Summary
Reparação de quebras de DNA dobro-costa é um processo dinâmico, que exige não só a formação de complexos de reparação em intervalos, mas também sua resolução após a lesão é dirigida. Aqui, usamos microscopia de imunofluorescência para quebras de dupla-hélice transitórias e duradouro como uma ferramenta para dissecar esse mecanismo de manutenção do genoma.
Abstract
O reparo de quebras de dupla-hélice (DSBs) no DNA é um processo altamente coordenado, exigindo a formação e a resolução de complexos de proteína multi reparo. Este processo é regulado por uma miríade de proteínas que promovem a associação e dissociação de proteínas para essas lesões. Graças, em grande parte para a capacidade de executar telas funcionais de uma vasta biblioteca de proteínas, há uma maior valorização dos genes necessários para a reparação de ruptura do DNA dobro-costa. Telas de inibidor frequentemente nocaute ou química identificam proteínas envolvidas em processos de reparação usando toxicidade aumentada como um marcador para uma proteína que é necessária para o reparo de ORL. Embora úteis para identificar novas proteínas celulares envolvidas na manutenção da fidelidade do genoma, análise funcional exige a determinação de se a proteína de interesse promove a resolução de complexos de reparação, formação ou localização.
O acúmulo de proteínas de reparo pode ser prontamente detectado como distintos focos nucleares pela microscopia de imunofluorescência. Assim, a associação e dissociação destas proteínas nos locais de dano do ADN podem ser acessados por observando estes focos nucleares em intervalos representativos após a indução de quebras de DNA dobro-costa. Esta abordagem também pode identificar proteínas fator de reparação mal localizadas, se a reparação de defeitos não ocorrer simultaneamente com incompletos atrasos na reparação. Neste cenário, quebras de DNA dobro-Costa duradouro podem ser projetadas por expressando uma endonuclease corte raros (por exemplo, eu-SceI) nas células onde o site de reconhecimento para a referida enzima foi integrado no genoma celular. A lesão resultante é particularmente difícil de resolver como fiel reparação irá reintroduzir o sítio de reconhecimento da enzima, solicitando mais uma rodada de clivagem. Como resultado, as diferenças na cinética de reparação são eliminadas. Se não são formados complexos de reparação, localização tem sido impedida. Este protocolo descreve a metodologia necessária para identificar alterações na cinética de reparação, bem como a localização da proteína de reparo.
Introduction
Cada dia, cada célula no corpo humano é bombardeada com um número estimado de 10.000 DNA lesões1. Esta ameaça existencial coloca-nos em risco de mutações, mixomas, bem como a célula morte. Para proteger a fidelidade do genoma, células de mamíferos evoluíram para responder ao dano do ADN com uma complexa série de associações de proteína e modificações. Esta resposta é organizada em várias vias, conhecidas coletivamente como o DNA danos resposta (DDR)2,3. A DDR consiste em acúmulo de proteínas de reparo do DNA em lesões do ADN, coordenadas tanto temporal e espacialmente. DDR frequentemente induz a detenção do ciclo celular para evitar a propagação ou a intensificação de danos que podem ocorrer durante a replicação do DNA danificado2,4,5. Por sua vez, também é necessário para a viabilidade celular desligar a detenção do ciclo celular desassociando complexos de reparação após o reparo foi concluído.
Entre os vários tipos de dano do ADN, DSBs são os mais deletérios. Reparar DSBs pode resultar em rearranjos cromossômicos ou exclusões em grande escala, como a perda dos braços do cromossoma inteiro. A reparação de DSBs é dividida em duas vias6,7,8. Recombinação homóloga (HR) requer uma irmã cromossomo para usar como um modelo de DNA e, portanto, é limitado a fases tardias, S e G2/M do ciclo celular9,10. Non-homologous final juntando (NHEJ) não tem essas restrições, mas pode causar pequenas exclusões ao reparar DSBs11,12.
