Summary
Ремонт двухнитевые разрывы ДНК представляет собой динамичный процесс, требующий не только образование комплексов ремонта на перерывы, но и их резолюции после поражения решается. Здесь мы используем иммунофлуоресценции для переходных и long-lasting двуцепочечные разрывы как инструмент для вскрыть этот механизм обслуживания генома.
Abstract
Ремонт двуцепочечные разрывы (DSBs) в ДНК является весьма скоординированного процесса, что обусловливает необходимость формирования и разрешению многих белков ремонт комплексов. Этот процесс регулируется мириад белков, которые способствуют ассоциации и дизассоциация белков для этих поражений. Благодаря в значительной степени способности выполнять функциональные экраны обширной библиотеки белков, есть большую признательность генов, необходимых для ремонта перерыв двухручьевой ДНК. Экраны часто нокаут или химического ингибитор идентификации белков, участвующих в процессах восстановления, используя увеличение токсичности в качестве маркера для белка, который необходим для ремонта DSB. Хотя полезно для выявления роман клеточных белков, участвующих в сохранении верности генома, функциональный анализ требует определения ли протеина интереса способствует локализации, формирование или разрешение ремонта комплексов.
Накопление белков, ремонт может быть легко обнаружен как собственный ядерный очагов иммунофлуоресценции. Таким образом ассоциации и дизассоциация этих белков в местах повреждения ДНК могут быть достиганы наблюдая эти ядерные очагов представитель интервалами после индукции двухнитевые разрывы ДНК. Этот подход также может определить неправильно локализованных ремонт фактор белков, если ремонт дефектов происходит одновременно с неполной задержек в ремонт. В этом случае долговечные двухнитевые разрывы ДНК могут быть спроектированы выразить редких резки эндонуклеазы (например, SceI) в клетках, где признание сайт для указанного фермента был интегрирован в клеточного генома. Результате поражения особенно трудно решить как верный ремонт будет вновь фермента признание сайта, вызвав еще один раунд расщепления. В результате устранены различия в кинетике ремонта. Если ремонт комплексы не образуются, препятствуют локализации. Этот протокол описывает методологии, необходимые для идентификации изменений в кинетика ремонт, а также ремонт белка локализации.
Introduction
Каждый день, каждая клетка в организме человека обстреляли с примерно 10 000 ДНК поражений1. Эта экзистенциальная угроза ставит нас на риск мутации, онкогенеза, а также клеток смерть. Для защиты генома верности, клетки млекопитающих эволюционировали, чтобы ответ на повреждения ДНК с серию сложных белков ассоциаций и модификаций. Этот ответ разделено на несколько путей, известные как ДНК повреждения ответ (ГДР)2,3. DDR состоит из накопления протеинов ремонта ДНК в повреждения ДНК, координировала височно и пространственно. DDR часто побуждает арест клеточного цикла, чтобы избежать распространения или интенсификация повреждения, которые могут произойти во время репликации поврежденной ДНК2,,4-5. В свою очередь это также необходимо для клеточной жизнеспособности выключить арест клеточного цикла, отмежевывается ремонта комплексы, после завершения ремонта.
Среди различных видов повреждения ДНК DSBs являются наиболее пагубным. Неспособность восстановить DSBs может привести к хромосоме перестановки или крупномасштабных изъятия такие потери всей хромосомы оружия. Ремонт DSBs делится на два пути6,,7-8. Гомологичная рекомбинация (HR) требует сестра хромосома для использования в качестве шаблона ДНК и таким образом ограничивается конце S и G2/M фазы клеточного цикла9,10. Non гомологичных конец присоединения (NHEJ) не имеют эти ограничения, но может привести к небольшой удаления при ремонте DSBs11,12.
DSB ремонт специально и РДР в целом являются активные области расследования. Несмотря на организуются в удобно разлученных пути, есть много избыточности. Действительно многие белки (BRCA1, BRCA2 и комплекс для примера РПА) участвуют в нескольких путей13,14,,1516. Ремонт поражения на один путь, может привести к повреждению промежуточных, которые должны быть отремонтированы на другой путь14. Переплетение этих путей, в сочетании с их сложной задачей подбора право белков в нужное место для точное количество времени, необходимое, требует многоуровневого процесса регулирования.
