Summary
Stroom cytometry in combinatie met visuele clustering biedt een easy-to-use en snelle methode voor het bestuderen van aquatische biofilms. Het kan worden gebruikt voor de karakterisering van de biofilm, de detectie van veranderingen in de structuur van de Gemeenschap van de biofilm, en detectie van abiotische deeltjes ingebed in de biofilm.
Abstract
Biofilms zijn dynamische consortia van micro-organismen die een belangrijke rol in zoetwater ecosystemen spelen. Door het veranderen van de structuur van hun gemeenschap, biofilms snel inspelen op de veranderingen in het milieu en kan dus worden gebruikt als indicatoren van de kwaliteit van het water. Op dit moment is biofilm beoordeling grotendeels gebaseerd op integratieve en functionele eindpunten, zoals fotosynthetische of luchtwegen activiteit, die geen informatie over de structuur van de biofilm-Gemeenschap geven. Stroom cytometry en computationele visualization bieden een alternatieve, gevoelig en eenvoudig-en-klare methode voor de beoordeling van de samenstelling van de Gemeenschap, met name van het photoautotrophic deel van zoetwater biofilms. Het vereist alleen eenvoudige bereiding van de monsters, waarna de gehele steekproef wordt uitgevoerd door de cytometer van de stroom. De eencellige optische en fluorescerende informatie wordt gebruikt voor computationele visualisatie en biologische interpretatie. De belangrijkste voordelen ten opzichte van andere methoden zijn de snelheid van de analyse en de aard van de hoge-informatie-inhoud. Stroom cytometry biedt informatie over verschillende cellulaire en biofilm eigenschappen in een enkele meting: deeltjesgrootte, dichtheid, pigment content, abiotische inhoud in de biofilm, en grof taxonomische informatie. Echter, biedt geen informatie over biofilm samenstelling op het niveau van de soorten. We zien hoog potentieel in het gebruik van de methode voor de milieumonitoring van aquatische ecosystemen en als een evaluatie van de eerste biofilm stap die stroomafwaarts informeert gedetailleerde onderzoeken door aanvullende en meer gedetailleerde methoden.
Introduction
Biofilms zijn dynamische consortia van micro-organismen die een sleutelrol in zoetwater ecosystemen spelen, variërend van primaire productie, nutriënten fietsen en waterzuivering tot het beïnvloeden van de distributie van micro-organismen en hun biodiversiteit in het ecosysteem 1. Wanneer biofilms worden blootgesteld aan het veranderlijke omgevingsomstandigheden of stressoren, zoals chemische stoffen, de structuur van hun gemeenschap snel verschuift richting meer tolerante soorten2,3. Hun hoge gevoeligheid verandert biofilms in aantrekkelijke modelsystemen voor milieu bewaking4, maar geen van de huidige methoden perfect afgestemd is op de dynamiek van een biofilm Gemeenschap daadwerkelijk te traceren in een snelle en gemakkelijke manier.
De gebruikte set van methoden voor het karakteriseren van biofilms bestaat uit de meting van de functionele en structurele eindpunten. Op het niveau van de gehele Gemeenschap bevat fotosynthetische en respiratoire activiteit alsook de activiteit van extracellulaire enzymen informatie over de functionele toestand van de biofilm5,6,7,8 ,9. De toename van de biomassa wordt gebruikt als een indicator voor de totale groei van de biofilm. Structurele veranderingen zijn momenteel gemeten met behulp van traditionele soorten identificatie met de lichte microscopie van of nucleotide gebaseerde technieken (bijvoorbeeldkleurovergang gelelektroforese (DGGE), geautomatiseerde ribosomal intergenic spacer denaturering analyse (ARISA), metagenomics)10,11,12. Deze methoden informatie verstrekken maar zijn tijdrovend worden uitgevoerd of wordt vereist specifieke kennis, of zijn nog in ontwikkeling. Tot slot, nieuwe methoden voor de evaluatie van de extracellulaire polymere stoffen (EPS)13,14 en de biofilm het platform1, terwijl gevoelig, zijn laag-doorvoer en hebben nog geen ontwikkeld naar redenen van toezicht afgeeft.
Het is duidelijk dat voor een volledige karakterisering van zoetwater biofilms, het noodzakelijk is om het combineren van verschillende methoden, die inzicht geven in de biofilm functie, de samenstelling en de architectuur. Voor milieubewaking, aan de andere kant, is een snelle en gevoelige methode welk vermag opsporing van wijzigingen in de biofilm en inschakelen van elementaire biologische interpretatie van de verschuivingen op de functionele en structurele niveau vereist.
We hebben een nieuwe methode voor de karakterisering van de microbiële Gemeenschap van de fototrofe component van stream biofilms (periphyton), die is snel genoeg voor controledoeleinden, en tegelijkertijd voldoende informatie verstrekt over de biofilm Gemeenschap ontwikkeld structuur om biologische interpretatie15. Het is gebaseerd op eencellige stroom cytometry (FC) van biofilm monsters en computationele visualisatie wordt gekoppeld en geeft informatie over optische en fluorescerende eigenschappen van de biofilm op het niveau van één cel.
