Summary
Flowcytometri i kombination med visual klynger tilbyder en nem at bruge og hurtig metode til at studere akvatiske biofilm. Det kan bruges til biofilm karakterisering, registrering af ændringer i biofilm Fællesskabets struktur og påvisning af abiotiske partikler indlejret i biofilm.
Abstract
Biofilm er dynamisk konsortier af mikroorganisme, som spiller en nøglerolle i ferskvand økosystemer. Ved at ændre deres Fællesskabets struktur, biofilm reagere hurtigt på miljøforandringer og kan således bruges som indikatorer for vandkvaliteten. I øjeblikket er biofilm vurdering for det meste baseret på integrativ og funktionelle endepunkter, såsom fotosyntetiske eller respiratorisk aktivitet, som ikke giver oplysninger om biofilm Fællesskabets struktur. Flowcytometri og beregningsmæssige visualisering tilbyde en alternativ, følsomme og nem at bruge metode til vurdering af Fællesskabets sammensætning, især den photoautotrophic del af ferskvand biofilm. Det kræver kun grundlæggende prøveforberedelse, hvorefter hele prøven køres gennem flow Flowcytometret. Enkelt celle optiske og fluorescerende oplysninger bruges til beregningsmæssige visualisering og biologiske fortolkning. Dets vigtigste fordele frem for andre metoder er hastigheden af analyse og høj-informationsindhold karakter. Flowcytometri indeholder oplysninger om flere cellulære og biofilm træk i en enkelt måling: partikelstørrelse, tæthed, pigment indhold, abiotiske indhold i biofilm og grove taksonomiske oplysninger. Det indeholder dog ikke oplysninger om biofilm sammensætning på artsniveau. Vi ser stort potentiale i anvendelsen af metoden til miljøovervågning af vandøkosystemer og som en indledende biofilm evaluering skridt, der informerer nedstrøms detaljerede undersøgelser af komplementær og mere detaljerede metoder.
Introduction
Biofilm er dynamisk konsortier af mikroorganisme, som spiller en nøglerolle i ferskvand økosystemer, lige fra primærproduktion, næringsstof cykling og vandrensning til at påvirke fordelingen af mikroorganismer og deres biodiversitet i økosystemet 1. Når biofilm er udsat for skiftende miljøforhold eller til stressfaktorer, såsom kemikalier, deres fællesskabsstruktur hurtigt skifter retning mere tolerante arter2,3. Deres høje følsomhed forvandler biofilm til attraktive modelsystemer for miljømæssige overvågning4, men ingen af de nuværende metoder er perfekt egnet til faktisk spore dynamikken i en biofilm Fællesskabet i en hurtig og nem måde.
De almindeligt anvendte sæt af metoder til at karakterisere biofilm består af måling af funktionelle og strukturelle slutpunkter. På niveauet for hele Fællesskabet indeholder fotosyntetiske og respiratoriske aktivitet samt aktiviteten af ekstracellulære enzymer oplysninger om funktionelle status af biofilm5,6,7,8 ,9. Biomasse periodisering bruges som en indikator for samlede biofilm vækst. Strukturændringer måles i øjeblikket enten ved hjælp af traditionelle arter identifikation med lysmikroskopi eller med nukleotid-baserede teknikker (f.eks., denaturering gradient gelelektroforese (DGGE), automatiseret ribosomale intergenic spacer analyse (ARISA), metagenomics)10,11,12. Disse metoder give oplysninger, men er tidskrævende at udføre, eller kræver specifik viden, eller er stadig under udvikling. Endelig, nye metoder til evaluering af ekstracellulære polymere stoffer (EPS)13,14 og biofilm arkitektur1, mens følsomme, er lav-overførselshastighed og endnu ikke er blevet udviklet til overvågningsformål.
Det er indlysende, at for en fuldstændig karakterisering af ferskvand biofilm, er det nødvendigt at kombinere flere forskellige metoder, som giver indsigt i biofilm funktion, sammensætningen og arkitektur. For miljøovervågning, på den anden side er en hurtig og følsom metode, der er i stand til at opdage ændringer i biofilm og aktiverer grundlæggende biologiske fortolkning af forskydninger på funktionelle og strukturelle plan påkrævet.
Vi har udviklet en ny metode for mikrobielle samfund karakterisering af komponenten fototopiske, stream biofilm (periphyton), som er hurtig nok til overvågningsformål, og samtidig giver tilstrækkelige oplysninger om Fællesskabets biofilm struktur til at tillade biologiske fortolkning15. Det er baseret på én celle flowcytometri (FC) af biofilm prøver og kombineret med computational visualisering og giver oplysninger om optisk og fluorescerende egenskaber af biofilm på enkelt celle-niveau.