Недавнем докладе подчеркивается в тонкостях DDR, продемонстрировав, что ремонт комплекс формирования, резолюции, локализации каждый отдельно можно и нарушением17. Общая цель следующий протокол является окончательно вскрыть способность клеток для восстановления DSB. С помощью иммунофлуоресценции, накопление протеинов ремонта на объектах повреждения могут быть визуализированы на представителя время точках после индукции DSBs.
Этот метод имеет несколько преимуществ для часто используемых подходов. Часто ремонт исследованы в одно время точках и неспособно представляющие динамичный процесс сборки и диссоциации ремонт комплексов. Наблюдения за полный спектр ремонта от первоначальной активации полной резолюции гарантирует, что задержка в ремонт не ошибочно как полное торможение. Наоборот он уверяет, что индукции ремонт ответ, что не способна инактивировать сказал ответ не ошибочно как нормальный или чрезмерного активации.
Комплекс формирования отсроченного белка и неправильного локализации ремонт белков, однако, могут не отличать однозначно с этим подходом. Чтобы определить, если ремонт белки являются неправильно локализованных против задержки в их локализации, «long-lasting» ОУС могут быть введены путем ферментативного расщепления клеточной ДНК. Результате поражения срезайте каждый раз, когда он отремонтирован, приводит в фокусе различных крупных ядерных ремонт и удаление временных ограничений из набора. Это может достигаться путем изменения существующего подхода с использованием редких резки эндонуклеазы (например, SceI) вызвать длительный DSB. Долговечность DSBs позволяет визуализацию неуловимого ремонт белков, иммунофлуоресценции. Расширенной изобилие также могли бы улучшить визуализации, когда обнаружение препятствуют ограничения в качестве антитела, функция, которая может быть полезной, когда менее изученных белки определены как имеющие влияние на репарации ДНК.
В частности мы предоставляем четкие инструкции для бесплатный изображений обработки и анализа программного обеспечения (например, ImageJ). Это снимает крупным финансовым барьером в анализ изображений, открыв допроса ДНК повреждения ремонт для более широкой аудитории.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Пожалуйста, обратите внимание, что этот протокол написан для U2OS клетки, содержащие признание сайта-SceI18. Клетки не нужно быть U2OS, но должно содержать сайт SceI. Протокол может потребоваться быть скорректированные (например, количество клеток семенами и инкубации раз) в зависимости от типа используемых ячеек.
1. Определение кинетика DSB ремонт комплекс формирования
- Рост клеток U20S-DRGFP на плите культуры ткани 10 см до 85-90% вырожденная.
- Удалите средства массовой информации и инкубации при комнатной температуре (RT) в 3 мл ЭДТА на 2 мин.
- Заменить ЭДТА с 1 мл раствора трипсина и инкубировать при 37 ° C за 5 мин убедитесь, что клетки отсоединяются от поверхности пластины путем просмотра под микроскопом. Нейтрализовать трипсина с 5 мл из Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM) дополнена плода бычьим сывороточным (ФБС) 10% и 1% пенициллина/стрептомицина.
- Определите концентрацию клеток в это подвеска, использованием метода Трипановый синий исключения и Горяева.
- Семя 6 x 103 клеток/хорошо 200 мкл плиты 96-луночных стекло дно. Кроме того семян 4 x 106 клеток в 8 мл на 12 мм coverslips помещены в пластине 10 см.
Примечание: Каждый хорошо или coverslip представляет собой точку один раз, включая элемент управления. - Рост клеток на ночь при 37 ° C и 5% CO2.
- Вызывая DSBs
- Заменить СМИ от блюдо 96-луночных пластины/10 см H2O2 разбавляют до концентрации 25 мкм с DMEM + 10% FBS и инкубировать при 37 ° C в течение 1 ч.
- Вымойте клетки, которые 3 x 1 x PBS и заменить свежим DMEM с 10% FBS и 1% пенициллина/стрептомицина. Инкубируйте клетки при 37 ° C для 0, 1, 4, 8, 24 и 48 ч. Убедитесь, что для каждого эксперимента используются свежие разведений H2O2 .