De werkstroom na de biofilm bemonstering bestaat voor de bereiding van de monsters in de vorm van ultrasoonapparaat en fixatie van de monsters, gevolgd door de beoordeling van het monster door de stroom cytometry grootte-gebaseerd filteren. De opgehaalde gegevens bevatten informatie over de verschillende cellulaire eigenschappen in een enkele meting: deeltjesgrootte, dichtheid, pigment content, abiotische inhoud (bijvoorbeeld microplastics) in de biofilm. Deze set van gegevens is dan geanalyseerd via computationele visualisatie met behulp van visuele stochastische buurman insluiten (viSNE)16, waarmee snel en gemakkelijk interpretatie van de gegevens. Hoewel een paar weken moeten instellen en optimaliseren van de methode, eenmaal ingesteld, duurt het slechts een paar uur van het verzamelen van de biofilm monsters voor de interpretatie van de resultaten.
De belangrijkste voordelen van de onderhavige methode over anderen zijn de snelheid van analyse en hoge-informatie-inhoud. Bovendien kunnen de monsters voor enkele weken na het verzamelen zonder verlies van hun optische en fluorescentie-eigenschappen worden opgeslagen. Dit kan zeer nuttig zijn wanneer de karakterisering van een groot aantal monsters is vereist, zoals grote bemonstering studies of biomonitoring programma's, maar kan ook voorzien in een aanzienlijke hoeveelheid informatie in kleinere verkennende studies.
De gepresenteerde protocol is gebaseerd op analyse van de stroom-cytometrische van fototrofe biofilms (periphyton) verzameld vanaf verschillende locaties van een stream. Vele stappen van het protocol, bijvoorbeeld de selectie van de programmagebieden geschikt voor controledoeleinden, afhankelijk van de doelstellingen van het onderzoek en daarom niet kunnen worden voorgeschreven. Anderen toestaan minder vrijheid en vereisen dat het protocol is gevolgd, dit wordt duidelijk gemaakt in het hieronder gedetailleerd protocol.
Het protocol begint met de selectie van de programmagebieden voor milieubewaking biofilm gebaseerde. De volgende stap is aan opstelling de stroom-cytometer (FC), zodat de afmetingen inschakelen discriminatie tussen verschillende fototrofe organismen leven in biofilms in de gecontroleerde omgeving. Dit wordt uitgevoerd door het verzamelen van monsters van de biofilm van de sites, identificeren de fluorescerende eigenschappen van verschillende soorten waarvan de aanwezigheid in de biofilm en het opzetten van de stroom-cytometer met lasers en filters waarmee de meting bij de passende optische golflengten. Zodra de FC is set-up, biofilms kunnen worden verzameld van de sites van tijd tot tijd de optische en fluorescerende eigenschappen van de afzonderlijke deeltjes aanwezig zijn in de biofilm gemeten door stroom cytometry en de gegevens geanalyseerd door visuele clustering. Voor betere interpretatie van de resultaten is het mogelijk om te bouwen van een referentiedatabank FC lokale biofilm-levende soorten en hun fenotypes en gebruiken van de database om te identificeren van verschillende taxonomieën in de FC-gegevens. Validatie is het mogelijk door middel van fluorescentie gebaseerde sortering van de geïdentificeerde clusters van afzonderlijke cellen met behulp van FACS en microscopie gebaseerde taxonomische identificatie van de aanwezige soort. Een schematische voorstelling van het protocol wordt gegeven in Figuur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ecosysteem selectie en Biofilm bemonstering
- Selecteer een aquatisch ecosysteem van belang en vinden bemonsteringsplaatsen waar biofilms groeien. Ondiepe delen van een stream met vertragen tot middellange waterstroom en een steenachtige streambed voor biofilm bevestiging zijn passende17,18.
- Optioneel: Als de site geen voldoende oppervlakken biofilm bijlage, of om het verlagen van de variabiliteit van biofilms binnen een site, plaats kunstmatige ondergronden voor bevestiging van de biofilm (bv glas dia's, keramische tegels) in de site, terwijl ervoor te zorgen dat ze zijn geplaatst in dezelfde richting ten opzichte van de waterstroom en soortgelijke diepte en lichtintensiteit19.
- Om te bepalen van de milieu-omstandigheden op de site van de bemonstering, gebruik draagbare instrumenten voor het meten van de lichtintensiteit, is temperatuur van het water, geleidbaarheid, zuurstof en pH pal boven de oppervlakte biofilm te bemonsteren uit. In de loop van de bemonstering, maatregelen herhaalde (3 – 5) om te berekenen van de gemiddelde waarden.
- Optioneel: Neem watermonsters om relevante water chemie parameters (opgeloste organische koolstof (DOC), K+nb+, Ca2 +, Mg2 +, Cl-, F-, SO42 -, PO42 - , NO32-,4SiO4 -).
- Gebruik beschermende handschoenen, verzamelen vergelijkbare stenen (in grootte, vorm en type) van elke site (of kunstmatige ondergronden). De stenen moeten worden blootgesteld aan vergelijkbaar stroom en lichtomstandigheden18.
- Voldoende water stroom van de site wordt gefiltreerd door 0,22 μm filters, zodat het klaar voor alle verzamelde monsters (bijv 15 mL per monster is).