DSB reparar especificamente e o DDR em geral são ativas áreas de investigação. Apesar de ser organizados em percursos convenientemente separados, há uma grande quantidade de redundância. Com efeito, muitas proteínas (BRCA1, BRCA2 e o RPA complexo por exemplo) estão envolvidas em vários caminhos13,14,15,16. O reparo de uma lesão por uma via, pode levar a um dano intermediário que deve ser reparado por um outro caminho14. O entrelaçamento destas vias, combinadas com sua complexa tarefa de recrutar as proteínas certa para o local correto para a quantidade exacta de tempo necessário, requer um processo de regulamentação de várias camadas.
Um recente relatório destaca os meandros das DDR demonstrando que reparação complexante, resolução e localização podem cada um separadamente ser prejudicada17. O objectivo geral do seguinte protocolo é definitivamente dissecar a capacidade das células para reparar o ORL. Usando microscopia de imunofluorescência, acúmulo de proteínas de reparo aos sítios de dano pode ser visualizado nos pontos de tempo representativo após a indução de DSBs.
Esta técnica tem várias vantagens para abordagens comumente usadas. Frequentemente, reparação é investigado em pontos de tempo único e incapaz de representar o dinâmico processo de montagem e dissociação dos complexos de reparação. Observando a gama completa de reparação de ativação inicial para a completa resolução garante que um atraso na reparação não é incorrectamente identificado como inibição completa. Por outro lado, assegura que a indução de uma resposta de reparação que é incapaz de inativar resposta disse não é incorrectamente identificada como o normal ou a ativação excessiva.
Formação do complexo proteína retardada e a mis localização das proteínas de reparo, no entanto, podem não ser inequivocamente distinguidos com esta abordagem. Para determinar se as proteínas de reparo são mis localizadas contra um atraso em sua localização, um "long-lasting" ORL pode ser introduzido através de clivagem enzimática do DNA celular. A lesão resultante é recut cada vez que está consertado, resultando em um foco distinto grande reparação nuclear e removendo a restrição temporal do recrutamento. Isto pode ser conseguido modificando a abordagem existente com o uso de uma endonuclease de corte raro (por exemplo, eu-SceI) para induzir um ORL de longa duração. A longevidade de DSBs permite a visualização de proteínas de reparo indescritível pela microscopia de imunofluorescência. A maior abundância também poderia melhorar a visualização quando deteção é prejudicada pela limitação da qualidade do anticorpo, um recurso que pode ser útil quando menor proteínas estudadas são identificadas como tendo um impacto na reparação do DNA.
Notavelmente, nós fornecemos instruções explícitas para um software livre imagem processamento e análise (por exemplo, ImageJ). Isso remove a maior barreira financeira na análise de imagem, abrindo o interrogatório de reparação de danos de DNA para um público mais vasto.
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Protocol
Note-se, este protocolo escrito para U2OS células contendo um eu-SceI reconhecimento local18. As células não precisam ser U2OS, mas devem conter o site eu-SceI. O protocolo pode precisar ser ajustada (por exemplo, número de células semeadas e tempos de incubação) dependendo do tipo de células utilizadas.
1. definir a cinética de ORL reparação complexante
- Desenvolvem-se células de U20S-DRGFP em uma placa de cultura de tecido de 10cm até 85-90% confluentes.
- Remova a mídia e incubar à temperatura ambiente (RT) em 3 mL de EDTA por 2 min.
- Substituir o EDTA com 1 mL de tripsina e incubar a 37 ° C por 5 min. Certifique-se de que as células são desanexadas da superfície da chapa por visualização sob um microscópio. Neutralize a tripsina com 5 mL de Dulbecco modificado águia médio (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% penicilina/estreptomicina.
- Determine a concentração de células em suspensão usando um hemocytometer e o método de exclusão azul trypan.
- Sementes de 6 x 103 células/poço em 200 µ l de uma placa de 96 poços de fundo de vidro. Como alternativa, células de semente 4 x 106 em 8 mL em lamelas de 12mm colocado em uma placa de 10 cm.
Nota: Cada bem ou lamela representa um ponto único de tempo, incluindo o controle. - Crescem as células durante a noite a 37 ° C e 5% de CO2.
- Indução de DSBs
- Substitua os meios de comunicação do prato placa de 96 poços/10 cm H2O2 diluído a uma concentração de 25 µM com DMEM + 10% FBS e incubar a 37 ° C, durante 1 h.