Примечание: Чтобы избежать убивает клетки на концентрации H2O2 , используемые здесь, обеспечить доза ущерб низкой достаточно таким образом, что основная часть клеток будет избежать апоптоз и старение. Очень важно наблюдать за процессом восстановления. Это лучше всего достигается путем измерения чувствительности в диапазоне доз. Выполните assay МТТ или иного анализа жизнеспособности клеток для определения минимальной концентрации перекиси водорода, который может быть использован.
- Фиксация и permeabilizing клетки
- Вымойте клетки 3 раза с ПБС. Удалить coverslip из 10 см пластины для каждой точки время и поместите его в один хорошо 24-ну пластины для крепления. Используйте иглу и щипцы для тщательно удалить coverslip и избегая царапин клетки с поверхности coverslip.
- Исправить клетки путем инкубации 15 мин с параформальдегида 4% (PFA) в установленное время после 1 h H2O2 экспозиции и свежие DMEM замена (0, 1, 4, 8, 24 и 48 ч).
- Вымойте фиксированной coverslips 3 раза с PBS. Разрушения клеток с 0,5% неионные стирального порошка разводят в 1 x PBS. Инкубируйте 15 мин на RT, перед стиркой 3 x с PBS.
Примечание: После permeabilization, хранения coverslips возможна в PBS на 4 ° C для по крайней мере неделю.
- Ремонт сложных визуализации
- Блокировать 96-луночных пластины/coverslips в раствор 3%, бычьим сывороточным альбумином (БСА) и 0.1% неионные стирального порошка разводят в однократном ПБС (3% раствор BSA) за 1 ч на RT.
- Проинкубируйте с первичного антитела, которые целевой ремонт протеина интереса, разбавленным согласно спецификации изготовителя в 3% растворе BSA 1 h на RT, перед стиркой 3 раза с ПБС.
- Проинкубируйте 96-луночных пластины/coverslips с вторичное антитело, разбавленным согласно протоколу производителя в 3% растворе BSA. Подтвердите, что вторичные флуорофоров не имеют перекрывающиеся возбуждения или выбросов спектры.
- После мытья клетки с PBS 3 раза добавить DAPI, разбавленным согласно спецификации изготовителя в ПБС и Инкубируйте на RT на 5 мин.
- Установите coverslips на слайды с капелькой установки агента, убедившись, что клетки боковые грани вниз. Нажмите coverslips тщательно и понежиться в любой избыток монтажа агент салфеткой.
- Печать coverslips с Быстросохнущий прозрачный лак и обеспечить полную печать coverslip с слайд.
- Возьмите Конфокальный микроскоп изображения, сосредоточив внимание на DAPI канале, прежде чем другие каналы (с сигналами от ДНК ремонт гена интереса) чтобы избежать предвзятости в эксперимент.
- Кроме того изображения могут быть приобретены, принимая Z-секции желаемого региона и конденсации изображение в одну плоскость для визуализации всех обнаруживаемых очагов.
Примечание: Если DSB резолюции или протеин интереса не наблюдается выбранного момента времени, определить, когда DSBs решить сначала выбрав широкий спектр точек времени (0-48 h должность DSB индукции). Время точек интереса будет зависеть от метода индукции ОУС и ремонт протеина интереса.
- Используйте бесплатные ImageJ программного обеспечения для определения ядер в изображениях микроскопия иммунофлуоресценции.
Примечание: Чтобы открыть изображения микроскопа, био-форматы плагин должен быть установлен в ImageJ.- Откройте конфокальный изображения (.czi или .tif), перетащив файл изображения в окне ImageJ, или выбрав «Био-форматы импортер» из панели «Плагин» в ImageJ.
Примечание: Появится окно «Био-форматы импорта вариант». - Выберите «Разделить каналы» для разделения изображения на учредительный DAPI и флуоресцентных изображений в окне «Био-форматы импорта вариант».
- Выберите «Раскраски» в «Параметры цвета» из раскрывающегося меню. Выберите «OK», чтобы открыть DAPI и гистон H2AX (H2AX) изображения как отдельные windows и выбрать изображение DAPI.
- Выберите параметр «Настроить порог» для выбора ядер и панель инструментов «Изображение».