Arbejdsgang efter biofilm prøveudtagningen består af prøveforberedelse i form af sonikering, fiksering og størrelse-baseret filtrering af prøverne efterfulgt vurdere prøven ved flowcytometri. De indsamlede data indeholder oplysninger om flere cellulære træk i en enkelt måling: partikelstørrelse, tæthed, pigment indhold, abiotiske indhold (f.eks. microplastics) i biofilm. Dette sæt af data er analyseret via beregningsmæssige visualisering ved hjælp af visuelle stokastiske nabo embedding (viSNE)16, som giver mulighed for hurtig og nem fortolkning af data. Selv om et par uger er forpligtet til at konfigurere og optimere metoden, en gang sat op, det tager kun et par timer fra indsamling af biofilm prøver at fortolke resultaterne.
De vigtigste fordele ved metoden præsenteres over andre er hastigheden af analyse og høj-oplysninger-indhold. Derudover kan prøver opbevares i flere uger efter samling uden tab af deres optisk og fluorescens egenskaber. Dette kan være meget nyttigt, når karakterisering af et stort antal prøver er nødvendige, såsom store stikprøver undersøgelser eller bioovervågning programmer, men kan også give en betydelig mængde af oplysninger i mindre sonderende undersøgelser.
Den præsenteres protokol er baseret på flow-cytometric analyse af fototopiske biofilm (periphyton) indsamlet fra forskellige steder i en stream. Mange trin i protokollen, f.eks. udvælgelsen af lokaliteter passende til overvågningsformål, afhænger af mål for forskningen og derfor ikke kan ordineres. Andre tillade mindre frihed og kræve, at protokollen er fulgt nøje, dette er gjort klart i den detaljerede protokollen nedenfor.
Protokollen starter med udvalg af steder for biofilm-baserede miljøovervågning. Det næste skridt er at set-up flow-Flowcytometret (FC), så dens målinger aktiverer forskelsbehandling mellem forskellige fototopiske organismer, der lever i biofilm i den overvågede miljø. Dette udføres ved at indsamle biofilm prøver fra websteder, identificerer de fluorescerende egenskaber af forskellige arter, der forekommer i biofilm og opsætning af flow-Flowcytometret med lasere og filtre, der aktiverer måling på den passende optiske bølgelængder. Når FC er blevet set-up, biofilm kan blive indsamlet fra websteder med jævne mellemrum, optisk og fluorescerende egenskaberne for én partikler findes i biofilm målt ved flowcytometri og dataene analyseres af visual klynger. For en bedre fortolkning af resultaterne er det muligt at bygge en FC referencedatabase af lokale biofilm-levende arter og deres fænotyper og bruge databasen til at identificere forskellige taksonomier i FC data. Validering er muligt gennem fluorescens-baseret sortering af de identificerede klynger af enkelt celler ved hjælp af FACS og mikroskopi-baserede taksonomisk identifikation af de foreliggende arter. En skematisk af protokollen er angivet i figur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. økosystem udvælgelse og Biofilm prøveudtagning
- Vælg en akvatiske økosystem af interesse og finde prøveudtagning sites hvor biofilm vokse. Lavvandede dele af en stream med langsom til medium vandflow og en stenede streambed for biofilm vedhæftet fil er passende17,18.
- Valgfrit: Hvis webstedet ikke har nok overflader for biofilm vedhæftet fil, eller at mindske biofilm variationen inden for et websted, placere kunstige substrater for biofilm vedhæftet fil (f.eks. glas lysbilleder, keramiske fliser) ind på webstedet, samtidig med at sikre, at de er placeret i den samme retning med hensyn til vandflow og lignende dybde og lysintensitet19.
- For at fastslå de miljøforhold på prøvetagningsstedet, brug bærbare instrumenter til måling af lysintensitet, er vandets temperatur, ledningsevne, ilt og pH lige over den overflade biofilm skal udtages fra. I løbet af prøveudtagning tage gentagne foranstaltninger (3-5) for at beregne middelværdier.
- Valgfrit: Tage vandprøver for at bestemme relevante vand kemi parametre (opløst organisk kulstof (DOC), K+, Na+, Ca2 +, Mg2 +, Cl-, F-, så42 -, PO42 - , Ingen32-, SiO44 -).
- Brug beskyttelseshandsker, indsamle sammenlignelige sten (i størrelse, form og type) fra hver site (eller kunstige substrater). Stenene bør være udsat for lignende flow og lysforhold18.
- Filtrere nok stream vand fra webstedet gennem 0,22 μm filtre, så det er klar til alle indsamlede prøver (f.eks. 15 mL pr. prøve).
