b) voorstelling van handmatige graaf van grote langdurige γ-H2AX foci (protocol stap 2.4). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De analyse van DNA schade reparatie in het algemeen en de reparatie van de double-stranded DNA-einden specifiek is een actief gebied van onderzoek, omdat de gevolgen ervan beslaan tumorvorming tot fundamentele biologie6,20. Dit manuscript details een aanpak die nauwkeurig de bijdrage van RAD51 en γ-H2AX eiwitten naar de resolutie van DSBs door HR. Verheugen, deze methode ontleedt kan worden gebruikt voor het verhelderen van de extra functies van reparatie eiwitten bij DSBs14. De vergelijking van de kinetiek van de reparatie en de werving van reparatie machines aan ik-SceI geïnduceerde DSBs tussen cellen en cellen met de proteïne van belang knock-out, zou waarin de bijdrage van deze eiwitten de aanwerving, lokalisatie, en resolutie van de reparatie te DSBs factoren.
Visualiseren van reparatie kinetiek heeft diverse voordelen ten opzichte van gangbare benaderingen. Vaak is reparatie onderzocht op één keer de punten, die is niet in staat om het dynamische proces van vergadering en dissociatie van reparatie complexen te vertegenwoordigen. Observatie van het volledige scala van reparatie van eerste activering naar volledige resolutie zorgt ervoor dat een vertraging in de reparatie niet als volledige remming onrechte is. Omgekeerd, het verzekert dat inductie van een reparatie antwoord zonder de mogelijkheid om de inactivering van dat antwoord niet als normale of buitensporige activering is onrechte. Dit zijn grotendeels veranderingen in de toepassing van een gevestigde aanpak, maar het gebruik van een endonuclease van de zeldzame snijden voor het opwekken van een langdurige DSB is een nieuwe tool. Het staat de onderzoeker om ondubbelzinnig als de lokalisatie van een reparatie-eiwit wordt geremd in plaats van haar aanwerving een korte termijn na de sluiting van het experiment wordt vertraagd. SceI geïnduceerde DSB kan laatste voor dagen en theoretisch, zolang het enzym wordt uitgedrukt (moet de cel blijven levensvatbare). De kinetiek van DSB reparatie kan ook worden waargenomen via levende cel imaging. Echter, hoewel levende cel imaging maakt de ontdekking van reparatie evenementen in real-time, de toepassing ervan is belemmerd door de eis dat de eiwitten met een fluorophore zoals GFP worden gelabeld. Deze genetische manipulatie heeft het potentieel om te veranderen van eiwitfunctie en een extra technische barrière.
Beeldanalyse via ImageJ software kan erg onhandig om te overmeesteren. De stapsgewijze instructie voor reparatie focus erkenning en kwantificering met behulp van deze software wordt geleverd in de hoop deze hindernis voor andere groepen verwijderen. Dit kan leiden tot een verhoogd gebruik van de krachtige software en het elimineren van de kosten van de duurdere programma's in een tijd van krimpende zwembaden van de federale financiële steun.