- Gebruik een zachte tandenborstel om de biofilm van het substraat in een maatkolf (penseel totdat alle biofilm is verwijderd) met 15 mL gefilterde stream water20.
- Corrigeer de monsters in 0.01% paraformaldehyde en 0,1% Glutaaraldehyde21.
2. bepaling van de Parameters van de optimale Flow-cytometrische (FC)
- Deelmonsters overbrengen in een lichte Microscoop (met een 40 X / 0,75 doelstelling; indien nodig een doelstelling van 100 × 1.3 olie gebruiken) en de soorten waarvan de aanwezigheid in de monsters22,23te identificeren.
- Volgorde geïdentificeerd eenzelfde soort van passende cultuurcollecties (bijvoorbeeld de experimentele fycologie en cultuur collectie van algen op de Universiteit van Göttingen [EPSAG] of cultuur collectie van algen op de Universiteit van Keulen [CCAC] als controle wordt uitgevoerd in de centrale Europese ecosystemen).
- De enkele soorten continu in soortgelijke omgevingsfactoren (e.g., licht, temperatuur, pH) aan het milieu dat de biofilm monsters werden genomen uit groeien. Verblijf in het 1 ° C en 0,5 pH punt van het milieu monsters wordt aanbevolen.
- Loskoppelen/verspreiden van de cellen, 15 mL van één soort monsters gestoken centrifuge buizen en zet de buizen in het midden van een waterbad en dompelen, zodat het vloeistofoppervlak van het monster op hetzelfde niveau als het oppervlak van het bad is. Bewerk ultrasone trillingen ten de monsters voor 1 min op 45 kHz24,25.
- De absorptie en fluorescentie spectra enkele soorten met behulp van een afleesapparaat opnemen. Raadpleeg afleesapparaat van keuze voor instructies. In dit voorbeeld 96-Wells vlakke onderkant transparant polystyrol platen werden geladen met 200 µL monstervolume en absorptie werd gemeten. (Instellingen die worden gebruikt: a fluorescentie scanmodus; emissie golflengte stap maat 10 nm, emissie scan nummer 30, bandbreedte 20 nm, krijgen 100, 25 flitsen, 20 Amerikaanse integratie tijd of (b) de extinctie scanmodus; 25 flitsen, bandbreedte 9 nm).
- De stroom cytometer met lasers, dichroïde splitters en filters die in combinatie betrekking hebben op alle die fluorescerende bereiken waarin verschillende soorten voorzien van bepaalde eigenschappen instellen. Voor centrale Europese streams, een 405 nm, 488 nm en 638 nm laser nuttige resultaten opleveren.
- Pas de instelling van de spanning van de photomultipliers (niet van toepassing op alle flow cytometers) en het bereik van de gemeten fluorescences tot ten minste 99% van alle gebeurtenissen van de monsters.
- Als alternatief, als kennis over soorten waarvan de aanwezigheid in de biofilms beschikbaar is, begint u met stap 2.2. Als fluorescerende eigenschappen bekend zijn, beginnen met stap 2.6.
3. Optioneel: Voorbereiding van een referentiedatabank Flow-cytometrische
Opmerking: FC staat geen taxonomische identificatie van cellen in de biofilm aanwezig. Een referentie-database van FC metingen van eenzelfde soort bekend moet aanwezig zijn in de biofilms, geteeld in vergelijkbare omstandigheden als de biofilms, kan helpen bij de interpretatie van de gegevens.
-
Referentie: eenzelfde soort
- Met de geoptimaliseerde FC-parameters ingesteld in 2.5 – 7, meten van de optische en fluorescerende eigenschappen van eenzelfde soort (opgelost in paraformaldehyde en Glutaaraldehyde en gefilterd door filters van de juiste grootte voor de stroom cytometer).
- Normaliseren van de gegevens van één soort op dezelfde manier als de gegevens uit de biofilms (zie stap 6.1.2).
-
Referentie: beschadigde en rottend cellen
Een van de belangrijkste indicatoren van biofilm gezondheid is de Fractie van beschadigd/sterven cellen aanwezig in de biofilm. Om te kwantificeren deze cellen, kan een verwijzing van rottende cellen worden voorbereid.- Neem 1 mL deelmonsters van verdunde biofilms en centrifugeer ze bij kamertemperatuur op 8.000 x g gedurende 10 minuten in een tafelblad centrifuge. Opschorten van de resulterende pellet in 1 mL 90% ethanol en opslaan van de opschorting 's nachts bij 4 ° C. Herhaal op de volgende dag.
- Met de geoptimaliseerde FC-instellingen, meet de optische en fluorescerende eigenschappen van de cellen van het beschadigde en rottend (vaste en gefilterd).
-
Referentie: microplastics
Opmerking: indien geïnteresseerd in het toezicht microplastic deeltjes in de biofilms, controleren of ze genoeg verschillen uit biotische deeltjes in optische en fluorescentie eigenschappen voor identificatie.- Opschorten van de deeltjes microplastic volgens de instructies van de producent microplastics en meet hun optische en fluorescerende eigenschappen (met behulp van FC parameters van 2.7).