- Brug en blød tandbørste til at fjerne biofilm fra underlaget i en målekolbe (børste indtil alle biofilm er fjernet) med 15 mL filtreret stream vand20.
- Lave prøverne i 0,01% PARAFORMALDEHYD og 0,1% glutaraldehyd21.
2. bestemmelse af Optimal Flow-cytometric (FC) parametre
- Overføre delprøver til et lysmikroskop (ved hjælp af en 40 X / 0,75 mål, hvis nødvendigt bruge en 100 × 1.3 olieobjektiv) og identificere, hvilken art i prøver22,23.
- Bestil identificeret enkelt arter fra passende kultur samlinger (fx den eksperimentelle Phycology og kultur samling af alger på Universitet i Göttingen [EPSAG] eller kultur samling af alger på universitetet i Köln [CCAC] Hvis Overvågningen udføres i central europæiske økosystemer).
- Vokse den enkelte arter kontinuerligt i samme miljøforhold (f.eks. lys, temperatur, pH) til miljøet biofilm prøver blev taget fra. Opholder sig inden for 1 ° C og 0,5 pH punkt fra de miljøprøver anbefales.
- For at frigøre/sprede cellerne, sætte 15 mL af enkelt art prøver til centrifugeglas og sætte rørene midt i et vandbad og dykke, således at den flydende overfladen af prøven er på samme niveau som overfladen af badet. Der sonikeres prøver for 1 min på 45 kHz24,25.
- Optage absorbans og fluorescens-spektre af de enkelte arter ved hjælp af en Pladelæser. Henvises til Pladelæser valg for instruktioner. I dette eksempel, 96-godt flad bund transparent polystyrol plader blev fyldt med 200 µL sample volumen og absorbans blev målt. (Indstillinger, der bruges: a fluorescens scanningstilstand; emission bølgelængde trin størrelse 10 nm, emission scan nummer 30, båndbredde 20 nm, få 100, 25 blinker, 20 kr. integration tid eller b absorbans scanningstilstand; 25 blinker, båndbredde 9 nm).
- Nedsat flow forskellige med lasere, dichroic splittere og filtre, der i kombination dækker alle de fluorescerende intervaller, hvor forskellige arter har særlige egenskaber. For centrale europæiske vandløb, en 405 nm, 488 nm og 638 nm laser producere brugbare resultater.
- Justere indstillingen spænding i Fotomultiplikatorer (gælder ikke alle flow cytometers) og rækken af de målte fluorescenser til også at omfatte mindst 99% af alle begivenheder i prøverne.
- Alternativt, hvis viden om arter, der forekommer i biofilm er tilgængelig, start med trin 2.2. Hvis fluorescerende egenskaber er kendt, skal du starte med trin 2.6.
3. Valgfrit: Forberedelse af en Flow-cytometric referencedatabase
Bemærk: FC tillader ikke taksonomisk identifikation af celler i biofilm. En referencedatabase over FC målinger af enkelte arter kendt for at være til stede i biofilm, dyrkes på samme betingelser som biofilm, kan hjælpe med fortolkningen af data.
-
Reference: fælles arter
- Ved hjælp af parametrene optimeret FC oprettet i 2.5 – 7, måle egenskaberne optisk og fluorescerende i enkelt art (fast i PARAFORMALDEHYD og glutaraldehyd og filtreret gennem filtre af passende størrelse til flow-Flowcytometret).
- Normalisere dataene fra enkelt art på samme måde som data fra biofilm (Se trin 6.1.2).
-
Reference: beskadiget og rådnende celler
En af de vigtigste indikatorer for biofilm sundhed er fraktion af beskadiget/døende celler findes i biofilm. For at kvantificere disse celler, kan en reference af rådnende celler tilberedes.- Tage 1 mL delprøver af fortyndede biofilm og centrifugeres dem ved stuetemperatur på 8.000 x g i 10 minutter i en bordplade centrifuge. Suspendere den resulterende pellet i 1 mL 90% ethanol og gemme suspension natten over ved 4 ° C. Gentag næste dag.
- Med de optimerede indstillinger for FC, måle optisk og fluorescerende egenskaberne for de beskadigede og rådnende celler (fast og filtreret).
-
Reference: microplastics
Bemærk: hvis du er interesseret i overvågning microplastic partikler i biofilm, tjek om de adskiller sig nok fra biotiske partikler i optiske og fluorescens egenskaber for identifikation.- Suspendere microplastic partiklerne efter anvisningerne på microplastics producent og måle deres optisk og fluorescerende egenskaber (ved hjælp af FC parametre fra 2.7).
- Tilføje microplastic partikler til eksemplet biofilm og efterlader over nat ved 4 ° C.
- Filtrer suspension og foranstaltning med samme FC parametre som ovenfor.