Примечание: Появится окно «Порог». - Отрегулируйте порог изображения, передвигая панели внизу окна «Порог» полностью вправо. Настройка верхней панели до ядра появляются полностью красные с отдельных контуров и черный фон. НЕ выберите Применить. Закройте окно «Настроить порог».
- Выберите параметр «Анализ частиц» и «Анализировать» панели инструментов. Окно «Анализ частиц», появляются на экране.
- Введите минимальный размер ядра.
Примечание: Ниже расчетного размера частиц не засчитывается как ядра. - В раскрывающемся меню «Показать» выберите «Контуры». Выберите параметр «Менеджер». Нажмите кнопку «ОК», чтобы открыть окно «Менеджер ROI».
Примечание: Контуры ядер будет отображаться в отдельном окне. - Назначение номеров ядер, которые могут быть выбраны из окна «ROI менеджер».
- Откройте конфокальный изображения (.czi или .tif), перетащив файл изображения в окне ImageJ, или выбрав «Био-форматы импортер» из панели «Плагин» в ImageJ.
- Используйте ImageJ для количественного определения очагов H2AX в изображениях микроскопия иммунофлуоресценции.
- Выберите окно «H2AX» очагов (витражи с дневно конъюгированных вторичное антитело). Затем выберите панель инструментов, «Процесс» и выберите «Найти Максима», чтобы найти очаги внутри ядра.
Примечание: Откроется окно «Найти Максима». - Выберите параметр «Сингл точек» из раскрывающегося меню «Тип вывода» и выберите «Выбор точек просмотра» для визуализации очагов Максима. Ввод значения «Терпимость шум» в зависимости от интенсивности флуоресценции изображения (рис. 1). Проверка для появления белого окна с маленькие черные точки.
Примечание: Эти точки представляют Максима очагов, которые были обнаружены H2AX. Значение допуска шума должна поддерживаться постоянным для всех изображений, анализируются. Низкий/высокий шум терпимости будет изображать слишком много/несколько Максима (очагов) в ядре и не будет точное представление очагов в ядре. - Выберите ядер, для которых H2AX очаги должны быть количественно для из окна «ROI менеджер». Выберите все ядра, установив параметр «Показать все».
- Выберите «Мера», чтобы измерить количество Максима/очагов в пределах выбранных ядер.
Примечание: Число очагов Максима появляются как кратные 255, то есть, один максимум имеет чтение «RawIntDen» (интегрированный плотность) 255. - Скопируйте значения «RawIntDen» и вставьте их в программное обеспечение для анализа данных.
- Выберите окно «H2AX» очагов (витражи с дневно конъюгированных вторичное антитело). Затем выберите панель инструментов, «Процесс» и выберите «Найти Максима», чтобы найти очаги внутри ядра.
2. анализ локализации ДНК двухручьевой длинный длительный перерыв в работе
- Клетки семян на 96-луночных пластины/coverslips как описано в разделах 1.1 и 1.2.
-
Индукция двухнитевые разрывы ДНК
- Transfect клетки с вектором выражения-SceI, используя реагент на основе липидов трансфекции согласно спецификации изготовителя. Подождите 24-72 ч после трансфекции максимизировать эндонуклеазы выражение. Определите, если transfection была успешной, найдя клетки с акцентом сингулярные большой ядерной γ-H2AX.
-
Получение изображений
- Исправить, разрушения, блокировать и мыть 96-луночных пластины/coverslips, как описано в разделе 1.8.
- Совместное инкубации клеток с антитело против γ-H2AX и ремонт протеина интереса (здесь, основное антитело против RAD51 использовался) разводят в соответствии со спецификациями изготовителя в 3% растворе BSA.
- Вымойте тарелка/coverslips 96-луночных 3 раза с ПБС. Проинкубируйте 96-луночных пластины/coverslips с вторичное антитело, разбавленным согласно протоколу производителя в 3% растворе BSA. Подтвердите, что вторичные флуорофоров не имеют перекрывающиеся возбуждения или выбросов спектры.
- Идентифицировать клетки, которые имеют большой ядерной γ-H2AX фокус. Только принимать фотографии этих клеток, чтобы избежать смещения.