- Voeg de microplastic deeltjes aan het biofilm monster en laat over nacht bij 4 ° C.
- Het filteren van de schorsing en de maatregel met dezelfde FC parameters als hierboven.
4. voorbereiding en opslag van de proeven
- Zodra de FC opgezet en de FC referentiedatabank klaar is, kan een doorgaan met de evaluatie van verse biofilm monsters, die volgens stap 1.1-7. Loskoppelen/verspreiden de biofilm, breng 15 mL van de monsters van de kolven (zie stap 1.7) in centrifuge buizen.
- Zet elke buis in het midden van een waterbad en dompelen zodat het vloeistofoppervlak van het monster op hetzelfde niveau als het oppervlak van het bad is. Bewerk ultrasone trillingen ten de monsters voor 1 min op 45 kHz.
- Corrigeer de monsters in 0.01% paraformaldehyde en 0,1% Glutaaraldehyde (stock in nanopure water). Bewaren bij 4 ° C tot klaar voor analyse.
- Belangrijk: Gebruik de helft van de monsters voor stroom cytometry analyse en houden de helft in opslag voor veiligheid en voor optioneel validatie met fluorescentie-geactiveerde cel Sorteren en/of lichte microscopie (zie punt 6).
Opmerking van: opgeslagen in de koelkast, vaste biofilm monsters moeten houden hun optische en fluorescerende eigenschappen voor maximaal drie weken.
5. doornemen het monster van de FC
- Als de monsters werden bewaard in de koelkast, bewerk ze snel ultrasone trillingen ten of Pipetteer meerdere malen te scheiden van de deeltjes. Filter de deelmonsters met 50 μm filters (filter grootte is afhankelijk van de breedte van het capillair FC) voor het meten.
- Laden van de afzonderlijke monsters (1-2 mL, dit hangt af van de cytometer van de stroom gebruikt) in de cytometer van de stroom en het meten van de optische en fluorescerende eigenschappen van elk deeltje. Herhaal de meting driemaal per elke biologische repliceren (drie technische wordt gerepliceerd).
- De gegevens uit de FC in CSV-indeling exporteren.
6. gegevens voorbereiding en analyse van de correlatie
FC kunt analyseren verschillende parameters (bijvoorbeeldsignaal gebied, hoogte, breedte) voor elke gemeten optische eigenschap en fluorescentie bereik. Uitvoeren van een analyse van de correlatie van de gemeten variabelen en houden alleen die metingen die zijn niet sterk gecorreleerd. Dit meestal verwijdert alles behalve één FC-parameter (bv, signaal gebied) en kan ook verwijderen sterk gecorreleerd fluorescerende metingen (meestal als gevolg van dezelfde laser en naburige filters).
-
CYT uitvoeren als een werkset in Matlab:
- De verminderde FC importgegevens in CSV-indeling van alle monsters die moeten worden geanalyseerd in het CYT software16, met inbegrip van alle technische en biologische worden gerepliceerd. (Klik op +, bestand filter *.csv, Selecteer bestanden om te importeren).
- Transformeren de fluorescerende kanalen van alle monsters met behulp van de transformatie van de hyperbolische arcsinus. De waarde van de cofactor moet worden geselecteerd; 150 werken voor de meest fototrofe biofilms en flow cytometers, maar optimalisatie mogelijk voor bepaalde experimentele opstellingen en heterotrofe biofilms. (Rechts-klikken/Transform/Voer cofactor 150)
- Voor kwaliteitscontrole, visueel vergelijken (in CYT) de histogrammen van de afzonderlijke monsters en afzonderlijke optische en fluorescerende kanalen om ervoor te zorgen dat er geen uitschieters zijn op het niveau van het technische en biologische van replicatie. Uitschieters zal manifesteren in aanzienlijk verschoven TL/optische distributies tussen de duplo's. (Gegevens selecteren, selecteer de zender, Plot)
- Alternatief: een belangrijkste componenten analyse (PCA) uitvoeren op de mediane waarden van fluorescerende distributies en ervoor te zorgen dat technische en biologische replicatieonderzoeken cluster samen.