4. prøve tilberedning og opbevaring
- Når har oprettet FC og FC referencedatabase er klar, kan man fortsætte med evalueringen af frisk biofilm prøver efter trin 1.1 – 7. For at frigøre/sprede biofilm, overføre 15 mL af prøverne fra kolberne (Se trin 1.7) til centrifugeglas.
- Sætte hver tube midt i et vandbad og dykke så at flydende overfladen af prøven er på samme niveau som overfladen af badet. Der sonikeres prøver for 1 min på 45 kHz.
- Lave prøverne i 0,01% PARAFORMALDEHYD og 0,1% glutaraldehyd (lager i nanopure vand). Opbevares ved 4 ° C indtil klar til analyse.
- Vigtigt: Brug halvdelen af prøverne til flowcytometri analyse og holde halvdelen i opbevaring for sikkerhed og valgfri validering med fluorescens-aktiveret celle sortering og/eller lysmikroskopi (Se afsnit 6).
Bemærk: gemmes i køleskabet, faste biofilm prøver bør holde deres optisk og fluorescerende egenskaber i op til tre uger.
5. kører prøven gennem FC
- Hvis prøverne blev opbevaret i køleskab, sonikeres dem hurtigt eller afpipetteres flere gange til at adskille partiklerne. Filtrer delprøverne med 50 μm filtre (filter størrelse afhænger af bredden af FC kapillær) før måling.
- Indlæse enkeltprøver (1-2 mL, dette afhænger af flow forskellige anvendes) i flow forskellige og måle optisk og fluorescerende egenskaberne for hver enkelt partikel. Gentag målingen tre gange per hver biologiske replikat (tre tekniske replikater).
- Eksportere data fra FC i .csv-format.
6. data forberedelse og korrelation analyse
FC kan analysere flere parametre (f.eks., signal område, højde, bredde) for hver målte optisk ejendom og fluorescens rækkevidde. Køre en korrelation analyse på de målte variabler og kun holde de målinger, der ikke er meget korreleret. Dette fjerner normalt alle undtagen én FC parameter (f.eks., signal område) og kan også fjerne stærkt korreleret fluorescerende målinger (normalt stammer fra den samme laser og omkringliggende filtre).
-
Køre CYT som en værktøjskasse i Matlab:
- Importer den reducerede FC data i .csv-format fra alle de prøver, der skal analyseres i den CYT software16, herunder alle tekniske og biologiske replikater. (Klik på +, fil filter *.csv, vælge filer til import).
- Omdanne de fluorescerende kanaler af alle prøverne ved hjælp af den hyperbolske arcus sinus transformation. Værdien af cofaktoren skal vælges; 150 værker for mest fototopiske biofilm og flow cytometers men optimering kan være nødvendige for særlige eksperimentelle opsætninger og heterotrofe biofilm. (Højre-klik/Transform/postere cofaktor 150)
- For kvalitetskontrol, visuelt sammenligne (i CYT) histogrammer af enkeltprøver og individuelle optisk og fluorescerende kanaler til at sørge for der er ingen outliers på det tekniske og biologiske niveau af replikering. Outliers vil manifestere i betydeligt skiftede fluorescerende/optisk fordelinger mellem replikater. (Vælg Data, Vælg kanal, Plot)
- Alternativ: køre en principal komponent analyse (PCA) på median værdier af fluorescerende distributioner og sørg for, at tekniske og biologiske replikater klynge sammen.
- Flet tekniske replikater i hver biologiske replikat og delprøve biologiske replikater, så hver er repræsenteret af det samme antal partikler (celler, celle fragment og abiotiske partikler), og det samlede antal partikler analyseret af Barnes-Hut stokastiske nabo embedding (bh-SNE) er omkring 150.000 (for bedste visualisering resultater26). (Vælg Data, højreklik, Flet/delprøve)
- Til sammenligning mellem prøver er det vigtigt at vælge kun de prøver, der skal sammenlignes. Vælg prøverne og køre bh-udstationerede27. Når algoritmen er færdige, nye kanaler, vises navngivne bh-SNE1 og bh-SNE2. Disse er de udstationerede nationale eksperter koordinater af alle analyserede partikler, som kan bruges til at visualisere data i en scatter plot (viSNE kort). (Vælg Data, Vælg kanaler, højreklik, bh-SNE, ja normaliserede data)
- I viSNE kort, er partikler placeres efter lighed og grupperet i visuelt adskilles klynger. Inspicere optisk/fluorescerende egenskaber af klynger og mærke og navn dem, der er godt adskilt og har forskellige optisk/fluorescens egenskaber ved hjælp af tegneværktøjerne i CYT. (Vælg kanal bh-SNE1, bh-SNE2)
- Valgfrit: Hvis en referencedatabase af enkelt mikrobielle arter (målt med den samme flowcytometri indstilling og dyrkes under lignende betingelser!) er tilgængelig, eksportere viSNE kortene i Matlab og projicere referencedatabase på kortene. På denne måde, kan bestemt klynger være tilsluttet bestemt arter/taksonomiske grupper (manuskripter anvendelig nemlig dataoverføre henne https://github.com/anzezupanic/FC_analysis). (Session/Save)
- Fejlfinding: Hvis bh-udstationerede analyse ikke returnerer visuelt adskilles klynger, men en enkelt stor en, for mange partikler blev brugt i bh-udstationerede nationale eksperter. Prøv igen med færre partikler pr. prøve. Hvis der er ingen klynger, men temmelig sparsomme enkelte punkter, øge antallet af partikler anvendt.