-
Анализ долгосрочных SceI индуцированной очагов
- Анализировать долгосрочные приоритеты вручную, путем подсчета числа клеток, которые имеют большой γ-H2AX очагов и совместно локализованных очагов ремонт протеина интереса.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 1 изображает выбор правильного шума дискриминации для квантификации Максима/очагов с помощью ImageJ. На левой панели объединенного изображения DAPI и ремонт протеина интереса. Рисунок 1A показывает шум дискриминации 90 и знаменует правильное количество очагов. Ядер на краю (изображен с розовыми стрелками) и очаги вне ядра (изображен с желтой стрелкой), не учитываются в ходе количественного определения. Рисунок 1B изображена терпимости низкий шум 50. Многочисленные Максима определяются за пределами ядра и в ядре. Рисунок 1 c показывает высокий шум терпимости 220. Был обнаружен только один фокус (белая стрелка). Предложить читателю чувство «положительных» и «отрицательных» результаты, мы собрали представитель результаты на рисунке 2. В частности рисунок 2A изображает Сопредседатель локализации между γ-H2AX фокус (зеленый) и ремонт протеин интереса (красный). Аналогично untransfected ячейки отображается в верхнем левом углу этой группы и ячейки с фокусом неядерных (ложных) γ-H2AX отображается в правом верхнем углу. Пожалуйста обратите внимание, что микроядер связать с ДНК повреждения машины являются вероятным источником этих неядерных очагов19. Рисунок 2B обеспечивает увеличение две ячейки справа от рисунок 2A для обеспечения ясности в как они были полны решимости быть интерьера и экстерьера для ядра, соответственно. Пример ядерной γ-H2AX фокуса без совместного локализация белка ремонт показан на рисунке 2 c. Схема этого протокола содержится в рис , который суммирует этот подход к характеристике ремонта ДНК.
Рисунок 1 : Представитель анализ кинетики двухручьевой ДНК перерыв ремонт. Представитель образы γ-H2AX очагов количественной оценки с использованием программного обеспечения ImageJ (с плагином био-форматы). Левой панели являются Композитные изображения ядер (40 кратном), окрашенных в синий для DAPI и зеленый для γ-H2AX. Центр панели показывают справочник ООН анализируемого ядер с γ-H2AX очагов/Максима. (A) правой панели показывает Максима/очагов обнаружения с допуском шум 90 и является представителем фактической оценки числа очагов в ядре. (B) право панели показывает Максима количественной оценки с низким уровнем шума терпимости (50). Максима/очагов могут быть обнаружены за пределами ядра (желтая стрелка), в то время как большинство Максима расположен в ядро неспецифической фон сигналов. (C) право панели показывает Максима количественной оценки с высокой шума терпимости (220). Только один максимум/фокус (белая стрелка) обнаруживается в ядре и не является представителем очагов в ядре. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Представитель я-SceI индуцированной двухнитевые разрывы ДНК. Представитель образы ядра от клеток, выращиваемых на coverslips (40 кратном). Ядер запятнаны синий. Ремонт белка (RAD51) окрашивается красным и γ-H2AX окрашивается в зеленый. (A) три панели показывают же три клетки. В левом большинство группа, ядра видны. В средней панели пятнать для RAD51 показано. На правой панели γ-H2AX пятнать показано. Ядро в правом верхнем углу не показывает каких-либо признаков SceI индуцированной DSBs. Ядро в центре (розовый стрелка) представляет собой истинный положительный событие как она имеет большой γ-H2AX ядерной фокус и совместно локализованных RAD51 ядерных фокус. Ядро на правой стороне имеет фокус ложных большой γ-H2AX как это extranuclear. Очаги вне ядра не должны использоваться для локализации совместного анализа. (B) это увеличение объединенного изображения в части A (центр и право большинства клеток). Большой