- Lave as células 3 x com 1X PBS e substituir com DMEM fresco suplementados com 10% FBS e 1% penicilina/estreptomicina. Incube as celulas em 37 ° C para 0, 1, 4, 8, 24 e 48 h. Certifique-se de que o frescas diluições de H2O2 são utilizadas para cada experimento.
Nota: Para evitar matar células a concentração de2 H2O usado aqui, certifique-se que a dose de danos é baixa bastante de modo que a maior parte das células vai evitar a apoptose e senescência. É fundamental observar o processo de recuperação. Isto é melhor conseguido através da medição da sensibilidade a uma gama de doses. Realize um ensaio de MTT ou outro ensaio da viabilidade celular para determinar a concentração mínima de peróxido de hidrogênio que pode ser usado.
- Fixação e permeabilizing células
- Lave as células 3 vezes com PBS 1x. Remova a placa de 10 cm para cada ponto de tempo uma lamela e colocá-lo em um único poço de uma placa de 24 para fixação. Use a agulha e a pinça para retirar cuidadosamente a lamela e evitar coçar as células da superfície da lamela.
- Fix as células incubando por 15 min com paraformaldeído 4% (PFA) no designado vezes após 1 h de exposição de2 H2O e substituição de DMEM fresca (0, 1, 4, 8, 24 e 48 h).
- Lave as lamínulas fixas 3 vezes com PBS. Permeabilize as células com 0,5% de detergente não-iônico diluído em 1X PBS. Incube durante 15 min em RT, antes de lavar 3x com PBS.
Nota: Após a permeabilização, armazenamento de lamelas é possível em PBS a 4 ° C pelo menos uma semana.
- Visualização complexa de reparação
- Bloquear as placa de 96 poços/lamelas em uma solução de 3% albumina de soro bovino (BSA) e 0,1% de detergente não-iônico diluído em PBS 1x (solução de 3% BSA) por 1h no RT
- Incube com os anticorpos primários que visam a reparação de proteína de interesse, diluída de acordo com as especificações do fabricante em solução de BSA 3% para 1 h no RT, antes de lavar 3 vezes com PBS 1x.
- Incube as placa de 96 poços/lamelas com anticorpo secundário diluído de acordo com o protocolo do fabricante em solução de BSA de 3%. Confirme que o fluorophores secundários não têm sobreposição de excitação ou espectros de emissão.
- Depois de lavar as células com PBS 3 vezes adicionar DAPI, diluída de acordo com as especificações do fabricante em 1X PBS e incubam a RT por 5 min.
- Monte as lamelas em slides com uma gota de agente de montagem, certificando-se as faces laterais de célula para baixo. Pressione as lamelas com atenção e absorva qualquer agente de montagem em excesso com uma limpeza.
- Selar as lamelas com esmalte secagem rápida transparente e garantir uma vedação completa da lamela com o slide.
- Com as imagens do microscópio confocal, centrando-se no canal de DAPI, antes de outros canais (com sinais de gene de reparo do DNA de interesse) para evitar a introdução de viés para o experimento.
- Alternativamente, imagens podem ser adquiridas por tomar Z-seções da região desejada e condensando a imagem em um único plano para Visualizar todos os focos detectáveis.
Nota: Se não for observada resolução DSB ou proteína de interesse em pontos de tempo escolhidos, determinar quando DSBs resolver selecionando uma ampla gama de pontos de tempo inicialmente (0 – 48 h após a indução de ORL). Pontos de interesse de tempo irão variar pelo método de indução de ORL e a reparo de proteína do interesse.
- Use software livre ImageJ para definir os núcleos nas imagens de microscopia de imunofluorescência.
Nota: Para abrir imagens de microscópio, o Bio-formatos plug-in deve ser instalado no ImageJ.- Abra as imagens confocal (.czi ou. tif), arrastando o arquivo de imagem para a janela do ImageJ, ou selecionando "Bio-formatos importador" na barra de ferramentas "Plugin" no ImageJ.