- Samenvoegen de technische repliceert in elke biologische repliceren en deelmonster die biologische wordt gerepliceerd, zodat elk wordt vertegenwoordigd door hetzelfde aantal deeltjes (cellen, cel fragment en abiotische deeltjes) en dus dat het totale aantal deeltjes geanalyseerd door Stochastische buurman Barnes-Hut (bh-GND) te embedding is ongeveer 150.000 (voor beste visualisatie resultaten26). (Selecteer gegevens, klik met de rechtermuisknop, samenvoegen/deelmonster)
- Voor de vergelijking tussen de monsters is het belangrijk om te selecteren slechts deze monsters die worden vergeleken. Selecteer de monsters en bh-GND27uitvoeren. Wanneer het algoritme klaar, nieuwe kanalen is, weergegeven benoemde bh-SNE1 en de bh-SNE2. Dit zijn de coördinaten van de GND van alle geanalyseerde deeltjes, die kunnen worden gebruikt voor het visualiseren van de gegevens in een scatterplot (viSNE kaart). (Selecteer gegevens, selecteert u kanalen, klik met de rechtermuisknop, bh-GND, ja genormaliseerde gegevens)
- In de viSNE kaart, zijn deeltjes gepositioneerd op basis van gelijkenis en gegroepeerd in visueel scheiden clusters. Inspecteer de optische/TL-eigenschappen van de clusters, merk en naam die zijn goed gescheiden en verschillende optische/fluorescentie-eigenschappen met behulp van de tekengereedschappen beschikbaar in CYT hebben. (Selecteer zender bh-SNE1, bh-SNE2)
- Optioneel: Als een referentiedatabank soorten één microbiële (gemeten met dezelfde stroom cytometry instelling en onder vergelijkbare omstandigheden geteeld!) beschikbaar is, de exportoverzichten viSNE in Matlab en de referentie database projecteren op de kaarten. Op deze manier kunnen bepaalde clusters worden aangesloten op specifieke soorten/taxonomische groepen (scripts beschikbaar voor download op https://github.com/anzezupanic/FC_analysis). (Sessie/Save)
- Problemen oplossen: Als de bh-GND analyse geen visueel scheiden clusters, maar één grote resultaat geeft, teveel deeltjes werden gebruikt in de bh-GND. Probeer het opnieuw met minder deeltjes per monster. Als er geen clusters, maar eerder schaars afzonderlijke punten, verhogen het aantal deeltjes gebruikt.
- Optioneel: In plaats van te vertrouwen op de bh-GND voor de clustering, andere clustering methoden (bijvoorbeeld, hiërarchische, centroid gebaseerde of dichtheid gebaseerd clustering) kunnen worden gebruikt op de genormaliseerde gegevens en vervolgens bovenop de viSNE kaart (https://github.com/ anzezupanic/FC_analysis).
- Zodra de clusters zijn geïdentificeerd, tellen het aantal deeltjes in elk cluster die behoren tot elke biologische repliceren in elk monster. Beoordelen van de verschillen tussen de monsters, met behulp van ANOVA en Tukey de test met passende (bijvoorbeeldHolmes) correctie voor meerdere vergelijking.
7. Optioneel: Validatie van interpretatie van de Cluster met behulp van fluorescentie-geactiveerde cel sorteren
- Zodra de clusters zijn geïdentificeerd, gebruik fluorescentie-activated cell sorting (FACS) om ze te sorteren uit de monsters indien gewenst, mits de FACS een soortgelijke (of identiek) configuratie van lasers en fluorescerende filters heeft.
- Voor elk geïdentificeerd cluster biedt CYT optische en fluorescerende gates die het cluster bepalen. Gebruik deze poorten te regelen de deeltjes in elk cluster met de FACS en vervolgens de gesorteerde cellen met behulp van de lichte microscopie van opsporen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van de procedure die hier gepresenteerd (Figuur 1), werden monsters van de verschillende sites van een plaatselijke stroom in Zwitserland geanalyseerd. Op elke site, drie soortgelijk formaat stenen (10-12 cm) zijn genomen, en biofilms waren geborsteld uit de stenen. De monsters werden dan sonicated, vaste, gefilterd en later geanalyseerd door stroom cytometry. De installatie van de cytometer van de stroom en de referentie database gebruikt waren hetzelfde als beschreven in een eerdere papier15: drie lasers werden gebruikt (405, 488 en 638 nm), zeven dichroïde splitters en tien filters waarvoor fluorescentie emissies van 425 tot > 755 nm , en de referentie database met inbegrip van > 30 soorten die van cyanobacteriën, groene algen, diatomeeën en rode algen, die werden gevonden in biofilms in Zwitserse stroom. Het totale aantal deeltjes worden aangewend voor het creëren van de kaarten van de viSNE was ongeveer 150.000 (figuur 2A). Met de beschreven aanpak, is het mogelijk onderscheid maken tussen de verschillende sites (figuur 2B), categoriseren van verschillende delen van de kaart van de viSNE in populaties van cellen met grof taxonomische informatie (Figuur 3) en stellen die subpopulaties verschilden tussen de monsters (Figuur 4).
Een soortgelijke aanpak werd gebruikt te kwantificeren microplastic deeltjes in een biofilm. Pure monsters van microplastic deeltjes van gelijkaardige grootte naar cellen in zoetwater biofilms (ca. 10 µm), biofilms monsters gekweekt in het laboratorium in de aanwezigheid of afwezigheid van microplastic deeltjes (met behulp van biofilm groei protocollen beschreven in Tlili et al. 20115) werden gemeten en vergeleken (Figuur 5). Er werd vastgesteld dat de microplastic deeltjes met een bekende optische en fluorescerende eigenschappen op concentraties boven 1000 ppm krachtig gedetecteerd kunnen worden.