In principe moet de duur van deze DSBs de visualisatie van de ongrijpbare reparatie eiwitten inschakelen door immunofluorescentie microscopie. Dit zou het geval is voor proteïnen die moeilijk te bekijken omdat ze niet in een hoog accumuleren doen genoeg concentratie worden gedetecteerd, bijvoorbeeld, de persistentie van de ik-SceI geïnduceerde DSB resulteert in een meer dan typische accumulatie van reparatie eiwitten op de laesie. De verbeterde overvloed kon ook de visualisatie verbeteren bij detectie wordt belemmerd door een beperking in de kwaliteit van het antilichaam; een functie die bijzonder nuttig zou kunnen zijn als minder bestudeerde eiwitten zijn geïdentificeerd als die van invloed zijn op DNA herstellen. Tot op heden is deze aanpak is geverifieerd voor 4 DNA repair eiwitten, namelijk RAD51, RPA70, BRCA1 en BRCA2 (gegevens niet worden weergegeven in afbeelding 2en verwijzing17)
Tot slot, zijn er wijzigingen die kunnen worden aangebracht in dit protocol uit te breiden van de types van DNA-schade die kan worden ondervraagd en de cellulaire omgevingen. De meest voor de hand liggende wijziging zou veranderen de bron of het type van geïnduceerde DNA-schade. Het bewijs van beginsel voor het gebruik van UVB, ioniserende straling of radiomimetics (phleomycin, bleomycine en etoposide) om te studeren de kinetiek van DNA-herstel reeds gepubliceerde18,19,23,24 , 25. met lichte wijziging, deze aanpak kan ook verhelderen reparatie eiwit reactie door NHEJ op DSBs. u kunt ook Britton et al. beschrijven een pre extractie-techniek die gebruikte26kon worden. Verder, er zijn homing plukt enzym (-HmuI of BasI) die uitgebreide erkenning plaatsen, gelijkend op-SceI27 hebben. Onderscheiden van SceI, veroorzaken deze enzymen single-streng DNA-einden (SSBs). Invoering van de site van de erkenning voor deze enzymen in een cellijn zou de analyse van SSB reparatie dat loopt parallel met het protocol beschreven in dit manuscript voor ondervragen langdurige DSBs. met name, het proces van integratie van de ik-SceI erkenning site en controleren van de invoering van de site kunnen moeizaam. Vooruitgang in technologie (zoals SCHERPER/Cas9 systemen) bewerken genoom hebben gelukkig deze last28versoepeld. Er is ook een veld van actief onderzoek dat is erin geslaagd engineering homing enzym te snijden op een gewenste genomic locatie, die dat in de toekomst suggereert, deze technische vooruitgang en het gebruik van CRISPR/Cas9 kan leiden deze klonen stap te zijn overbodig28,29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Joel Sanneman en Dr. Philine Wangemann van de Confocal Microscopie kern, gefinancierd door de Kansas State University College of Veterinary Medicine, voor hun steun aan de inspanningen voor de ontwikkeling van deze techniek. pCBASceI was een geschenk van Maria Jasin (Addgene plasmide # 26477) 30. U2OS DR-GFP cellen waren een soort geschenk van Maria Jasin18.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mm Coverslips | VWR | 89015-725 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| 24-well plate | VWR | 82050-892 | |
| 96-well glass bottom plate | Cellvis | P96-1.5H-N | |
| Anti-H2AX Alexa488 | EMD Millipore | 05-636-AF488 | |
| Anti-Rad51 (D4B10) | Cell Signaling Technology | 8875S | |
| Bio-formats plugin for ImageJ | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher Scientific | 12100046 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 89510-194 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG Alexa594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | |
| Hydrogen Peroxide | sigma-Aldrich | 216763-100ML | |
| ImageJ Software | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| I-SceI Expression Vector | Addgene | 26477 | |
| Nail Polish- Insta Dri | Sally and Hansen | Clearly Quick (103) | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Bio Basic | PD8117 | |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049-500ML | |
| TurboFect Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | R0531 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 |
References
- Lindahl, T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).
- Branzei, D., Foiani, M. Regulation of DNA repair throughout the cell cycle. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 297-308 (2008).
- Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Mol Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
- Auclair, Y., Rouget, R., Drobetsky, E. A. ATR kinase as master regulator of nucleotide excision repair during S phase of the cell cycle. Cell Cycle. 8 (12), 1865-1871 (2009).
- Awasthi, P., Foiani, M., Kumar, A. ATM and ATR signaling at a glance. J Cell Sci. 128 (23), 4255-4262 (2015).
- Ceccaldi, R., Rondinelli, B., D'Andrea, A. D. Repair Pathway Choices and Consequences at the Double-Strand Break. Trends Cell Biol. 26 (1), 52-64 (2016).
- Chapman, J. R., Taylor, M. R. G., Boulton, S. J. Playing the End Game: DNA Double-Strand Break Repair Pathway Choice. Mol Cell. 47 (4), 497-510 (2012).
- Daley, J. M., Sung, P. 53BP1, BRCA1, and the Choice between Recombination and End Joining at DNA Double-Strand Breaks. Mol Cell Biol. 34 (8), 1380-1388 (2014).
- Hartlerode, A., Odate, S., Shim, I., Brown, J., Scully, R. Cell Cycle-Dependent Induction of Homologous Recombination by a Tightly Regulated I-SceI Fusion Protein. PLOS ONE. 6 (3), e16501 (2011).