Nota: A janela de "Bio-formatos opção de importação" irá aparecer. - Selecione "Split canais" para dividir a imagem em DAPI constitutiva e imagens fluorescentes dentro da janela de "Bio-formatos opção de importação".
- Selecione "Colorized" em "Opções de cores" no menu suspenso. Selecione "Okey" para abrir o DAPI e H2AX de histona (H2AX) imagens como separar windows e escolha a imagem DAPI.
- Selecione a barra de ferramentas "Imagem" e "Ajustar o limiar" Selecione opção para núcleos.
Nota: Vai aparecer uma janela de "Limiar". - Ajuste o limite de imagem deslizando a barra inferior da janela do "Limiar" completamente para a direita. Ajuste a barra superior até os núcleos aparecem completamente vermelhos com contornos distintos e o fundo preto. Não selecione aplicar. Feche a janela "Ajustar o limiar".
- Selecione a opção de "Analisar partículas" e "Analisar" barra de ferramentas. Ver uma janela de "Analisar partículas" aparece na tela.
- O tamanho mínimo de um núcleo de entrada.
Nota: Partículas abaixo o tamanho digitada não serão contadas como núcleos. - No menu suspenso "Show", selecione "Contornos". Selecione a opção "Adicionar ao Gerenciador". Clique em "Okey" para abrir uma janela de "ROI Manager".
Nota: Os contornos dos núcleos irão aparecer em uma janela separada. - Atribua números para os núcleos que podem ser selecionados na janela "Gerenciador de ROI".
- Abra as imagens confocal (.czi ou. tif), arrastando o arquivo de imagem para a janela do ImageJ, ou selecionando "Bio-formatos importador" na barra de ferramentas "Plugin" no ImageJ.
- Use o ImageJ para quantificar H2AX focos em imagens de microscopia de imunofluorescência.
- Selecione a janela de focos de "H2AX" (manchada com anticorpo secundário conjugado fluorescente). Em seguida, selecione barra de ferramentas "Processo" e escolha "Como encontrar a Maxima" para encontrar os focos dentro dos núcleos.
Nota: Abrirá uma janela de "Encontrar Maxima". - Escolha a opção "Single pontos" no menu suspenso "Tipo de saída" e selecione "Seleção de ponto de visualização" para visualizar os maxima/focos. Entrada de um valor de "Tolerância de ruído", dependendo da intensidade de fluorescência da imagem (Figura 1). Verifique a aparência de uma janela branca com pequenos pontos pretos.
Nota: Estes pontos representam os focos de H2AX/máximos que foram detectados. O valor de tolerância de ruído deve ser mantido constante para todas as imagens sendo analisadas. Uma tolerância de ruído de baixa/alta vai retratar também muitos/poucos maxima (focos) dentro do núcleo e não será uma representação precisa dos focos dentro do núcleo. - Selecione os núcleos para os quais H2AX focos devem ser quantificados da janela "Gerenciador de ROI". Selecione todos os núcleos, marcando a opção "Mostrar tudo".
- Selecione "Medida" para medir o número de maxima/focos dentro dos núcleos selecionados.
Nota: O número de maxima/focos aparece como múltiplos de 255, ou seja, um máximo tem uma leitura de "RawIntDen" (densidade integrada) de 255. - Copiar os valores de "RawIntDen" e colá-los em software para análise de dados.
- Selecione a janela de focos de "H2AX" (manchada com anticorpo secundário conjugado fluorescente). Em seguida, selecione barra de ferramentas "Processo" e escolha "Como encontrar a Maxima" para encontrar os focos dentro dos núcleos.
2. análise de localização para uma pausa de longa duração Double-strand DNA
- Células de sementes em placas de 96 poços/lamelas conforme descrito nas seções 1.1 e 1.2.
-
Indução de quebras de DNA dobro-costa
- Transfect células com o vetor de expressão do eu-SceI usando um reagente de Transfeccao de lipídios-baseado de acordo com as especificações do fabricante. Espere 24-72 h após a transfeccao para maximizar a expressão endonuclease. Determine se a transfeccao foi bem sucedido, localizando-se células com um foco singular grande nuclear γ-H2AX.
-
Aquisição de imagens
- Corrigir, permeabilize, bloquear e lavar as placa de 96 poços/lamelas conforme descrito na seção 1.8.