- Valgfrit: I stedet for at stole på bh-udstationeret national ekspert for den klyngedannelse, andre klyngedannelse metoder (fx, hierarkisk, barycentrum-baseret eller tæthed baseret klyngedannelse) kan anvendes på de normaliserede data og derefter overlejret på viSNE kort (https://github.com/ anzezupanic/FC_analysis).
- Når klyngerne er blevet identificeret, tælle antallet af partikler i hver klynge tilhører hver biologiske replikeres i hver prøve. Vurdere forskellene mellem de prøver, ved hjælp af ANOVA og Tukey's test med passende (fxHolmes) korrektion for flere sammenligning.
7. ekstraudstyr: Validering af klynge fortolkning ved hjælp af fluorescens-aktiveret celle sortering
- Når klyngerne, der er blevet identificeret, skal du bruge fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) til at sortere dem ud af prøverne, hvis det ønskes, forudsat at FACS har en lignende (eller identiske) konfiguration af lasere og fluorescerende filtre.
- For hver identificerede klynge giver CYT optisk og fluorescerende gates, der definerer klyngen. Bruge disse porte til at sortere partikler i hver klynge med FACS og derefter identificere de sorterede celler ved hjælp af lysmikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af den procedure, der er præsenteret her (figur 1), blev prøver fra flere steder i en lokal stream i Schweiz analyseret. På hvert sted, tre lignende mellemstore sten (10-12 cm) er taget, og biofilm var børstet ud stenene. Prøverne blev derefter sonicated, faste, filtreret og senere analyseret ved flowcytometri. Opsætningen af flow forskellige og referencedatabase bruges var de samme som beskrevet i en tidligere papir15: tre lasere blev brugt (405, 488 og 638 nm), syv dichroic splittere og ti filtre, der er omfattet fluorescens emission fra 425 til > 755 nm , og reference database herunder > 30 arter der dækker cyanobakterier, grønalger, kiselalger og rødalger, der blev fundet i biofilm i schweiziske stream. Det samlede antal partikler bruges til oprettelse af viSNE kortene var ca 150.000 (figur 2A). Med den beskrevne tilgang, er det muligt at skelne mellem de forskellige lokaliteter (figur 2B), kategorisere forskellige dele af viSNE kortet i delpopulation af celler med grove taksonomiske oplysninger (figur 3) og etablere som delpopulationer var anderledes mellem prøver (figur 4).
En lignende fremgangsmåde blev brugt til at kvantificere microplastic partikler i en biofilm. Ren prøver af microplastic partikler af lignende størrelse til celler i ferskvand biofilm (ca. 10 µm), biofilm prøver dyrkes i laboratoriet i tilstedeværelse eller fravær af microplastic partikler (ved hjælp af biofilm vækst protokoller er beskrevet i Tlili et al. 20115) blev målt og sammenlignet (figur 5). Det blev fastslået, at microplastic partikler med kendte optisk og fluorescerende egenskaber håndfast kan påvises ved koncentrationer over 1.000 ppm.