- Brandsma, I., Gent, D. C. Pathway choice in DNA double strand break repair: observations of a balancing act. Genome Integr. 3, 9 (2012).
- Davis, A. J., Chen, D. J. DNA double strand break repair via non-homologous end-joining. Transl Cancer Res. 2 (3), 130-143 (2013).
- Reid, D. A., et al. Organization and dynamics of the nonhomologous end-joining machinery during DNA double-strand break repair. Proc Natl Acad Sci. 112 (20), E2575-E2584 (2015).
- Chen, J. J., Silver, D., Cantor, S., Livingston, D. M., Scully, R. BRCA1, BRCA2, and Rad51 Operate in a Common DNA Damage Response Pathway. Cancer Res. 59 (7 Supplement), 1752s-1756s (1999).
- D'Andrea, A. D. BRCA1: A Missing Link in the Fanconi Anemia/BRCA Pathway. Cancer Discov. 3 (4), 376-378 (2013).
- Gudmundsdottir, K., Ashworth, A. The roles of BRCA1 and BRCA2 and associated proteins in the maintenance of genomic stability. Oncogene. 25 (43), 5864-5874 (2006).
- Liu, S., et al. Distinct roles for DNA-PK, ATM and ATR in RPA phosphorylation and checkpoint activation in response to replication stress. Nucleic Acids Res. 40 (21), 10780-10794 (2012).
- Wallace, N. A., Khanal, S., Robinson, K. L., Wendel, S. O., Messer, J. J., Galloway, D. A. High Risk Alpha Papillomavirus Oncogenes Impair the Homologous Recombination Pathway. J Virol. , (2017).
- Pierce, A. J., Johnson, R. D., Thompson, L. H., Jasin, M. XRCC3 promotes homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells. Genes Dev. 13 (20), 2633-2638 (1999).
- Luzhna, L., Kathiria, P., Kovalchuk, O. Micronuclei in genotoxicity assessment: from genetics to epigenetics and beyond. Front Genet. 4, (2013).
- Jasin, M. Homologous repair of DNA damage and tumorigenesis: the BRCA connection. Oncogene. 21 (58), 8981-8993 (2002).
- Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. β-HPV 5 and 8 E6 Disrupt Homology Dependent Double Strand Break Repair by Attenuating BRCA1 and BRCA2 Expression and Foci Formation. PLOS Pathog. 11 (3), e1004687 (2015).
- Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. HPV 5 and 8 E6 Abrogate ATR Activity Resulting in Increased Persistence of UVB Induced DNA Damage. PLoS Pathog. 8 (7), (2012).
- Mah, L. J., Vasireddy, R. S., Tang, M. M., Georgiadis, G. T., El-Osta, A., Karagiannis, T. C. Quantification of γH2AX Foci in Response to Ionising Radiation. J Vis Exp. (38), e1957 (2010).
- Popp, H. D., Brendel, S., Hofmann, W. K., Fabarius, A. Immunofluorescence Microscopy of γH2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks. J Vis Exp. (129), e56617 (2017).
- Burma, S., Chen, B. P., Murphy, M., Kurimasa, A., Chen, D. J. ATM Phosphorylates Histone H2AX in Response to DNA Double-strand Breaks. J Biol Chem. 276 (45), 42462-42467 (2001).
- Britton, S., Coates, J., Jackson, S. P. A new method for high-resolution imaging of Ku foci to decipher mechanisms of DNA double-strand break repair. J Cell Biol. 202 (3), 579-595 (2013).
- Landthaler, M., Shen, B. W., Stoddard, B. L., Shub, D. A. I-BasI and I-HmuI: two phage intron-encoded endonucleases with homologous DNA recognition sequences but distinct DNA specificities. J Mol Biol. 358 (4), 1137-1151 (2006).
- Lackner, D. H., et al. A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging. Nat Commun. 6, 10237 (2015).
- Chan, S. H., Stoddard, B. L., Xu, S. Y. Natural and engineered nicking endonucleases--from cleavage mechanism to engineering of strand-specificity. Nucleic Acids Res. 39 (1), 1-18 (2011).