- Co, incubar as células com um anticorpo contra γ-H2AX e a reparação de proteína de interesse (aqui, um anticorpo primário contra RAD51 foi usado) diluído de acordo com as especificações do fabricante em solução de 3% BSA.
- Lave as placa de 96 poços/lamelas 3 vezes com PBS 1x. Incube as placa de 96 poços/lamelas com anticorpo secundário diluído de acordo com o protocolo do fabricante em solução de BSA de 3%. Confirme que o fluorophores secundários não têm sobreposição de excitação ou espectros de emissão.
- Identifica as células que têm um foco grande γ-H2AX nuclear. Apenas tire fotos dessas células para evitar o viés.
-
Análise de longa duração-SceI induzido focos
- Analise os focos de longa duração manualmente, pela contagem do número de células que possuem o γ-H2AX grandes focos e co localizados focos da reparação proteína de interesse.
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Representative Results
Figura 1 descreve a seleção da discriminação correta do ruído para quantificação de maxima/focos usando o ImageJ. As imagens mescladas de DAPI e a proteína de reparo de interesse estão no painel esquerdo. A figura 1A mostra uma discriminação de ruído de 90 e marca o número correto de focos. Núcleos na borda (retratado com uma flecha-de-rosa) e focos fora dos núcleos (representados com uma seta amarela) não são contados durante a quantificação. Figura 1B retrata uma tolerância de baixo ruído de 50. Maxima numerosos é identificado fora do núcleo e dentro do núcleo. A Figura 1 mostra uma tolerância de ruído elevado de 220. Apenas um único foco (uma seta branca) foi detectado. Para oferecer ao leitor uma sensação de "positiva" e resultados "negativos", nós compilamos também resultados representativos na Figura 2. Especificamente, a Figura 2A retrata co localização entre um foco de γ-H2AX (verde) e uma proteína de reparo de interesse (vermelho). Da mesma forma, uma célula untransfected é mostrada no canto superior esquerdo deste painel e uma célula com um foco não-nucleares γ-H2AX (falso) é indicada no canto superior direita. Por favor note que os micronúcleos associam com maquinaria de dano do ADN são uma fonte provável desses focos não-nucleares19. Figura 2B fornece uma maior ampliação das duas células mais direito da Figura 2A para fornecer clareza em como eles estavam determinados a ser interior e exterior para o núcleo, respectivamente. Um exemplo de um foco de γ-H2AX nuclear sem localização co de uma proteína de reparo é mostrado na Figura 2. Um esquema do presente protocolo é fornecido na Figura 3 que resume esta abordagem para caracterizar reparar o ADN.
Figura 1 : Análise representativa da dobro-Costa DNA quebra reparação cinética. Imagens representativas de quantificação de focos de γ-H2AX usando software ImageJ (com Bio-formatos plugin). Os painéis à esquerda são imagens compostas de núcleos (ampliação de X 40), manchados de azuis para verde para γ-H2AX e DAPI. Centro painéis mostram referência un-analisados núcleos com focos de γ-H2AX/maxima. (A) o painel direito mostra a detecção de focos/maxima com uma tolerância de ruído de 90 e é representante da real estimativa do número de focos dentro do núcleo. (B) o direito painel mostra quantificação máxima com uma tolerância de baixo ruído (50). Maxima/focos podem ser detectados fora do núcleo (seta amarela), enquanto a maioria dos valores máximos localizados dentro do núcleo são sinais de fundo específico. (C) o direito painel mostra quantificação maxima com tolerância de ruído elevado (220). Apenas um único máximo/foco (seta branca) é detectado dentro do núcleo e não é representativo dos focos dentro do núcleo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Representante SceI induzida por quebras de DNA dobro-costa. Imagens representativas de núcleos de células cultivadas em lamelas (ampliação de 40 X). Núcleos são manchados de azuis. Uma proteína de reparo (RAD51) está manchada de vermelho e γ-H2AX está manchado de verde. (A), os três painéis mostrar os mesmos três células. No canto esquerdo mais painel, núcleos são visíveis. No painel do meio, coloração para RAD51 é mostrado. No painel direito, γ-H2AX coloração é mostrado. O núcleo no canto direito superior