Figuur 1: Schema van de experimentele protocol. Het verzamelen van de monsters milieu biofilms wordt gevolgd door de identificatie van soorten waarvan de aanwezigheid in de biofilm, bepaling van de optische en fluorescerende eigenschappen en passend maken van de stroom-cytometer met passende lasers en filters voor het meten van dit Eigenschappen. Voor metingen van de flow-cytometrische, de monsters zijn sonicated, repareren en opgeslagen. Wanneer genoeg monsters hebt verzameld zijn dat ze door de stroom cytometry waar voor elke gemeten cel worden gemeten, een aantal optische fluorescentie-eigenschappen worden verkregen en geanalyseerd met behulp van visuele clustering. Optioneel (gestippelde pijlen), is het mogelijk een FC-database van soorten in gecontroleerde biofilms bouwen en gebruiken van de database voor interpretatie van de resultaten. Het is ook mogelijk om te gebruiken voor verdere validatie methoden, bijvoorbeeld fluorescentie gebaseerde cel Sorteren en taxonomische analyse met behulp van de lichte microscopie van Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Afbeelding 2: vergelijking milieu biofilms met viSNE kaarten. (A) viSNE kaarten verkregen uit teveel cellen (300.000) hebben een grote cluster (boven), te weinig (10.000) cellen vormen geen clusters op alle (bodem), terwijl een optimale aantal cel (ca. 150.000) formulier duidelijk visueel scheiden clusters (midden). (B) deelverzamelingen van de kaart van de viSNE die deel uitmaken van zes verschillende monsters zijn voorzien van verschillende dichtheden in ander deel van de viSNE-kaart. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Clustering van de subpopulaties van deeltjes in biofilms. (A) verschillende delen van de kaart van de viSNE worden bevolkt door deeltjes met verschillende optische en fluorescentie-eigenschappen die aanwijzingen geven aan de abiotische/biotische oorsprong van de deeltjes en die taxonomische groep de biotische deeltjes (cellen) behoren tot (golflengten van boven naar beneden: 525 nm, 695 nm, 660 nm). Voor elke golflengte, is de kleurenschaal genormaliseerd van hoogste gemeten fluorescentie (rood) naar laagst gemeten (blauw). (B) projectie van de referentiedatabank (rode stippen) naar de viSNE-kaart kunt interpreteren welke delen van de kaart worden bevolkt door welke taxa en/of abiotisch deeltjes: rottend cellen (boven), diatomeeën (midden), cyanobacteriën (onder). (C) op basis van informatie in (A) en (B) en het visueel scheiden clusters van de viSNE kaart, is het mogelijk verschillende delen van de kaart van de viSNE toewijzen aan verschillende clusters (SP1-11) en de clusters dienovereenkomstig categoriseren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: statistische analyse van de monsters van de biofilm. (A) kwantificering wordt uitgevoerd door het tellen van het aantal deeltjes van elke subpopulatie behorend tot verschillende biologische replicatieonderzoeken. A – F vormen zes verschillende locaties langs een lokale stream, waaruit de biofilm monsters zijn genomen. (B) ANOVA-programma kan worden gebruikt voor het evalueren van statistische verschil tussen de monsters, met in voorkomend geval meerdere vergelijking correctie (p < 0,05, paarsgewijs Tukey HSD alle sites vs site A). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: Tracking microplastic deeltjes met viSNE. (A) Microplastic deeltjes, zoetwater biofilms (B) , (C) zoetwater biofilm gemengd met microplastic deeltjes, (D) fluorescentie van de deeltjes gemeten door FC op 695 nm. De kleurenschaal is genormaliseerd van hoogste gemeten fluorescentie (rood) naar laagst gemeten fluorescentie (blauw) bij 695 nm. De verhouding tussen microplastic deeltjes en biofilm deeltjes is ongeveer 1:1. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het protocol dat hierboven beschreven is relatief eenvoudig te implementeren. Terwijl de gepresenteerde standaardinstellingen zijn geschikt voor alle fototrofe biofilm getest tot nu toe getoond, is optimalisatie (zoals beschreven in het protocol) echter noodzakelijk om te maximaliseren van de informatie verkregen uit de methode. Inderdaad, de optische en fluorescerende eigenschappen van biofilms kunnen variëren, afhankelijk van de omgevingsomstandigheden (seizoen, temperatuur, chemische samenstelling van het water)1. Daarom is het belangrijk rekening te houden deze variabiliteit bij het opzetten van de FC-analyses. Eén manier om het doen dit is door het nemen van representatieve monsters van biofilms van de bemonsteringsplaatsen en/of nemen van één soort en groeien ze in verschillende omstandigheden en maatregel hen met behulp van verschillende opstellingen. Enkele soorten groeien is ook nuttig voor de bouw van een database van fluorescerende eigenschappen die kunnen worden gebruikt voor het interpreteren van de resultaten van de FC. Om dit te doen, is het echter belangrijk dat de enkele soorten zijn gemeten in dezelfde wijze waaronder gaan de biofilms te bemonsteren. Bijvoorbeeld, zal een database van FC metingen van eenzelfde soort groeien bij 25 ° C zeggen heel weinig over de samenstelling van een biofilm groeien bij 15 ° C. Het is echter niet absoluut noodzakelijk om te bouwen van een referentie-database voor het effectief gebruik van deze methode. Reeds met de fundamentele FC-protocol gebruikt, is het mogelijk om informatie te krijgen over de omvang, de granulatie en de aanwezigheid van verschillende pigment in de cellen in de biofilm aanwezig. Visuele clusters indeling van cellen in clusters die vergelijkbaar zijn in de gemeten eigenschappen en de vastberadenheid waarvan de eigenschap van de meeste tussen de monsters is gewijzigd. De referentie-database, wordt echter belangrijk bij het taxonomische identiteiten toewijzen aan de verschillende clusters. Zodra de wijzigingen in de eigenschappen van de biofilm hebben geconstateerd, is het mogelijk te correleren van hen met fysische en chemische metingen van het water bij de bemonsteringsplaatsen. Hierdoor kan bepalen welke milieu-factor heeft de sterkste invloed op de Gemeenschap biofilm op de gecontroleerde ecosysteem.