Figur 1: skemaet for den forsøgsplan. Samling af miljømæssige biofilm prøver er efterfulgt af identifikation af arter, der forekommer i biofilm, bestemmelse af deres optisk og fluorescerende egenskaber og montering flow-Flowcytometret med passende lasere og filtre til at måle disse egenskaber. Flow-cytometric målinger, prøverne er sonicated, fastsætte og gemt. Når nok prøver er blevet indsamlet de måles ved flowcytometri hvor der for hver målte celle, en række af optiske og fluorescens egenskaber er fremstillet og analyseret ved hjælp af visual klynger. Valgfrit (stiplede pile), det er muligt at opbygge en FC database af arter, der forekommer i overvågede biofilm og bruge databasen for fortolkning af resultaterne. Det er også muligt at bruge yderligere validering metoder, fx fluorescens-baserede celle sortering og taksonomisk analyse ved hjælp af lysmikroskopi venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: sammenligne miljømæssige biofilm ved hjælp af viSNE maps. (A) viSNE kort fremstillet af for mange celler (300.000) har en enkelt stor klynge (top), for få (10.000) celler ikke udgør klynger på alle (nederst), mens en optimal antal celle (ca. 150.000) form klart visuelt adskilles klynger (midten). (B) delmængder af viSNE kort, der hører til seks forskellige prøver har forskellige tætheder i anden del af viSNE kort. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: klynger af delpopulationer af partikler i biofilm. (A) forskellige dele af viSNE kort er befolket af partikler med forskellige optiske og fluorescens-egenskaber, der giver ledetråde til biotiske/abiotiske oprindelsen af partikler og til hvilken taksonomiske gruppe de biotiske partikler (celler) tilhører (bølgelængder fra top til bund: 525 nm, 695 nm, 660 nm). For hver bølgelængde, er farveskalaen normaliseret fra højeste målte fluorescens (rød) til laveste målte (blå). (B) projektion af referencedatabase (røde prikker) på viSNE kort kan hjælpe med at fortolke, hvilke dele af kortet er befolket af som taxa og/eller abiotiske partikler: rådnende celler (Top), kiselalger (midten), cyanobakterier (nederst). (C) baseret på oplysningerne i litra a og B og de visuelt kan adskilles klynger af viSNE kort, det er muligt tildele forskellige dele af viSNE kort til forskellige klynger (SP1-11) og kategorisere klyngerne i overensstemmelse hermed. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: statistisk analyse af biofilm prøver. (A) kvantificering udføres ved at tælle antallet af partikler af hver af de delpopulationer tilhører forskellige biologiske replikater. A – F repræsenterer seks forskellige steder langs en lokal stream, hvorfra biofilm prøverne blev taget. (B) ANOVA kan bruges til at evaluere statistisk forskel mellem prøverne, med passende flere sammenligning korrektion (p < 0,05, parvise Tukey HSD alle websteder vs site A). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Tracking microplastic partikler med viSNE. (A) Microplastic partikler, (B) ferskvand biofilm, (C) ferskvand biofilm blandet med microplastic partikler, (D) fluorescens af partikler målt ved FC på 695 nm. Farveskalaen er normaliseret fra højeste målte fluorescens (rød) til laveste målte fluorescens (blå) på 695 nm. Forholdet mellem microplastic partikler og biofilm partikler er ca 1:1. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den protokol, der er beskrevet ovenfor er relativt enkle at gennemføre. Men mens præsenteres standardindstillingerne har vist sig at være egnet til alle fototopiske biofilm testet hidtil, optimering (som beskrevet i protokollen) er nødvendigt at maksimere oplysningerne fra metoden. Faktisk, den optiske og fluorescerende egenskaber af biofilm kan variere, afhængigt af miljøforhold (sæson, temperatur, vandets kemiske sammensætning)1. Derfor er det vigtigt at tage hensyn til denne variabilitet ved opsætning af FC analyser. En måde at gøre dette er ved at tage repræsentative prøver af biofilm fra prøveudtagning websteder og/eller at tage enkelte arter og voksende dem i forskellige betingelser og måle dem ved hjælp af forskellige opsætninger. Voksende enkelt arter er også nyttige til at konstruere en database med fluorescerende egenskaber, der kan bruges til at fortolke FC resultater. For at gøre dette, er det imidlertid vigtigt, at de enkelte arter er blevet målt under lignende forhold til dem, hvorunder biofilm skal udtages. For eksempel vil en database med FC målinger af enkelt art vokser ved 25 ° C fortælle lidt om sammensætningen af en biofilm vokser på 15 ° C. Det er imidlertid ikke absolut nødvendigt at bygge en referencedatabase for at bruge denne metode effektivt. Allerede med at bruge den grundlæggende FC protokol, er det muligt at få oplysninger om størrelse og detaljeringsgrad og tilstedeværelsen af forskellige pigment i cellerne i biofilm. Visual klynger tillader klassifikation af celler i klynger, der ligner hinanden i den målte egenskaber og beslutsomhed som ejendom har ændret mest mellem prøver. Referencedatabase, men bliver vigtig, når du tildeler taksonomiske identiteter til de forskellige klynger. Når ændringer i biofilm egenskaber er blevet påvist, er det muligt at sammenholde dem med fysiske og kemiske målinger af vand ved prøveudtagning websteder. Dette giver mulighed for fastsættelse af, hvilken miljømæssig faktor har den stærkeste indflydelse på Fællesskabets biofilm i den overvågede økosystem.