ядерной желтый фокус, указывающее перекрытия RAD51 и H2AX сигнала обозначается розовыми стрелками. (C) A представитель изображение ядерной γ-H2AX фокус без совместного окрашивание ДНК ремонт протеина интереса. В отличие от фокус, обозначенных с белой стрелкой в (A) и (B) желтая стрелка показывает типичные результаты, когда ремонт белки предотвращены от локализации места повреждения. Шкалы бар = 15 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Визуальное описание протокола для анализа двухручьевой репарации ДНК перерыв. (1) представление протокола шаги 1.1 для заполнения ячеек на coverslips/стекло нижней плиты. (2) Иллюстрация индукции двухнитевые разрывы лечения с перекисью водорода (справа) или вызывая длительно двухнитевые разрывы, transfecting 3 мкг SceI. (3) представление шагов 1.4 для 1.5.3 протокола для визуализации двухнитевые разрывы. (4a) изображения, представляющие confocal микроскопии клетки окрашивали DAPI (синий) и γ-H2AX очагов (зеленый). ядер (4b) изображение сингулярных большой γ-H2AX очагов (зеленый) снова пятно DAPI (синий). (5А) изображение анализа очагов γ-H2AX, используя ImageJ (протокол шаги 1.10.1–1.11.5). (5б) изображение вручную количество крупных долгосрочных γ-H2AX очагов (шаг 2.4 протокол). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Анализ ДНК повреждения ремонт в целом и ремонт двуцепочечные разрывы ДНК специально активной областью исследований, потому что его последствия охватывают tumorigenesis фундаментальной биологии6,20. Эта рукопись детали, подход, который точно анализирует вклад RAD51 и γ-H2AX белков в резолюции DSBs через HR. нетерпением, этот метод может использоваться для уточнения дополнительных функций белков ремонт DSBs14. Сравнение ремонт кинетики и вербовки ремонт техники-SceI индуцированной DSBs между управления клетки и клетки с протеином интереса, нокаут, будет определять вклад этого белка для вербовки, локализации, и разрешение ремонта факторов DSBs.
Визуализация ремонта кинетики имеет ряд преимуществ над часто используемых подходов. Часто ремонт исследована в одно время точках, который неспособен представлять динамичный процесс сборки и диссоциации ремонт комплексов. Наблюдения за полный спектр ремонта от первоначальной активации полной резолюции гарантирует, что задержка в ремонт не ошибочно как полное торможение. Наоборот он обеспечивает что индукции ремонт ответ без способности к инактивации, что ответ не ошибочно как нормальный или чрезмерного активации. Это главным образом изменения в применении установленных подход, но использование редких резки эндонуклеазы побудить долговечные DSB Роман инструмент. Это позволяет детектива, чтобы однозначно определить, если локализация белка ремонт ингибируется вместо его набора, задерживается в короткий период времени после завершения эксперимента. SceI индуцированной DSB может последнего дня и теоретически до тех пор, как выражается фермента (следует клетки остаются жизнеспособными). Кинетика DSB ремонта может также наблюдаться через живых клеток. Однако хотя живых клеток позволяет обнаружение ремонт событий в режиме реального времени, его применение сдерживается требование, что белки быть помечены с Флюорофор например GFP. Такие генетические манипуляции имеет потенциал, чтобы изменить функции белков и представляет дополнительный технический барьер.
Анализ изображений через ImageJ программное обеспечение может быть громоздким освоить. Пошаговая инструкция для ремонта фокус признание и количественной оценки, используя это программное обеспечение предоставляется надежде на устранение этого препятствия для других групп. Это может привести к увеличению использования мощного программного обеспечения и исключить стоимость более дорогих программ во время усадки бассейны Федеральный грант поддержки.