Er zijn ook enkele beperkingen aan de methode. FC staat bijvoorbeeld geen de identificatie van de samenstelling van de biofilm op het niveau van de soorten. Bovendien, wanneer wijzigingen in de eigenschappen van de biofilm worden gedetecteerd, FC niet kan toeschrijven verantwoordelijk oorzaken: een verschuiving naar meer tolerante soorten of naar meer tolerante fenotypen (soort gelijk blijft). Andere, aanvullende methoden, zoals metagenomics, zijn nodig om deze vraag te behandelen. Een andere beperking van de methode is dat alleen het fototrofe onderdeel van biofilms, rijk met pigmenten met verschillende fluorescerende eigenschappen, wordt geanalyseerd. Terwijl het is zeker mogelijk met behulp van de methode voor de karakterisering van de heterotrofe biofilm, is het niet duidelijk of voldoende informatie kan worden verkregen met de analyse van de vlek-vrij. Als gevolg van de lage natuurlijke fluorescentie van bacteriën en schimmels, verschillende instellingen moeten worden gebruikt, en het is daarom niet mogelijk om te evalueren van de fototrofe en heterotrofe componenten van de biofilm samen in een enkele FC uitvoeren. Daarentegen zou scheiden van het monster en de evaluatie van enerzijds met fototrofe en een deel met de heterotrofe instelling nodig. Tenslotte is er een beperking bij het gebruik van de viSNE voor biofilm visualisatie. De beste resultaten worden behaald met ca. 150.000 cellen beeld samen. Hiermee stelt u een limiet voor het aantal monsters dat kan worden geanalyseerd en vergeleken met de methode zonder teveel computationeel het verdunnen van de monsters. Bijvoorbeeld, als een vergelijken 150 monsters wilde, zou vervolgens elk monster slechts worden vertegenwoordigd door ca. 1000 cellen. Unidirectioneel rond deze beperking is voor het analyseren van de monsters met behulp van een "venster verplaatsen" aanpak waarin overlappende groepen van monsters kan worden geanalyseerd afzonderlijk met behulp van viSNE en vervolgens de resultaten gebundeld samen, een dergelijke oplossing, echter, is nog niet geïmplementeerd.
Wij zijn van mening dat de evaluatie van de stroom-cytometry op basis van biofilms efficiënt kan worden toegepast op het toezicht op de aquatische ecosystemen. Het kan worden gebruikt voor het vergelijken van de monsters genomen op verschillende locaties of time-serie, en, met uitzondering van de bemonstering zelf, heeft potentieel voor complete automatisering. De methode kan worden beschouwd als een eerste biofilm evaluatie stap die informatie voor stroomafwaarts levert gedetailleerd onderzoeken met aanvullende en meer gedetailleerde methoden. Tot slot kan zij worden uitgebreid tot meer specifieke toepassingen, zoals detectie van niet-biologische verontreiniging van biofilms, zoals we hebben voor het geval van microplastic.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Het gepresenteerde werk werd gesteund door een SNF Ambizione Fellowship (PZ00P2_142533) en een onderzoeksbeurs van Velux (Amplebig). We zouden graag bedanken Bettina Wagner voor hulp bij het experimentele werk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Multimeter | WTW | MultiLine 3620 IDS | For measuring temperature, pH, dissolved oxygen |
| Ultrasonic cleaner | VWR International | 97043-986 | Tank dimesions: 15*14*10 cm |
| Flow cytometer | Beckman Coulter | Gallios | Lasers: 405, 488 and 638 nm. Filters bands in Supplementary Table 11. Sgier et, Nat Comm, 2016. |
| Plate reader | Tecan | Infinite M200 | used for selecting appropriate setting of the FC |
| Cell sorter | Beckman Coulter | MoFlo Astrios | Settings in Supplementary Table 12. Sgier et, Nat Comm, 2016. |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axiovert 135 | Zeiss EC Plan-Neofluar 40x/0.75 objective |
| SOFTWARE | |||
| Matlab | MathWorks | R2013a | software for numerical computing |
| CYT | Dana Pe'er Lab | Version 1.1 | free interactive visualization tool for analysis of cytometry data |
References
- Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. The ecology and biogeochemistry of stream biofilms. Nat Rev Microbiol. 14 (4), 251-263 (2016).
- Rotter, S., Heilmeier, H., Altenburger, R., Schmitt-Jansen, M. Multiple stressors in periphyton - comparison of observed and predicted tolerance responses to high ionic loads and herbicide exposure. J Appl Ecol. 50 (6), 1459-1468 (2013).
- Tlili, A., et al. Pollution-induced community tolerance (PICT): towards an ecologically relevant risk assessment of chemicals in aquatic systems. Freshw Biol. 61 (12), 2141-2151 (2016).