Der er også nogle begrænsninger for metoden. For eksempel, tillader FC ikke identifikation af biofilm sammensætning på artsniveau. Desuden, når der påvises ændringer i biofilm egenskaber, FC ikke kan tilskrive ansvarlig årsager: et skift mod mere tolerante arter eller mod mere tolerant fænotyper (arter forbliver den samme). Andre, supplerende metoder, såsom metagenomics, er nødvendige for at løse dette spørgsmål. En anden begrænsning af metoden er, at kun den fototopiske komponent af biofilm, rige med pigmenter med forskellige fluorescerende egenskaber, er analyseret. Det er bestemt muligt at bruge metoden til heterotrofe biofilm karakterisering, er det ikke klart, om nok information kan fås med plet-fri analyse. På grund af den lave naturlig fluorescens af bakterier og svampe, forskellige indstillinger skal bruges, og det er derfor ikke muligt at evaluere de fototopiske og heterotrofe komponenter af biofilm sammen i en enkelt FC køre. Derimod ville adskiller prøven og evaluere en del med fototopiske og en del med de heterotrofe indstilling være nødvendigt. Endelig er der en begrænsning med ved hjælp af viSNE for biofilm visualisering. De bedste resultater er opnået med ca. 150.000 celler afbildet sammen. Dette sætter en grænse for antallet af prøver, der kan analyseres og sammenholdes med metoden uden beregningsmæssigt fortynde prøverne for meget. For eksempel, hvis man ønskede at sammenligne 150 prøver, ville derefter hver prøve kun være repræsenteret af ca. 1.000 celler. Én måde omgå denne begrænsning er at analysere prøverne ved hjælp af en "flytte vinduet" tilgang, hvor overlappende grupper af prøver kan analyseres separat ved hjælp af viSNE og derefter resultaterne samles sammen, sådan en løsning, men, endnu ikke er blevet gennemført.
Vi mener, at flowcytometri baseret evaluering af biofilm kan anvendes effektivt til overvågning af akvatiske økosystemer. Det kan bruges til at sammenligne tidsserier prøver eller prøver taget på forskellige lokationer, og bortset fra prøveudtagning selv, har potentiale til komplet automatisering. Metoden kan betragtes som en indledende biofilm evaluering skridt, der giver oplysninger til downstream detaljerede undersøgelser med komplementær og mere detaljerede metoder. Endelig kan det udvides til mere specifikke programmer, såsom påvisning af abiotiske kontaminering med biofilm, som vi har vist i tilfælde af microplastic.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Det præsenterede arbejde blev støttet af et SNF Ambizione Fellowship (PZ00P2_142533) og et Velux forskning tilskud (Amplebig). Vi vil gerne takke Bettina Wagner for hjælp med det eksperimentelle arbejde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Multimeter | WTW | MultiLine 3620 IDS | For measuring temperature, pH, dissolved oxygen |
| Ultrasonic cleaner | VWR International | 97043-986 | Tank dimesions: 15*14*10 cm |
| Flow cytometer | Beckman Coulter | Gallios | Lasers: 405, 488 and 638 nm. Filters bands in Supplementary Table 11. Sgier et, Nat Comm, 2016. |
| Plate reader | Tecan | Infinite M200 | used for selecting appropriate setting of the FC |
| Cell sorter | Beckman Coulter | MoFlo Astrios | Settings in Supplementary Table 12. Sgier et, Nat Comm, 2016. |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axiovert 135 | Zeiss EC Plan-Neofluar 40x/0.75 objective |
| SOFTWARE | |||
| Matlab | MathWorks | R2013a | software for numerical computing |
| CYT | Dana Pe'er Lab | Version 1.1 | free interactive visualization tool for analysis of cytometry data |
References
- Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. The ecology and biogeochemistry of stream biofilms. Nat Rev Microbiol. 14 (4), 251-263 (2016).
- Rotter, S., Heilmeier, H., Altenburger, R., Schmitt-Jansen, M. Multiple stressors in periphyton - comparison of observed and predicted tolerance responses to high ionic loads and herbicide exposure. J Appl Ecol. 50 (6), 1459-1468 (2013).
- Tlili, A., et al. Pollution-induced community tolerance (PICT): towards an ecologically relevant risk assessment of chemicals in aquatic systems. Freshw Biol. 61 (12), 2141-2151 (2016).
- Lavoie, I., Lavoie, M., Fortin, C. A mine of information: Benthic algal communities as biomonitors of metal contamination from abandoned tailings. Science of the Total Environment. 425, 231-241 (2012).
- Tlili, A., Montuelle, B., Berard, A., Bouchez, A. Impact of chronic and acute pesticide exposures on periphyton communities. Sci Total Environ. 409 (11), 2102-2113 (2011).