não mostra que qualquer sinal de eu-SceI induzida DSBs. O núcleo no centro (seta cor de rosa) representa um verdadeiro acontecimento positivo, como ele tem um foco de grande γ-H2AX nuclear e foco nuclear RAD51 co localizado. O núcleo do lado direito tem um foco grande falso γ-H2AX como é extranuclear. Focos, fora do núcleo não devem ser usados para análise de localização co. (B) esta é uma maior ampliação da imagem mesclada em parte A (centro e direita a maioria das células). O grande foco de amarelo nuclear indicando a sobreposição de sinal RAD51 e H2AX é indicado pela seta rosa. (C) A imagem representativa de um foco de γ-H2AX nuclear sem co coloração da proteína de reparo do DNA de interesse. Ao contrário o foco assinalado com uma seta branca no (A) e (B), a seta amarela ilustra resultados típicos, quando proteínas de reparo são impedidas de localização para locais de danos. Barra de escala = 15 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Imagem de protocolo para a análise de reparação DNA dobro-costa. (1) representação do protocolo passos 1.1 para a propagação de células para lamelas/vidro inferior placas. (2) ilustração da indução da dobro-Costa quebras de tratamento com peróxido de hidrogênio (à direita) ou induzindo quebras duradouro duplo por transfecting µ g 3 do eu-SceI. (3) representação das etapas do protocolo 1.4 a 1.5.3 para visualização das rupturas da dobro-costa. (4a) imagem representando a microscopia confocal de células coradas com DAPI (azul) e focos de γ-H2AX (verde). núcleos (4b), imagem de focos singular grande γ-H2AX (verde) novamente mancham DAPI (azul). (5a) representação da análise dos focos de γ-H2AX usando o ImageJ (protocolo 1.10.1–1.11.5 de passos). (5b) representação da contagem manual dos grandes focos de γ-H2AX duradouro (etapa de protocolo 2.4). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A análise do DNA reparação de danos em geral e o reparo de quebras de DNA dupla-hélice especificamente é uma área ativa de pesquisa porque suas consequências abrangem tumorigênese de biologia básica6,20. Este detalhes de manuscrito, uma abordagem que disseca com precisão a contribuição das proteínas RAD51 e γ-H2AX para a resolução de DSBs através de HR olhando para a frente, esse método pode ser usada para elucidar as funções adicionais de proteínas de reparo no DSBs14. A comparação da cinética de reparação e o recrutamento de reparação máquinas para SceI induzida DSBs entre células e células de controle com a proteína de interesse nocauteado, definiria a contribuição de proteínas para o recrutamento, localização, e resolução de fatores de reparação de DSBs.
Visualizando a cinética de reparação tem várias vantagens sobre abordagens comumente usadas. Frequentemente, reparação é investigada em pontos de tempo único, que é incapaz de representar o dinâmico processo de montagem e dissociação dos complexos de reparação. Observando a gama completa de reparação de ativação inicial para resolução completa garante que um atraso na reparação não é incorrectamente identificado como inibição completa. Por outro lado, assegura a indução de uma resposta de reparação sem a capacidade de inativar que a resposta não é identificados incorretamente como normal ou excessiva ativação. Estas são em grande parte as alterações na aplicação de uma abordagem estabelecida, mas o uso de uma endonuclease de corte raro para induzir um ORL de longa duração é uma nova ferramenta. Ele permite que o investigador determinar inequivocamente se a localização de uma proteína de reparo é inibida em vez de seu recrutamento sendo atrasado em um curto período de tempo, além da conclusão do experimento. Eu-SceI induzido can DSB duram por dias e teoricamente, enquanto a enzima é expressa (deve a célula permanecer viável). A cinética de reparação DSB também pode ser observada através de imagens de células vivas. No entanto, embora ao vivo imagem latente da pilha permite a detecção de eventos de reparação em tempo real, sua aplicação é prejudicada pela exigência que proteínas será marcado com um fluoróforo como GFP. Tal manipulação genética tem potencial para alterar a função das proteínas e representa uma barreira técnica adicional.