- Lavoie, I., Lavoie, M., Fortin, C. A mine of information: Benthic algal communities as biomonitors of metal contamination from abandoned tailings. Science of the Total Environment. 425, 231-241 (2012).
- Tlili, A., Montuelle, B., Berard, A., Bouchez, A. Impact of chronic and acute pesticide exposures on periphyton communities. Sci Total Environ. 409 (11), 2102-2113 (2011).
- Dorigo, U., et al. Lotic biofilm community structure and pesticide tolerance along a contamination gradient in a vineyard area. Aquat Microb Ecol. 50 (1), 91-102 (2007).
- Pesce, S., et al. Evaluation of single and joint toxic effects of diuron and its main metabolites on natural phototrophic biofilms using a pollution-induced community tolerance (PICT) approach. Aquat Toxicol. 99 (4), 492-499 (2010).
- Ricart, M., et al. Effects of low concentrations of the phenylurea herbicide diuron on biofilm algae and bacteria. Chemosphere. 76 (10), 1392-1401 (2009).
- Martinez, A., Kominoski, J. S., Larranaga, A. Leaf-litter leachate concentration promotes heterotrophy in freshwater biofilms: Understanding consequences of water scarcity. Sci Total Environ. , 1677-1684 (2017).
- Corcoll, N., et al. Comparison of four DNA extraction methods for comprehensive assessment of 16S rRNA bacterial diversity in marine biofilms using high-throughput sequencing. Fems Microbiol Lett. 364 (14), (2017).
- Welsh, A. K., McLean, R. J. Characterization of bacteria in mixed biofilm communities using denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). Curr Protoc Microbiol. , Chapter 1, Unit 1E 1 (2007).
- Ranjard, L., et al. Characterization of bacterial and fungal soil communities by automated ribosomal intergenic spacer analysis fingerprints: Biological and methodological variability. Appl Environm Microbiol. 67 (10), 4479-4487 (2001).
- Stewart, T. J., Traber, J., Kroll, A., Behra, R., Sigg, L. Characterization of extracellular polymeric substances (EPS) from periphyton using liquid chromatography-organic carbon detection-organic nitrogen detection (LC-OCD-OND). Environ Sci Pollut R. 20 (5), 3214-3223 (2013).
- Kroll, A., et al. Mixed messages from benthic microbial communities exposed to nanoparticulate and ionic silver: 3D structure picks up nano-specific effects, while EPS and traditional endpoints indicate a concentration-dependent impact of silver ions. Environ Sci Pollut R. 23 (5), 4218-4234 (2016).
- Sgier, L., Freimann, R., Zupanic, A., Kroll, A. Flow cytometry combined with viSNE for the analysis of microbial biofilms and detection of microplastics. Nat Commun. 7, 11587 (2016).
- Amir el, A. D., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nat Biotechnol. 31 (6), 545-552 (2013).
- Mora-Gomez, J., Freixa, A., Perujo, N., Barral-Fraga, L. Limits of the biofilm concept and types of aquatic biofilms. Aquatic Biofilms: Ecology, Water Quality and Wastewater Treatment. , 3-27 (2016).
- Matthaei, C. D., Guggelberger, C., Huber, H. Local disturbance history affects patchiness of benthic river algae. Freshw Biol. 48 (9), 1514-1526 (2003).
- Tlili, A., Hollender, J., Kienle, C., Behra, R. Micropollutant-induced tolerance of in situ periphyton: Establishing causality in wastewater-impacted streams. Water Res. 111, 185-194 (2017).
- Robinson, C. T., Rushforth, S. R. Effects of physical disturbance and canopy cover on attached diatom community structure in an idaho stream. Hydrobiologia. 154, 49-59 (1987).
- Pomati, F., Nizzetto, L. Assessing triclosan-induced ecological and trans-generational effects in natural phytoplankton communities: A trait-based field method. Ecotoxicology. 22 (5), 779-794 (2013).
- Hulliger, J. Methoden zur Untersuchung und Beurteilung der Fliessgewässer. , Vol. Umwelt-Vollzug Nr. 0740, Bundesamt für Umwelt, Bern (2007).
- Tlili, A., et al. In situ spatio-temporal changes in pollution-induced community tolerance to zinc in autotrophic and heterotrophic biofilm communities. Ecotoxicology. 20 (8), 1823-1839 (2011).
- Foladori, P., Laura, B., Gianni, A., Giuliano, Z. Effects of sonication on bacteria viability in wastewater treatment plants evaluated by flow cytometry - Fecal indicators, wastewater and activated sludge. Water Res. 41 (1), 235-243 (2007).
- Buesing, N., Gessner, M. O. Comparison of detachment procedures for direct counts of bacteria associated with sediment particles, plant litter and epiphytic biofilms. Aquat Microb Ecol. 27 (1), 29-36 (2002).
- van der Maaten, L., Hinton, G. Visualizing Data using t-SNE. J Mach Learn Res. 9, 2579-2605 (2008).
- van der Maaten, L. Accelerating t-SNE using Tree-Based Algorithms. J Mach Learn Res. 15, 3221-3245 (2014).