В принципе продолжительность этих DSBs следует включить визуализацию неуловимого ремонт белков, иммунофлуоресценции. Это может быть случай для белков, которые трудны для того посмотреть, потому что они не накапливаются в высокой достаточно концентрации, чтобы быть обнаружены, например, сохранение результатов DSB-SceI индуцированной в большей чем типичный накопление белков ремонт в поражения. Расширенной изобилие также могли бы улучшить визуализации, когда обнаружение препятствуют ограничения в качестве антитела; функция, которая может быть особенно полезно, когда менее изученных белки определены как имеющие влияние на ДНК ремонт. На сегодняшний день, этот подход проверена 4 ДНК ремонт белки, а именно: RAD51, RPA70, BRCA1 и BRCA2 (данные не отображаются, Рисунок 2и ссылка17)
Наконец есть изменения, которые можно было бы внести в этот протокол расширить типы повреждения ДНК, что может быть допрошен а также клеточной среды. Наиболее очевидным изменением будет изменение исходного или тип индуцированных повреждений ДНК. Доказательство принципа использования UVB, ионизирующего излучения или radiomimetics (phleomycin, блеомицин и этопозид) для изучения кинетики репарации ДНК уже было опубликовано18,19,,2324 , 25. с небольшими изменениями, этот подход можно также пролить свет ремонт белок реакции NHEJ DSBs. Кроме того, Бриттон et al. Опишите предварительного извлечения технику, которая может быть используемые26. Кроме того гостей самонаведения уменьшение поперечного сечения эндонуклеазами (-HmuI или Баси), которые имеют широкое признание сайтов, аналогичные-SceI27. Отличать их от SceI, эти энзимы вызывают разрывы ДНК одного стренги (рабочего тормоза РСРТ). Представляя на сайте признание за эти ферменты в линию клеток позволит анализ SSB ремонта, что параллели протокол, описанный в этой рукописи для допроса долговечные DSBs. в частности, процесс интеграции-SceI признание сайт и проверка введение сайта может быть трудоемким. К счастью успехи в геноме, редактирования технологии (например, CRISPER/Cas9 системы) ослабили это бремя28. Есть также поле активных исследований, которая преуспела в инженерных самонаведения эндонуклеазами сократить в геномной расположение, которое предполагает, что в будущем, эти инженерные достижения и использования ТРИФОСФАТЫ/Cas9 может привести этот клонирования шаг, чтобы быть Расходные28,29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарим Joel Sanneman и доктор Philine Вангеманн конфокальная микроскопия ядра, финансируемых на Канзас государственный университет колледж ветеринарной медицины, за их поддержку усилий по разработке этой техники. pCBASceI был подарок от Мария Jasin (Addgene плазмиды # 26477) 30. Клетки U2OS DR-ГФП были рода подарок от Мария Jasin18.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 mm Coverslips | VWR | 89015-725 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | ThermoFisher Scientific | 28908 | |
| 24-well plate | VWR | 82050-892 | |
| 96-well glass bottom plate | Cellvis | P96-1.5H-N | |
| Anti-H2AX Alexa488 | EMD Millipore | 05-636-AF488 | |
| Anti-Rad51 (D4B10) | Cell Signaling Technology | 8875S | |
| Bio-formats plugin for ImageJ | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 97061-416 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher Scientific | 12100046 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 89510-194 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG Alexa594 | ThermoFisher Scientific | A-11012 | |
| Hydrogen Peroxide | sigma-Aldrich | 216763-100ML | |
| ImageJ Software | National Institute of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| I-SceI Expression Vector | Addgene | 26477 | |
| Nail Polish- Insta Dri | Sally and Hansen | Clearly Quick (103) | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Bio Basic | PD8117 | |
| ProLong Gold Antifade Reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4049-500ML | |
| TurboFect Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | R0531 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 |
References
- Lindahl, T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).
- Branzei, D., Foiani, M. Regulation of DNA repair throughout the cell cycle. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 297-308 (2008).
- Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Mol Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
- Auclair, Y., Rouget, R., Drobetsky, E. A. ATR kinase as master regulator of nucleotide excision repair during S phase of the cell cycle. Cell Cycle. 8 (12), 1865-1871 (2009).
- Awasthi, P., Foiani, M., Kumar, A. ATM and ATR signaling at a glance. J Cell Sci. 128 (23), 4255-4262 (2015).
- Ceccaldi, R., Rondinelli, B., D'Andrea, A. D. Repair Pathway Choices and Consequences at the Double-Strand Break. Trends Cell Biol. 26 (1), 52-64 (2016).
- Chapman, J. R., Taylor, M. R. G., Boulton, S. J. Playing the End Game: DNA Double-Strand Break Repair Pathway Choice. Mol Cell. 47 (4), 497-510 (2012).
- Daley, J. M., Sung, P. 53BP1, BRCA1, and the Choice between Recombination and End Joining at DNA Double-Strand Breaks. Mol Cell Biol. 34 (8), 1380-1388 (2014).
- Hartlerode, A., Odate, S., Shim, I., Brown, J., Scully, R. Cell Cycle-Dependent Induction of Homologous Recombination by a Tightly Regulated I-SceI Fusion Protein. PLOS ONE. 6 (3), e16501 (2011).