Análise de imagem através do software ImageJ pode ser pesado para mestre. A instrução passo a passo para o reconhecimento de foco de reparação e quantificação usando este software é fornecida na esperança de remover este obstáculo para outros grupos. Isso poderia levar a maior utilização do software poderoso e eliminar o custo de programas mais caros em um momento de encolhimento piscinas de subvenção federal apoio.
Em princípio, a duração destes DSBs deve permitir a visualização de proteínas de reparo indescritível pela microscopia de imunofluorescência. Este poderia ser o caso de proteínas que são difíceis de ver, porque eles não se acumulam em uma alta a concentração suficiente para ser detectado, por exemplo, a persistência dos resultados DSB SceI induzida em um maior do que o típico acúmulo de proteínas de reparo no a lesão. A maior abundância também poderia melhorar a visualização quando deteção é impedida por uma limitação na qualidade do anticorpo; reparação de um recurso que pode ser particularmente útil quando menos proteínas estudadas são identificadas como tendo um impacto do DNA. Até à data, esta abordagem foi verificada por 4 proteínas, nomeadamente RAD51, RPA70, BRCA1 e BRCA2 de reparação do DNA (dados não mostrados, Figura 2e referência17)
Finalmente, existem modificações que poderiam ser feitas para este protocolo para expandir os tipos de dano do ADN que pode ser interrogado assim como os ambientes celulares. A alteração mais óbvia seria mudar a fonte ou o tipo de dano ao DNA induzido. A prova de princípio para o uso de UVB, radiação ionizante ou radiomimetics (phleomycin, bleomicina e etoposide) para estudar a cinética de reparação do DNA já foi publicado18,19,23,24 , 25. com ligeira modificação, esta abordagem pode também elucidar resposta de proteína de reparo por NHEJ de DSBs. Alternativamente, Britton et al . Descreva uma técnica de pre-extração que poderia ser usado26. Além disso, lá são homing roubando as endonucleases (eu-HmuI ou eu-BasI) que têm sites de amplo reconhecimento, semelhantes a SceI eu27. Distinguindo-os do eu-SceI, estas enzimas causam quebras de single-strand DNA (SSBs). Apresentando o site de reconhecimento para estas enzimas em uma linha celular permitiria a análise de reparação SSB paralela o protocolo descrito neste manuscrito para interrogar duradouro DSBs. notadamente, o processo de integração do reconhecimento do eu-SceI site e verificar a introdução do site podem ser trabalhosos. Felizmente os avanços na tecnologia (tais como sistemas de CRISPAR/Cas9) de edição de genoma tem facilitado este fardo28. Há também um campo de pesquisa ativo que foi bem-sucedida em engenharia endonucleases homing para cortar em um genoma local desejado, que sugere que, no futuro, esses avanços de engenharia e o uso de CRISPR/Cas9 pode levar este passo clonagem para ser dispensável28,,29.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos Joel Sanneman e Dr. Philine Wangemann do núcleo microscopia Confocal, financiado pelo Kansas estado Universidade faculdade de medicina veterinária, pelo apoio dos esforços para desenvolver esta técnica. pCBASceI foi um presente de Maria Jasin (plasmídeo Addgene # 26477) 30. U2OS DR-GFP células foram um presente tipo de Maria Jasin18.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mm Coverslips | VWR | 89015-725 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| 24-well plate | VWR | 82050-892 | |
| 96-well glass bottom plate | Cellvis | P96-1.5H-N | |
| Anti-H2AX Alexa488 | EMD Millipore | 05-636-AF488 | |
| Anti-Rad51 (D4B10) | Cell Signaling Technology | 8875S | |
| Bio-formats plugin for ImageJ | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher Scientific | 12100046 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 89510-194 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG Alexa594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | |
| Hydrogen Peroxide | sigma-Aldrich | 216763-100ML | |
| ImageJ Software | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| I-SceI Expression Vector | Addgene | 26477 | |
| Nail Polish- Insta Dri | Sally and Hansen | Clearly Quick (103) | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Bio Basic | PD8117 | |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049-500ML | |
| TurboFect Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | R0531 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 |
References
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