- Dorigo, U., et al. Lotic biofilm community structure and pesticide tolerance along a contamination gradient in a vineyard area. Aquat Microb Ecol. 50 (1), 91-102 (2007).
- Pesce, S., et al. Evaluation of single and joint toxic effects of diuron and its main metabolites on natural phototrophic biofilms using a pollution-induced community tolerance (PICT) approach. Aquat Toxicol. 99 (4), 492-499 (2010).
- Ricart, M., et al. Effects of low concentrations of the phenylurea herbicide diuron on biofilm algae and bacteria. Chemosphere. 76 (10), 1392-1401 (2009).
- Martinez, A., Kominoski, J. S., Larranaga, A. Leaf-litter leachate concentration promotes heterotrophy in freshwater biofilms: Understanding consequences of water scarcity. Sci Total Environ. , 1677-1684 (2017).
- Corcoll, N., et al. Comparison of four DNA extraction methods for comprehensive assessment of 16S rRNA bacterial diversity in marine biofilms using high-throughput sequencing. Fems Microbiol Lett. 364 (14), (2017).
- Welsh, A. K., McLean, R. J. Characterization of bacteria in mixed biofilm communities using denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). Curr Protoc Microbiol. , Chapter 1, Unit 1E 1 (2007).
- Ranjard, L., et al. Characterization of bacterial and fungal soil communities by automated ribosomal intergenic spacer analysis fingerprints: Biological and methodological variability. Appl Environm Microbiol. 67 (10), 4479-4487 (2001).
- Stewart, T. J., Traber, J., Kroll, A., Behra, R., Sigg, L. Characterization of extracellular polymeric substances (EPS) from periphyton using liquid chromatography-organic carbon detection-organic nitrogen detection (LC-OCD-OND). Environ Sci Pollut R. 20 (5), 3214-3223 (2013).
- Kroll, A., et al. Mixed messages from benthic microbial communities exposed to nanoparticulate and ionic silver: 3D structure picks up nano-specific effects, while EPS and traditional endpoints indicate a concentration-dependent impact of silver ions. Environ Sci Pollut R. 23 (5), 4218-4234 (2016).
- Sgier, L., Freimann, R., Zupanic, A., Kroll, A. Flow cytometry combined with viSNE for the analysis of microbial biofilms and detection of microplastics. Nat Commun. 7, 11587 (2016).
- Amir el, A. D., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nat Biotechnol. 31 (6), 545-552 (2013).
- Mora-Gomez, J., Freixa, A., Perujo, N., Barral-Fraga, L. Limits of the biofilm concept and types of aquatic biofilms. Aquatic Biofilms: Ecology, Water Quality and Wastewater Treatment. , 3-27 (2016).
- Matthaei, C. D., Guggelberger, C., Huber, H. Local disturbance history affects patchiness of benthic river algae. Freshw Biol. 48 (9), 1514-1526 (2003).
- Tlili, A., Hollender, J., Kienle, C., Behra, R. Micropollutant-induced tolerance of in situ periphyton: Establishing causality in wastewater-impacted streams. Water Res. 111, 185-194 (2017).
- Robinson, C. T., Rushforth, S. R. Effects of physical disturbance and canopy cover on attached diatom community structure in an idaho stream. Hydrobiologia. 154, 49-59 (1987).
- Pomati, F., Nizzetto, L. Assessing triclosan-induced ecological and trans-generational effects in natural phytoplankton communities: A trait-based field method. Ecotoxicology. 22 (5), 779-794 (2013).
- Hulliger, J. Methoden zur Untersuchung und Beurteilung der Fliessgewässer. , Vol. Umwelt-Vollzug Nr. 0740, Bundesamt für Umwelt, Bern (2007).
- Tlili, A., et al. In situ spatio-temporal changes in pollution-induced community tolerance to zinc in autotrophic and heterotrophic biofilm communities. Ecotoxicology. 20 (8), 1823-1839 (2011).
- Foladori, P., Laura, B., Gianni, A., Giuliano, Z. Effects of sonication on bacteria viability in wastewater treatment plants evaluated by flow cytometry - Fecal indicators, wastewater and activated sludge. Water Res. 41 (1), 235-243 (2007).
- Buesing, N., Gessner, M. O. Comparison of detachment procedures for direct counts of bacteria associated with sediment particles, plant litter and epiphytic biofilms. Aquat Microb Ecol. 27 (1), 29-36 (2002).
- van der Maaten, L., Hinton, G. Visualizing Data using t-SNE. J Mach Learn Res. 9, 2579-2605 (2008).
- van der Maaten, L. Accelerating t-SNE using Tree-Based Algorithms. J Mach Learn Res. 15, 3221-3245 (2014).