- Brandsma, I., Gent, D. C. Pathway choice in DNA double strand break repair: observations of a balancing act. Genome Integr. 3, 9 (2012).
- Davis, A. J., Chen, D. J. DNA double strand break repair via non-homologous end-joining. Transl Cancer Res. 2 (3), 130-143 (2013).
- Reid, D. A., et al. Organization and dynamics of the nonhomologous end-joining machinery during DNA double-strand break repair. Proc Natl Acad Sci. 112 (20), E2575-E2584 (2015).
- Chen, J. J., Silver, D., Cantor, S., Livingston, D. M., Scully, R. BRCA1, BRCA2, and Rad51 Operate in a Common DNA Damage Response Pathway. Cancer Res. 59 (7 Supplement), 1752s-1756s (1999).
- D'Andrea, A. D. BRCA1: A Missing Link in the Fanconi Anemia/BRCA Pathway. Cancer Discov. 3 (4), 376-378 (2013).
- Gudmundsdottir, K., Ashworth, A. The roles of BRCA1 and BRCA2 and associated proteins in the maintenance of genomic stability. Oncogene. 25 (43), 5864-5874 (2006).
- Liu, S., et al. Distinct roles for DNA-PK, ATM and ATR in RPA phosphorylation and checkpoint activation in response to replication stress. Nucleic Acids Res. 40 (21), 10780-10794 (2012).
- Wallace, N. A., Khanal, S., Robinson, K. L., Wendel, S. O., Messer, J. J., Galloway, D. A. High Risk Alpha Papillomavirus Oncogenes Impair the Homologous Recombination Pathway. J Virol. , (2017).
- Pierce, A. J., Johnson, R. D., Thompson, L. H., Jasin, M. XRCC3 promotes homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells. Genes Dev. 13 (20), 2633-2638 (1999).
- Luzhna, L., Kathiria, P., Kovalchuk, O. Micronuclei in genotoxicity assessment: from genetics to epigenetics and beyond. Front Genet. 4, (2013).
- Jasin, M. Homologous repair of DNA damage and tumorigenesis: the BRCA connection. Oncogene. 21 (58), 8981-8993 (2002).
- Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. β-HPV 5 and 8 E6 Disrupt Homology Dependent Double Strand Break Repair by Attenuating BRCA1 and BRCA2 Expression and Foci Formation. PLOS Pathog. 11 (3), e1004687 (2015).
- Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. HPV 5 and 8 E6 Abrogate ATR Activity Resulting in Increased Persistence of UVB Induced DNA Damage. PLoS Pathog. 8 (7), (2012).
- Mah, L. J., Vasireddy, R. S., Tang, M. M., Georgiadis, G. T., El-Osta, A., Karagiannis, T. C. Quantification of γH2AX Foci in Response to Ionising Radiation. J Vis Exp. (38), e1957 (2010).
- Popp, H. D., Brendel, S., Hofmann, W. K., Fabarius, A. Immunofluorescence Microscopy of γH2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks. J Vis Exp. (129), e56617 (2017).
- Burma, S., Chen, B. P., Murphy, M., Kurimasa, A., Chen, D. J. ATM Phosphorylates Histone H2AX in Response to DNA Double-strand Breaks. J Biol Chem. 276 (45), 42462-42467 (2001).
- Britton, S., Coates, J., Jackson, S. P. A new method for high-resolution imaging of Ku foci to decipher mechanisms of DNA double-strand break repair. J Cell Biol. 202 (3), 579-595 (2013).
- Landthaler, M., Shen, B. W., Stoddard, B. L., Shub, D. A. I-BasI and I-HmuI: two phage intron-encoded endonucleases with homologous DNA recognition sequences but distinct DNA specificities. J Mol Biol. 358 (4), 1137-1151 (2006).
- Lackner, D. H., et al. A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging. Nat Commun. 6, 10237 (2015).
- Chan, S. H., Stoddard, B. L., Xu, S. Y. Natural and engineered nicking endonucleases--from cleavage mechanism to engineering of strand-specificity. Nucleic Acids Res. 39 (1), 1-18 (2011).
